CN108186564B - 一种肿瘤微环境响应型基因纳米胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肿瘤微环境响应型基因纳米胶束，包括聚乙烯亚胺‑苯基硼酸和聚乙烯亚胺‑马来酸酐‑靶向基团，所述的聚乙烯亚胺‑苯基硼酸和聚乙烯亚胺‑马来酸酐‑靶向基团的质量比为1:1‑1:2。本发明还提供了上述肿瘤微环境响应型基因纳米胶束的制备方法。本发明还提供了上述的肿瘤微环境响应型基因纳米胶束在制备治疗癌症的药物中的应用以及作为药物载体的用途。本发明的纳米胶束可高效荷载与递送RNA，并具有微环境响应型递送基因药物进入肿瘤细胞靶点发挥作用，特别适用于负载RNA用于基因治疗恶性肿瘤。本发明制备方法简便，适于大规模生产。

Description

一种肿瘤微环境响应型基因纳米胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种肿瘤靶向给药技术，具体来说是一种肿瘤微环境响应型基因纳米胶束及其制备方法和应用。
背景技术
临床上所用的化疗药物在肿瘤治疗中发挥了重要作用，但其也存在着一些严重的问题，这限制了药物的进一步应用。一个主要的问题是临床用的抗肿瘤药物对肿瘤缺乏特异性，导致严重的剂量依赖性毒副作用的产生，极大地限制了药物的抗肿瘤效果。近年来，通过RNA的递送(包括siRNA和microRNA)来治疗恶性肿瘤越来越受到重视，尽管利用RNA在肿瘤细胞的实验中取得成功，然而其在体内研究进展仍然缓慢。主要原因是用于治疗外源性RNA无靶向性，在体内易于被RNA酶降解；且由于RNA表面带负电，不易通过细胞膜，细胞难于吸收、胞内积累少等缺点，导致其在体内无法有效地发挥作用。因此如何利用载体将目标基因的RNA高效、安全的输送到体内的靶点，并确保其发挥疗效，这是成功实现体内基因治疗的必要条件。
目前国内外关于基因治疗应用的载体主要集中在病毒载体和非病毒载体。病毒载体充分利用病毒高度进化所具有的感染和寄生特性，使其具有高效的转染效率，但因其免疫原性高、毒性大、目的基因容量小等目前尚无法有效解决的缺点限制其在临床的应用。因此低免疫原性、生物安全性好、可控释靶向的非病毒基因载体越来越受到重视。如脂质体、纳米粒、阳离子多聚物、胶束等纳米递送系统在基因递送方面都取得了不同程度的研究成果。纳米递送系统可增强基因递送的靶向性，同时在纳米载体表面耦联特异性的靶向基团，如特异性配体、单克隆抗体等，通过靶向基团与细胞表面特异性受体结合，可实现基因的特异性的主动靶向递送，提高治疗效率。由此可知，良好递送效率和靶向性的非病毒基因递送载体，在肿瘤的基因治疗中具有举足轻重的作用。
尽管非病毒基因载体已取得较大的研究进展，但是其特异性的靶向和高效的荷载效率的问题仍没有得到彻底的解决，仍面临很大的挑战，这是因为纳米载体进入肿瘤细胞后还要面临许多屏障来阻止其有效发挥作用，如纳米载体一旦进入肿瘤细胞就会被酸性的内涵体(pH＝5.5)捕捉，内涵体的酸性环境会极大的破坏纳米载体，而且由于像miRNA等基因发挥功能的场所为细胞质，因此纳米载体如何从内涵体安全逃逸到细胞质是miRNA发挥作用的前提。一旦进入细胞质后，纳米载体释放miRNA等基因的效率也是影响其转染效率的关键。尽管目前有相关研究通过微环境响应载体来解决此问题，但在载体的毒性、对miRNA的荷载、内涵体逃逸和细胞质释放的效率，及转染miRNA的效率等方面仍不理想，因而也限制其进一步的应用；如何解决这些问题，并研究其对肿瘤治疗的机理是推动纳米基因载体真正应用到临床治疗的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤微环境响应型基因纳米胶束及其制备方法和应用，所述的这种肿瘤微环境响应型基因纳米胶束及其制备方法和应用要解决现有技术中的非病毒基因载体特异性的靶向和荷载效率不高的技术问题。本发明构建合适的载体，使其能高效荷载RNA，并通过微环境的响应将RNA安全、准确的递送到肿瘤靶点。
本发明提供了一种肿瘤微环境响应型基因纳米胶束，包括聚乙烯亚胺-苯基硼酸和聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团，所述的聚乙烯亚胺-苯基硼酸和聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团的质量比为1:1-1:2，所述的聚乙烯亚胺的分子量为1800～2500Da。
优选的，所述的所述的聚乙烯亚胺的分子量为1800Da。
进一步的，所述的纳米胶束的粒径为100-200nm，形态为球形。
进一步的，所述的靶向基团为具有肿瘤靶向特性的抗体、酶或者小分子化合物。
