CN109381705A - 具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡及其制备方法 - Google Patents

具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡及其制备方法。合成了三嵌段聚合物PEG‑P(TMC‑DTC)‑PEI、PEG‑P(DLLA‑DTC)‑PEI自组装、自交联后得到具有不对称膜结构的聚合物囊泡，或者接有靶向分子自组装得到靶向RCCPs，内壳为PEI用于通过静电相互作用复合和装载核酸；膜为可逆交联的生物可降解且生物相容性好的聚酯/聚碳酸酯，侧链的二硫戊环类似人体天然抗氧化剂硫辛酸，外壳为以PEG为背景、可靶向癌细胞。研究载体复合功能性siRNA、其体内外基因沉默效果、体内血液循环及生物分布、治疗荷原位肺癌小鼠的情况和毒副作用，其有望成为集简易、稳定、多功能等优点于一身的纳米系统平台，用于高效、主动靶向输送siRNA至原位肿瘤。

Description

具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡及其制 备方法
本发明属于发明名称为具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡及其制备方法与在核酸药物中的应用、申请日为2016年6月30日、申请号为201610501766.7专利申请的分案申请，属于产品技术部分。
技术领域
本发明属于药物载体技术，具体涉及一种具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡及其制备方法。
背景技术
基因疗法是指把具有特异性功能的基因通过一定方法输送到生物体特异性组织细胞来治疗疾病的过程。利用已能精准识别的多种致病基因来替代组织细胞内的病变基因或抑制病变基因的表达，已可以治愈多种遗传性疾病；也可通过递送功能性基因促进细胞内蛋白的合成、调控毒性蛋白或药物前体活化酶的合成来治疗非遗传性疾病。但是基因药物易被血清中的核酸酶降解，且进入细胞能力差因此很难细胞核进行基因转染。因此设计能够保护DNA不被降解且安全输送进入靶细胞核的载体十分重要。
近年来，小干扰RNAs(siRNA)作为一种新型核酸药物用于治疗包括癌症在内的多种不治之症。值得注意的是，治疗眼疾及呼吸道疾病的一系列siRNA正在临床试验中。不同于DNA的是，siRNA的分子量小21-23个碱基对，只需要在细胞质中，而不需要进入细胞核发挥作用，具有巨大的应用潜力。然而，同样由于非特异性脱靶、免疫源性高、siRNA易于降解和细胞摄取低等问题，siRNAs进一步发展成为抗肿瘤药物仍然面临巨大挑战，探究载体如何高效复合递送siRNA成为一个迫切需要科学家解决的难题。
以病毒为核酸药物的载体是利用灭活后的病毒衣壳来携带核酸进入细胞，虽然转染效率很高，但安全性堪忧，存在高免疫原性和潜在的致癌性。因此非病毒基因载体尤其是阳离子聚合物基因载体成为研究的热点。聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）是继聚赖氨酸之后研究最多的聚合物转染试剂，具有较高的正电荷密度，每隔二个碳原子就是一个可质子化的氨基氮原子，使聚合物网络在任何pH下都能充当有效的质子海绵体(protonsponge)。支化结构的PEI具有伯、仲、叔三种胺，具有比线性更好的基因复合效率和转染效率。但是研究发现现有PEI载体存在基因复合和转染效率高但细胞毒性很大、细胞毒性虽小但其基因复合和转染效率差的缺陷。用含阳离子的脂质体和聚离子复合物等纳米载体来装载核酸的研究结果也并不令人满意，存在着体内不稳定、靶向性差、基因复合和转染效率不高、仍有细胞毒性的问题。目前尚无能同时解决这些问题的方案。
发明内容
本发明的目的是公开一种具有不对称膜结构的可逆交联的生物可降解聚合物囊泡。
为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡，由聚合物自组装后交联得到；所述聚合物的分子链包括依次连接的亲水链段、疏水链段以及PEI分子；所述疏水链段包括聚碳酸酯链段和/或聚酯链段；所述亲水链段的分子量为3000-10000Da；疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2.3-8.4倍；PEI分子的分子量为亲水链段分子量的20%-60%
优选的，本发明的聚合物化学结构式如下：
其中，R1选自以下基团中的一种：
R2选自以下基团中的一种：
、；
PEI的化学结构式如下：
、
本发明的聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）为支化和线性两种，得到聚合物的化学结构式为以下结构式中的一种：
所述聚合物中，PEG的分子量为3000-10000Da；PTMC或PDLLA的总分子量为PEG分子量的2-6倍；PDTC的总分子量为PTMC或PDLLA总分子量的15%-40%；PEI分子的分子量为PEG分子量的20%-60%。
本发明的聚合物中，限定PEI的结构与分子量，作为载体时毒性小，结合PEG链段与疏水链段，可以形成良好的药物包载效果，即使当siRNA含量高达80 wt.%，该囊泡仍可以完全、紧实包裹siRNA；同时本发明的聚合物避免了现有PEI通过物理缠绕的方式结合核酸带来的不稳定、带正电易与细胞结合而迁移力差、释放效率差的缺陷；通过静电作用力结合核酸，再被交联的囊泡膜和外界分隔，避免在输送过程被细胞黏附而造成损失和毒副作用，能够高效迁移至病灶处，并在体内高浓度盐和还原剂GSH的作用下，快速释放核酸药物，解决疾病问题。
本发明中，聚合物囊泡为具有不对称膜结构的还原敏感可逆交联、细胞内可解交联的生物可降解聚合物囊泡；所述聚合物为PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI，即聚合物由PEG亲水链段、疏水链段以及PEI分子组成，其中疏水链段的结构为：
；
当R2为时，为PTMC链段；当R2为时，为PDLLA链段，即疏水链段由PTMC-PDTC或者PDLLA-PDTC组成。
优选方案为：PEG分子量为4000-8000Da；PTMC或PDLLA总分子量为PEG分子量的2.5-5倍；PDTC总分子量为PTMC或PDLLA总分子量的18%-38%；PEI的分子量为PEG单元分子量的25%-50%。
上述三嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI，其中中间嵌段的TMC或者DLLA与DTC呈无规排列；PEI分子量小于PEG分子量，在自组装、交联后得到具有不对称膜结构的交联的聚合物囊泡，囊泡膜的内壳为PEI用于复合核酸药物如DNA和siRNA，并能通过质子海绵效应逃逸内涵体；囊泡膜为可逆交联的生物可降解且生物相容性好的PTMC或者PDLLA，侧链的二硫戊环类似人体天然的抗氧化剂硫辛酸，可提供还原敏感的可逆交联，不但支持生物药物在血液中的长循环，还可保证在细胞内快速解交联，释放核酸药物到靶细胞细胞内。
本发明还公开了上述具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡的制备方法，包括以下步骤：
（1）将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(DLLA-DTC)的末端用羟基活化剂比如氯甲酸对硝基苯酯NPC活化，再与PEI反应制得PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI；
（2）在PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)–PEI的PEG端偶联肿瘤特异性靶向分子，得到靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者靶向PEG-P(DLLA-DTC)-PEI；
