CN109288815B - 一种可实现肿瘤靶向投递核酸药物的多级递送纳米粒子的制备方法和应用 - Google Patents

一种可实现肿瘤靶向投递核酸药物的多级递送纳米粒子的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种可实现肿瘤靶向投递核酸药物的多级递送纳米粒子的制备方法与应用，多级递送纳米粒子被设计为核‑壳结构，具有环境响应性的壳层赋予多级递送纳米粒子针对周围环境呈现不同表面特性的能力，允许多级递送纳米粒子克服多个生理屏障并将核酸药物高效送至肿瘤组织。我们向患有肿瘤的小鼠注射携带有荧光探针标记的质粒DNA的多级递送纳米粒子实现了核酸药物在肿瘤组织中高效富集，表明利用多级递送纳米粒子完全可以实现肿瘤靶向递送核酸药物。

Description

一种可实现肿瘤靶向投递核酸药物的多级递送纳米粒子的制 备方法和应用
技术领域
本发明属于高分子生物材料领域，涉及一种可实现肿瘤靶向递送核酸药物的多级递送纳米粒子的制备方法和应用。
背景技术
遗传学和分子生物学的研究进展表明，癌症的发生、发展与多种遗传基因改变和紊乱有关。基因疗法可以将具有治疗性的核酸药物递送到癌细胞中以纠正或修改遗传信息，在遗传水平上显示出了对癌症治疗的巨大潜力。癌症的基因治疗包括自杀基因治疗，沉默癌基因表达，突变校正，肿瘤抑制增强，抑制肿瘤血管生成和刺激针对肿瘤细胞的免疫应答。在过去的25年中，已经进行了超过2000次的基因治疗临床试验，其中约三分之二用于治疗各种类型的癌症，这些临床实验显示基因治疗是一种具有高选择性和高效率癌症疗法。
尽管基因疗法在医学上具有很大的应用潜力，但对于癌症治疗来说，目前存在的最大的挑战是如何将核酸药物安全高效地递送至肿瘤组织。近年来，各种各样的方法已经被开发用于核酸药物的投递，例如，慢病毒(LV)，腺病毒(AV)和腺伴随病毒(AAV)等病毒载体。然而，由于插入诱变、致癌作用和免疫原性等原因，病毒类载体的临床应用潜力仍然非常有限。与此同时，非病毒载体由于其安全性、较大的负载能力、并且易于合成等优点，在核酸药物的递送应用上已经显示出巨大的潜力。阳离子类载体可与负电性的核酸通过静电作用复合形成带正电的纳米颗粒，其随后可以被负电性的细胞膜高效摄取。近年来，研究人员已经成功地使用阳离子脂质体，聚乙烯亚胺(PEI)，细胞穿透肽(CPP)，金纳米粒子实现了核酸在体外和体内的递送。然而，此类载体的高正电性可能会引起纳米粒子与正常生理环境中其它组分产生非特异性相互作用，导致较短的体内循环时间。虽然引入聚乙烯醇(PEG)层或其它阴离子聚合物来进一步修饰纳米粒子的表面可以解决这个问题，但这种方法不利于癌细胞对纳米粒子的摄取。从递送的角度来看，基于核酸药物的递送体系在体内递送过程中必须经历三个连续阶段。第1阶段，递送体系在血液循环过程中保持稳定；第2阶段，递送体系在肿瘤组织中有效富集；第3阶段，核酸药物被癌细胞高效摄取并释放以实现治疗效果。然而，这些不同的阶段要求递送系统具有完全不同的表面特性，因此将这三种需求整合到一个体系中是一个巨大的挑战。
发明内容
本发明目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种可实现体内高效投递核酸药物并有效抑制肿瘤生长的多级递送纳米粒子的制备方法和应用。
本发明在多级递送纳米粒子的制备过程中，首先使用苯硼酸修饰的低分子量的聚乙烯亚胺与核酸通过静电作用复合成高正电性的纳米复合物，此纳米复合物既具有较低的生物毒性又可以大幅度提高核酸被细胞摄取的能力。随后，进一步通过与环境响应性阴离子聚合物静电自组装形成具有针对不同微环境响应而改变表面性质的多级递送纳米粒子。此纳米粒子在正常的生理环境中(pH 7.4)由于弱负电位和聚乙二醇(PEG)壳层的屏蔽作用而可以稳定循环，但在弱酸性的肿瘤微环境(pH＝6.5)中，纳米粒子表面的环境响应性阴离子聚合物壳层可以迅速脱除并暴露出高正电性的内核，从而被肿瘤细胞高效摄取。由于可以在不同体内微环境中呈现出不同的表面性质，这种纳米粒子既能在血液的环境中稳定循环又能被肿瘤部位的肿瘤细胞有效摄取，从而实现了对核酸药物在体内的高效递送。此外，其制备方法工艺简单，易于操作，成本较低，易于推广应用。