进一步的，所述的靶向基团为西妥昔单抗(C225)。
进一步的，还含有肿瘤抑制基因、siRNA或miRNA，所述的聚乙烯亚胺-苯基硼酸和肿瘤抑制基因、siRNA或miRNA的质量比为2:1-4:1。
进一步的，所述的肿瘤抑制基因为miR-146a。
进一步的，在聚乙烯亚胺-苯基硼酸中，所述的聚乙烯亚胺和苯基硼酸的摩尔比为1:4-1:8，在聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团中，聚乙烯亚胺和马来酸酐的摩尔比为1:16-1：32，聚乙烯亚胺和靶向基团的重量比为1500:1。
本发明还提供了上述的肿瘤微环境响应型基因纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
(1)一个制备聚乙烯亚胺-苯基硼酸的步骤；
(2)一个制备聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团的步骤；
(3)将聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团投入到上述聚乙烯亚胺-苯基硼酸溶液中，所述的聚乙烯亚胺-苯基硼酸和聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团的质量比为1:1-1:2，搅拌形成聚乙烯亚胺-苯基硼酸-聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团纳米胶束。
进一步的，在一个制备聚乙烯亚胺-苯基硼酸的步骤中，将4-(溴甲基)苯基硼酸与聚乙烯亚胺加入无水二甲基亚砜中，在60～90℃下搅拌反应10～30小时，所述的4-(溴甲基)苯基硼酸与聚乙烯亚胺的比例分别为4～8:1，最后将产物透析并冻干，获得聚乙烯亚胺-苯基硼酸。
进一步的，在一个制备聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团的步骤中；先将靶向基团活化，然后将溶于磷酸盐缓冲液中的聚乙烯亚胺加入到被活化的靶向基团溶液中，并在室温下搅拌反应10～30小时，最后将产物透析冻干，获得聚乙烯亚胺-靶向基团；
将聚乙烯亚胺-靶向基团与马来酸酐在蒸馏水中混合，所述的聚乙烯亚胺和马来酸酐的摩尔比为1:16～32，室温搅拌24～36小时后使用蒸馏水依次透析，产物冻干后得到聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团。
本发明还提供了另外一种上述的肿瘤微环境响应型基因纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
(1)一个制备聚乙烯亚胺-苯基硼酸-肿瘤抑制基因的步骤；
(2)一个制备聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团的步骤；
(3)将聚乙烯亚胺-苯基硼酸和肿瘤抑制基因投入到水溶液中形成荷载基因的聚乙烯亚胺-苯基硼酸-肿瘤抑制基因纳米胶束，所述的聚乙烯亚胺-苯基硼酸和肿瘤抑制基因的质量比为2:1-4:1然后将聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团投入到上述纳米胶束溶液中，所述的聚乙烯亚胺-苯基硼酸和聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团的质量比为1:1-1:2，搅拌形成聚乙烯亚胺-苯基硼酸-肿瘤抑制基因-聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团纳米胶束。
本发明还提供了上述的肿瘤微环境响应型基因纳米胶束在制备治疗癌症的药物中的应用。
本发明还提供了上述的肿瘤微环境响应型基因纳米胶束在制备治疗非雄激素依赖性前列腺癌药物中的应用。
本发明还提供了上述的肿瘤微环境响应型基因纳米胶束作为药物载体的用途。
本发明的纳米胶束具有如下特点：
(1)高效荷载miR-146a，同时也提高纳米胶束的稳定性