（3）以PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI为原料，通过溶剂置换法制备具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI为原料，通过溶剂置换法制备肿瘤靶向、具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(DLLA-DTC)-PEI和靶向PEG-P(DLLA-DTC)-PEI为原料，通过溶剂置换法制备肿瘤靶向、具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)为原料，通过溶剂置换法制备具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(DLLA-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)为原料，通过溶剂置换法制备具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡。
优选以PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)为原料，或者以PEG-P(DLLA-DTC)-PEI和靶向PEG-P(DLLA-DTC)为原料，共混自组装、装载核酸、交联得到肿瘤主动靶向、具有不对称膜结构的聚合物囊泡，外壳为以PEG为背景、靶向分子对癌细胞可高特异性结合，增加载体的靶向性。靶向分子可以为多肽cNGQ、cRGD及CC9或是叶酸、半乳糖。比如通过PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI和偶联了肿瘤主动靶向分子的二嵌段聚合物如cNGQ-PEG-P(TMC-DTC)混合，共自组装、装载核酸、交联后得到肿瘤主动靶向、具有不对称膜结构的聚合物囊泡(cNGQ/RCCPs)；所述cNGQ-PEG-P(TMC-DTC)的化学结构式为：
。
上述制备方法，具体包括以下步骤：
步骤（1）为将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(DLLA-DTC)、羟基活化剂氯甲酸对硝基苯酯NPC溶于干燥的溶剂中反应，然后沉淀、过滤、真空干燥得到活化的PEG-P(TMC-DTC)-NPC或者PEG-P(DLLA-DTC)-NPC；将PEG-P(TMC-DTC)-NPC或者PEG-P(DLLA-DTC)-NPC溶液滴加到PEI溶液中反应后，透析、沉淀、抽滤、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI；步骤（2）为将得到聚合物溶于带有靶向分子的有机溶剂如DSMO或DMF中；步骤（3）为将原料溶液中加入非离子缓冲溶液中如HEPES，室温放置少许后在相同缓冲溶液中透析，室温孵育交联，得到具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡。本发明可以在加或不加还原剂如二硫代苏糖醇（DTT）和谷胱甘肽（GSH）下室温交联得到具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡。
比如：
将PEG-P(TMC-DTC)的末端羟基用羟基活化剂氯甲酸对硝基苯酯NPC活化，再与PEI的端基伯胺反应制得PEG-P(TMC-DTC)-PEI，具体为，PEG-P(TMC-DTC)和NPC溶于干燥的二氯甲烷(DCM)中冰水浴下反应12-24小时，然后在冰乙醚中沉淀、过滤、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-NPC；然后将PEG-P(TMC-DTC)-NPC溶于干燥DCM，滴加到PEI的DCM中30-40℃下反应12-24小时后，在DCM和甲醇(体积比为1:1)的介质中透析24-48小时，接着沉淀、抽滤、真空干燥得到产物PEG-P(TMC-DTC)-PEI；
以PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)为原料，通过溶剂置换法制备具有不对称膜结构的自交联聚合物囊泡；具体为把PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)的DMDO溶液混合后加入HEPES缓冲液中，室温下放置过夜、透析、加或不加还原剂如二硫代苏糖醇（DTT）和谷胱甘肽（GSH）孵育4 h，得到具有不对称膜结构的交联聚合物囊泡。
本发明进一步公开了一种抗肿瘤药物，由上述具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡装载核酸药物得到，如DNA或siRNA。本发明的药物以主动靶向、还原敏感可逆交联的纳米囊泡为载体、装载核酸，在小鼠体内治疗肿瘤表现了卓越的疗效和低毒性。
上述抗肿瘤药物的制备方法，为以下制备方法中的一种：
（1）将PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液与核酸缓冲溶液、非离子缓冲溶液混合，室温下放置，然后透析、交联，得到抗肿瘤药物；
（2）将PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液与核酸缓冲溶液、非离子缓冲溶液混合，室温下放置，然后透析、交联，得到抗肿瘤药物；
（3）将PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液与核酸缓冲溶液、非离子缓冲溶液混合，室温下放置，然后透析、交联，得到抗肿瘤药物；
（4）将PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)溶液与核酸缓冲溶液、非离子缓冲溶液混合，室温下放置，然后透析、交联，得到抗肿瘤药物；
（5）将PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(DLLA-DTC)溶液与核酸缓冲溶液、非离子缓冲溶液混合，室温下放置，然后透析、交联，得到抗肿瘤药物。
本发明中，室温孵育交联，得到抗肿瘤药物。优选的，将PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液与核酸siRNA溶液混合，再加入非离子缓冲溶液中如HEPES中，室温下放置，然后透析、室温孵育交联，得到抗肿瘤药物；将PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液与核酸siRNA溶液混合，再加入非离子缓冲溶液中如HEPES中，室温下放置，然后透析、室温孵育交联，得到抗肿瘤药物；将PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液与核酸siRNA溶液混合，再加入非离子缓冲溶液中如HEPES中，室温下放置，然后透析、室温孵育交联，得到抗肿瘤药物；将PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)溶液与核酸siRNA溶液混合，再加入非离子缓冲溶液中如HEPES中，室温下放置，然后透析、室温孵育交联，得到抗肿瘤药物；将PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(DLLA-DTC)溶液与核酸siRNA溶液混合，再加入非离子缓冲溶液中如HEPES中，室温下放置，然后透析、室温孵育交联，得到抗肿瘤药物。