本发明的技术方案：
一种可实现肿瘤靶向投递核酸药物的多级递送纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
1)苯硼酸修饰的低分子量聚乙烯亚胺(PEI-PBA)的合成步骤，
首先向容器中加入聚乙烯亚胺(MW：1800)并加入甲醇充分溶解，然后加入2-溴乙基苯硼酸，所述聚乙烯亚胺与2-溴乙基苯硼酸的用量摩尔比为1:3；60℃-75℃下搅拌回流12-24小时，反应结束后冷却至室温，用冰乙醚沉淀，干燥后得淡黄色固体产物即为PEI-PBA；
2)环境响应性阴离子聚合物的合成，
2.1)将N-苄氧羰基-L-赖氨酸加入到容器中，同时加入重蒸四氢呋喃充分溶解，然后缓慢加入溶有三光气的四氢呋喃溶液，所述N-苄氧羰基-L-赖氨酸与三光气的用量摩尔比为1:1.5；60-70℃油浴搅拌条件下反应2-4h，待反应澄清之后，用氩气除去容器中的残余三光气；浓缩反应液，快速加入预先准备好的过量正己烷中，沉淀，放入冰箱过夜，抽滤，得到淡黄色固体，加入体积比为1:1的乙酸乙酯/正己烷溶液，加热溶解至微沸，趁热过滤去除不溶物，得到饱和的N-苄氧羰基-L-赖氨酸酐(Lys(Z)-NCA)溶液，静置析出结晶，冰箱过夜；重复上述重结晶过程，抽滤，得到Lys(Z)-NCA；
2.2)将步骤2.1)得到的Lys(Z)-NCA溶解在无水DMF中，通过加入单氨基封端的聚乙二醇(PEG-NH2)作为引发剂进行聚合，Lys(Z)-NCA与PEG-NH2的用量摩尔比为150：1；将反应混合物在30-40℃下通入干燥氩气下搅拌48-72小时；然后减压蒸发溶剂，将所得产物溶于CHCl3中，然后沉淀在过量的乙醚中，得到PEG-b-PLys(Z)；在0-4℃下，通过将HBr加入到PEG-b-PLys(Z)的CF3COOH溶液中，进行PEG-b-PLys(Z)中的苄氧羰基的脱保护反应；反应1-3h之后，将反应混合物沉淀在过量的冰乙醚中；将沉淀重新溶解在DMF中，通过220nm微孔过滤器过滤纯化；滤液在过量的乙醚中沉淀以除去残留的CF3COOH，并得到单甲氧基聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物(mPEG113-b-PLys100)；然后将产物在室温下真空干燥；
2.3)将将步骤2.2)得到的mPEG113-b-PLys100溶解在pH＝8.0-9.0的碳酸氢钠缓冲溶液中，然后加入2,3-二甲基马来酸酐(DMMA)反应，mPEG113-b-PLys100与DMMA的用量摩尔比为1：500；在整个反应过程中不断滴加0.2N的氢氧化钠溶液使整个反应体系的pH保持在8.0-9.0；反应结束后，使用透析袋(截留分子量：3500Da)将未反应的DMMA除去，然后冻干透析液得到环境响应性阴离子聚合物mPEG113-b-PLys100/DMMA；
3)多级递送纳米粒子的制备
在室温下，将步骤1)得到的PEI-PBA和质粒DNA等体积混合并孵化15min形成高正电性的纳米复合物PEI-PBA/pDNA，PEI-PBA和质粒DNA的质量比为2:1-6:1；随后通过静电相互作用将步骤2)得到的环境响应性阴离子聚合物mPEG113-b-PLys100/DMMA引入正电性的纳米复合物表面，进一步孵化15min以形成多级递送纳米粒子，mPEG113-b-PLys100/DMMA与质粒DNA的质量比为4:1-16:1。
一种可实现肿瘤靶向投递核酸药物的多级递送纳米粒子的应用，包括以下方面：
1)在抗蛋白吸附方面的应用；2)在随微环境变化呈现不同表面方面的应用；3)在微酸性环境下促进细胞对核酸药物摄取方面的应用；4)在体外环境下促进核酸药物调控肿瘤细胞基因表达方面的应用；5)观察多级递送纳米粒子在肿瘤部位富集方面的应用。
本发明的优点是：
