CN114452266A - 一种基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统及其制备方法与应用，该递送系统包含内源性阳离子核糖体蛋白、被递送核酸药物和促进核酸药物在溶酶体内释放的外层修饰聚合物，所述内源性阳离子核糖体蛋白选自60S核糖体蛋白L28、60S核糖体蛋白L32、60S核糖体蛋白L27、60S核糖体蛋白S17和60S核糖体蛋白L22中的一种；优选为60S核糖体蛋白L32，所述促进核酸药物在溶酶体内释放的外层修饰聚合物为聚L‑赖氨酸衍生聚合物。可以有效地将所压缩的核酸药物递送至细胞内，转染效率佳，且材料规避了病毒载体的安全性问题，本身具有细胞毒性低、易于生物降解等特征，在基于mRNA、DNA、siRNA及miRNA等核酸药物的研究中有很好的应用前景。

Description

一种基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
近年来，基因治疗领域快速发展，核酸分子作为生物药物中备受关注和研究的一大类，可以实现被动或主动干预调控疾病的目标，为癌症、传染病、罕见病及其它难治疾病的患者提供了创新的治疗方法。其中，以核酸分子中的mRNA为例，mRNA疗法以mRNA药物制剂通过功能性蛋白的表达而治疗基因缺陷性疾病或组织修复，又可通过抗原、抗体或受体的表达应用于免疫治疗，具有极大的应用价值。mRNA药物相比于其他生物治疗药物具有更安全、更方便和更可控的优势，因此，mRNA药物受到越来越多研究者的青睐。
同其他基因疗法一样，mRNA疗法的重点也是能够有效且安全地递送mRNA药物到患者体内。由于在体内递送时mRNA易受到血浆和组织中的核酸酶清除、被靶细胞摄取的效率不高以及进入细胞后难以逃逸内吞小体而无法发挥作用。提高mRNA稳定性及翻译效率是mRNA走向临床应用必须要跨越的障碍。目前的研究主要通过mRNA结构化学优化以及递送系统的优化来改善mRNA的稳定性和翻译效率。综上，安全有效的递送载体在mRNA药物的应用中具有重要意义。
现有研究较为成熟的mRNA载体系统主要包括阳离子多肽、鱼精蛋白、脂质体LNP和脂质纳米复合物。其中，鱼精蛋白是一种阳离子蛋白，可以把带负电的mRNA分子络合成纳米级别的核酸-蛋白颗粒，从而保护mRNA不被血清中的RNA酶降解。然而，由于鱼精蛋白和mRNA的结合太过紧密，mRNA-鱼精蛋白颗粒的蛋白表达效率会受限。此外，鱼精蛋白是从鲑鱼精子中提取的一种异体蛋白，具有一定的抗原性，可能引起人体的不良反应。因此，阳离子多肽/蛋白作为mRNA浓缩递送的载体仍需进一步的优化研究。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种基于重组阳离子核糖体蛋白的核酸药物递送系统，该系统通过静电相互作用结合核酸药物、并修饰可促进细胞摄取和胞内溶酶体逃逸的聚L-赖氨酸衍生物，可以有效地将所压缩的核酸药物递送至细胞内，转染效率佳，且材料规避了病毒载体的安全性问题，本身具有细胞毒性低、易于生物降解等特征。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，提供一种基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统，包含内源性阳离子核糖体蛋白、被递送的核酸药物和促进核酸药物在溶酶体内释放的外层修饰聚合物。
在一种或多种实施方式中，所述核酸药物包括mRNA药物、DNA药物、siRNA药物或miRNA药物；
进一步地，所述mRNA药物为经修饰后的荧光素酶mRNA(mFluc)；
在一种或多种实施方式中，所述内源性阳离子核糖体蛋白选自60S核糖体蛋白L28(RPL28)、60S核糖体蛋白L32(RPL32)、60S核糖体蛋白L27(RPL27)、60S核糖体蛋白S17(RPS17)或60S核糖体蛋白L22(RPL22)中的一种；优选为RPL32；
在一种或多种实施方式中，所述促进核酸药物在溶酶体内释放的外层修饰聚合物为可实现于溶酶体酸性环境下电荷翻转的聚L-赖氨酸衍生聚合物。
在本发明的第二方面，提供一种上述基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统的制备方法，所述制备方法的具体步骤如下：
