CN104231265A - 脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供脂肪烃基接枝低分子量聚乙烯亚胺、其制备方法及应用。本发明采用一步合成法将脂肪烃基接枝于低分子量聚乙烯亚胺的氨基上，脂肪烃基接枝后的低分子量聚乙烯亚胺与核酸复合形成的复合颗粒在水溶液中能自组装形成胶束状结构，稳定性大大提高；接枝后材料的亲脂性特征增加了材料与细胞的亲和力，提高核酸递送效率的同时保持了低分子量聚乙烯亚胺较低的细胞毒性。另外，本发明提供的脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺在血清存在条件下递送质粒DNA的最高转染效率和递送siRNA的靶基因沉默效率与市售lipofectamine2000相当，且无明显细胞毒性，是一种高效低毒的核酸递送载体，具有较好的应用前景。

Description

脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺、制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，涉及一种聚合物载体材料，具体涉及一种脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺衍生物、其制备方法及用途。

背景技术

核酸治疗是治疗多种先天和后天疾病的一种有力工具，但是如何实现核酸药物安全有效的体内递送是核酸治疗的一大技术瓶颈。目前常用的核酸输送载体可以分为重组病毒载体和人工合成载体（非病毒载体）。病毒载体转染效率高，但是制备及纯化困难，携载核酸容量小，且具有潜在致病性。非病毒载体被认为是比病毒载体更理想的核酸药物输送载体。

非病毒载体主要包括天然高分子和合成高分子两大类。天然高分子来源受限且质量不易控制；合成高分子材料因来源可靠，质量稳定而更受青睐。在合成高分子材料中，聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)是目前研究最广泛的一类聚阳离子非病毒载体。分子量为25KDa的分枝状PEI和In vivo jetPEI^TM(分子量为22KDa的直线型PEI)分别被认为是体外核酸递送和体内核酸递送的金标准。然而，未经化学改性的PEI存在转染活性-毒性的相互制约关系，即PEI分子量越大，转染活性越高，但同时毒性也越大。

为了平衡聚乙烯亚胺的毒性和转染活性，现在多采用结构修饰的方法对聚乙烯亚胺进行化学改性，如采用PLGA嫁接分子量为22K Da的直线型PEI（参见Chumakova OV,Liopo AV,Andreev VG et al.Composition of PLGA and PEI/DNnanoparticles improves ultrasound-mediated gene delivery in solid tumors in vivo.Cancer Lett.2008;261(2):215-225.）；采用肝素嫁接分子量为18K的分枝状PEI（参见Jeon O,Yang HS,Lee TJ,Kim BS.Heparin-conjugated polyethylenimine forgene delivery.J.Control.Release2008;132(3):236-242.）；采用透明质酸嫁接分子量为25K的分枝状PEI（参见Jiang G,Park K,Kim J,Kim KS,Hahn SK.Targetspecifc intracellular delivery of siRNA/PEI–HA complex by receptor mediatedendocytosis.Mol.Pharm.2009;6(3):727-737.）；采用PEG嫁接分子量为25K的分枝状PEI（参见Merkel OM,Beyerle A,Librizzi D et al.Nonviral siRNA delivery tothe lung:investigation of PEG–PEI polyplexes and their in vivo performance.Mol.Pharm.2009;6(4):1246-1260.）。中国专利号CN102181053A公开了名称为“一种疏水基团修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其应用”的发明专利，该专利提供了一种酸敏感疏水改性的聚乙烯亚胺（分子量为9.5K-10.5K），该修饰方法增强了PEI与DNA的复合能力，且材料细胞毒性较低。中国专利号CN101704949A公开了名称为“丙烯酰胺类单体修饰的聚乙烯亚胺、制法和在基因传递中的应用”，该专利对分子量为25K的分枝状PEI修饰后，不仅提高了转染效率，而且大大降低了毒性。

