CN101148680B - 由纳米粒子将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由纳米粒子将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞的方法。其过程包括：选择生长状态良好的细胞接种于细胞培养板培养；将无机盐纳米粒子悬液离心、弃上清后，将沉淀溶于500ul去离子水中；吸取2ul质粒溶于98ul去离子水；取含有5～10mg纳米粒子的溶液与含有4～15ug质粒的溶液配成总体积为1ml的悬液摇匀，使纳米粒子与质粒充分结合；将充分结合的悬液离心、弃上清，在沉淀中加入离子水混匀后加入细胞培养板中，加入新鲜培养液，培养，使与质粒充分结合的纳米粒子转染入细胞；最后通过显微镜观察转染效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞的方法，尤其是一种由纳米粒子将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞的方法。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种由双链RNA诱发的“基因沉默”。在此过程中，致病细胞中与双链RNA有同源序列的信使RNA被降解，从而抑制了致病基因的表达，RNA干扰技术在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景。siRNA是一种用于RNA干扰的短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，可以作为一种具有靶向性的基因治疗药物。
siRNA药物包括化学合成的siRNA、表达siRNA的载体(表达siRNA的质粒、表达siRNA的病毒)。表达siRNAs的载体通常含有RNA聚合酶III启动子或RNA聚合酶II启动子序列，首先转录生成与miRNA前体相似的shRNA，然后在细胞内变成siRNA发挥基因沉默效应.在活体内和培养组织细胞中应用表达siRNA的载体能够长时间整合到基因组中并“敲除”内源性基因。要使siRNA成功地应用于癌症和传染病的治疗，siRNA药物必须具备下列条件：足够小，能穿过细胞膜，进入细胞；不被细胞内的核酸酶降解；可到达细胞适宜的部位；连接载体后在细胞中能正确折叠；能返回特定的靶细胞，如巨噬细胞、T细胞、造血干细胞，从而实现载体的降解或药效。因此，开发出一种安全、有效具特异性又无不良反应的体系作为siRNA药物导入系统，是一个迫切的问题。
目前，通常采用微量注射法、电穿孔法、脂质体法、浸泡法、工程菌喂养法、转基因法和病毒感染法将siRNA药物导入到哺乳动物细胞中。迄今为止，最有效的导入方法是利用表达siRNA的病毒载体感染法，但是由于病毒系统的局限性，如安全性、致瘤性与免疫源性，有限的DNA装载量，载体组装难度大，花费高等缺点使其应用受到了很大限制。例如，1999年9月13日，美国宾州大学人类基因治疗研究所利用腺病毒作载体对18岁患者Gelsinger作鸟氨酸氨基甲酰转移酶基因治疗.4天后患者死亡.死亡原因为腺病毒引起的免疫反应导致重症肝炎，多器官功能衰竭，这些都阻碍了基因治疗的临床应用。
随着纳米生物技术的飞速发展，以纳米材料为基础的非病毒载体系统——纳米材料载体系统的出现为基因治疗注入了新的活力。利用纳米材料携带表达siRNA的质粒载体进入哺乳动物细胞，具有如下的优点：低免疫原性；在很小的体积中也可存储相对较大的基因片断；可对插入其中的DNA片断有很好的保护作用。
人端粒酶反转录酶(Human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因是肿瘤治疗的理想分子靶标。hTERT是端粒酶复合体的重要组成部分，在80％～90％的肿瘤细胞中表达，且和端粒酶活性间有高度相关性，是端粒酶活性的限速因子。hTERT siRNA表达载体具有抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的作用，目前已经有文献报道hTERT siRNA表达载体可以抑制人宫颈癌HeLa细胞、膀胱癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、鼻咽癌细胞等肿瘤细胞的增殖，能够促进HeLa细胞、舌鳞癌细胞等肿瘤细胞的凋亡，转染方法包括电穿孔法、脂质体法、聚酰胺-胺型树枝状高聚物(G5 PAMAM-D)纳米微球介导法等，研究显示纳米微球介导法对hTERT mRNA表达抑制的效果好于脂质体法。