(1)制备聚L-赖氨酸衍生聚合物(APP)：
聚L-赖氨酸和顺式乌头酸酐在pH为9.0的条件下反应6-10h，反应液转移至透析袋中，在pH为8-9的水溶液中透析22-26h后冻干，得到顺式乌头酸接枝的聚L-赖氨酸AA-PLL；
将AA-PLL和NHS-PEG-MAL在pH为7.4的条件下反应6-10h，透析冻干得到AA-PLL-MAL；在AA-PLL-MAL上接枝RGD多肽，两者适量混合在pH为7.0的条件下惰性环境下反应6-10h，产物通过透析冻干获得马来酰亚胺修饰的AA-PLL(AA-PP-MAL，即APP)；
(2)制备基于内源性阳离子核糖体蛋白的核酸药物递送系统：
将内源性阳离子核糖体蛋白与核酸药物混合，室温下孵育20-40min，经过离心重悬后，加入一定量的聚L-赖氨酸衍生聚合物(APP)，室温孵育，经离心重悬后得到基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统。
在本发明的第三方面，提供一种上述基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统在制备核酸药物递送药物中的应用。
本发明的具体实施方式具有以下有益效果：
本发明提供了一种基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统，该系统通过静电相互作用结合核酸药物(如mRNA药物)及促进细胞摄取和胞内溶酶体逃逸的聚L-赖氨酸衍生物，可以有效地将所压缩的核酸药物递送至细胞内，转染效率佳，且材料规避了病毒载体的安全性问题，本身具有细胞毒性低、易于生物降解等特征，在基于mRNA、DNA、siRNA及miRNA等核酸药物的研究中有很好的应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例1中基于阳离子核糖体蛋白的mRNA递送系统的合成过程示意图；
图2是本发明实施例1的聚L-赖氨酸衍生聚合物(APP)的合成过程示意图；
图3是本发明实施例1的聚L-赖氨酸衍生聚合物(APP)的合成中的核磁氢谱图；
图4是mFluc@RP/APP纳米复合物给药后细胞的相对光强度；
其中a为mFluc@RP/APP纳米复合物的合成示意图，b为不同条件下各纳米复合物给药后肌成纤维细胞的相对光强度，c为不同条件下各纳米复合物给药后A549细胞的相对光强度。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一种实施方式中，提供了一种基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统，包含内源性阳离子核糖体蛋白、被递送的核酸药物和促进核酸药物在溶酶体内释放的外层修饰聚合物。
在一种或多种实施方式中，所述核酸药物包括mRNA药物、DNA药物、siRNA药物或miRNA药物；
进一步地，所述mRNA药物为经修饰后的荧光素酶mRNA(mFluc)；
在一种或多种实施方式中，所述内源性阳离子核糖体蛋白选自60S核糖体蛋白L28(RPL28)、60S核糖体蛋白L32(RPL32)、60S核糖体蛋白L27(RPL27)、60S核糖体蛋白S17(RPS17)或60S核糖体蛋白L22(RPL22)中的一种；优选为RPL32；
在一种或多种实施方式中，所述促进核酸药物在溶酶体内释放的外层修饰聚合物为可实现于溶酶体酸性环境下电荷翻转的聚L-赖氨酸衍生聚合物；
进一步地，所述聚L-赖氨酸衍生聚合物由顺式乌头酸-聚L-赖氨酸-靶向肽构成。
在一种或多种实施方式中，核糖体蛋白与核酸药物的质量比为1-16，优选为1、2、4、8或16；进一步优选为8；所述促进核酸药物在溶酶体内释放的外层修饰聚合物与内源性阳离子核糖体蛋白的质量比为35～45:1，优选40:1。
本发明中的内源性阳离子核糖体蛋白由一系列具有相似的理论等电点或分子量的、多种重组的碱性核糖体蛋白筛选而来，优选60S核糖体蛋白L28(RPL28)、60S核糖体蛋白L32(RPL32)、60S核糖体蛋白L27(RPL27)、60S核糖体蛋白S17(RPS17)和60S核糖体蛋白L22(RPL22)，该系列碱性核糖体蛋白的分子量相近且适中，理论等电点存在差异，分别为12.02、11.32、10.56、9.85和9.22。