优选的，将核酸DNA溶液、非离子缓冲溶液中如HEPES混合，再加入PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液，室温下放置，然后透析、室温孵育交联，得到抗肿瘤药物；将核酸DNA溶液、非离子缓冲溶液中如HEPES混合，再加入PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)溶液，室温下放置，然后透析、室温孵育交联，得到抗肿瘤药物；将核酸DNA溶液、非离子缓冲溶液中如HEPES混合，再加入PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(DLLA-DTC)溶液，室温下放置，然后透析、室温孵育交联，得到抗肿瘤药物；将核酸DNA溶液、非离子缓冲溶液中如HEPES混合，再加入PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液，室温下放置，然后透析、室温孵育交联，得到抗肿瘤药物；将核酸DNA溶液、非离子缓冲溶液中如HEPES混合，再加入PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液，室温下放置，然后透析、室温孵育交联，得到抗肿瘤药物。
其中，聚合物溶液、核酸溶液和非离子缓冲溶液三者共同混合得到包载核酸药物的具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡，优选条件为聚合物溶液与siRNA溶液混合后再加入HEPES中，或聚合物溶液加入至含DNA的HEPES缓冲溶液中。
本发明还公开了上述具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡作为核酸药物载体的应用，比如作为siRNA和DNA载体的应用。
本发明还公开了上述具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡在制备生物抗肿瘤药物中的应用。
本发明还公开了一种聚合物，其特征在于，所述聚合物的化学结构式如下：
其中， R1选自以下基团中的一种：
R2选自以下基团中的一种：
、；
PEI的化学结构式如下：
、
所述聚合物中，PEG的分子量为3000-10000Da；PTMC或PDLLA的总分子量为PEG分子量的2-6倍；PDTC的总分子量为PTMC或PDLLA总分子量的15%-40%；PEI分子的分子量为PEG单元分子量的20%-60%。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1. 本发明设计了具有不对称膜结构的交联聚合物囊泡用于核酸的体内传递；首先合成了三嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-PEI，PEI分子量为PEG分子量的20%-60%，在聚合物自组装、交联后得到具有不对称膜结构的交联的聚合物囊泡，囊泡膜的内壳为PEI用于复合核酸如siRNA和DNA；囊泡膜为可逆交联的生物可降解且生物相容性好的PTMC，侧链的二硫戊环类似人体天然抗氧化剂硫辛酸，可提供还原敏感的可逆交联，不但支持纳米药物在血液中长循环，还可保证在细胞内快速解交联，释放核酸到靶细胞细胞内；外壳以PEG为背景同时具有靶向分子，对癌细胞可高特异性结合。
2. 本发明通过对具有不对称膜结构的交联聚合物囊泡来复合功能性siRNA和DNA药物、其体内外基因沉默效果、体内血液循环及生物分布、治疗荷原位肺癌小鼠的情况和毒副作用研究，表明该囊泡装载核酸体系拥有多种独特优点，包括制备的简易操控性、杰出的生物相容性、对核酸极好的控制释放性(生理条件泄漏量低/肿瘤细胞内快速释放)、超强的体内循环稳定性、对癌细胞的优越靶向性、显著的特异性基因沉默能、卓越的抑制肿瘤生长和转移的能力；因此，本发明的囊泡体系有望成为集便捷、稳定、多功能等优点于一身的纳米系统平台，用于高效、主动靶向输送核酸药物至肿瘤包括原位肿瘤。
3. 本发明设计了一种具有不对称膜结构的、还原敏感可逆交联、细胞内可解交联的生物可降解聚合物囊泡，其囊泡膜的内表面由低分子量的PEI（600-6000Da）组成，用于高效装载核酸，交联的囊泡膜可保护核酸不被降解，并可在体内长循环，囊泡的纳米尺寸以及肿瘤特异性靶向使得囊泡可输送核酸高效进入肿瘤细胞，在细胞内的还原环境下，囊泡解交联，核酸解离释放进入细胞质；这里限定的低分子量PEI作为载体时毒性小，在结合PEG链段与疏水链段后却可以形成良好的药物包载效果；同时本发明的聚合物避免了现有PEI通过静电相互作用结合核酸形成的复合物带来的不稳定、带正电易与细胞结合而迁移力差、释放效率差的缺陷。
4.本发明的具有不对称膜结构的聚合物囊泡为交联囊泡，PEI配合亲水链段以及疏水链段，从而具有稳定的结构，在体内循环良好，能够即使当siRNA含量高达80 wt.%，该囊泡仍可以完全、紧实包裹siRNA，证明siRNA-cNGQ/RCCPs稳定性优异，当它在10 mM GSH存在下孵育20 h后发现，由于交联囊泡的解交联及溶胀大部分siRNA释放出来；是一种良好的siRNA控释载体，用于肿瘤治疗。
附图说明
图1是实施例一中PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k核磁谱图；
图2为实施例七中载siScramble交联囊泡siScramble-cNGQ/RCCPs的粒径分布及TEM图；
图3为实施例九中载DNA交联囊泡DNA-RCCPs的凝胶电泳图
图4 是实施例十二中载siScramble交联囊泡siScramble-cNGQ/RCCPs的凝胶电泳图；
图5 是实施例十三中载siRNA交联囊泡siCy5-cNGQ/RCCPs对A549肺癌细胞的流式结果图；
图6是实施例十三中载siRNA交联囊泡siCy5-cNGQ/RCCPs对A549肺癌细胞的共聚焦显微镜（CLSM）结果图；
图7是实施例十四中载siGL3交联囊泡siGL3-cNGQ/RCCPs对A549-Luc肺癌细胞的荧光素基因沉默结果图；
图8为实施例十五中载siPLK1交联囊泡siPLK1-cNGQ/RCCPs对A549-Luc肺癌细胞的PLK1基因沉默结果图；
图9为实施例十六中载siGL3交联囊泡siGL3-cNGQ/RCCPs对A549-Luc肺癌细胞的细胞毒性结果图；
图10为实施例十六中载siGL3交联囊泡siGL3-cNGQ/RCCPs对A549-Luc原位肺癌模型的基因沉默图；
图11为实施例十六中载siGL3交联囊泡siGL3-cNGQ/RCCPs对A549-Luc原位肺癌模型的基因沉默定量图；
图12为是实施例十八中载siRNA交联囊泡siCy5-cNGQ/RCCPs对A549-Luc原位肺癌模型的药代动力学结果图；
图13为是实施例十八中载siRNA交联囊泡siCy5-cNGQ/RCCPs对A549-Luc原位肺癌模型的成像结果图；
图14为是实施例十九中载siRNA交联囊泡siCy5-cNGQ/RCCPs对A549-Luc原位肺癌模型的体外荧光成像图；
图15为是实施例十九中载siRNA交联囊泡siCy5-cNGQ/RCCPs对A549-Luc原位肺癌模型的生物分布图；
图16为实施例二十中载siPLK1交联囊泡siPLK1-cNGQ/RCCPs对A549-Luc原位肺癌模型的治疗成像图；
图17为实施例二十中载siPLK1交联囊泡siPLK1-cNGQ/RCCPs对A549-Luc原位肺癌模型治疗后的器官成像图；
图18为实施例二十中载载siPLK1交联囊泡siPLK1-cNGQ/RCCPs对A549-Luc原位肺癌模型的治疗实验，其中A为荧光定量曲线，B为小鼠治疗后肺部图片，C为体重变化曲线，D为生存曲线；
图19为实施例二十中载siPLK1交联囊泡siPLK1-cNGQ/RCCPs对A549-Luc原位肺癌模型治疗后各器官组织学分析。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述：
实施例一 PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k嵌段共聚物的合成
PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI的合成分为两步，首先是开环聚合制备PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)二嵌段共聚物，具体操作如下，在氮气手套箱内，依次称取MeO-PEG-OH(M n =5.0 kg/mol, 0.50 g, 100 μmol), TMC (2.0 g, 19.2 mmol) 和DTC (0.50 g, 2.60mmol) 并溶解在二氯甲烷(DCM，7.0 mL)中，快速加入开环聚合催化剂双（双三甲基硅基）胺锌(29 mg, 75 μmol)。密闭反应器密封好放置40 °C油浴中磁力搅拌下反应2天。冰醋酸终止反应后在冰乙醚中沉淀两次、抽滤、常温真空干燥后得到PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)。
