CN110840839A - 一种联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束及制备方法和应用。所述多功能聚合物胶束为三层结构,内核为用于负载光敏剂的疏水聚己内酯,中间层为可与基因编辑体系偶联的配体NTA,外层为iRGD‑聚乙二醇‑聚天冬氨酰(丁二氨)正电聚合物,同时外层可与中间层通过静电作用结合。所述多功能聚合物作为载体,负载光敏剂和基因编辑体系后,由于具有靶向性,可高效进入肿瘤细胞,然后胶束和基因编辑体系在溶酶体酸性环境中解离,经激光照射后,光敏剂实现光动力治疗,而基因编辑体系敲除Nrf2的表达基因,阻断了Nrf2的表达,促进肿瘤细胞的凋亡;光敏剂和基因编辑体系共同发挥作用,同时进行光动力治疗和基因治疗,极大地增强了抗肿瘤效果。
Description
技术领域
本发明涉及高分子化学与生物医学工程技术领域,更具体地,涉及一种联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤的治疗手段越来越多,有化疗、放疗、光动力治疗、光热治疗和免疫治疗等。无论哪种治疗手段都会有一定的治疗效果,但是随着治疗的进行,会激活肿瘤本身抵抗治疗的机制,造成相关基因表达上调或抑制,进而降低了抗肿瘤的治疗效果。因此需要多药联合治疗,多模式调控多个基因的表达。尤其需要单一剂型多靶点联合治疗药物(一个载体同时输送多种药物,针对多个靶点),不但可提高多药协同能力,也提高了患者的顺应性。但是,同时输送多种药物(尤其是化学性质不同的药物)也加大了药物载体设计和制备难度,阻碍了单一剂型多药联合治疗策略的发展和临床应用。
因此,迫切需要采用新技术发展新的联合治疗策略。2013年、2015年和2017年三次被SCIENCE杂志评为十大科技突破之一的CRISPR基因编辑技术具有很强的基因调控能力,该系统由Cas蛋白或dCas蛋白(失去剪切核酸活性的Cas蛋白,但仍保留结合核酸的能力)和gRNA组成,可同时对多个基因进行多种模式的调控(修改DNA,增强或抑制基因表达),适于制备单一剂型多靶点药物。但是,仍需解决安全高效Cas/gRNA传输载体缺乏的问题,这是制约CRISPR/Cas基因编辑技术临床转化的关键科学问题之一。
近年来发展了多种非病毒载体的输送体系用于输送CRISPR/Cas9基因编辑体系,有输送DNA质粒、mRNA或直接输送Cas9蛋白和gRNA。而直接输送Cas蛋白/gRNA是最有优势、最有前景的方向,不仅可避免了Cas9蛋白和gRNA体内多步加工所导致的基因编辑效率低的问题,也易于调控Cas蛋白和gRNA的体内作用时间和剂量,具有易调控、基因编辑效率高和脱靶率低的优点。但是输送Cas9蛋白/gRNA具有较高的难度,需要在不破坏Cas9蛋白活性的条件下高效的输送Cas9蛋白/gRNA,并且在细胞内能有效的释放出Cas9蛋白/gRNA。
近几年,光动力治疗成为了肿瘤治疗的研究热点。利用光激发光敏剂产生活性氧杀死肿瘤细胞,创伤小、副作用小、恢复快。但是传统的光动力治疗需要消耗肿瘤组织的氧气,而肿瘤组织本身就是乏氧环境,所以伴随着光动力治疗的进行,Nrf2(Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2)会受细胞缺氧诱导过表达,抑制肿瘤细胞凋亡,还会促进VEGF表达,促进肿瘤生长,从而抑制治疗效果。如果在进行光动力治疗的同时,用基因编辑技术敲除Nrf2的基因,抑制Nrf2的表达,就可以促进抗肿瘤治疗的效果。
因此,有必要开发一种能够用于肿瘤光动力治疗和基因编辑的一体化载体。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束。本发明所述多功能聚合物作为载体,负载光敏剂和基因编辑体系后,进入体内,由于具有靶向性,可高效进入肿瘤细胞,进入肿瘤细胞后,胶束和基因编辑体系在溶酶体酸性环境中解离,在肿瘤部位经激光照射后,胶束中负载的光敏剂在细胞内将氧气转化成单线态氧,实现光动力治疗并且使溶酶体膜破裂,基因编辑体系释放到胞质,进而进入细胞核进行基因编辑,敲除Nrf2的表达基因,阻断了Nrf2的表达,促进肿瘤细胞的凋亡;光敏剂和基因编辑体系共同发挥作用,同时进行光动力治疗和基因治疗,避免了由于光动力治疗而导致的肿瘤治疗效果降低的情况,极大地增强了抗肿瘤效果。
本发明的第二目的在于提供所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束的制备方法。
本发明的第三目的在于提供所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束的应用。
本发明的第四目的在于提供一种联合输送光敏剂和基因编辑体系的载药聚合物胶束。
本发明的第五目的在于提供所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的载药聚合物胶束的制备方法。
本发明的第六目的在于提供所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的载药聚合物胶束的应用。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的:
一种联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束,所述多功能聚合物胶束为三层结构,内核为用于负载光敏剂的疏水聚己内酯,中间层为可与基因编辑体系偶联的配体NTA,外层为iRGD-聚乙二醇-聚天冬氨酰(丁二氨)正电聚合物(iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac正电聚合物),同时外层可与中间层通过静电作用结合。
优选地,所述配体NTA为可与含有组氨酸标签多肽偶联;所述基因编辑体系可敲除Nrf2(Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2)基因;所述光敏剂为疏水性光敏剂。
本发明提供的多功能聚合物胶束为三层结构,其内核可负载疏水性光敏剂,因此内核为疏水的聚己内酯,中间层可与基因编辑体系偶联连接,形成一层复合物;外层为iRGD-聚乙二醇-聚天冬氨酰(丁二氨)正电聚合物,是带有iRGD的PEG和正电嵌段的聚合物,其中的iRGD具有靶向作用,同时外层还可以与中间层通过静电作用结合。
此外,本发明所述多功能聚合物作为载体,负载光敏剂和基因编辑体系后,进入体内,由于具有靶向性,可高效进入肿瘤细胞,进入肿瘤细胞后,胶束和基因编辑体系在溶酶体酸性环境中解离,在肿瘤部位经激光照射后,胶束中负载的光敏剂在细胞内将氧气转化成单线态氧,实现光动力治疗并且使溶酶体膜破裂,基因编辑体系释放到胞质,进而进入细胞核进行基因编辑,敲除Nrf2的表达基因,阻断了Nrf2的表达,促进肿瘤细胞的凋亡;光敏剂和基因编辑体系共同发挥作用,同时进行光动力治疗和基因治疗,避免了由于光动力治疗而导致的肿瘤治疗效果降低的情况,极大地增强了抗肿瘤效果。
本发明同时还保护所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束的制备方法,经如下步骤制备得到:
S1.将NTA经巯基修饰,得到NTA-SH;
S2.以ε-己内酯和烯丙基聚乙二醇为原料,在催化剂辛酸亚锡和无水无氧条件下经聚合反应制得两嵌段共聚物APEG-PCL;
S3.以步骤S2的APEG-PCL和NTA-SH为原料,加入AIBN,加热反应,制得NTA-PEG-PCL;
S4.以APEG-NH2和BLA-NCA为原料,经开环聚合得到两嵌段聚合物APEG-PBLA;
S5.以APEG-PBLA和乙酰氯为原料,加入三乙胺,制得APEG-PBLA-Ac;
S6.以APEG-PBLA-Ac和N-叔丁氧羰基-1,2-丁二胺为原料,制得APEG-PAsp(DAB-boc)-Ac;
S7.以APEG-PAsp(DAB-boc)-Ac、巯基乙胺盐酸盐和偶氮二异丁腈为原料,制得NH2-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac;
S8.以NH2-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac、3-马来酰亚胺丙酸琥珀酰亚胺酯和三乙胺为原料,制得Mal-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac;
S9.以Mal-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac和iRGD-SH多肽为原料,制得iRGD-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac;
S10.以iRGD-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac为原料,在三氟乙酸溶液中反应,制得iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac;
S11.将步骤S3的嵌段聚合物NTA-PEG-PCL混溶于THF、DMF或DMSO中,然后加入二价镍盐溶液,透析,超滤浓缩;然后和步骤S10制备的iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac聚合物溶液混合、静置,即可制备得到所述多功能聚合物胶束。
优选地,步骤S2中,所述反应在惰性气体分为中进行,反应的温度为90~120℃;所述ε-己内酯和烯丙基聚乙二醇的反应摩尔比为3~5:1;所述ε-己内酯和叠氮聚乙二醇羟基的反应摩尔比为3~5:1。
优选地,步骤S3中,所述反应在无氧条件下进行,先冻融,然后加热至65~75℃反应12~24h。
优选地,步骤S4中,所述反应在无水无氧条件下进行,反应温度为25~40℃,反应时间为24~48h。
优选地,步骤S5中,所述反应在无水条件下进行,反应温度为25~40℃,反应时间为24~48h,所述APEG-PBLA和乙酰氯的反应摩尔比为1:10~30。
优选地,步骤S6中,所述反应温度为25~40℃,所述APEG-PBLA-Ac和N-叔丁氧羰基-1,2-丁二胺的反应摩尔比为1:10~50。
优选地,步骤S7中,所述反应温度为65~80℃,所述APEG-PAsp(DAB-boc)-Ac、巯基乙胺盐酸盐和偶氮二异丁腈的反应摩尔比为1:10~30:2~6。