前述文献报道和专利等都是对大分子量PEI进行化学改性，降低其毒性的同时保留或增强其转染活性，而对小分子量PEI的化学改性研究相对较少。因为，普遍认为小分子量的PEI(Mw≤2000)细胞毒性较小，但其转染效率低下，无法达到治疗的目的。中国专利号CN102391509A公开了名为“聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用”的发明专利，该专利采用泊洛沙姆嫁接分子量为2000的分枝状PEI，所得PEI衍生物毒性小，且转染效率高。采用胆固醇氯甲酸盐对分子量为1800的分枝状PEI进行化学修饰后，毒性低，且体内递送siRNA效率高（参见Kim WJ,Chang CW,Lee M,Kim SW.cient siRNA delivery usingwater soluble lipopolymer for anti-angiogenic gene therapy.J.Control.Release2007;118:357-363.）。以上专利及文献结果说明，对小分子量PEI进行化学修饰，在增强其转染活性的同时保留其低毒性是有可能的。

目前，应用比较成熟的市售转染试剂lipofectamine2000虽然转染效率高，但毒性较大，且价格昂贵，因此亟需开发高效安全且经济的转染试剂。

经专利查询及文献检索，目前尚无采用脂肪烃基接枝小分子量分枝状PEI的文献报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺，其在体内外的稳定性好，细胞毒性小，且转染效率高。

此外，还需要提供一种脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的制备方法及其作为核酸载体的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺，其分子式如下：

式中，x和y表示重复单元的个数，且x与y之间满足x=2y的配比关系；R基团为脂肪烃基（CH₃(CH₂)_n-，n表示亚甲基CH₂的个数，n=6～14），该脂肪烃基来自相应溴代烷或碘代烷，优选的脂肪烃基是己烷基、庚烷基、辛烷基、壬烷基、癸烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基；更优选的脂肪烃基是己烷基和十二烷基。

其中，聚乙烯亚胺的分子量为100-2000g/mol(道尔顿)，优选地，聚乙烯亚胺的分子量为1200-1800g/mol(道尔顿)；更优选的，聚乙烯亚胺的分子量为1800g/mol(道尔顿)。

其中，聚乙烯亚胺与脂肪烃基的摩尔比可以为1:1-12，优选地，聚乙烯亚胺与脂肪烃基的摩尔比为1:5-11。

脂肪烃基为疏水链，与低分子量聚乙烯亚胺接枝后，脂肪烃可以形成疏水内核，低分子量聚乙烯亚胺作为亲水外壳，该脂肪烃基接枝低分子量聚乙烯亚胺在水溶液中可以自组装形成胶束状结构（参见附图3），提高了载体的胶体稳定性，本发明优选的脂肪烃基是己烷基、庚烷基、辛烷基、壬烷基、癸烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基，优选己烷基和十二烷基，且所述脂肪烃基来自相应的溴代烷或碘代烷。这些优选的脂肪烃基的链长与低分子量聚乙烯亚胺的链长大致相当，有利于接枝聚合物在水溶液中自组装形成胶束状结构；另外，脂肪烃基接枝低分子量聚乙烯亚胺，可以增加材料的亲脂性，提高对细胞的亲和力，增加细胞摄取量，进而提高转染效率。

本发明的另一方面，提供了一种脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺(如上所述)的制备方法，包括如下步骤：

（1）将聚乙烯亚胺溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，在30-40℃下搅拌溶解；

（2）将一定量的溴代或碘代脂肪烃溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，以一定速度（10-50ml/h）滴加至聚乙烯亚胺溶液中，在30-40℃下，避光反应12-48h；

（3）所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂半固体膏状物，将该半固体膏状物混悬于5-10ml蒸馏水中，然后用截留分子量为50-1000的透析袋进行透析，冷冻干燥后制得脂肪烃基接枝的聚乙烯亚胺。其中，所述透析是先在40-60%的乙醇溶液中透析4-6次，再在去离子水中透析24-48h。

在脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的制备方法中，优选的聚乙烯亚胺与混合溶剂的比例为1g聚乙烯亚胺溶解于80-150ml混合溶剂中，更优选的聚乙烯亚胺与混合溶剂的比例为1g聚乙烯亚胺溶解于100ml混合溶剂中，优选的二氯甲烷与甲醇混合溶剂的体积比为90:10-99:1，更优选的二氯甲烷和甲醇混合溶剂的体积比为95:5；优选的，聚乙烯亚胺与脂肪烃的摩尔比为1:1-12，更优选的聚乙烯亚胺与脂肪烃基的摩尔比为1:5-11。