聚乙烯亚胺(PEI)的分子量和其毒性成正比，为此本发明中用低分子量的支链PEI(Mw＝1800Da)来进行载体合成，PEI(Mw＝1800Da)不仅具有较低的毒性，而且分子链上有足够的伯胺基来用于进行实验的设计。与常规的阳离子聚合物压缩包裹RNA形成胶束等载体不同，本发明中所制备的PEI-PBA/PEI-MAH-C225纳米胶束可明显提高对miR-146a荷载，因为其不仅可通过聚合物上PEI的正电荷来压缩miR-146a形成胶束，而且聚合物上PBA本身也能有效地结合miR-146a，这会有助于极大提高纳米胶束对miR-146a的荷载。主要是由于PBA可以和含有1，2或1，3二羟基有效结合形成可逆的硼酸酯共价键，而合成的miR-146a的两端都含有羟基，利用此结合特性可以更高效的将miR-146a结合到PBA上，提高纳米胶束对miR-146a的荷载；miR-146a两端的羟基在结合PBA同时会和PBA进行分子间交联从而形成核交联胶束，这有助于提高纳米胶束的稳定性，使其避免在到达靶部位前崩解。
(2)pH响应、电荷逆转来有效的逃逸内涵体
PEI-PBA/PEI-MAH-C225纳米胶束中的MAH具有pH敏感性，其在正常pH7.4条件下处于稳定状态，而在pH5.5条件下可快速降解，因此PEI-PBA/PEI-MAH-C225被内涵体(pH5.5)捕捉后，带有负电荷的MAH随即发生降解，外层PEI-MAH-C225解离，电荷发生逆转暴露出带有正电荷的PEI。而在低pH值的内涵体，PEI分子链上的伯胺基团能够大量捕获质子，来缓冲内涵体内部H+，并通过质子泵引起H+和Cl-内流，导致内涵体渗透性肿胀破裂，从而使PEI-PBA-miR-146a进入细胞质。
(3)细胞质的响应性快速释放
PEI-PBA-miR-146a在细胞质外的环境下具有良好的稳定性，主要是由于在细胞质外的环境ATP含量极低(0.4mM)，无法实现与PBA进行有效的竞争性置换结合，而细胞质内ATP含量则明显升高至3mM，PEI-PBA-miR-146a一旦进入细胞质中，大量含有羟基的ATP可竞争性的将miR-146a置换出来，实现miR-146a在细胞质内的快速响应性释放(图2)；同时胶束的稳定性会随ATP浓度的增加而降低，导致胶束解离。这比传统的聚合物通过降解来释放基因具有明显快速释放优势，有助于促进更多的miR-146a暴露在细胞质中，增强干扰效果，提高治疗效率。
(4)实现低毒性和高转染效率的统一
通常阳离子聚合物载体的基因转染效率和细胞毒性之间是相互矛盾的。如支链PEI(Mw＝25000Da)被认为是转染试剂的金标准，但其高的正电荷导致其产生高的细胞毒性。为解决此问题，在本发明中选用具有足够的电荷和活性基团的支链PEI(Mw＝1800Da)来进行实验研究。首先合成具有正电荷PEI-PBA，并荷载miR-146a形成带正电荷的PEI-PBA-miR-146a，之后通过带负电荷的MAH和靶向抗体C225修饰PEI来控制合成带负电荷的PEI-MAH-C225，最后将带正电荷的PEI-PBA-miR-146a和带负电荷的PEI-MAH-C225通过正负电荷相互吸附作用形成具有中性电荷的PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米胶束，中性电荷的纳米胶束不仅可以减少其体内毒性，而且有助于延长其在体内循环时间。
通过pH敏感的MAH修饰使PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米胶束在内涵体的酸性环境中，实现电荷逆转，从而来逃逸内涵体进入细胞质中，而通过可高效结合miR-146a并具有细胞质响应特性的PBA修饰使PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米胶束不仅能高效荷载miR-146a，通过核交联增强纳米胶束的稳定性，同时可使纳米胶束在细胞质内利用高浓度的ATP与PBA竞争性置换结合而实现miR-146a响应性快速释放，促使大量的miR-146a在细胞质内发挥作用，这有助于提高转染效率。
(5)纳米胶束的良好适应性与可塑性
由于RNA在其化学结构上的相似性，不同的siRNA或miRNA都可通过静电力与缩合反应与PEI-PBA交联；同时不同的抗体都可以利用其两端的羧基通过缩合反应与PEI-MAH交联。因此通过不同的RNA与靶向基团的组合变化，可以做到针对不同肿瘤的靶向与基因治疗作用。这给PEI-PBA/PEI-MAH-C225纳米胶束带来了良好适应性与可塑性。
由此可知PEI-PBA/PEI-MAH-C225纳米胶束具有强大的功能与适应性，稍加变化即可用于多种肿瘤的治疗。本发明同时也对PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米粒递送miR-146a治疗非雄激素依赖性前列腺癌进行相应的研究，为该纳米粒的临床应用奠定基础。