优选地,步骤S8中,所述反应温度为25~40℃,所述NH2-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac、3-马来酰亚胺丙酸琥珀酰亚胺酯和三乙胺的反应摩尔比为1:10~50:1~2。
优选地,步骤S9中,所述反应温度为25~40℃,所述Mal-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac和iRGD-SH多肽的反应摩尔比为1:2~6。
优选地,步骤S10中,所述反应温度为25~40℃,反应时间为2~12h。
所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束的应用也在本发明的保护范围之类,所述多功能聚合物胶束作为载体,同时负载光敏剂和基因编辑体系。
优选地,所述光敏剂为疏水性光敏剂;优选地,为二氢卟吩e6、啉或酞菁;所述基因编辑体系为Cas9/sgRNA。
本发明还保护一种联合输送光敏剂和基因编辑体系的载药聚合物胶束,由上述所述多功能聚合物胶束,其内核负载二氢卟吩e6、啉或酞菁中的一种或多种光敏剂;中间层的配体NTA与Cas9/sgRNA偶联;所述sgRNA靶标Nrf2基因的sgRNA。
所述载药聚合物胶束靶向进入肿瘤细胞后,在iRGD多肽的作用下靶向到实体瘤组织,进入肿瘤细胞,然后胶束和Cas9/sgRNA复合物在溶酶体酸性环境中解离,在肿瘤部位用660nm的激光照射,包有胶束负载的光敏剂Ce6在细胞内将氧气转化成单线态氧,实现光动力治疗并且使溶酶体膜破裂,Cas9/sgRNA复合物释放到胞质,进而进入细胞核进行基因编辑,敲除Nrf2的表达基因,阻断了Nrf2的表达,促进肿瘤细胞的凋亡,极大地增强了抗肿瘤效果。
优选地,当光敏剂为二氢卟吩e6,基因编辑体系为Cas9/sgRNA时,则载药聚合物胶束为联合输送二氢卟吩e6和Cas9/sgRNA的载药聚合物胶束。
所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的载药聚合物胶束的制备方法同样在本发明的保护范围之内,具体过程为:经上述制备方法制备得到NTA-PEG-PCL和iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac后,先将NTA-PEG-PCL和光敏剂混溶于THF、DMF或DMSO中,然后加入二价镍盐溶液,透析,超滤浓缩,制得NTA@光敏剂胶束溶液;
然后将NTA@光敏剂胶束溶液和Cas9/sgRNA复合物溶液混合,超滤,制得Cas9/sgRNA-NTA@光敏剂胶束溶液;
最后,将Cas9/sgRNA-NTA@光敏剂胶束溶液和iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac聚合物溶液混合、静置,即可得到所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的载药聚合物胶束。
优选地,所述聚合物NTA-PEG-PCL和光敏剂的质量比为10:0.5~1.5。
优选地,所述NTA@光敏剂胶束和Cas9/sgRNA复合物混合的质量比为10:1~2,超滤使用截留分子量30K~100K的超滤管。
优选地,所述Cas9/sgRNA-NTA@光敏剂胶束和iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac聚合物混合的质量比为30:1~5。
优选地,所述载药聚合物胶束中,Cas9/sgRNA占聚合物胶束质量的11.0~13.0%。
优选地,所述载药聚合物胶束中,光敏剂的负载量为1%~10%。
所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的载药聚合物胶束在制备抗肿瘤药物中的应用也在本发明的保护范围之类。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供的多功能聚合物胶束为三层结构,其内核可负载化疗药物,中间层可与基因编辑体系偶联连接,形成一层复合物;外层是iRGD-聚乙二醇-聚天冬氨酰(丁二氨)正电聚合物(iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac正电聚合物,为带有iRGD的PEG和正电嵌段的聚合物,其中的iRGD具有靶向作用),同时外层还可以与中间层通过静电作用结合。
本发明所述多功能聚合物作为载体,负载光敏剂和基因编辑体系后,由于具有靶向性,可高效进入肿瘤细胞,进入肿瘤细胞后,胶束和基因编辑体系在溶酶体酸性环境中解离,在肿瘤部位经激光照射后,胶束中负载的光敏剂在细胞内将氧气转化成单线态氧,实现光动力治疗并且使溶酶体膜破裂,基因编辑体系释放到胞质,进而进入细胞核进行基因编辑,敲除Nrf2的表达基因,阻断了Nrf2的表达,促进肿瘤细胞的凋亡;光敏剂和基因编辑体系共同发挥作用,同时进行光动力治疗和基因治疗,避免了由于光动力治疗而导致的肿瘤治疗效果降低的情况,极大地增强了抗肿瘤效果。
附图说明
图1为NTA-SH的合成路线示意图。