本发明提供的多级递送纳米粒子中的环境响应性阴离子聚合物壳层赋予多级递送纳米粒子在不同递送阶段呈现不同表面特性的能力，允许多级递送纳米粒子克服多个生理屏障，以最佳效率将核酸药物递送至肿瘤组织并被肿瘤细胞高效摄取。利用这些功能，多级递送纳米粒子可以成为解决基于癌症基因治疗开发中的递送问题的基础技术。更广泛地说，本多级递送纳米粒子的结构还可以适用于其他类型的核酸药物投递(miRNA、siRNA等)，为癌症的基因治疗提供新的机会。而且这种多级递送纳米粒子制备简单，易于操作，成本较低，极易于推广应用。
附图说明
图1为多级递送纳米粒子的制备和体内递送机理示意图。
图2为多级递送纳米粒子抗蛋白吸附能力以及针对肿瘤微环境的响应，其中，a显示的是多级递送纳米粒子的抗蛋白吸附能力；b显示的是多级递送纳米粒子表面zeta电位随环境pH改变产生的变化；c和d显示的分别是多级递送纳米粒子和单级递送纳米粒子在不同pH下的荧光共振能量转移现象。
图3为多级递送纳米粒子在微酸性环境下促进细胞对核酸药物的摄取，其中，a是MDA-MB-231细胞在不同pH环境下对多级递送纳米粒子和单级递送纳米粒子摄取的激光共聚焦图片；b和c显示的分别是MDA-MB-231细胞在不同pH环境下对多级递送纳米粒子和单级递送纳米粒子摄取的流式细胞术结果。
图4为多级递送纳米粒子在体外环境下促进核酸药物调控肿瘤细胞基因表达，其中，a显示的是MDA-MB-231和LN 229细胞经过多级递送纳米粒子处理后miR-524基因的表达情况；b显示的是MDA-MB-231和LN 229细胞经过多级递送纳米粒子处理后相关蛋白的表达情况；c显示的是MDA-MB-231和LN 229细胞经过多级递送纳米粒子处理后细胞的增殖情况。
图5为多级递送纳米粒子在肿瘤部位的富集，其中，a显示的是小鼠注射多级递送纳米粒子和单级递送纳米粒子后不同时间点纳米粒子在小鼠各器官内的富集情况；b是使用活体成像软件对结果a的定量分析；c是对结果a中肿瘤组织进行切片染色后的激光共聚焦图片。
具体实施方式
以下通过非限定性实例进一步详细说明本发明。
实施例1：一种可实现肿瘤靶向递送核酸药物的多级递送纳米粒子的制备方法。
附图1显示出了本发明多级递送纳米粒子的制备以及应用示意图，本发明方法制备的多级递送纳米粒子为粒径为150±30nm且均匀分布的核壳结构球状颗粒。所述纳米粒子首先由苯硼酸修饰的低分子量的聚乙烯亚胺与核酸形成的正电性纳米复合物内核，再与环境响应性阴离子聚合物壳层通过静电自组装形成。参见附图1，一种可实现肿瘤靶向递送核酸药物的多级递送纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
1)使用2-溴乙基苯硼酸修饰低分子量聚乙烯亚胺(PEI-PBA)
首先向圆底烧瓶中加入1.80g聚乙烯亚胺(MW：1800)并加入15mL甲醇充分溶解，然后加入0.42g 2-溴乙基苯硼酸，60℃下搅拌回流12小时，反应结束后冷却至室温，用冰乙醚沉淀两次，干燥后得PEI-PBA。
2)环境响应性阴离子聚合物的合成
2.1)称取N-苄氧羰基-L-赖氨酸5.35g(18.4mmol)，加入250mL圆底烧瓶中，同时加入重蒸四氢呋喃100mL，然后缓慢加入溶有8.5g(27.6mmol)三光气的四氢呋喃溶液，在60℃油浴搅拌条件下反应2h，待反应澄清之后，用氩气除去烧瓶中的残余三光气。浓缩反应液，快速加入预先准备好的过量正己烷中，沉淀，放入冰箱过夜。抽滤。得到淡黄色固体，加入适量乙酸乙酯正己烷溶液(v:v＝1:1)加热溶解至微沸，趁热过滤去不溶物，得到饱和的N-苄氧羰基-L-赖氨酸酐(Lys(Z)-NCA)溶液，静置析出结晶，冰箱过夜。重复上述重结晶过程。抽滤，得到白色固体Lys(Z)-NCA。