接着，PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)的末端羟基氯甲酸对硝基苯酯NPC活化，再与支化PEI（bPEI）的伯胺反应制得。具体的，PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k) (0.4 g, 羟基0.013 mmol)和NPC(40 mg, 0.07 mmol)溶于干燥的DCM中在0℃下反应24小时，然后在冰乙醚中沉淀、过滤、真空干燥得到PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-NPC。然后将产物溶于3 mLDCM后滴加到3 mL溶有bPEI (M n=1.8 kg/mol) (180 mg, 0.10 mmol)的DCM中，30℃下反应24小时后，在DCM和甲醇(体积比为1:1)中透析(MWCO 7000) 48小时，接着在冰乙醚中沉淀两次、抽滤并室温真空干燥得到产物PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k。产率：91.6%。1HNMR (400 MHz, DTCl3)：PEG: δ 3.38, 3.65; TMC: δ 4.24, 2.05; DTC: δ 4.32, 3.02,PEI: δ 2.56-2.98。附图1为PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k的核磁图谱，其1H NMR表征显示除了PEG及P(DTC-TMC)峰外，还有PEI的特征峰在2.59-2.79，通过积分可知，聚合物的分子量为5.0-(4.4-19.8)-1.8 kg/mol。
实施例二 Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)-lPEI1.2k嵌段共聚物的合成
Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)-lPEI1.2k的合成与实施例一类似，也是分为两步，只是将其中的第一步中的引发剂MeO-PEG-OH换为马来酰亚胺官能化的Mal-PEG6k-OH，开环聚合TMC和DTC得到Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)，其末端羟基用NPC活化，再与线性PEI(lPEI)的伯胺(M n=1.2 kg/mol)反应制得。具体操作与实施例一类似，产物在冰乙醚中沉淀两次、抽滤并室温真空干燥得到产物。产率：93.2%。1H NMR (400 MHz, DTCl3)：PEG: δ3.38, 3.65; TMC: δ 4.24, 2.05; DTC: δ 4.32, 3.02, PEI: δ 2.56-2.98。聚合物的数均分子量通过特征峰面积的积分比值，计算为6.0-(4.8-19.2)-1.2 kg/mol，为Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)-lPEI1.2k。
实施例三 cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)二嵌段共聚物的合成
cNGQ-PEG7k-P(DTC2.8k-TMC14.2k)的合成与实施例一类似，也是分为两步，将第一步中的引发剂MeO-PEG-OH换为N-羟基琥珀酰亚胺官能化的NHS-PEG-OH，开环聚合TMC和DTC得到NHS-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)；其次，具有自由伯胺的多肽C(NGQGEQ) (cNGQ)与NHS-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)通过酰胺化反应而键合。简要的说，NHS-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k) (0.5 g, 0.017 mmol) 与cNGQ (20 mg, 0.033 mmol) 相继溶解在5 mL DMF中, 常温反应2天后，在蒸馏水中透析两天(MWCO 3500)，冷冻干燥得产物cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)。产率：81.2%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): PEG: δ 3.51; TMC: δ4.23, 1.94; DTC: δ 4.13, 2.99; cNGQ: δ 6.84–7.61。BCA蛋白试剂盒(Thermoscientific)测得cNGQ的接枝率为89.7%。通过调整原料比例可以得到不同分子量的聚合物，见表1。
表1 各个聚合物制备条件和产物的核磁表征结果
实施例四 靶向聚合物的合成
靶向聚合物的合成有多种方式，取决于PEG的另一端功能化基团，我们将分几种情况描述。第一，例如当马来酰亚胺Mal功能化的Mal-PEG6k-OH或者丙烯酸酯功能化的AA-PEG6.5k-OH引发DTC与TMC开环聚合、端羟基活化、与支化b1.8k PEI反应得到末端为活性Mal的聚合物Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)-bPEI1.8k或者末端为活性AA的AA-PEG6.5k-P(DTC4.6k-TMC18.6k)-bPEI1.8k，最后通过迈克尔加成与含有自由巯基的靶向分子如多肽cNGQ-SH或叶酸FA-SH，室温下反应后得到靶向聚合物，cNGQ-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)-bPEI1.8k。
第二，当炔功能化的Alkynyl-PEG5k-OH引发DTC与DLLA开环聚合、端羟基活化、与线性lPEI1.2k反应得到末端为活性炔基的聚合物Alkynyl-PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-lPEI1.2k；最后，与叠氮功能化的靶向分子，如多肽cNGQ-N3或半乳糖Gal-N3，通过叠氮-炔基的点击化学反应得到靶向聚合物Gal-PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-lPEI1.2k。
第三，当叠氮功能化的Azide-PEG3k-OH引发DTC与TMC开环聚合、端羟基活化、与支化bPEI0.6k反应得到末端为活性叠氮基的聚合物Azide-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-bPEI0.6k，最后，与炔基功能化的靶向分子，如alk-CC9或是cRGD-alk，通过叠氮-炔基的点击化学得到靶向聚合物CC9-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-bPEI0.6k。
当功能化聚合物为二嵌段聚合物、没有PEI的情况，其键合cNGQ等多肽的方式与上述类似。
实施例五 PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k制备siRNA-RCCPs