本发明的再一个方面，提供了上述脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体，特别是体内、体外核酸递送载体的应用，或者其制备体内、体外核酸递送载体的应用，比如用于递送质粒DNA、siRNA等。

在一个实施方案中，上述脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体时，递送的质粒DNA的大小为1-30Kb，递送的siRNA的大小为15-30bp。上述脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺作为体内、体外核酸递送载体应用时，脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺与核酸的质量比、脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺与核酸复合的孵育介质、体外递送时的血清浓度对转染效率和毒性有显著影响。优选的，所述脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺与核酸的质量比为1:1-20:1；更优选的，所述脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺与核酸的质量比为3:1-10:1。室温条件下，本发明提供的脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺与核酸可在HBS缓冲液、HBG缓冲液、RPMI-1640细胞培养液、或DMEM细胞培养液中依照一定质量比复合形成复合物（即核酸复合颗粒，如下所述的“基因转染复合颗粒”）。采用本发明提供的脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺制备的核酸复合颗粒可以采用静脉注射给药、肺部气管内滴注、雾化吸入、及局部瘤内注射等方法给药。

本发明提供的脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺在体外转染中作为核酸递送载体的用法，其步骤和条件如下：

（1）细胞毒性评价

取对数生长期细胞，胰酶消化后用含血清培养基稀释后以一定密度接种于96孔培养板中，培养24h后，细胞融合度达到约85-90%，将不同浓度的材料与细胞在不含血清的培养基中共同培养4h后(每孔总体积为100μl)，吸弃旧培养基，每孔分别加入含0.5mg/ml的MTT的培养基继续培养4h后，吸弃溶液，加入150μl DMSO溶解甲臢结晶，然后用酶标仪测定各孔在570nm处的OD值，以未加聚合物溶液孔的OD值作为对照，计算各聚合物作用条件下细胞的存活率，每组实验设置3个重复孔。

（2）体外转染

取对数生长期细胞，胰酶消化后用含血清培养基稀释后以一定密度接种于96孔培养板中，培养24h后，细胞融合度约达到85-90%，开始转染。转染时，吸弃旧培养基，每孔用PBS洗涤两次后，每孔加入含有基因转染复合颗粒的无血清培养基50μl（含质粒DNA约100ng），培养箱中培养4h后，加入含血清培养基125μl，继续培养20h后取出培养板，吸弃旧培养基，用PBS洗2次，加入1×细胞裂解液20μl，37℃振摇15min后，取10μl裂解液加入50μl荧光素酶底物，用发光检测仪测定转染效率。

本发明提供的脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺在体内转染中作为核酸递送载体的用法，其步骤和条件如下：

（1）取5-6周龄的Balb/c小鼠，在第四乳腺垫处皮下接种小鼠来源的乳腺癌4T1细胞，待肿瘤体积达到150mm³时，将小鼠随机分为2组，每组5只，分别在瘤内注射含有5μg荧光素酶质粒的基因转染的复合物颗粒溶液100μl和裸荧光素酶质粒的生理盐水溶液100μl，第二天重复注射一次，注射后48h，将小鼠用异氟烷麻醉，麻醉5min后，向小鼠腹腔注射200μl荧光素酶底物，10min后用小动物活体成像仪观察体内转染效果。

（2）取5-6周龄的的Balb/c小鼠，在第四乳腺垫处皮下接种小鼠来源的乳腺癌4T1细胞，待肿瘤体积达到150mm³时，将小鼠随机分为2组，每组5只，分别尾静脉注射含有70μg荧光素酶质粒的基因转染的复合物颗粒溶液200μl和裸荧光素酶质粒的生理盐水溶液200μl，注射后24h，将小鼠用异氟烷麻醉，麻醉5min后，向小鼠腹腔注射200μl荧光素酶底物，10min后用小动物活体成像仪观察体内转染效果。