2.2)将Lys(Z)-NCA(0.98g,3.2mmol)溶解在30mL无水DMF中，通过加入单氨基封端的聚乙二醇(MW:5000，2.0g，0.4mmol)作为引发剂进行聚合。将反应混合物在35℃下通入干燥氩气下搅拌48小时。然后减压蒸发溶剂。将所得产物溶于15mL CHCl3中，然后沉淀在过量的乙醚中，得到PEG-b-PLys(Z)。在0℃下，通过将HBr(33wt％在HOAc中，2mL)加入到PEG-b-PLys(Z)(2.0g)的20mL的CF3COOH溶液中，进行PEG-b-PLys(Z)中的苄氧羰基的脱保护反应。反应1h之后，将反应混合物沉淀在过量的冰乙醚中。将沉淀重新溶解在DMF中，通过220nm微孔过滤器过滤纯化。滤液在过量的乙醚中沉淀以除去残留的CF3COOH，并得到单甲氧基聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物(mPEG113-b-PLys100)。然后将产物在室温下真空干燥。
2.3)将mPEG113-b-PLys100(100mg)溶解在10mL pH＝8.0的50mM的碳酸氢钠缓冲溶液中，然后加入211.2mg 2,3-二甲基马来酸酐(DMMA)反应，在整个反应过程中不断滴加0.2N的氢氧化钠溶液使整个反应体系的pH保持在8.0。反应结束后，使用透析袋(截留分子量：3500Da)将未反应的DMMA除去，然后冻干透析液得到环境响应性阴离子聚合物(mPEG113-b-PLys100/DMMA)。
同时用丁二酸酐(SA)替代DMMA按照同样的方法得到不具有环境响应性的阴离子聚合物mPEG113-b-PLys100/SA作为对照。
3)多级递送纳米粒子的制备
在室温下，将步骤1)得到的PEI-PBA(0.5mL,1mg/mL)和质粒DNA(0.5mL，500μg/mL)混合并孵化15min形成高正电性的纳米复合物PEI-PBA/pDNA。随后通过静电相互作用将步骤2)得到的环境响应性阴离子聚合物mPEG113-b-PLys100/DMMA(1mL，4mg/mL)引入正电性的纳米复合物表面，进一步孵化15min以形成多级递送纳米粒子。
在室温下，将步骤1)得到的PEI-PBA(0.5mL,1mg/mL)和质粒DNA(0.5mL，500μg/mL)混合并孵化15min形成高正电性的纳米复合物PEI-PBA/pDNA。随后通过静电相互作用将步骤2)得到的环境响应性阴离子聚合物mPEG113-b-PLys100/SA(1mL，4mg/mL)引入正电性的纳米复合物表面，进一步孵化15min以形成单级递送纳米粒子作为对照。
实施例2：一种可实现肿瘤靶向递送核酸药物的多级递送纳米粒子的制备方法。
附图1显示出了本发明多级递送纳米粒子的制备以及应用示意图，本发明方法制备的多级递送纳米粒子为粒径为150±30nm且均匀分布的核壳结构球状颗粒。所述纳米粒子首先由苯硼酸修饰的低分子量的聚乙烯亚胺与核酸形成的正电性纳米复合物内核，再与环境响应性阴离子聚合物壳层通过静电自组装形成。参见附图1，一种可实现肿瘤靶向递送核酸药物的多级递送纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
1)使用2-溴乙基苯硼酸修饰低分子量聚乙烯亚胺(PEI-PBA)
首先向圆底烧瓶中加入1.80g聚乙烯亚胺(MW：1800)并加入15mL甲醇充分溶解，然后加入0.42g 2-溴乙基苯硼酸，70℃下搅拌回流24小时，反应结束后冷却至室温，用冰乙醚沉淀两次，干燥后得PEI-PBA。
2)环境响应性阴离子聚合物的合成
2.1)称取N-苄氧羰基-L-赖氨酸5.35g(18.4mmol)，加入250mL圆底烧瓶中，同时加入重蒸四氢呋喃100mL，然后缓慢加入溶有8.5g(27.6mmol)三光气的四氢呋喃溶液，在70℃油浴搅拌条件下反应4h，待反应澄清之后，用氩气除去烧瓶中的残余三光气。浓缩反应液，快速加入预先准备好的过量正己烷中，沉淀，放入冰箱过夜。抽滤。得到淡黄色固体，加入适量乙酸乙酯正己烷溶液(v:v＝1:1)加热溶解至微沸，趁热过滤去不溶物，得到饱和的N-苄氧羰基-L-赖氨酸酐(Lys(Z)-NCA)溶液，静置析出结晶，冰箱过夜。重复上述重结晶过程。抽滤，得到白色固体Lys(Z)-NCA。