siRNA-RCCPs通过溶剂交换法制备并复合包裹无特异性的、对照siRNA(siScramble)。100 μL PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k的DMSO溶液(5.0 mg/mL)与预定数量的siRNA缓冲溶液(1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH 7.4)混合，再缓慢打入900 μL的HEPES (10mM, pH 6.8)，室温下放置过夜、在HEPES中透析、25℃孵育4 h，自交联得到siRNA-RCCPs。DLS结果显示包裹10 wt% siRNA时，粒径为100 纳米左右，且TEM证实了其中空结构。
实施例六 肿瘤靶向、装siRNA的交联囊泡siRNA-cNGQ/RCCPs的制备
siRNA-cNGQ/RCCPs通过溶剂交换法制备并复合包裹siScramble。重量含量为80%的PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k及20%的 cNGQ-PEG6.5k-P(DTC4.6k-TMC18.6k)-bPEI1.8溶解于DMSO (5.0 mg/mL)中，先与预定数量的siRNA缓冲溶液(1 mg/mL, 10 mMHEPES, pH 7.4)混合，再缓慢加入到900 μL的HEPES (10 mM, pH 6.8)，室温放置过夜，在HEPES中透析、孵育4 h，得到交联siRNA-cNGQ/RCCPs。
实施例七 肿瘤靶向、装siRNA的交联囊泡PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k和cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)制备siRNA-cNGQ/RCCPs
siRNA-cNGQ/RCCPs通过溶剂交换法制备并复合包裹siScramble，加入重量比为80%的PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k及20% cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)由溶剂交换法包载siRNA制备得到siRNA-cNGQ/RCCPs。100 μL PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k和cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)的DMSO溶液(5.0 mg/mL)与预定数量的siRNA缓冲溶液(1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH 7.4)混合，再缓慢打入900 μL的HEPES (10mM, pH 6.8)，室温下放置过夜，在HEPES中透析(MWCO 14000) 12小时（换液五次），接着在25℃摇床中孵育4 h囊泡自交联，得到siRNA-cNGQ/RCCPs。后续实验若无特殊说明，均使用的是这两种聚合物制备的包载siRNA交联靶向囊泡。
附图2为siRNA-cNGQ/RCCPs的DLS结果图以及TEM图，DLS结果显示包载10 wt.%siRNA的cNGQ/RCCPs平均粒径为109 nm，粒径分布为0.13；TEM图片显示它为清晰的球状中空结构。表2为siRNA-cNGQ/RCCPs的粒径与siRNA含量的关系；随着siRNA含量从0 wt.%增加到50 wt.%，siRNA-cNGQ/RCCPs的粒径也由109增长到175 nm。
表2 siRNA-cNGQ/RCCPs的粒径与siScramble含量的关系
实施例八 包载siRNA靶向交联囊泡siRNA-cNGQ/RCCPs的制备
实施例四介绍了多种功能性聚合物键合多肽的方式，除此以外，还可以通过溶剂交换法制备纳米粒之后，再后修饰靶向多肽，具体举例如下，通过开环聚合并与支化PEI反应得到功能化聚合物Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)-bPEI1.8k，与上述溶剂交换法复合siRNA类似得到Mal-siRNA-RCCPs，接着在室温下与cNGQ-SH迈克尔加成得到靶向交联囊泡siScramble-cNGQ/RCCPs,。
实施例九 PEG5k-P(DTC3.0k-TMC15k)-bPEI1.8k制备DNA-RCCPs
通过溶剂交换法可制备并复合包裹核酸DNA得到DNA-RCCPs。DNA为pcDEF3-CD8IL-36γ（pIL-36γ），pcDEF3-CD8IL-12（pIL-12）、小牛胸腺DNA等。具体操作为下，100 μL PEG5k-P(DTC3.0k-TMC15k)-bPEI1.8k的DMSO溶液(5.0 mg/mL) 缓慢打入预定数量的DNA缓冲溶液(1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH 7.4)与900 μL的HEPES (10 mM, pH 6.8)的混合溶液，室温下放置过夜，在HEPES中透析(MWCO 14000) 12小时（换液五次），接着加入催化量还原剂二硫苏糖醇（DTT）交联得到DNA-RCCPs。DLS结果显示，DNA-RCCPs粒径随着DNA百分比的增加而增大，见表3，且TEM证实了其中空结构，凝胶电泳显示交联囊泡可有效复合DNA（pIL-12），见附图3。
表3 DNA-cNGQ/RCCPs的粒径与DNA含量的关系
实施例十 肿瘤靶向、装DNA的交联囊泡PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k和cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)制备DNA-cNGQ/RCCPs制备DNA-cNGQ-RCCPs
通过溶剂交换法可制备并复合包裹核酸DNA得到DNA-RCCPs。DNA为pcDEF3-CD8IL-36γ（pIL-36γ），pcDEF3-CD8IL-12（pIL-12）、小牛胸腺DNA等。具体操作为下，80 μL PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k与20 μL cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)的DMSO溶液(5.0 mg/mL) 缓慢打入预定数量的DNA缓冲溶液(1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH 7.4)与900μL的HEPES (10 mM, pH 6.8)的混合溶液，室温下放置过夜，在HEPES中透析(MWCO 14000)12小时（换液五次），接着加入催化量还原剂二硫苏糖醇（DTT）交联得到DNA-cNGQ-RCCPs
实施例十一 装载DNA的交联靶向囊泡DNA-cNGQ-RCCPs凝胶电泳分析
在70 mL四溴乙烷(TBE)缓冲溶液中加入0.7 g琼脂糖，加热溶解琼脂糖粉末，在冷却后加入1 μL溴化乙锭，得到琼脂糖胶待用。DNA-cNGQ-RCCPs或DNA-RCCPs 在DNA和聚合物的重量百分比(wt. %)分别设定为10%、20%、30%、40%、50%。在胶中分别加入20 μL的DNA-cNGQ-RCCPs、DNA-RCCPs、自由DNA，以及用10 mM DTT处理20 h后的DNA-cNGQ-RCCPs，在TBE电泳缓冲液中跑胶(100 V, 30 min)。之后，由Molecular Imager FX(Bio-Rad, Hercules，Ex/Em:532/605 nm)拍照凝胶图片，通过Quantity One 软件(Bio-Rad)分析，琼脂糖凝胶阻留法表明，即使当DNA含量高达50 wt.%，DNA-cNGQ-RCCPs仍可以完全、紧实包裹DNA，证明DNA-cNGQ-RCCPs稳定性优异。然而，当它在10 mM GSH存在下孵育20 h后发现，由于交联囊泡的解交联及溶胀大部分DNA释放出来。
实施例十二 siScramble-cNGQ/RCCPs的凝胶电泳分析