CN100335038C号专利文献公开了一种含有生物活性物质和中药成分包封的无机盐纳米粒子的制备方法，但是，这种无机盐纳米粒子能否介导质粒转染细胞，未作报道。
发明内容
本发明的目的在于：针对目前把治疗基因有效的转运到靶细胞中的传统载体在实际运用中存在的实际问题，选择一种新的载体，并提供一种由纳米将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞的方法。
本发明的目的是这样实现的：一种由纳米粒子将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞的方法，其特征在于：
a)生长状态良好的细胞，隔夜培养，0.25％的胰酶消化，细胞计数后取1×106的细胞接种12孔板，加入新鲜培养基DMEM，在37℃、5％CO2条件下培养，24小时后换液一次，转染前24h将适量细胞重新接种于12孔中细胞培养板的各孔，贴壁细胞在长满底面积80％时进行转染；
b)取无机盐纳米粒子净含量为20～30mg的悬液，于4摄氏度，8500rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀溶于500ul去离子水中，分装成5份，每份100ul；
c)吸取2ul质粒溶于98ul去离子水，分光光度计测出质粒载体浓度1084ug/ml，纯度1.65；
d)将b)步骤中获得的纳米粒子含量为5～10mg的溶液与c)步骤中获得的质粒含量为4～15ug的溶液配成总体积为1ml的悬液，于4摄氏度，96rpm，4小时摇匀，使纳米粒子与质粒充分结合；
e)取摇匀后的纳米粒子悬液1ml于4摄氏度，8500rpm，离心15分钟，弃上清，沉淀中加入200ul去离子水，混匀，均匀加入12孔中细胞培养板中的4孔，轻摇使之混合均匀，再于每孔中加入2ml新鲜培养液，在37℃、5％CO2条件下过夜培养，使与质粒充分结合的纳米粒子转染入细胞；
f)24小时后于显微镜下观察，含有基因治疗片段的质粒载体被导入细胞。
在本发明的技术方案中：所述的细胞为胶质瘤细胞；所述的质粒为含有基因治疗片段的质粒载体，其中：基因治疗片段取自GenBank中No.NM003219的人端粒酶反转录酶(hTERT)基因，含有基因治疗片段的质粒载体是指将人端粒酶反转录酶(hTERT)基因接入质粒载体pGCsi-H1/neo/GFP；所述的于显微镜下观察是指通过激光共聚焦显微镜或荧光倒置显微镜进行观察。
在本发明的技术方案中：所述的新鲜培养基DMEM中含有10％的胎牛血清。
在本发明的技术方案中：所述的无机盐纳米粒子为中药成分包封的无机盐纳米粒子。
在本发明的技术方案中：所述的中药成分包封的无机盐纳米粒子为黄芪多糖包封成分的无机盐纳米粒子。
本发明的优点在于：以纳米粒子为基础的非病毒载体系统与目前迄今为止最有效的基因转移方法中的病毒载体相比有如下的优点：无毒性，无免疫原性，增加细胞对基因的转染率，在很小的体积中也可存储相对较大的基因片断，可对插入其中的DNA片断有很好的保护作用；无机盐纳米粒子可以在体内生物降解，包封黄芪多糖成分的无机盐纳米粒子可以改善无机盐纳米粒子的理化特性，提高携带基因片断的能力，对插入其中的DNA片断有很好的保护作用。
附图说明
图1是显微镜下观察的生长状态良好的胶质瘤U251细胞；
图2是激光共聚焦显微镜下观察的人胶质瘤细胞U251转染纳米粒子后的情况；
图3是荧光倒置显微镜下观察的人胶质瘤细胞U251转染纳米粒子后的情况；
图4是与本发明效果相关的电泳图。
具体实施方式
实施例1：
制备中药成分包封的无机盐纳米粒子
制备前的准备
盐溶液：用去离子水制备0.01～1.0摩尔的氯化锰(或氯化镁，或氯化钙溶液)。
磷酸溶液：用去离子水制备0.01～1.0摩尔的磷酸溶液。
中药的活性物质溶液：按每100ml生理盐水+1mg黄芪多糖的比例制备中药黄芪多糖的活性物质溶液。
pH值为7.0，0.01摩尔的磷酸缓冲液可以外购。