图2为NTA-SH及其相关合成分子的核磁共振氢谱图。
图3为聚合物NTA-PEG-PCL的合成路线示意图。
图4为聚合物NTA-PEG-PCL及其相关聚合物的核磁共振氢谱图。
图5为聚合物iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac的合成路线示意图。
图6为聚合物iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac及其相关聚合物的核磁共振氢谱图。
图7为NTA@Ce6胶束对Cas9蛋白负载量的凝胶电泳图。
图8为Cas9/sgRNA-NTA@Ce6胶束复合不同比例的正电靶向聚合物iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac的水化粒径和表面电位的变化图。
图9为iRGD-Cas9/sgRNA-NTA@Ce6胶束在不同PH条件下释放Cas9蛋白后的凝胶电泳图和释放曲线图。
图10为用SOSG(单线态活性氧探针)的荧光光谱体外测试胶束产生ROS的荧光光谱图。
图11为细胞摄取纳米粒子的共聚焦图。
图12为细胞凋亡的流式图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种联合输送光敏剂和基因编辑体系的载药聚合物胶束,其中负载的光敏剂为二氢卟吩e6(Ce6),基因编辑体系为Cas9/sgRNA复合物,其聚合物胶束的合成路线过程如图1所示,包括如下步骤:
1、(1S)-N-[5-[(4-Mercaptobutanoyl)amino]-1-carboxypentyl]iminodiaceticAcid(NTA-SH)的合成
(1)(1S)-N-(5-Carbobenzyloxyamino-1-carboxypentyl)iminodiacetic Acid(Nε-Cbz-NTA)的合成:称取8.4g Nε-Cbz-Lys(30mmol),加入45mL 2M的氢氧化钠溶液溶解;再称取8.34g溴乙酸(60mmol)溶于30mL 2M的氢氧化钠溶液中,在冰浴条件下,滴加Nε-Cbz-Lys的氢氧化钠溶液;室温反应过夜,然后将反应加热到70℃反应两小时。反应完后,将反应在冰浴中冷却,加入90mL 1N的盐酸溶液,溶液析出大量白色沉淀;将沉淀抽滤收集起来,用水洗两次、抽干、真空干燥,得到12.4g产物Nε-Cbz-NTA。
(2)(1S)-N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic Acid(NTA)的合成:将6gNε-Cbz-NTA溶解在95mL甲醇和5mL水中,加入0.6g 10%Pd/C催化剂,在常压的氢气气氛中室温反应过夜。反应完后,加入100mL水到反应液中,将甲醇旋蒸除去;然后,过滤除掉催化剂,将滤液浓缩到5mL,加入200mL无水乙醇沉淀出产物,抽滤收集沉淀,真空干燥,得到2.9g产物NTA。
(3)(1S)-N-[5-[(4-Mercaptobutanoyl)amino]-1-carboxypentyl]iminodiacetic Acid(NTA-SH)的合成:称取1g NTA(3.8mmol)和1g碳酸氢钠(11.9mmol)溶解在10mL水里,再加入0.6gγ-硫代丁内酯,在氮气气氛中加热到70℃反应过夜。反应完后,将溶液冷却至室温,用醋酸将溶液PH调至3;然后将溶液旋蒸浓缩,用乙醇沉淀出产物,离心收集沉淀,用乙醇洗两次,真空干燥等到0.95g产物NTA-SH。
2、两嵌段共聚物NTA-聚乙二醇-聚己内酯(NTA-PEG-PCL)的合成
(1)APEG-PCL的合成:称取1g的APEG-OH(Mw3.4kDa,0.29mmol)加入50mL反应瓶中,70℃真空干燥2h,加入1滴辛酸亚锡Sn(Oct)2继续干燥0.5h,再加入干燥的2g(17.5mmol)己内酯和10mL无水甲苯;在N2下110℃搅拌反应18h,沉淀在过量的乙醚中,抽滤,干燥得白色粉末状产物2.8g。
(2)NTA-PEG-PCL的合成:将1g APEG-PCL(Mw9.6kDa,0.1mmol)溶于1mLDMF中,将0.36g的NTA-SH(1mmol)溶于2mL水中,再将NTA-SH的水溶液加入到APEG-PCL的DMF溶液;冻融循环2次基本除去氧气置换成N2后,加入5mg AIBN(0.03mmol)到反应溶液中,再冻融1次,密封,70℃反应12h。反应完后,将反应液转移至透析袋(MWCO:3.5kDa)中,甲醇透析1d,去离子水透析2d,冻干得0.92g白色产物NTA-PEG-PCL。
3、BLA-NCA单体的合成
(1)天门冬氨酸苄酯(BLA)的合成:准备单口瓶(500m L),添加100mL无水乙醚后,再缓慢添加10mLH2SO4(98%),边滴加边剧烈搅拌,等冷却至室温后,加入100mL苯甲醇,充分搅拌后,用旋转蒸发仪旋蒸掉乙醚。然后分三次加天冬氨酸(L-aspartic acid)共13.3g至反应瓶中;室温均匀搅拌反应24h,再加入200mL 95%乙醇,并用滴液漏斗逐滴加入50mL吡啶,边滴边剧烈搅拌;然后经冰箱冷冻过夜,抽虑后的固体,80℃下搅拌溶解后,热过滤,滤液冷藏过夜;抽虑,按上述步骤重结晶两次,冻干后得到纯净的天门冬氨酸苄酯BLA。