在70 mL四溴乙烷(TBE)缓冲溶液中加入0.7 g琼脂糖，加热溶解琼脂糖粉末，在冷却后加入1 μL溴化乙锭，得到琼脂糖胶待用。siRNA-cNGQ/RCCPs或siRNA-RCCPs在siRNA和聚合物的重量百分比(wt. %)分别设定为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%。在胶中分别加入20 μL的siRNA-cNGQ/RCCPs、siRNA-RCCPs、自由siRNA，以及用10 mM GSH处理20 h后的siRNA-cNGQ/RCCPs，在TBE电泳缓冲液中跑胶(100 V, 30 min)。之后，由Molecular ImagerFX(Bio-Rad, Hercules，Ex/Em: 532/605 nm)拍照凝胶图片，通过Quantity One 软件(Bio-Rad)分析，见附图4，琼脂糖凝胶阻留法表明，即使当siRNA含量高达80 wt.%，cNGQ/RCCPs仍可以完全、紧实包裹siRNA，证明siRNA-cNGQ/RCCPs稳定性优异。然而，当它在10 mMGSH存在下孵育20 h后发现，由于交联囊泡的解交联及溶胀大部分siRNA释放出来。
实施例十三 Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs流式细胞仪及共聚焦显微镜(CLSM)实验
基因使用Cy5-siRNA（Cy5在5′反转链末端引入）。按实施例五制备装载荧光标记的基因Cy5-siRNA的囊泡Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs。流式细胞仪测试具体操作如下：A549-Luc细胞铺于6孔板内(1 × 106细胞/孔)孵育24小时，加入50 μL HEPES的Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs、Cy5-siRNA-RCCPs或自由Cy5-siRNA(Cy5-siRNA 浓度为200 nmol）37℃孵育4 h。然后，细胞经胰酶消化并离心(1000 × g)2次，由PBS清洗两次并再次分散在500 μL PBS中待测。Cy5荧光强度由BD FACS Calibur流式仪(Becton Dickinson, USA)检测并分析。CLSM实验具体操作如下：A549-Luc细胞铺于6孔板内(1 × 106细胞/孔)孵育24小时，加入50 μL HEPES的Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs、Cy5-siRNA-RCCPs或自由Cy5-siRNA(Cy5-siRNA 浓度为200 nmol）37℃孵育4 h。之后，移走培养基并继续孵育4 h后，移走培养基用PBS清洗两遍。接着染溶酶体1 h、4%多聚甲醛固定15 min、DAPI染色10 min，每个过程均用PBS清洗两遍，最后用甘油固定封片。荧光图片由共聚焦仪器(TCS SP5)拍摄获得。
细胞内吞及释放行为通过流式及CLSM检测cNGQ/RCCPs 包载Cy5-siRNA作用于A549肺癌细胞。附图5为流式分析结果图，流式分析显露cNGQ功能化显著提高RCCPs被A549细胞内吞；附图6为CLSM图，显示Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs能有效逃离内涵/溶酶体。此外，Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs孵育的细胞Cy5荧光强度明显强于无靶向组Cy5-siRNA-RCCPs及游离siRNA组。
实施例十四 siGL3-cNGQ/RCCPs体外荧光素及细胞毒性实验
siRNA使用萤火虫荧光素酶报告基因siRNA(siGL3)。荧光素酶基因稳定表达的肺癌细胞(A549-Luc)悬浮在含10% FBS的RPMI-1640培养基中植于96孔板(8 × 103细胞/孔)培养24 h。接着，换上90 μL新鲜培养基并加入10 μL siRNA-cNGQ/RCCPs或siRNA-RCCPs (200nM和400 nM 的siRNA)，pH为7.4的HEPES缓冲液作为对照组。孵育48 h后，细胞由细胞裂解液(Promega, Fitchburg, WI, USA)裂解。细胞裂解液的荧光素强度由基于荧光酶标仪(Mithras LB 940, Berthold technologies, Bad Wildbad, Germany)的荧光素酶检测系统(Promega)测定。以HEPES组别为标准(100%)得到相对荧光素酶活性（n = 4）。
细胞毒性的实验操作简要概述：A549-Luc悬浮在含10% FBS的DMEM培养基中植于96孔板(8 × 103细胞/孔)培养24 h。然后换上新鲜培养基并加上预定浓度的siRNA-cNGQ/RCCPs或siRNA-RCCPs，继续培养48 h。接着，加入CCK-8溶液(1 μL/10 μL培养基)37℃孵育1 h。细胞存活率由酶标仪(Tecan Ltd., Morrisville, NC, USA)在450 nm检测计算得到（n = 4）。
为了研究siRNA-cNGQ/RCCPs体外基因沉默效率，转染实验选用siGL3并在A549-Luc细胞进行。附图7为荧光素酶基因表达结果图，结果显示荧光素酶表达被siGL3-cNGQ/RCCPs显著下调。siGL3-cNGQ/RCCPs在siRNA浓度为200 nM和400 nM时，分别抑制约48%及62%荧光素酶表达，对照组siScramble-cNGQ/RCCPs并没有导致荧光素酶表达量降低，siGL3-RCCPs(无靶向对照组)呈现出较低的基因沉默效率。
实施例十五 siPLK1-cNGQ/RCCPs中siPLK1基因沉默能力，
按实施例五制备装载治疗性基因siRNA(siPLK1，siE6，北海道系统科学提供Hokkaido,Japan)的囊泡siPLK1-cNGQ/RCCPs。用qRT-PCR来评估siPLK1基因沉默能力，附图8为靶向性及序列特异性基因沉默能力结果图，siPLK1-cNGQ/RCCPs在A549细胞中孵育48 h，发现siPLK1-cNGQ/RCCPs 组PLK1 mRNA量与siPLK1-cNGQ/RCCPs和siScramble-cNGQ/RCCPs相比显著降低，证明其靶向性及序列特异性基因沉默能力。本发明的cNGQ/RCCPs 包载siGL3或siPLK1，囊泡在细胞培养基环境下能有效包裹siRNA，通过受体介导内吞方式有效细胞内在化，由于PEI质子海绵效应逃离内涵体，细胞质还原环境下快速释放siRNA，从而有如此高的基因沉默能力。另外，附图9为水溶性四唑盐(CCK-8)试剂盒检测的细胞毒性结果图，表明siGL3-cNGQ/RCCPs和siGL3-RCCPs均无毒性，佐证了本发明的囊泡优异的生物相容性。
实施例十六 siPLK1-cNGQ/RCCPs通过qRT-PCR定量体外基因沉默实验和siGL3-cNGQ/RCCPs体内基因沉默实验
实时荧光定量基因扩增荧光检测系统(qPCR)用于研究siPLK1-cNGQ/RCCPs内源性基因沉默活性实验，类似球激酶(PLK1)作为靶向基因。A549细胞悬浮于含有10% FBS的RPMI-1640培养基中铺于6孔板((1×106 个细胞/孔)。培养24 h后，分别加入10 µL siPLK1-cNGQ/RCCPs、siScramble-cNGQ/RCCPs和siPLK1-RCCPs (最终siRNA浓度为200 nM)。孵育48 h后，细胞经PBS清洗并收集RNA，反转并由qPCR测试得到。人β-机动蛋白作为内援参照基因确定PLK1 mRNA量。mRNA表达水平由相对Ct方法(2−ΔΔCt)计算得到。每个样品平行四组，取平均值最终结果及标准偏差。附图10为荷A549-Luc原位肺癌异种移植裸鼠肺部荧光在siGL3-cNGQ/RCCPs给药前后的变化图片；附图11为肺部生物荧光图，注射siGL3-cNGQ/RCCPs 24及48 h后，肺部生物荧光强度分别降低76%及53%，证明siGL3-cNGQ/RCCPs引诱肺组织荧光素酶基因有效表达。相反，没有观察到siScramble-cNGQ/RCCPs对照组小鼠肺部荧光强度的变化，证实了只有特异序列才能致使生物荧光基因沉默。
实施例十七 siE6-RCCPs通过qRT-PCR定量体外基因沉默实验