本发明的目的是提供一种肿瘤微环境响应的、以聚乙烯亚胺-苯基硼酸/聚乙烯亚胺-马来酸酐-西妥昔单抗(PEI-PBA/PEI-MAH-C225)纳米胶束基因递送载体，PEI具有较低的毒性并可结合RNA与抗体，PBA具有细胞质响应性并能有效结合RNA有利于提高RNA的荷载，MAH使纳米胶束具有pH响应性以实现内涵体逃逸，C225对靶向肿瘤细胞具有靶向功能，这使构建的PEI-PBA/PEI-MAH-C225纳米给药载体系统具有肿瘤特异性的多功能靶向功能的同时可以高效的荷载与递送RNA。
本发明所述的PEI-PBA/PEI-MAH-C225纳米胶束载体可通过自主装等方法制备获得，粒径在100-200nm以下可控，表面光滑，均匀度好，颗粒规则无粘连，再分散性好，载药量和包封率高。制备的纳米胶束可以分散在固体、半固体或溶液中。可用于制备静脉注射、肌肉注射或口服给药的肿瘤微环境响应型纳米胶束。
本发明所述的PEI-PBA/PEI-MAH-C225纳米递送系统可以通过自主装法制备。首先将PEI-PBA和miR-146a投入到水溶液中形成荷载基因的PEI-PBA-miR-146a纳米胶束，然后将PEI-MAH-C225投入到上述纳米胶束溶液搅拌形成PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米胶束。
本发明所述的纳米胶束不添加任何表面活性剂，可在水溶液中制备，安全无毒。
本发明所述的载RNA肿瘤微环境响应型纳米胶束可以用于制备荷载抗癌药物、RNA的载体。本发明所述的PEI-PBA/PEI-MAH-C225纳米胶束可高效荷载RNA，并通过肿瘤微环境的响应来高效特异性的递送RNA到肿瘤靶点。本发明所述的PEI-PBA/PEI-MAH-C225纳米胶束中的C225抗体可以更换成任何靶向基团，实现对不同肿瘤的靶向治疗本发明制备方法简便，适于大规模生产，特别适应于制备肿瘤微环境响应型的靶向递送基因的纳米胶束载体。
本发明基于聚乙烯亚胺设计聚乙烯亚胺-苯基硼酸(PEI-PBA)和西妥昔单抗修饰聚乙烯亚胺-马来酸酐-西妥昔单抗(PEI-MAH-C225)两种聚合物载体，以能有效干扰DU145雄性激素非依赖性前列腺癌细胞生长的miR-146a mimics(miR-146a)为模型基因，构建低毒性、可高效荷载miR-146a、能安全有效逃逸内涵体、递送miR-146a进入细胞质并快速释放、实现高转染效率的递送基因的纳米胶束(聚乙烯亚胺-苯基硼酸-miR-146a mimics/聚乙烯亚胺-马来酸酐-西妥昔单抗，PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225)(图1)；该纳米胶束通过利用肿瘤微环境的Ph值和细胞质中的ATP酶响应性来实现基因的安全递送，有效提高抗肿瘤疗效。
本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明的纳米胶束可高效荷载与递送RNA，并具有微环境响应型递送基因药物进入肿瘤细胞靶点发挥作用，特别适用于负载RNA用于基因治疗恶性肿瘤。本发明制备方法简便，适于大规模生产。
附图说明：
图1显示了PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米胶束的制备、溶酶体逃逸和细胞质释放的机理。
图2为PBA和miR-146a的结合与释放机理示意图。
图3为PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米胶束的制备路线图。
图4为PEI-PBA核磁共振氢谱图。
图5为PEI-MAH-C225核磁共振氢谱图。
图6为PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米胶束原子粒显微镜图。
图7为PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225透射电子显微镜图。
图8为PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米胶束处理细胞24h毒性图；横坐标为检测时间，纵坐标为OD450值。
图9为PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米胶束转染细胞6h荧光显微镜图；bright为明场拍摄图片，GFP为绿色荧光下图片，merge为两张图片合成处理后的图片。
图10为PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米胶束转染细胞7天克隆形成图；A图为PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米胶束处理后克隆形成图片，B图为用正常培养液培养后克隆形成图片。