(2)BLA-NCA的合成:首先将500mL的两口瓶抽真空通氩气来除水除氧,然后添加4.5g的天冬氨酸苄酯中,在氩气环境中加入300mL新蒸的无水乙酸乙酯,80℃下回流30分钟;然后用恒压滴液漏斗将60mL溶有2.7g三光气的新蒸乙酸乙酯缓慢滴加入,80℃继续回流直到溶液变澄清;溶液变清后,利用冰盐浴将反应溶液快速冷却(半小时),然后用冷的饱和碳酸氢钠溶液快速洗涤三次,接着萃取液用冷的饱和氯化钠溶液快速洗涤两次,再萃取分液,最后将乙酸乙酯溶液用适量无水硫酸镁室温干燥30分钟;过滤,滤液经浓缩后,用新蒸的无水石油醚沉淀;冷冻抽滤所得白色沉淀,用乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行重结晶,最终得到白色针状晶体BLA-NCA。
4、iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac的合成
(1)APEG-PBLA的合成:首先取50mL的反应瓶加入0.6g的APEG-NH2(MW=3400,0.17mmol),在70℃油浴下抽真空干燥6h后,等冷却至室温后加入30mL无水CH2CL2搅拌溶解均匀;然后加入2mL溶有3g BLA–NCA(12.4mmol)的无水DMF溶液至上述反应瓶中,在磁力搅拌下35℃反应72h。反应完后CH2CL2溶液经浓缩后缓慢滴加至大量冷的无水乙醚中沉淀,冷冻后抽滤,干燥得到白色固体APEG-PBLA。
(2)APEG-PAsp(DAB-boc)-Ac的合成:将1g APEG-PBLA(0.056mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中,然后加入0.2mL的乙酰氯(2.8mmol),室温反应8小时;反应完后,将溶液在乙醚中沉淀,把白色固体抽滤,干燥。然后,将白色沉淀溶解在10mL DMSO中,然后加入3.7g N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺(19.6mmol),室温反应过夜。反应完后,将反应液转移至透析袋(MWCO:3.5kDa)中,甲醇透析1d,旋干等到产物APEG-PAsp(DAB-boc)-Ac。
(3)NH2-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac的合成:将0.8g APEG-PAsp(DAB-boc)-Ac(0.034mmol)溶于10mL DMF中,加入11mg AIBN(0.068mmol)和154mg 2-氨基乙基硫醇盐酸盐(1.35mmol),N2鼓泡20min除去氧气后,70℃搅拌反应24h。反应完后恢复至室温,将反应液装入透析袋中(MWCO:3.5kDa),甲醇透析除去小分子,旋干得到产物NH2-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac。
(4)Mal-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac的合成:将0.7g NH2-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac(0.03mmol)溶于10mL DMF中,加入160mg 3-马来酰亚胺丙酸琥珀酰亚胺酯(0.6mmol),再加入4.1μL三乙胺(0.03mmol),室温搅拌反应24h。反应完后,将反应液装入透析袋中(MWCO:3.5kDa),甲醇透析除去小分子,旋干得到产物Mal-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac。
(5)iRGD-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac的合成:将0.5g Mal-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac(0.021mmol)溶于5mL DMF中,加入109mg iRGD-SH多肽(0.1mmol),再加入2.9μL三乙胺(0.021mmol),室温搅拌反应24h。反应完后,将反应液装入透析袋中(MWCO:7kDa),甲醇透析除去没反应的iRGD-SH,旋干得到产物iRGD-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac。
(6)iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac的合成:将0.4g iRGD-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac(0.016mmol)溶于3mL三氟乙酸中,室温反应2h。反应完后,将反应液沉淀在乙醚中,离心收集沉淀,真空干燥。将干燥后的固体溶解在水中,将水溶液装入透析袋中(MWCO:3.5kDa),用纯水透析1d,冻干得到产物iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac。