PEG5k-P(DTC3k-TMC15k)-bPEI1.8k和cNGQ-PEG7k-P(DTC3k-TMC15k)聚合物按4:1复合siE6基因得到siE6-cNGQ/RCCPs实时荧光定量基因扩增荧光检测系统(qPCR)用于研究siE6- cNGQ/RCCPs内源性基因沉默活性实验，E6作为靶向基因，我们选用人宫颈癌细胞（Hela）。我们选用Hela细胞悬浮于含有10% FBS的DMEM培养基中铺于6孔板((1×106 个细胞/孔)。培养24 h后，分别加入10 µL siE6-cNGQ/RCCPs和siScramble-cNGQ/RCCPs (最终siRNA浓度为200 nM)。孵育48 h后，细胞经PBS清洗并收集RNA，反转并由qPCR测试得到。人β-机动蛋白作为内援参照基因确定E6 mRNA量。mRNA表达水平由相对Ct方法(2−ΔΔCt)计算得到。每个样品平行四组，取平均值最终结果及标准偏差。结果证明siE6-cNGQ/RCCPs诱导Hela细胞的E6基因有效下调，而作为对照组的siScramble-cNGQ/RCCPs则无明显变化，证实了只有特异序列才能致使生物荧光基因沉默。
实施例十八 Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs药代动力学及体内活体成像
所有动物实验操作均在苏州大学动物中心及动物保护及使用委员会批准下进行。Balb/C小白鼠经尾静脉注射200 μL HEPES的Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs，Cy5-siRNA-RCCPs和游离Cy5-siRNA (20 μg Cy5-siRNA 每只小鼠)。在预订时间里，从眼眶取血(约50 μL血液)，并立即溶解在100 μL1%曲拉通裂解液中，其中Cy5由500 μL萃取液(含20 mM DTT的DMSO溶液)在37℃萃取过夜。离心(14.8 krpm, 30 min)后，上清液中Cy5的含量由荧光测得。血液循环有两种典型模式：快速降低的分散相(t1/2, α)及长时间的消除相(t1/2, β)。由以下公式及Origin 8软件拟合这两种半衰期: y = A1 × exp(-x/t1) + A2 × exp(-x/t2) + y0, 接着由t1/2, α= 0.693×t1 and t1/2, β= 0.693× t2获得。
在6周龄Balb/C裸鼠肺癌注射100 μL悬浮于PBS(含1/4组织胶)的A549-Luc细胞来建立原位肺癌模型。由IVIS Lumina系统观察肿瘤生长情况。约两周后，将荷瘤裸鼠随机分为两组，分别尾静脉注射200 μL HEPES的Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs 和Cy5-siRNA-RCCPs(20μg Cy5-siRNA 每只小鼠)。在不同时间点(0, 2, 4, 8, 12和24 h)注射后，小鼠通过异氟烷麻醉并由近红外荧光成像系统(Lumina, IVIS II)获取荧光图片，发射波长为643 nm，吸收波长为668 nm。在图片获取过程中，由小动物麻醉机麻醉小鼠。通过Lumina II软件拍摄并分析图片。
Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs在体内的药代动力学于小鼠体内研究。单剂量尾静脉注射各种Cy5-siRNA制剂(20 μg Cy5-siRNA每只小鼠)，通过荧光检测血浆中不同时间点的Cy5-siRNA。附图12为血浆中不同时间点的Cy5-siRNA图，结果表明，Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs和Cy5-siRNA-RCCPs证明相对于游离Cy5-siRNA，它们有相当长的血液循环时间，并且长于文献中报道的其他阳离子复合物siRNA载体。(Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs和Cy5-siRNA-RCCPs的消除半衰期分别为1.35和1.21 h，而自由Cy5-siRNA则为0.17 h)。
Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs及Cy5-siRNA-RCCPs尾静脉进入荷瘤裸鼠体内，通过近红外荧光实时跟踪其在在原位A549-Luc肺癌的积累。附图13为肿瘤部位Cy5-siRNA荧光图，图片显示Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs组小鼠在注射2 h后，观察到肿瘤部位Cy5-siRNA荧光很强。相比之下，无靶向组Cy5-siRNA-RCCPs在肿瘤部位积累量显著减少，尽管它们含有相近的循环时间。这些结果表明主动靶向在肿瘤高富集及久持续上发挥着重要作用。
实施例十九 siPLK1-cNGQ/RCCPs离体成像及生物分布
尾静脉单次注射200 μL的Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs和Cy5-siRNA-RCCPs的HEPES溶液(20μg Cy5-siRNA 每只小鼠)至荷A549-Luc肺癌原位裸鼠体内。注射后4 h，荷瘤裸鼠被处死。收集包括心、肝、脾、肾及含肿瘤肺等主要器官、清洗、干燥并称重。荧光图片由Lumina IVISII近红外荧光成像系统拍摄获取。为了定量Cy5-siRNA在肺及其他器官的分布，肺及其他组织中加入600 μL 1%曲拉通匀浆机(IKA T25)匀浆10 min，之后加入900 μL上述萃取剂在37℃萃取过夜。离心30 min后，悬浮液中Cy5由荧光检测，并通过标准曲线计算，最终表达为每克组织注射百分比(%ID/g)。
注射Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs 4 h后，通过离体成像及荧光定量进一步分析Cy5-siRNA在心、肝、脾、肾及含有肿瘤的肺等主要器官的生物分布。附图14为不同部位Cy5-siRNA荧光强度图，结果表明Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs组小鼠肺部Cy5-siRNA荧光强度明显强于其他主要器官，相比之下，无靶向对照组Cy5-siRNA-RCCPs肺部呈现出较弱的Cy5-siRNA荧光，而在肝及肾荧光很强。附图15为不同部位Cy5-siRNA富集率图，荧光定量表明Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs在肺部富集量为4.02%，为Cy5-siRNA-RCCPs(1.13 %ID/g)组3.5倍。
实施例二十 荷A549-Luc原位肺癌裸鼠的治疗实验
荷A549-Luc原位肺癌异种移植裸鼠模型的建立方法见实施例七具体操作。所有图片在3%的异氟烷麻醉、仰卧姿势、体内生物发光模式下通过Lumina IVIS II系统采集。为了观察A549-Luc细胞，在成像前10-15分钟，腹腔注射100 μL荧光素酶(150 mg/kg)。在约10 d后，肿瘤荧光强度达到7 × 104时开始治疗，并将这天定义为0 d。小鼠称重并随机分为4组(每组6只)：siPLK1-cNGQ/RCCPs (I), siPLK1-RCCPs (II), siScramble-cNGQ/RCCPs (III),and PBS (IV)。小鼠经尾静脉每两天注射一次，剂量为40 µg siRNA每只小鼠。小鼠的相对体重以它们初始体重为标准。此外，在第10天治疗终止，每组任意取一只小鼠处死，取出主要器官清洗、干燥后由Lumina IVIS II系统成像。之后，浸泡在4%的福尔马林并包埋于石蜡中，由H&E染色并由正置显微镜拍照(Olympus BX41)。除此以外，在57天内观察各组的生存曲线(每组5只)。