制备过程如下：
a)制备无机盐纳米粒子：
将0.01～1.0摩尔的盐溶液、0.01～1.0摩尔的磷酸溶液按1∶1混合置于搅拌器后，在4℃下搅拌48小时，再通过超声波破碎仪超声处理15分钟，然后在4℃下，经过高速离心机在转速为8500rpm离心15分钟，去除上清液，用去离子水悬浮粒子，在5mg/ml的浓度形成无机盐粒子，其大小尺寸为100nm～800nm；
b)包封中药的活性物质：
室温下，将无机盐纳米粒子、中药的活性物质(本实施例为中药黄芪多糖的活性物质溶液)按1∶10混合后，按10mg/ml的浓度悬浮在pH值7.0，0.01摩尔的磷酸缓冲液中，4℃下在摇床上摇动2小时，然后在4℃下，经过高速离心机在转速为8500rpm离心三次，每次15分钟，获得中药成分包封的无机盐纳米粒子。
获得的中药成分(黄芪多糖)包封的无机盐纳米粒子应该贮存于4℃或通过冷冻干燥机冷冻干燥后备用。
实施例2
由纳米粒子将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞的方法
制备前的准备
1、细胞：人脑胶质瘤细胞U251购自上海生科院细胞资源中心。
2、质粒：含有基因治疗片段的质粒载体，是将人端粒酶反转录酶(hTERT)基因接入质粒载体pGCsi-H1/neo/GFP，其中：基因治疗片段取自GenBank中No.NM 003219的人端粒酶反转录酶(hTERT)基因，可以通过人类基因库获得；质粒载体pGCsi-H1/neo/GFP由中国吉凯公司提供。
3、无机盐纳米粒子，按照实施例1的方法制备。
制备过程
a)生长状态良好的人脑胶质瘤细胞U251，隔夜培养，0.25％的胰酶消化，细胞计数后取1×106的细胞接种12孔板，加入新鲜培养基DMEM(DMEM中含有10％的胎牛血清)，在37℃、5％CO2条件下培养，24小时后换液一次，转染前24h将细胞U251重新接种于12孔中细胞培养板的各孔，贴壁细胞U251在长满底面积80％时进行转染；
b)取无机盐纳米粒子净含量为20～30mg的悬液，于4摄氏度，8500rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀溶于500ul去离子水中，分装成5份，每份100ul；
c)吸取2ul质粒溶于98ul去离子水，分光光度计测出质粒载体浓度1084ug/ml，纯度1.65；
d)将b)步骤中获得的纳米粒子含量为5～10mg的溶液与c)步骤中获得的质粒含量为4～15ug的溶液配成总体积为1ml的悬液，于4摄氏度，96rpm，4小时摇匀，使纳米粒子与质粒充分结合；
e)取摇匀后的纳米粒子悬液1ml于4摄氏度，8500rpm，离心15分钟，弃上清，沉淀中加入200ul去离子水，混匀，均匀加入12孔中细胞培养板中的4孔，轻摇使之混合均匀，其余各孔作为对照，再于每孔中加入2ml新鲜培养液，在37℃、5％CO2条件下过夜培养，使与质粒充分结合的纳米粒子转染入细胞；
f)24小时后于显微镜下观察，含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞。
在本实施例的d)步骤中，将b)步骤中获得的纳米粒子含量分别为1mg、5mg、10mg的溶液与c)步骤中获得的质粒含量分别为5ug、10ug、20ug的溶液配成总体积为1ml的悬液，于4摄氏度，96rpm，4小时摇匀，使纳米粒子与质粒充分结合，其试验结果见表1
表1纳米粒子与质粒采用不同混合比例的包封率
由表1可见，当采用10毫克纳米粒子与10微克质粒的混合比例配成总体积为1ml的悬液，其包封率可达98.3％。
实施例3
由纳米粒子将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞的效果：
图1是取自对照的生长状态良好的胶质瘤细胞U251，通过荧光倒置显微镜(Nikon Eclipse TE 2000-S)的观察结果。
图2可见，采用实施例2的方式转染完成后，将长满细胞的盖玻片置于激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM510，40×(放大倍数))下观察人胶质瘤细胞U251转染纳米粒子后的情况，在激光共聚焦显微镜下可以看到，转染纳米粒子后的胶质瘤细胞生长状态良好(如箭头所指)，其中绿色部分是转染成功后GFP(绿色荧光蛋白)表达产生的绿色荧光(见黑白图箭头前端泛白处)。