图11为PEI-PBA-miR146a/PEI-MAH-C225纳米胶束抑制裸鼠皮下种植瘤增殖图；A图为对照组皮下瘤照片，B图为PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米胶束治疗组皮下瘤照片。
具体实施方式：
下面以实施例对本发明加以进一步的说明，但是不限制本发明的内容。
实施例1PEI-PBA和PEI-MAH-C225载体制备
(1)聚乙烯亚胺-苯基硼酸(PEI-PBA)的制备：
Figure BDA0001538393530000071
PEI-PBA的合成路线
根据上述聚合物合成路线，具体描述如下：
将4-(溴甲基)苯基硼酸与PEI加入无水DMSO中，在80℃下搅拌反应24小时。4-(溴甲基)苯基硼酸与PEI的比例分别为4:1，6:1和8:1。最后将产物透析并冻干，完成PEI-PBA的制备。核磁共振氢谱如图4显示，表明PEI-PBA成功合成。
(2)聚乙烯亚胺-马来酸酐-西妥昔单抗(PEI-MAH-C225)的制备：
Figure BDA0001538393530000081
PEI-MAH的合成路线
根据上述聚合物合成路线，具体描述如下：
(1)PEI-C225的制备：将C225加入含有EDC与NHS的0.1M MES溶液(pH＝6.0)中活化6小时；然后将溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2-7.5)中的PEI逐滴加入到被活化的C225溶液中，并在室温下搅拌反应24小时。最后将产物透析冻干，完成PEI-C225的制备。
(2)PEI-MAH-C225的合成：将33nmol PEI-C225与1400nmol MAH在蒸馏水中混合，室温搅拌48小时后使用蒸馏水依次透析，产物冻干后得到PEI-MAH-C225。核磁共振氢谱如图5显示，表明PEI-MAH-C225成功合成。
实施例2荷载microRNA-146a(miR-146a)与西妥昔单抗的
PEI-PBA-miR146a/PEI-MAH-C225纳米胶束的制备
将5mg PEI-PBA和2.5mg miR-146a投入到水溶液中形成荷载基因的PEI-PBA-miR-146a纳米胶束，然后将10mg PEI-MAH-C225投入到上述纳米胶束溶液搅拌形成PEI-PBA-miR-146a/PEI-MAH-C225纳米胶束。纳米胶束通过原子力显微镜和透射电子显微镜测试的结果如图6、7所示，制备的纳米粒呈圆形，具有良好的分散性，粒径主要集中在100-200nm之间，尤其是以150nm的粒径为主。
实施例3 PEI-PBA/PEI-MAH-C225纳米胶束的细胞毒性
DU145前列腺癌细胞铺96孔板，每孔细胞的密度为1×105个，在37℃，CO2体积分数为5％的细胞培养箱中培养过夜。分别将不同浓度的纳米胶束加入到96孔板中(只加培养液的细胞组为阴性对照组)，每个实验条件设置5个复孔。在培养24h加入cck8(5mg/mL)溶液20μL，继续培养2h，之后吸取培养液，在酶标仪450nm处测试并计算细胞的存活率。
实验结果如8所示，与对照组相比，纳米粒孵育24小时内的细胞的OD值无明显改变，表明纳米粒具有良好的生物相容性。
实施例4 PEI-PBA-miR146a/PEI-MAH-C225纳米胶束荧光显微镜的观察
为便于进行荧光显微镜观察，实验中用荧光探针GFP来标记miRNA进行研究。将灭菌的盖玻片置于24孔板中，DU145前列腺癌细胞铺24孔板，每孔细胞的密度为2×105个，0.5mL培液，在37℃，CO2体积分数为5％的细胞培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，去除培养液。分别在不同孔中加入PEI-PBA-miR146a/PEI-MAH-C225纳米胶束的培养液0.2mL，37℃细胞培养箱中继续培养6h。吸取出培养液，置于荧光显微镜下观察摄入到细胞中纳米胶束的分布情况。上述实验进行避光操作。
实验结果如图9所示，PEI-PBA-miR146a/PEI-MAH-C225纳米胶束孵育的DU145前列腺癌细胞内荧光分布均匀，表明PEI-PBA-miR146a/PEI-MAH-C225纳米胶束能有效递送miRNA进入肿瘤细胞内。
实施例5 PEI-PBA-miR146a/PEI-MAH-C225纳米胶束抑制细胞克隆形成
DU145前列腺癌细胞铺6孔板，每孔细胞的密度为200个，在37℃，CO2体积分数为5％的细胞培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，加入含PEI-PBA-miR146a/PEI-MAH-C225纳米胶束培养液，24h后换为正常细胞培养液。7天后观察细胞克隆形成情况。对照组细胞不做任何处理。