5、制备载药胶束
将20mg NTA-PEG-PCL溶于2mL THF中,加入2mg Ce6后,超声下滴入到20mL水中,用5mM PBS(pH为7.4)的水溶液透析(MWCO:14kDa)除去有机溶剂和游离的药物,超滤浓缩至5mg/mL,得到NTA@ce6胶束;
将30μg Cas9蛋白和7.5μg sgRNA的溶液混合,37℃复合五分钟,将Cas9/sgRNA的复合物和50μL的NTA@ce6胶束溶液(5mg/mL)混合,孵育半小时,得到Cas9/sgRNA-NTA@Ce6胶束溶液;
再加入20μL iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac的水溶液(1mg/mL),得到iRGD-Cas9/sgRNA-NTA@Ce6胶束溶液。
参照上述过程,直接将NTA-PEG-PCL混溶于THF、DMF或DMSO中,然后加入二价镍盐溶液,透析,超滤浓缩,再和iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac聚合物溶液混合、静置,即制备得到未负载任何光敏剂和基因编辑体系的空白多功能聚合物胶束。
实施例2聚合物的结构分析
取实施例1各步产物约10mg溶于适量氘代溶剂,用1H-NMR 400MHz核磁共振波谱仪进行测试,检测反应前后聚合物结构上1H化学位移的变化,结果如图2、4和6所示。
从图2、图4和图6中可知,所有聚合物的结构上的氢都在核磁共振氢谱图上有很好的归属,证明聚合物的成功合成。
实施例3聚合物胶束的性能检测
1、NTA@Ce6胶束蛋白负载能力的测试
固定30μg Cas9蛋白的量,加入等摩尔量的sgRNA7.5μg,制得37.5μg的Cas9/sgRNA复合物。分别加入不同量的NTA@Ce6胶束,在四摄氏度下孵育1小时。然后用超滤管(MWCO:300kDa)超滤三次,除去没有结合上的Cas9/sgRNA,并将体积浓缩到40μL。用凝胶电泳法检测没有被超滤掉,即负载上的Cas9蛋白,并通过灰度值计算出蛋白的量。
NTA@Ce6胶束负载Cas9蛋白的凝胶电泳图如图7所示,从图7中可知,NTA@Ce6胶束加入250ug时,Cas9/sgRNA的包封率达到93.1%,而Cas9/sgRNA的负载量占Cas9/sgRNA-NTA@Ce6胶束总质量的12.3%。所以选用Cas9:sgRNA:NTA@Ce6=30μg:7.5μg:250μg,为最佳比例进行下面的实验。
2、复合不同量的iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac,对iRGD-Cas9/sgRNA-NTA@Ce6胶束的粒径和表面电位的影响
固定Cas9:sgRNA:NTA@Ce6=30μg:7.5μg:250μg的比例,加入不同量的iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac聚合物(iRGD-PPA),在25℃下选用美国Brookhaven公司的90Plus/BI-MAS仪器进行测量iRGD-Cas9/sgRNA-NTA@Ce6胶束的水化粒径和表面电位并且每组测量均平行测量5次,取平均值测量。
测得结果如图8所示,从图8中可知,iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac的量为20μg时,iRGD-Cas9/sgRNA-NTA@Ce6胶束的粒径为75.2nm,表面电位为-3.6mV,有利于胶束在体内长循环,所以选用iRGD-PPA:Cas9:sgRNA:NTA@Ce6=20μg:30μg:7.5μg:250μg为iRGD-Cas9/sgRNA-NTA@Ce6胶束的组装比例进行下面的实验。
3、Cas9/sgRNA复合物释放的性能
按iRGD-PPA:Cas9:sgRNA:NTA@Ce6=20μg:30μg:7.5μg:250μg的比例组装好iRGD-Cas9/sgRNA-NTA@Ce6胶束。按这个比例的量制备27份胶束,分成3组,每组9份,每组分别加入pH5.0、6.5、7.4的缓冲液。每组的9个样品分别放置0h、0.5h、1h、1.5h、2h、4h、8h、12h、24h,然后各超滤三次除去释放的Cas9/sgRNA,将未释放的Cas9/sgRNA通过凝胶电泳检测,并通过灰度值计算出Cas9蛋白的量。
测得结果如图9所示,从图9中可知,iRGD-Cas9/sgRNA-NTA@Ce6胶束在不同PH条件下释放Cas9/sgRNA的能力不同,当体系pH为5.0时,Cas9/sgRNA的释放量最佳,释放率在80%以上。
4、iRGD-Cas9/sgRNA-NTA@Ce6胶束体外产生单线态氧的能力检测
将iRGD-Cas9/sgRNA-NTA@Ce6胶束溶液用水稀释至Ce6浓度为1μM,加入一定量的单态氧荧光探针(SOSG)甲醇溶液使其浓度为2.5μM,用660nm的激光器,在800mW/cm2的功率密度下照射溶液,照射不同的时间,然后用荧光光谱仪,在494nm激发光的激发下,测量其在530nm左右的荧光发射峰。
测得结果如图10所示,从图10中可知,随着照射时间的增加,荧光发射峰的强调增强,说明产生单线态氧的数量增加。
5、细胞摄取实验