2.2)将Lys(Z)-NCA(0.98g,3.2mmol)溶解在30mL无水DMF中，通过加入单氨基封端的聚乙二醇(MW:5000，2.0g，0.4mmol)作为引发剂进行聚合。将反应混合物在40℃下通入干燥氩气下搅拌72小时。然后减压蒸发溶剂。将所得产物溶于15mL CHCl3中，然后沉淀在过量的乙醚中，得到PEG-b-PLys(Z)。在4℃下，通过将HBr(33wt％在HOAc中，2mL)加入到PEG-b-PLys(Z)(2.0g)的20mL的CF3COOH溶液中，进行PEG-b-PLys(Z)中的苄氧羰基的脱保护反应。反应2h之后，将反应混合物沉淀在过量的冰乙醚中。将沉淀重新溶解在DMF中，通过220nm微孔过滤器过滤纯化。滤液在过量的乙醚中沉淀以除去残留的CF3COOH，并得到单甲氧基聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物(mPEG113-b-PLys100)。然后将产物在室温下真空干燥。
2.3)将mPEG113-b-PLys100(100mg)溶解在10mL pH＝9.0的50mM的碳酸氢钠缓冲溶液中，然后加入211.2mg 2,3-二甲基马来酸酐(DMMA)反应，在整个反应过程中不断滴加0.2N的氢氧化钠溶液使整个反应体系的pH保持在9.0。反应结束后，使用透析袋(截留分子量：3500Da)将未反应的DMMA除去，然后冻干透析液得到环境响应性阴离子聚合物(mPEG113-b-PLys100/DMMA)。
同时用丁二酸酐(SA)替代DMMA按照同样的方法得到不具有环境响应性的阴离子聚合物mPEG113-b-PLys100/SA作为对照。
3)多级递送纳米粒子的制备
在室温下，将步骤1)得到的PEI-PBA(0.5mL,1mg/mL)和质粒DNA(0.5mL，250μg/mL)混合并孵化15min形成高正电性的纳米复合物PEI-PBA/pDNA。随后通过静电相互作用将步骤2)得到的环境响应性阴离子聚合物mPEG113-b-PLys100/DMMA(0.5mL，1mg/mL)引入正电性的纳米复合物表面，进一步孵化15min以形成多级递送纳米粒子。
在室温下，将步骤1)得到的PEI-PBA(0.5mL,1mg/mL)和质粒DNA(0.5mL，250μg/mL)混合并孵化15min形成高正电性的纳米复合物PEI-PBA/pDNA。随后通过静电相互作用将步骤2)得到的环境响应性阴离子聚合物mPEG113-b-PLys100/SA(0.5mL，1mg/mL)引入正电性的纳米复合物表面，进一步孵化15min以形成单级递送纳米粒子作为对照。
实施例3：一种可实现肿瘤靶向递送核酸药物的多级递送纳米粒子的制备方法。
附图1显示出了本发明多级递送纳米粒子的制备以及应用示意图，本发明方法制备的多级递送纳米粒子为粒径为150±30nm且均匀分布的核壳结构球状颗粒。所述纳米粒子首先由苯硼酸修饰的低分子量的聚乙烯亚胺与核酸形成的正电性纳米复合物内核，再与环境响应性阴离子聚合物壳层通过静电自组装形成。参见附图1，一种可实现肿瘤靶向递送核酸药物的多级递送纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
1)使用2-溴乙基苯硼酸修饰低分子量聚乙烯亚胺(PEI-PBA)
首先向圆底烧瓶中加入1.80g聚乙烯亚胺(MW：1800)并加入15mL甲醇充分溶解，然后加入0.42g 2-溴乙基苯硼酸，65℃下搅拌回流18小时，反应结束后冷却至室温，用冰乙醚沉淀两次，干燥后得PEI-PBA。
2)环境响应性阴离子聚合物的合成
2.1)称取N-苄氧羰基-L-赖氨酸5.35g(18.4mmol)，加入250mL圆底烧瓶中，同时加入重蒸四氢呋喃100mL，然后缓慢加入溶有8.5g(27.6mmol)三光气的四氢呋喃溶液，在65℃油浴搅拌条件下反应3h，待反应澄清之后，用氩气除去烧瓶中的残余三光气。浓缩反应液，快速加入预先准备好的过量正己烷中，沉淀，放入冰箱过夜。抽滤。得到淡黄色固体，加入适量乙酸乙酯正己烷溶液(v:v＝1:1)加热溶解至微沸，趁热过滤去不溶物，得到饱和的N-苄氧羰基-L-赖氨酸酐(Lys(Z)-NCA)溶液，静置析出结晶，冰箱过夜。重复上述重结晶过程。抽滤，得到白色固体Lys(Z)-NCA。