实验结果如图10所示，与对照组的(10B)细胞克隆形成相比，PEI-PBA-miR146a/PEI-MAH-C225纳米胶束处理的DU145前列腺癌细胞(10A)形成克隆数明显少，表明细胞克隆形成被纳米胶束有效地抑制。
实施例6 PEI-PBA-miR146a/PEI-MAH-C225纳米胶束抑制裸鼠皮下种植瘤增殖
取对数生长期且生长状况良好的DU145前列腺癌细胞，离心后用生理盐水重悬调整细胞的浓度至1×107/ml，取100ul的DU145细胞，分别注射裸鼠的右下肢上部，并作相应标记。每周三次使用PEI-PBA-miR146a/PEI-MAH-C225纳米胶束通过尾静脉注射的方式对裸鼠进行治疗，观察皮下瘤的大小。对照组裸鼠注射生理盐水。
实验结果如图11所示，与对照组的(11A)皮下瘤相比，PEI-PBA-miR146a/PEI-MAH-C225纳米胶束治疗的裸鼠皮下瘤(11A)体积明显小，表明裸鼠皮下瘤的增殖能被纳米胶束有效地抑制。

Claims (4)

1.一种肿瘤微环境响应型基因纳米胶束，其特征在于：包括聚乙烯亚胺-苯基硼酸和聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团，所述的聚乙烯亚胺-苯基硼酸和聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团的质量比为1:1-1:2，所述的聚乙烯亚胺的分子量为1800～2500Da，所述的纳米胶束的粒径为100-200nm，形态为球形，所述的靶向基团为西妥昔单抗，还含有肿瘤抑制基因，所述的肿瘤抑制基因为miR-146a，所述的聚乙烯亚胺-苯基硼酸和肿瘤抑制基因的质量比为2:1-4:1，在聚乙烯亚胺-苯基硼酸中，所述的聚乙烯亚胺和苯基硼酸的摩尔比为1:4-1:8，在聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团中，聚乙烯亚胺和马来酸酐的摩尔比为1:16-1：32，聚乙烯亚胺和靶向基团的重量比为1500:1。
2.根据权利要求1所述的肿瘤微环境响应型基因纳米胶束，其特征在于：还含有siRNA或miRNA，所述的聚乙烯亚胺-苯基硼酸和siRNA或miRNA的质量比为2:1-4:1。
3.权利要求1所述的肿瘤微环境响应型基因纳米胶束的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)一个制备聚乙烯亚胺-苯基硼酸-肿瘤抑制基因的步骤；在一个制备聚乙烯亚胺-
苯基硼酸的步骤中，将4-(溴甲基)苯基硼酸与聚乙烯亚胺加入无水二甲基亚砜中，在60～90℃下搅拌反应10～30小时，所述的4-(溴甲基)苯基硼酸与聚乙烯亚胺的比例分别为4～8:1，最后将产物透析并冻干，获得聚乙烯亚胺-苯基硼酸；
(2)一个制备聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团的步骤；在一个制备聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团的步骤中；先将靶向基团活化，然后将溶于磷酸盐缓冲液中的聚乙烯亚胺加入到被活化的靶向基团溶液中，并在室温下搅拌反应10～30小时，最后将产物透析冻干，获得聚乙烯亚胺-靶向基团；将聚乙烯亚胺-靶向基团与马来酸酐在蒸馏水中混合，所述的聚乙烯亚胺和马来酸酐的摩尔比为1:16～32，室温搅拌24～36小时后使用蒸馏水依次透析，产物冻干后得到聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团；
(3)将聚乙烯亚胺-苯基硼酸和肿瘤抑制基因投入到水溶液中形成荷载基因的聚乙烯亚胺-苯基硼酸-肿瘤抑制基因纳米胶束，所述的聚乙烯亚胺-苯基硼酸和肿瘤抑制基因的质量比为2:1-4:1然后将聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团投入到上述纳米胶束溶液中，所述的聚乙烯亚胺-苯基硼酸和聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团的质量比为1:1-1:2，搅拌形成聚乙烯亚胺-苯基硼酸-肿瘤抑制基因-聚乙烯亚胺-马来酸酐-靶向基团纳米胶束。
4.权利要求1所述的肿瘤微环境响应型基因纳米胶束在制备治疗非雄激素依赖性前列腺癌药物中的应用。
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