使用激光共聚焦显微镜系统分别拍摄鼻咽癌细胞CNE-2与胶束共孵育2h,然后用660nm,功率密度为800mW/cm2,照射30s。iRGD-Cas9/gRNA@Ce6+Laser,是负载了Ce6和FITC标记的Cas9蛋白,并且加激光照射。iRGD-Cas9/gRNA@Ce6,是负载了Ce6和FITC标记的Cas9蛋白,但不加激光照射。iRGD-Cas9/gRNA+Laser,是负载了FITC标记的Cas9蛋白,并且加激光照射。通过观察Ce6的荧光和FITC标记的Cas9的荧光在细胞内的分布情况。
测得结果如图11所示,从图中可知,胶束iRGD-Cas9/sgRNA-NTA@ce6胶束能很好被CNE-2细胞摄取,但是只有在有Ce6的条件下用激光照射产生单线态氧才能使胶束从溶酶体逃逸出来,释放出Cas9/gRNA,然后Cas9/gRNA才能入核。
6、细胞凋亡实验
使用Annexin V-FITC和PI双染色法流式细胞术检测细胞凋亡和坏死。如图12所示,图中Q1区表示坏死的细胞,Q2区表示早期凋亡细胞,Q3区表示正常细胞,Q4区表示晚期凋亡细胞。Q1、Q2与Q4细胞数之和的大小可认为是样品诱导CNE-2细胞凋亡的能力。
iRGD-Cas9/gRNA(+)@Ce6是带iRGD靶向的负载了Cas9蛋白,NRF2的sgRNAA和Ce6,细胞孵育2h后,但没有用激光照射。iRGD-Cas9/gRNA(+)+Laser是带iRGD靶向的负载了Cas9蛋白,NRF2的sgRNAA,但没有Ce6,细胞孵育2h后,用660nm,功率密度为800mW/cm2,照射30s。iRGD-Cas9/gRNA(-)@Ce6+Laser是带iRGD靶向的负载了Cas9蛋白、阴性对照的sgRNA和Ce6,细胞孵育2h后,用660nm,功率密度为800mW/cm2,照射30s。Non-iRGD-Cas9/gRNA(+)@Ce6+Laser是不带iRGD靶向的负载了Cas9蛋白,Nrf2的sgRNAA和Ce6,细胞孵育2h后,用660nm,功率密度为800mW/cm2,照射30s。iRGD-Cas9/gRNA(+)@Ce6+Laser是带iRGD靶向的负载了Cas9蛋白,Nrf2的sgRNA和Ce6,细胞孵育2h后,用660nm,功率密度为800mW/cm2,照射30s。通过流式图我们可以知道,在没有Ce6有光照或者有Ce6没有光照的条件下,载体都几乎不诱导细胞凋亡。这是因为Ce6和光照是产生单线态氧的条件,单线态氧一方面有光动力治疗的作用,一方面控制着Cas9/sgRNA的释放。在有Ce6和光照的条件下,有Nrf2的sgRNA可以诱导更多的细胞凋亡,说明了敲掉NRF2的基因可以抑制Nrf2的表达,促进细胞凋亡。有iRGD靶向也可以诱导更多的细胞凋亡,说明iRGD靶向提高了细胞对胶束的摄取。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,对于本领域的普通技术人员来说,在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束,其特征在于,所述多功能聚合物胶束为三层结构,内核为用于负载光敏剂的疏水聚己内酯,中间层为可与基因编辑体系偶联的配体NTA,外层为iRGD-聚乙二醇-聚天冬氨酰(丁二氨)正电聚合物,同时外层可与中间层通过静电作用结合。
2.根据权利要求1所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束,其特征在于,所述配体NTA为可与含有组氨酸标签多肽偶联;所述基因编辑体系可敲除Nrf2基因;所述光敏剂为疏水性光敏剂。
3.权利要求1或2所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束的制备方法,其特征在于,经如下步骤制备得到:
S1.将NTA经巯基修饰,得到NTA-SH;
S2.以ε-己内酯和烯丙基聚乙二醇为原料,在催化剂辛酸亚锡和无水无氧条件下经聚合反应制得两嵌段共聚物APEG-PCL;
S3.以步骤S2的APEG-PCL和NTA-SH为原料,加入AIBN,加热反应,制得NTA-PEG-PCL;
S4.以APEG-NH2和BLA-NCA为原料,经开环聚合得到两嵌段聚合物APEG-PBLA;
S5.以APEG-PBLA和乙酰氯为原料,加入三乙胺,制得APEG-PBLA-Ac;
S6.以APEG-PBLA-Ac和N-叔丁氧羰基-1,2-丁二胺为原料,制得APEG-PAsp(DAB-boc)-Ac;
S7.以APEG-PAsp(DAB-boc)-Ac、巯基乙胺盐酸盐和偶氮二异丁腈为原料,制得NH2-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac;
S8.以NH2-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac、3-马来酰亚胺丙酸琥珀酰亚胺酯和三乙胺为原料,制得Mal-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac;