本发明的一种实施方式中，提供了一种上述基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统的制备方法，所述制备方法的具体步骤如下：
(1)制备聚L-赖氨酸衍生聚合物(APP)：
聚L-赖氨酸和顺式乌头酸酐在pH为9.0的条件下反应6-10h，反应液转移至透析袋中，在pH为8-9的水溶液中透析22-26h后冻干，得到顺式乌头酸接枝的聚L-赖氨酸AA-PLL；
将AA-PLL和NHS-PEG-MAL在pH为7.4的条件下反应6-10h，透析冻干得到AA-PLL-MAL；在AA-PLL-MAL上接枝RGD多肽，两者适量混合在pH为7.0的条件下惰性环境下反应6-10h，产物通过透析冻干获得马来酰亚胺修饰的AA-PLL(AA-PP-MAL，即APP)；
(2)制备基于内源性阳离子核糖体蛋白的核酸药物递送系统：
将内源性阳离子核糖体蛋白与核酸药物混合，室温下孵育20-40min，经过离心重悬后，加入一定量的聚L-赖氨酸衍生聚合物(APP)，室温孵育，经离心重悬后得到基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统。
在一种或多种实施方式中，所述透析袋的截留分子量为3500Da。
在一种或多种实施方式中，步骤(1)中的溶剂为PBS溶液，使用NaOH调节pH值。
本发明的一种实施方式中，提供了一种上述基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统在制备核酸药物递送药物中的应用。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1
多功能的聚L-赖氨酸衍生物(APP)的合成
1、顺式乌头酸接枝的聚L-赖氨酸—AA-PLL的合成
精密称取5.0mg的聚L-赖氨酸溶解在5ml pH 9.0的PBS中，再加入精密称量的4.2mg顺式乌头酸酐溶解，用1.0M的NaOH溶解调节混合溶液的pH至9.0左右，电磁搅拌下室温反应8小时，将反应混合液转移至提前检漏后的截留分子量3500Da的透析袋中，在NaOH调节pH为8-9的水溶液中透析24h后冻干，使用核磁氢谱检测目的产物是否合成。
2、马来酰亚胺修饰的AA-PLL—AA-PP-MAL的合成
精密称定上述产物AA-PLL 9.0mg并将其溶解在5ml pH7.4的PBS中，将称取的26.0mg的NHS-PEG-MAL加入至AA-PLL溶液中，电磁搅拌下室温反应8h，而后将反应混合液转移至提前检漏后的截留分子量3500Da的透析袋中，在pH为7.2-7.4的PBS中透析24h后冻干，使用核磁氢谱检测目的产物是否合成。
3、多肽接枝的AA-PP-MAL—APP的合成
将上述合成的9.8mg的AA-PLL-AML与5.0mg的RGD环肽快速混合在pH7.0的PBS中，在氮气保护下室温反应8h，产物经透析冻干获得，并进一步用核磁氢谱检测。
实施例2
聚L-赖氨酸衍生聚合物修饰的核糖体蛋白浓缩的mRNA递送系统—mFluc@RP/APP纳米复合物的制备
将一系列供筛选的核糖体蛋白RPL28、RPL32、RPL27、RPS17、RPL22分别与荧光素酶mRNA混合(核糖体蛋白与mRNA的质量比分别为1、2、4、8、16)，移液枪轻吹打10s，室温下孵育30min促使阳离子蛋白和mRNA的充分结合以形成mFluc@RP复合物，经过离心重悬后，再分别加入一定量的聚L-赖氨酸衍生聚合物(APP：蛋白＝40:1的质量比)，移液枪轻吹10s后室温孵育30min，经离心重悬后得到制备的mFluc@RP/APP纳米复合物，即基于阳离子核糖体蛋白的mRNA递送系统。
实施例3
mFluc@RP/APP纳米复合物的表征与筛选