本发明的有益效果是，本发明采用一步合成法将脂肪烃基接枝于低分子量聚乙烯亚胺的氨基上，制备方法简单；所述脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺与核酸复合形成的复合颗粒在水溶液中自组装形成胶束状结构，稳定性极大提高；接枝后材料的亲脂性特征增加了材料与细胞的亲和力，接枝后的材料在有血清条件下的转染效率可以提高到接枝前的160倍，转染效率与接枝前相比大大提高，在有血清条件下接枝材料的转染效率与市售转染试剂脂质体2000（lipofectamine2000）相当，且该接枝材料在提高转染效率的同时，细胞毒性较低，适合作为体外、体内核酸递送载体，转染效率高，且无明显细胞毒性(毒性低)。

附图说明

图1是实施例1的合成路线。

图2是实施例1中制备所得脂肪烃基接枝低分子量聚乙烯亚胺的¹H-NMR图谱。

图3是实施例1中制备所得脂肪烃基接枝低分子量聚乙烯亚胺与质粒DNA形成的复合颗粒的透射电子显微镜图。

图4是分子量为1800的分枝状聚乙烯亚胺bPEI₁₈₀₀和十二烷基接枝的bPEI₁₈₀₀的细胞毒性柱状图。

图5是bPEI₁₈₀₀和十二烷基接枝的bPEI₁₈₀₀的体外转染效率柱状图。

具体实施方式

为了详细说明本发明及其特点，下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。应当指出的是，这些实施例仅用于具体说明本发明而不能用于限制本发明的范围。

实施例1：脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的制备

（1）称取分子量为1800的分枝状聚乙烯亚胺（bPEI₁₈₀₀）1g，溶于100ml二氯甲烷和甲醇(两者体积比为95:5)的混合溶剂中，在30℃下搅拌溶解；

（2）称取1-溴十二烷1.1430g溶于50ml的二氯甲烷和甲醇(两者体积比为95:5)的混合溶剂中，以10ml/h的速度滴加至上述聚乙烯亚胺溶液中，在40℃下，避光反应24h；

（3）所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂得到淡黄色半固体膏状物，将该半固体膏状物混悬于6ml蒸馏水中，然后用截留分子量为1000的透析袋先在40%的乙醇溶液中透析6次，再在去离子水中透析24h，将透析后得到的物质冷冻干燥48h后，制得脂肪烃基接枝的聚乙烯亚胺。

取冻干后的脂肪烃基接枝的聚乙烯亚胺约15mg溶解于约0.6ml重水中，采用400MHz的核磁共振氢谱（¹H-NMR）进行结构确认，结果见附图2。从附图2中可知，化学位移0.92ppm和1.31ppm处的峰分别归属于（-CH₃）和（-(CH₂)₁₁-），表明十二烷基已成功接枝于bPEI₁₈₀₀上。

实施例2：脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的制备

（1）称取分子量为1800的分枝状聚乙烯亚胺（bPEI₁₈₀₀）1g，溶于100ml二氯甲烷和甲醇(两者体积比为90:10)的混合溶剂中，在40℃下搅拌溶解；

（2）称取1-溴已烷3.037g溶于50ml二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(两者体积比为90:10)中，以50ml/h的速度滴加至上述聚乙烯亚胺溶液中，在40℃下，避光反应24h；

（3）所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂得到灰白色半固体膏状物，将该灰白色半固体膏状物混悬于10ml蒸馏水中，然后用截留分子量为1000的透析袋先在50%的乙醇溶液中透析5次，再在去离子水中透析48h，冷冻干燥48h后制得脂肪烃基接枝的聚乙烯亚胺。

实施例3：脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的制备

（1）称取分子量为600的分枝状聚乙烯亚胺（bPEI₆₀₀）1g，溶于100ml二氯甲烷和甲醇(两者体积比为99:1)的混合溶剂中，在40℃下搅拌溶解；

（2）称取1-溴癸烷5.159g溶于50ml二氯甲烷和甲醇(两者体积比为99:1)的混合溶剂中，以15ml/h的速度滴加至上述聚乙烯亚胺溶液中，在40℃下，避光反应12h；

（3）所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂得到灰色半固体膏状物，将该灰色半固体膏状物混悬于10ml蒸馏水中，然后用截留分子量为500的透析袋先在60%的乙醇溶液中透析6次，再在去离子水中透析24h，冷冻干燥48h后制得脂肪烃基接枝的聚乙烯亚胺。