2.2)将Lys(Z)-NCA(0.98g,3.2mmol)溶解在30mL无水DMF中，通过加入单氨基封端的聚乙二醇(MW:5000，2.0g，0.4mmol)作为引发剂进行聚合。将反应混合物在38℃下通入干燥氩气下搅拌60h。然后减压蒸发溶剂。将所得产物溶于15mL CHCl3中，然后沉淀在过量的乙醚中，得到PEG-b-PLys(Z)。在2℃下，通过将HBr(33wt％在HOAc中，2mL)加入到PEG-b-PLys(Z)(2.0g)的20mL的CF3COOH溶液中，进行PEG-b-PLys(Z)中的苄氧羰基的脱保护反应。反应1.5h之后，将反应混合物沉淀在过量的冰乙醚中。将沉淀重新溶解在DMF中，通过220nm微孔过滤器过滤纯化。滤液在过量的乙醚中沉淀以除去残留的CF3COOH，并得到单甲氧基聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物(mPEG113-b-PLys100)。然后将产物在室温下真空干燥。
2.3)将mPEG113-b-PLys100(100mg)溶解在10mL pH＝8.5的50mM的碳酸氢钠缓冲溶液中，然后加入211.2mg 2,3-二甲基马来酸酐(DMMA)反应，在整个反应过程中不断滴加0.2N的氢氧化钠溶液使整个反应体系的pH保持在8.5。反应结束后，使用透析袋(截留分子量：3500Da)将未反应的DMMA除去，然后冻干透析液得到环境响应性阴离子聚合物(mPEG113-b-PLys100/DMMA)。
同时用丁二酸酐(SA)替代DMMA按照同样的方法得到不具有环境响应性的阴离子聚合物mPEG113-b-PLys100/SA作为对照。
3)多级递送纳米粒子的制备
在室温下，将步骤1)得到的PEI-PBA(0.5mL,1mg/mL)和质粒DNA(0.5mL，250μg/mL)混合并孵化15min形成高正电性的纳米复合物PEI-PBA/pDNA。随后通过静电相互作用将步骤2)得到的环境响应性阴离子聚合物mPEG113-b-PLys100/DMMA(1mL，1mg/mL)引入正电性的纳米复合物表面，进一步孵化15min以形成多级递送纳米粒子。
在室温下，将步骤1)得到的PEI-PBA(0.5mL,1mg/mL)和质粒DNA(0.5mL，250μg/mL)混合并孵化15min形成高正电性的纳米复合物PEI-PBA/pDNA。随后通过静电相互作用将步骤2)得到的环境响应性阴离子聚合物mPEG113-b-PLys100/SA(1mL，1mg/mL)引入正电性的纳米复合物表面，进一步孵化15min以形成单级递送纳米粒子作为对照。
实施例4：观察多级递送纳米粒子在抗蛋白吸附方面的应用。
首先，我们将上述实施例制备的多级递送纳米粒子与牛血清白蛋白(2mg/mL)溶液等体积混合，并在37℃下孵育120分钟。孵育结束后，使用超滤离心管(截留分子量：300kDa)除去未吸附在多级递送纳米粒子上的游离牛血清蛋白，随后使用BCA蛋白定量试剂盒测定流出液中的牛血清蛋白含量，牛血清蛋白总量与流出液中蛋白含量的差值即为多级投递纳米粒子非特异性吸附牛血清蛋白的含量。等量的磷酸盐缓冲液、没有引入环境响应性阴离子聚合物的PEI-PBA/pDNA正电性复合物作为对照组。
实验结果如图2a所示：与PEI-PBA/pDNA复合物相比，多级递送纳米粒子对蛋白非特异性吸附量显著降低，这和纳米粒子的表面具有PEG壳层是符合的。
实施例5：观察多级递送纳米粒子针对不同微环境呈现不同表面性质方面的应用