为了评估siRNA-cNGQ/RCCPs在体内的治疗效率，我们以siPLK作为治疗siRNA，以荷A549-Luc原位肺癌为肿瘤模型。siPLK1-cNGQ/RCCPs在第0, 2, 4, 6和8天给药，siPLK1的给药量为40 µg每只小鼠。附图16为通过荧光成像跟踪肿瘤生长情况图，结果表明siPLK1-cNGQ/RCCPs显著抑制肿瘤增长。siPLK1-RCCPs造成部分肿瘤增长被抑制。对比之下，我们观察到siScramble-cNGQ/RCCPs及PBS组小鼠肿瘤快速增长。附图17为小鼠器官离体成像图，经siPLK1-cNGQ/RCCPs治疗10天后，此组别显示其肺组织生物荧光显著低于其他对照组。此外，siScramble-cNGQ/RCCPs和PBS组小鼠图像显示肝肿瘤大面积转移至心脏及肝脏，而siPLK1-cNGQ/RCCPs.组小鼠其他器官几乎没有荧光，证明肺癌没有转移。
附图18从左至右分别为肺部A549-Luc含量图、小鼠体重以及生存率图，显示各治疗组肺部A549-Luc含量。siPLK1-cNGQ/RCCPs展示出高效的肿瘤抑制能力，显著强于无靶向对照组siPLK1-RCCPs；表明各组在10天后肺部图片再次说明siPLK1-cNGQ/RCCPs高效的治疗效率，siPLK1-cNGQ/RCCPs或siPLK1-RCCPs组小鼠体重几乎无变化，而siScramble-cNGQ/RCCPs及PBS组小鼠体重有所降低这可能是由于肺部、以及肿瘤转移的心脏和肝脏衰竭。生存曲线显示siPLK1-cNGQ/RCCPs诊断组小鼠生存期明显延长。siPLK1-cNGQ/RCCPs、siPLK1-RCCPs和siScramble-cNGQ/RCCPs组小鼠生存中值分别为54.0、30.1及21.9天。
附图19为H&E染色的组织学分析图，表明，siPLK1-cNGQ/RCCPs治疗的小鼠的肺组织和外观和正常小鼠的肺部类似，其他组老鼠肺部仍有大量肿瘤细胞存在。siPLK1-cNGQ/RCCPs比其他组引发了大量及大面积肺肿瘤细胞的凋亡，但对心、肝及肾伤害较小；而siScramble-cNGQ/RCCPs及PBS组小鼠的肝脏及心脏均存在肺癌转移，并造成伤害。这些结果指明siPLK1-cNGQ/RCCPs介导安全、高效、靶向传递siRNA至荷原位肺癌小鼠。
本发明设计了基于三嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI的肿瘤靶向、具有不对称膜结构的、还原敏感可逆交联、细胞内可解交联的生物可降解聚合物囊泡。该囊泡能高效装载保护核酸药物siRNA或DNA，并能输送其到活体的肿瘤细胞内，诱导其凋亡。该体系拥有多种独特优点，包括制备的简易操控性、杰出的生物相容性、对siRNA极好的控制释放性、超强的体内循环稳定性、优越的癌细胞靶向性、显著的特异性基因沉默能力等。因此，其有望成为集简易、稳定、多功能等优点于一身的纳米系统平台，用于高效、主动靶向输送核酸至原位肿瘤。

Claims (6)

1.一种具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡，由聚合物自组装后交联得到；所述聚合物的分子链包括依次连接的亲水链段、疏水链段以及PEI分子；所述疏水链段包括聚碳酸酯链段和/或聚酯链段；所述亲水链段的分子量为3000-10000Da；疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2.3-8.4倍；PEI分子的分子量为亲水链段分子量的20%-60%。
2.根据权利要求1所述具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡，其特征在于：所述聚合物的化学结构式如下：
其中，R1选自以下基团中的一种：
R2选自以下基团中的一种：
；
PEI的化学结构式如下结构式中的一种：
所述聚合物中，PEG的分子量为3000-10000Da；PTMC或PDLLA总分子量为PEG分子量的2-6倍；PDTC总分子量为PTMC或PDLLA总分子量的15%-40%；PEI的分子量为PEG分子量的20%-60%。
3.根据权利要求1所述具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡，其特征在于：PEG的分子量为4000-8000Da；PTMC或PDLLA的总分子量为PEG分子量的2.5-5倍；PDTC总分子量为PTMC或PDLLA总分子量的18%-38%；PEI的分子量为PEG分子量的25%-50%。
4.权利要求1-3所述任意一项具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(DLLA-DTC)的末端通过羟基活化剂活化，再与PEI反应制得PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI；
（2）在PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI的PEG端偶联肿瘤特异性靶向分子，得到靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者靶向PEG-P(DLLA-DTC)-PEI；
（3）以PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI为原料，通过溶剂置换法制备具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI为原料，通过溶剂置换法制备具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(DLLA-DTC)-PEI和靶向PEG-P(DLLA-DTC)-PEI为原料，通过溶剂置换法制备具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)为原料，通过溶剂置换法制备具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(DLLA-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)为原料，通过溶剂置换法制备具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡。
5.根据权利要求4所述具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，步骤（1）为将PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(DLLA-DTC)、羟基活化剂在干燥的溶剂中反应，然后沉淀、过滤、真空干燥得到端羟基活化的PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(DLLA-DTC)；将端羟基活化的PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(DLLA-DTC)的溶液滴加到PEI溶液中反应，然后透析、沉淀、抽滤、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI；步骤（2）为将步骤（1）得到聚合物和溶于有机溶剂的靶向分子反应得到靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者靶向PEG-P(DLLA-DTC)-PEI；步骤（3）为将原料溶液加入非离子缓冲溶液中，室温放置后透析、交联，得到具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡。
6.一种聚合物，其特征在于，所述聚合物的化学结构式如下：
其中，R1选自以下基团中的一种：
R2选自以下基团中的一种：
；
PEI的化学结构式如下：
所述聚合物中，PEG的分子量为3000-10000Da；PTMC或PDLLA的总分子量为PEG分子量的2-6倍；PDTC的总分子量为PTMC或PDLLA总分子量的15%-40%；PEI分子的分子量为PEG分子量的20%-60%。
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