图3可见，采用实施例2的方式转染完成后，将长满细胞的盖玻片置于荧光倒置显微镜(Nikon Eclipse TE 2000-S)下观察人胶质瘤细胞U251转染纳米粒子后的情况，在荧光倒置显微镜下可以看到，转染纳米粒子后(如箭头所指)，转染成功后GFP表达同样产生的绿色荧光(见黑白图箭头前端泛白处)。
图4是对本发明进行基因包封的过程，通过电泳图来判断本发明对基因的结构和功能的影响，图中：第1电泳道：基因标准品；第2电泳道：从质粒包封的纳米粒子上分解下来的质粒；第3电泳道：没有与纳米结合的质粒。由图4可见，第2和第3两个电泳道所显示的基因条带在数量和位置上完全相同，说明包封在纳米上的基因不会因包封过程而被降解和丧失功能。
由纳米粒子将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞的转染率能达到86％，该转染率虽然低于病毒载体感染法的转染率，确比目前商业化的脂质体要高出近一倍左右。
采用病毒载体感染法具有它的局限性：首先是其安全性问题，病毒载体对于治疗者存在许多潜在的危险性，如细胞毒性，免疫原性和炎症反应，应用病毒载体感染法还可出现插入诱变和导致肿瘤的危险；其次，在病毒载体感染法中，只有小片段的DNA能够插入到病毒基因组中，而大片段的DNA则很难插入其中。而本发明却不存在此类风险和隐患，纳米粒子将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞具有很大的优势。
以上各实施例不是对本发明的具体限制。
Claims (3)
1.一种由纳米粒子将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞的方法，其特征在于：
a)生长状态良好的细胞，隔夜培养，0.25％的胰酶消化，细胞计数后取1×106的细胞接种于12孔板，加入新鲜培养基DMEM，在37℃、5％CO2条件下培养，24小时后换液一次，转染前24h将适量细胞重新接种于12孔中细胞培养板的各孔，贴壁细胞在长满底面积80％时进行转染；
b)取无机盐纳米粒子净含量为20～30mg的悬液，于4摄氏度，8500rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀溶于500ul去离子水中，分装成5份，每份100ul；
c)吸取2ul质粒溶于98ul去离子水，分光光度计测出质粒载体浓度1084ug/ml，纯度1.65；
d)将b)步骤中获得的纳米粒子含量为5～10mg的溶液与c)步骤中获得的质粒含量为4～15ug的溶液配成总体积为1ml的悬液，于4摄氏度，96rpm，4小时摇匀，使纳米粒子与质粒充分结合；
e)取摇匀后的纳米粒子悬液1ml于4摄氏度，8500rpm，离心15分钟，弃上清，沉淀中加入200ul去离子水，混匀，均匀加入12孔中细胞培养板中的4孔，轻摇使之混合均匀，再于每孔中加入2ml新鲜培养液，在37℃、5％CO2条件下过夜培养，使与质粒充分结合的纳米粒子转染入细胞；
f)24小时后于显微镜下观察，含有基因治疗片段的质粒载体被导入细胞；
所述的无机盐纳米粒子为黄芪多糖包封的无机盐纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的由纳米粒子将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞的方法，其特征在于：所述的细胞为胶质瘤细胞；所述的质粒为含有基因治疗片段的质粒载体，其中：基因治疗片段取自GenBank中No.NM 003219的人端粒酶反转录酶Htert基因，含有基因治疗片段的质粒载体是指将人端粒酶反转录酶hTERT基因接入质粒载体pGCsi-H1/neo/GFP；所述的于显微镜下观察是指通过激光共聚焦显微镜或荧光倒置显微镜进行观察。
3.根据权利要求1所述的由纳米粒子将含有基因治疗片段的质粒载体导入细胞的方法，其特征在于：所述的新鲜培养基DMEM中含有10％的胎牛血清。
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