使用实施例1制备多级递送纳米粒子和单级递送纳米粒子，在不同时间节点取样，使用zeta电位分析仪测定纳米粒子表面电位变化。待纳米粒子表面电位稳定后，使用稀盐酸将缓冲体系的pH下调至pH＝7.4，在不同时间节点取样，使用zeta电位分析仪测定纳米粒子表面电位变化。待纳米粒子表面电位稳定后，进一步将体系pH下调到6.5，继续在不同时间节点取样测定纳米粒子表面的zeta电位，直至其表面电位不在变化。同时使用荧光共振能量转移法研究纳米粒子表面环境响应性阴离子聚合物针对不同微环境的响应性。首先，分别用荧光探针Cy3和Cy5标记PEI-PBA和mPEG113-b-PLys100/DMMA(mPEG113-b-PLys100/SA)，然后使用荧光标记聚合物材料按照实施例1制备多级递送纳米粒子和单级递送纳米粒子。将荧光标记的纳米粒子分别溶解于pH＝7.4和pH＝6.5的PBS缓冲液中并在37℃条件下孵育2小时，然后使用515nm的激发光激发同时记录荧光发射光谱。
实验结果如图2b、c、d所示，多级递送纳米粒子同对照组相比，在肿瘤微环境下(pH＝6.5)能够快速的脱除表面的环境响应性阴离子聚合物，并暴露出高正电性的PEI-PBA/pDNA内核。
实施例6：观察多级递送纳米粒子在微酸性环境下促进细胞对核酸药物摄取方面的应用
首先，我们将MDA-MB-231细胞均匀的分到24孔板中，并在37℃、5％CO2环境中培养24小时。然后使用不同pH的培养基替换原来的培养基，随后将YOYO-1荧光染料(绿色)标记的多级递送纳米粒子加入到含有不同pH培养基的细胞中培养2小时，随后用PBS洗涤三遍，并使用4％多聚甲醛固定细胞。待细胞固定后，进一步使用DAPI(蓝色)和罗丹明标记的鬼笔环肽(红色)染色细胞核和细胞骨架蛋白并使用激光共聚焦显微镜观察。上述处理后的细胞经过胰蛋白酶消化、离心收集，随后使用流式细胞术可进行荧光定量分析。上述实验中，加入等量的单级递送纳米粒子作为对照。
实验结果如图3所示：多级递送纳米粒子同对照组相比，在肿瘤微环境下(pH＝6.5)能够更有效被肿瘤细胞摄取，这主要是因为在肿瘤微环境下，多级递送纳米粒子能够脱除表面的环境响应性阴离子聚合物，从而暴露出正电性的内核。
实施例7：观察多级递送纳米粒子在体外环境下促进核酸药物调控肿瘤细胞基因表达方面的应用
近期研究表明在多种肿瘤细胞中miR-524基因的表达受到抑制，上调miR-524基因的表达可以有效地抑制癌细胞的增殖和迁移，所以我们选择将miR-524作为靶基因并设计了相应的CRISPR/dCas9系统(质粒DNA,CRISPR/dCas9-miR-524)作为模型。为了研究多级递送纳米粒子在体外细胞中对miR-524基因表达的调控，我们首先将MDA-MB-231和LN-229细胞均匀的分到6孔板中，并在37℃、5％CO2环境中孵育24小时。24小时后，使用不同pH的培养基替换原来的培养基，随后加入多级递送纳米粒子，4小时后，重新换上新培养基并继续培养48小时。培养结束后，分别提取孔板中的RNA和蛋白质，使用定量即时聚合酶链锁反应技术和蛋白印迹技术分别分析相关RNA和蛋白质的表达。
在同样条件下，用CCK-8细胞凋亡测试法观察在不同pH条件下加入多级递送纳米粒子后24h、48h、72h后肿瘤细胞的成活情况，等量的PBS缓冲液、单级递送纳米粒、负载空载体的多级递送纳米粒子作为对比。
实验结果如图4所示：包载了CRISPR/dCas9-miR-524质粒DNA的多级递送纳米粒子同对照组相比，在肿瘤微酸性环境下(pH＝6.5)能够更有效的调节肿瘤细胞内的miR-524基因的表达，并且进一步对肿瘤细胞进行有效杀伤。
实施例8：观察多级递送纳米粒子在肿瘤部位富集方面的应用
首先，我们使用TOTO-3(红色)标记质粒DNA，并按实施例1制备多级递送纳米粒子和单级递送纳米粒子。随后，我们以在小鼠皮下注射肿瘤细胞的方式建立了小鼠皮下肿瘤模型，当肿瘤体积达到约300mm3时，将多级递送纳米粒子和单级纳米粒子按照500ug/Kg(CRISPR/dCas9-miR-524质粒DNA)的剂量注射到小鼠尾静脉，同时注射单级递送纳米粒子和PEI25K/质粒DNA复合物作为对照组。在注射结束后1h，6h，24h分别将小鼠处死，将其脏器取出并使用小动物活体成像仪分析质粒DNA在各个脏器中的富集状况，并使用软件定量分析了肿瘤处的荧光强度。最后，取小鼠肿瘤组织进行切片并进行荧光分析。