实施例4：脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的制备

（1）称取分子量为1200的分枝状聚乙烯亚胺（bPEI₁₂₀₀）1g，溶于100ml二氯甲烷和甲醇(两者体积比为90:10)的混合溶剂中，在30-40℃下搅拌溶解；

（2）称取1-溴十四烷4.292g溶于50ml二氯甲烷和甲醇(两者体积比为90:10)的混合溶剂中，以30ml/h的速度滴加至上述聚乙烯亚胺溶液中，在40℃下，避光反应48h；

（3）所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂得到灰白色半固体膏状物，将该灰白色半固体膏状物混悬于10ml蒸馏水中，然后用截留分子量为500的透析袋先在60%的乙醇溶液中透析4次，再在去离子水中透析48h，冷冻干燥48h后制得脂肪烃基接枝的聚乙烯亚胺。

实施例5：脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的制备

（1）称取分子量为1800的分枝状聚乙烯亚胺（bPEI₁₈₀₀）1g，溶于100ml二氯甲烷和甲醇(两者体积比为95:5)的混合溶剂中，在30-40℃下搅拌溶解；

（2）称取1-碘十二烷6.878g溶于50ml二氯甲烷和甲醇(两者体积比为95:5)的混合溶剂中，以20ml/h的速度滴加至上述聚乙烯亚胺溶液中，在40℃下，避光反应24h；

（3）所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂得到灰白色半固体膏状物，将该灰白色半固体膏状物混悬于10ml蒸馏水中，然后用截留分子量为500的透析袋先在50%的乙醇溶液中透析4次，再在去离子水中透析25h，冷冻干燥48h后制得脂肪烃基接枝的聚乙烯亚胺。

实施例6：脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺与质粒DNA复合颗粒的外观形态

取20μl质粒DNA浓度为20ng/μl的HBS溶液与等体积的浓度为60ng/μlbPEI₁₈₀₀-C₁₂-19.72(注：19.72表示C₁₂的取代度，本发明中的取代度是依照氢谱（¹H-NMR）积分计算得到的)的HBS溶液室温混合，孵育30min后，再用160μl HBS稀释后，取稀释后的溶液10μl滴入蜡块表面，另取表面膜化处理的铜网正面朝下覆于液滴上，放置5min后，取下铜网，用滤纸吸干铜网表面液体。取1%磷钨酸溶液2滴分别滴于蜡块表面，然后将吸附有复合颗粒的铜网正面朝下覆于磷钨酸液滴上，静置5min后，用镊子取下铜网，置于培养皿中，灯下烤干（约15min），透射电子显微镜（TEM）观察，结果见附图3。

由附图3中的外观形态可知，脂肪烃基（十二烷基）接枝的聚乙烯亚胺（bPEI1800）在HBS溶液中形成了胶束状结构。其中，疏水链十二烷基构成了疏水内核，bPEI1800质粒DNA的复合结构构成了花冠状亲水外壳，这种自组装行为提示由该接枝材料制备的复合颗粒在水溶液中具有较高的稳定性。

实施例7：脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的细胞毒性评价试验

将4T1细胞以4×10³/孔密度接种于96孔板中，培养24h后，吸弃旧培养基，分别加入含系列浓度（2、6、10μg/ml）的聚乙烯亚胺（bPEI₁₈₀₀）和脂肪烃基接枝的聚乙烯亚胺（bPEI₁₈₀₀-C₁₂-5.28、bPEI₁₈₀₀-C₁₂-12.5、bPEI₁₈₀₀-C₁₂-19.72、bPEI₁₈₀₀-C₁₂-25;5.28、12.5、19.72、25表示十二烷基C₁₂的取代度，其中bPEI₁₈₀₀-C₁₂-19.72是按照实施例1制备得到的接枝材料）的无血清RPMI1640培养基100μl，继续培养4h后，吸弃旧培养基，每孔分别加入含0.5mg/ml的MTT的培养基继续培养4h后，吸弃溶液，加入150μl DMSO溶解甲臢结晶，然后用酶标仪测定各孔在570nm处的OD值，以未加聚合物溶液孔的OD值作为对照，计算各聚合物作用条件下细胞的存活率，每组实验设置3个重复孔。从附图4可以看出，脂肪烃接枝后的聚乙烯亚胺在检测的各浓度条件下都保持了较好的细胞活力。