将上述合成的各纳米复合物进行粒径和电位的测定，并通过体外细胞实验考察其各自的递送能力。实验所用的细胞为细胞表面整合素上调的TGFβ1诱导的人肺肌成纤维细胞和人肺腺癌细胞A549，分别以1.0×104个/每孔的数量将细胞接种在96孔板内，过夜培养后，用除菌的PBS清洗后，每孔加入100μl的含纳米复合物的无血清培养基(每孔相当于含有约400ng mFluc)，然后放至CO2培养箱中孵育8h后，将培养基转换为含血清培养后再培养48h，取出细胞培养板在室温平衡10分钟，96孔板每孔加入100μl萤火虫萤光素酶检测试剂，室温(约25℃)孵育10分钟，使发光信号趋于稳定，使用具有多功能酶标仪进行化学发光检测。根据动态光散射与体外细胞转染的结果来确定最佳的mFluc@RP/APP纳米复合物。
表1为各mFluc@RP/APP纳米复合物的动态光散射表征结果
Figure BDA0003499172890000061
从表1中可以看出：相比于RPL22、RPS17和RPL27，RPL28和RPL32具有更优的形成粒径合适的纳米递送复合物的能力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统，其特征在于，其包含内源性阳离子核糖体蛋白、被递送的核酸药物和促进核酸药物在溶酶体内释放的外层修饰聚合物。
2.如权利要求1所述的基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统，其特征在于，所述核酸药物包括mRNA药物、DNA药物、siRNA药物或miRNA药物；
优选地，所述mRNA药物为经修饰后的荧光素酶mRNA。
3.如权利要求1所述的基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统，其特征在于，所述内源性阳离子核糖体蛋白选自60S核糖体蛋白L28、60S核糖体蛋白L32、60S核糖体蛋白L27、60S核糖体蛋白S17和60S核糖体蛋白L22中的一种；优选为60S核糖体蛋白L32。
4.如权利要求1所述的基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统，其特征在于，所述促进mRNA在溶酶体内释放的外层修饰聚合物为聚L-赖氨酸衍生聚合物。
5.如权利要求4所述的基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统，其特征在于，所述聚L-赖氨酸衍生聚合物由顺式乌头酸-聚L-赖氨酸-靶向肽构成。
6.如权利要求1所述的基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统，其特征在于，内源性阳离子核糖体蛋白与核酸药物的质量比为1-16，优选为1、2、4、8或16；进一步优选为8；
所述促进核酸药物在溶酶体内释放的外层修饰聚合物与内源性阳离子核糖体蛋白的质量比为35～45:1，优选40:1。
7.权利要求1-6任一所述基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤如下：
(1)制备聚L-赖氨酸衍生聚合物：
聚L-赖氨酸和顺式乌头酸酐在pH为9.0的条件下反应6-10h，反应液转移至透析袋中，在pH为8-9的水溶液中透析22-26h后冻干，得到顺式乌头酸接枝的聚L-赖氨酸AA-PLL；
将AA-PLL和NHS-PEG-MAL在pH为7.4的条件下反应6-10h，透析冻干得到AA-PLL-MAL；在AA-PLL-MAL上接枝RGD多肽，两者适量混合在pH为7.0的条件下惰性环境下反应6-10h，产物通过透析冻干获得马来酰亚胺修饰的AA-PLL，即AA-PP-MAL；
(2)制备基于内源性阳离子核糖体蛋白的核酸药物递送系统：
将内源性阳离子核糖体蛋白与核酸药物混合，室温下孵育20-40min，经过离心重悬后，加入一定量的聚L-赖氨酸衍生聚合物，室温孵育，经离心重悬后得到基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述透析袋的截留分子量为3500Da。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的溶剂为PBS溶液，使用NaOH调节pH值。
10.一种上述基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统在制备核酸药物递送药物中的应用。
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