实验结果如图5所示：包载了荧光探针标记的CRISPR/dCas9-miR-524质粒DNA的多级递送纳米粒子同对照组相比，能够更快更高效的富集在肿瘤部位。

Claims (2)

1.一种可实现肿瘤靶向投递核酸药物的多级递送纳米粒子的制备方法，其特征包括如下步骤：
1)苯硼酸修饰的低分子量聚乙烯亚胺(PEI-PBA)的合成，
首先向容器中加入聚乙烯亚胺并加入甲醇充分溶解，然后加入2-溴乙基苯硼酸，所述聚乙烯亚胺与2-溴乙基苯硼酸的用量摩尔比为1:3；60℃-70℃下搅拌回流12-24小时，反应结束后冷却至室温，用冰乙醚沉淀，干燥后得淡黄色固体产物即为PEI-PBA；
2)环境响应性阴离子聚合物的合成，
2.1)将N-苄氧羰基-L-赖氨酸加入到容器中，同时加入重蒸四氢呋喃充分溶解，然后缓慢加入溶有三光气的四氢呋喃溶液，所述N-苄氧羰基-L-赖氨酸与三光气的用量摩尔比为1:1.5；60-70℃油浴搅拌条件下反应2-4h，待反应澄清之后，用氩气除去容器中的残余三光气；浓缩反应液，快速加入预先准备好的过量正己烷中，沉淀，放入冰箱过夜，抽滤，得到淡黄色固体，加入体积比为1:1的乙酸乙酯/正己烷溶液，加热溶解至微沸，趁热过滤去除不溶物，得到饱和的N-苄氧羰基-L-赖氨酸酐(Lys(Z)-NCA)溶液，静置析出结晶，冰箱过夜；重复上述重结晶过程，抽滤，得到Lys(Z)-NCA；
2.2)将步骤2.1)得到的Lys(Z)-NCA溶解在无水DMF中，通过加入单氨基封端的聚乙二醇(PEG-NH2)作为引发剂进行聚合，Lys(Z)-NCA与PEG-NH2的用量摩尔比为150：1；将反应混合物在30-40℃下通入干燥氩气下搅拌48-72小时；然后减压蒸发溶剂，将所得产物溶于CHCl3中，然后沉淀在过量的乙醚中，得到PEG-b-PLys(Z)；在0-4℃下，通过将HBr加入到PEG-b-PLys(Z)的CF3COOH溶液中，进行PEG-b-PLys(Z)中的苄氧羰基的脱保护反应；反应1-3h之后，将反应混合物沉淀在过量的冰乙醚中；将沉淀重新溶解在DMF中，通过220nm微孔过滤器过滤纯化；滤液在过量的乙醚中沉淀以除去残留的CF3COOH，并得到单甲氧基聚乙二醇-聚赖氨酸嵌段聚合物(mPEG113-b-PLys100)；然后将产物在室温下真空干燥；
2.3)将步骤2.2)得到的mPEG113-b-PLys100溶解在pH＝8.0-9.0的碳酸氢钠缓冲溶液中，然后加入2,3-二甲基马来酸酐(DMMA)反应，mPEG113-b-PLys100与DMMA的用量摩尔比为1：500；在整个反应过程中不断滴加0.2N的氢氧化钠溶液使整个反应体系的pH保持在8.0-9.0；反应结束后，使用透析袋将未反应的DMMA除去，然后冻干透析液得到环境响应性阴离子聚合物mPEG113-b-PLys100/DMMA；
3)多级递送纳米粒子的制备
在室温下，将步骤1)得到的PEI-PBA和质粒DNA等体积混合并孵化15min形成高正电性的纳米复合物PEI-PBA/pDNA，PEI-PBA和质粒DNA的质量比为2:1-6:1；随后通过静电相互作用将步骤2)得到的环境响应性阴离子聚合物mPEG113-b-PLys100/DMMA引入正电性的纳米复合物表面，进一步孵化15min以形成多级递送纳米粒子，mPEG113-b-PLys100/DMMA与质粒DNA的质量比为4:1-16:1。
2.权利要求1所述方法制备的可实现肿瘤靶向投递核酸药物的多级递送纳米粒子在制备以下应用产品中的用途，其特征是所述应用产品包括以下几个方面：
1)在抗蛋白吸附方面的应用产品；
2)在随微环境变化呈现不同表面方面的应用产品；
3)在微酸性环境下细胞对多级递送纳米粒子摄取方面的应用产品；
4)观察多级递送纳米粒子在肿瘤部位富集方面的应用产品。
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