实施例8：脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的体外基因转染

将4T1细胞以4×10³/孔的密度接种于96孔中，培养24h后细胞融合度约达到85-90%，开始转染。将聚乙烯亚胺（bPEI1800）和脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺(bPEI1800-C₁₂-12.5、bPEI1800-C₁₂-19.72、bPEI1800-C₁₂-25;12.5、19.72、25数值表示十二烷基C₁₂的取代度)与质粒pGL4.50(表达萤火虫荧光素酶，购自Promega公司，6600bp)以不同质量比（3:1,5:1）在HBS缓冲液中等体积混合形成复合物（质粒DNA的浓度固定为20ng/μl），室温孵育30min。吸弃96孔板中的旧培养基，用PBS洗涤2次，每孔加入40μl含10%血清或无血清的RPMI1640培养基，然后每孔加入含有100ng pGL4.50的基因转染复合颗粒溶液10μl，培养4h后，每孔加入125μl含10%血清的RPMI1640培养基，继续培养20h后，取出培养板，吸弃旧培养基，用PBS洗2次，每孔加入1×细胞裂解液20μl，37℃振摇15min后，每孔取10μl裂解液加入50μl荧光素酶底物，用发光检测仪测定转染效率，同时用BCA蛋白定量试剂盒测定每孔的蛋白含量，最终计算每孔单位蛋白含量的荧光素酶的表达（每微克蛋白的荧光素酶活力，LA/μg蛋白）。分别以lipofectamine2000和分子量为22K的直线型PEI（lPEI22K）作为阳性对照。结果见附图5。

从附图5可知，接枝后的材料在有血清条件下转染4T1细胞表达荧光素酶的活力大大高于无血清条件；且在有血清条件下，接枝后的材料转染荧光素酶的活力提高到接枝前的160倍，荧光素酶活力与接枝前相比极大提高；另外，在有血清条件下接枝材料转染荧光素酶的活力与市售转染试剂脂质体2000（lipofectamine2000）相当，表明脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺是一种十分高效的转染试剂，具有非常好的研发前景。

Claims (9)

1.一种脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺，其特征在于，其分子式如下：

式中，x和y表示重复单元的个数；R基团为脂肪烃基CH₃(CH₂)_n-，n表示亚甲基CH₂的个数，聚乙烯亚胺的分子量为100-2000g/mol。

2.根据权利要求1所述的脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺，其特征在于，脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的分子式中，x与y之间满足x=2y的配比关系；脂肪烃基CH₃(CH₂)_n-中的n=6～14，即脂肪烃基是己烷基、庚烷基、辛烷基、壬烷基、癸烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基，优选己烷基和十二烷基。

3.根据权利要求1或2所述的脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将聚乙烯亚胺溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，在30-40℃下搅拌溶解，得到聚乙烯亚胺溶液；

（2）将溴代或碘代脂肪烃溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，以一定速度滴加至聚乙烯亚胺溶液中，在30-40℃下，避光反应12-48h；

（3）将所得混合溶液旋干溶剂得到半固体膏状物，将该半固体膏状物混悬于5-10ml蒸馏水中，然后用一定截留分子量的透析袋进行透析，冷冻干燥后制得脂肪烃基接枝的聚乙烯亚胺。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，二氯甲烷和甲醇混合溶剂的体积比为90:10-99:1。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，透析方法为先用40-60%乙醇溶液透析4-6次，再用去离子水透析24-48h。

6.根据权利要求1或2所述的脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺用于制备体内或体外核酸递送载体的应用。

7.根据权利要求6所述的脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的应用，其特征在于，作为体内或体外核酸递送载体时，递送的质粒DNA的大小为1-30Kb。

8.根据权利要求6所述的脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的应用，其特征在于，作为体内或体外核酸递送载体时，递送的siRNA的大小为15-30bp。

9.根据权利要求6所述的脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺的应用，其特征在于，作为体内或体外核酸递送载体时，脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺与核酸的质量比为1:1-20:1，优选3:1-10:1。