S9.以Mal-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac和iRGD-SH多肽为原料,制得iRGD-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac;
S10.以iRGD-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac为原料,在三氟乙酸溶液中反应,制得iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac;
S11.将步骤S3的嵌段聚合物NTA-PEG-PCL混溶于THF、DMF或DMSO中,然后加入二价镍盐溶液,透析,超滤浓缩;然后和步骤S10制备的iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac聚合物溶液混合、静置,即可制备得到所述多功能聚合物胶束。
4.根据权利要求3所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束的制备方法,其特征在于,步骤S2中,所述反应在惰性气体氛围中进行,反应的温度为90~120℃;所述ε-己内酯和烯丙基聚乙二醇的反应摩尔比为3~5:1;所述ε-己内酯和叠氮聚乙二醇羟基的反应摩尔比为3~5:1;
步骤S3中,所述反应在无氧条件下进行,先冻融,然后加热至65~75℃反应12~24h;
步骤S4中,所述反应在无水无氧条件下进行,反应温度为25~40℃,反应时间为24~48h;
步骤S5中,所述反应在无水条件下进行,反应温度为25~40℃,反应时间为24~48h,所述APEG-PBLA和乙酰氯的反应摩尔比为1:10~30;
步骤S6中,所述反应温度为25~40℃,所述APEG-PBLA-Ac和N-叔丁氧羰基-1,2-丁二胺的反应摩尔比为1:10~50;
步骤S7中,所述反应温度为65~80℃,所述APEG-PAsp(DAB-boc)-Ac、巯基乙胺盐酸盐和偶氮二异丁腈的反应摩尔比为1:10~30:2~6;
步骤S8中,所述反应温度为25~40℃,所述NH2-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac、3-马来酰亚胺丙酸琥珀酰亚胺酯和三乙胺的反应摩尔比为1:10~50:1~2;
步骤S9中,所述反应温度为25~40℃,所述Mal-PEG-PAsp(DAB-boc)-Ac和iRGD-SH多肽的反应摩尔比为1:2~6;
步骤S10中,所述反应温度为25~40℃,反应时间为2~12h。
5.权利要求1或2所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束的应用,其特征在于,所述多功能聚合物胶束作为载体,同时负载光敏剂和基因编辑体系。
6.根据权利要求5所述应用,其特征在于,所述光敏剂为疏水性光敏剂;优选地,为二氢卟吩e6、卟啉或酞菁;所述基因编辑体系为Cas9/sgRNA。
7.一种联合输送光敏剂和基因编辑体系的载药聚合物胶束,其特征在于,由权利要求1或2所述多功能聚合物胶束,其内核负载二氢卟吩e6、卟啉或酞菁中的一种或多种光敏剂;中间层的配体NTA与Cas9/sgRNA偶联;所述sgRNA靶标Nrf2基因的sgRNA。
8.权利要求7所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的载药聚合物胶束的制备方法,其特征在于,经由权利要求3或4所述制备方法制备得到NTA-PEG-PCL和iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac后,先将NTA-PEG-PCL和光敏剂混溶于THF、DMF或DMSO中,然后加入二价镍盐溶液,透析,超滤浓缩,制得NTA@光敏剂胶束溶液;
然后将NTA@光敏剂胶束溶液和Cas9/sgRNA复合物溶液混合,超滤,制得Cas9/sgRNA-NTA@光敏剂胶束溶液;
最后,将Cas9/sgRNA-NTA@光敏剂胶束溶液和iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac聚合物溶液混合、静置,即可得到所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的载药聚合物胶束。
9.根据权利要求8所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的载药聚合物胶束的制备方法,其特征在于,所述聚合物NTA-PEG-PCL和光敏剂的质量比为10:0.5~1.5;
所述NTA@光敏剂胶束和Cas9/sgRNA复合物混合的质量比为10:1~2,超滤使用截留分子量30K~100K的超滤管;
所述Cas9/sgRNA-NTA@光敏剂胶束和iRGD-PEG-PAsp(DAB)-Ac聚合物混合的质量比为30:1~5。
10.权利要求7所述联合输送光敏剂和基因编辑体系的载药聚合物胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。
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