CN115998709B - 一种膜融合纳米核酸载体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种膜融合纳米核酸载体及其制备方法与应用。本发明设计的膜融合纳米核酸载体利用通过膜融合的方式向细胞质递送核酸分子。膜融合递送方式绕过了经典的细胞内吞途径,由此避免了核酸分子在进入细胞内体或溶酶体后被核酸酶降解造成的损耗,提高了核酸递送的效率。当利用该载体递送siRNA时,体外24小时基因沉默效率达到75%,体内实验时72小时几乎完全沉默目的基因。当利用该载体向肿瘤部位递送5`‑pppdsRNA,可显著抑制肿瘤的生长。另外,Zn2+交联核酸后使用GMP修饰可以增强对核酸的保护。此外,负载核酸的纳米内核在过表达谷胱甘肽的胞质环境下,可以响应谷胱甘肽释放出核酸。
Description
技术领域
本发明涉及纳米医药技术领域,具体涉及一种膜融合纳米核酸载体及其制备方法与应用。
背景技术
核酸药物(例如:DNA、siRNA、miRNA、mRNA)被广泛地用于基因治疗、免疫治疗、疫苗研究等领域。DNA、miRNA、siRNA、mRNA等核酸药物往往需要被递送到细胞质才能发挥作用。但核酸分子比较大,并且核酸药物带负电荷,容易受到细胞膜阴离子脂质层的静电排斥,因此难以实现跨膜运输。此外,在核酸分子进入体内后将面临免疫系统的清除、血液中的核酸酶降解,在进入细胞后还面临着溶酶体核酸酶的降解。因此若没有载体,核酸药物在体内的作用效率将非常低。
纳米递送载体为解决核酸药物的递送问题提供了良好的解决策略。一方面,合理设计的纳米载体会保护核酸分子免受核酸酶的降解。另一方面,纳米载体有助于核酸药物穿透组织和细胞屏障到达细胞质或细胞核内发挥作用。当前主要的非病毒核酸载体主要有脂质纳米颗粒(LNP)和阳离子聚合物载体。40多年前,Pieter Cullis等率先利用脂质纳米颗粒递送沉默基因表达的核酸分子。如今,脂质纳米颗粒作为一种先进的mRNA疫苗载体已经在临床上得到广泛的应用。此外,阳离子聚合物作为一种高效负载和递送核酸的载体被广泛研究。Y.Dong等利用树枝状阳离子聚合物负载siRNA用于肿瘤基因治疗。该阳离子可以通过“质子海绵效应”实现内体逃逸,因此可成功向细胞质递送核酸。然而,阳离子载体具有引起全身性细胞损伤的风险、易被免疫清除和肝脏截留,因此其在体内使用受到限制。脂质纳米颗粒作为mRNA疫苗载体也有引起全身性炎症的风险。因此,为了解决核酸分子的递送问题,亟需探索具有高效递送能力和良好生物相容性的核酸递送载体。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供了一种膜融合纳米核酸载体,解决了核酸分子在体内递送过程中易被降解和难以克服组织和细胞屏障进入细胞质的问题。
该纳米载体可高效负载和保护核酸分子,在微酸性环境下,通过与细胞进行膜融合的方式向细胞质递送负载核酸的纳米内核并响应细胞质环境释放出核酸分子。此外,该纳米载体通过包覆细胞膜提高了自身的生物相容性。因此,该纳米载体可向细胞质高效递送核酸分子并具有良好的生物安全性。
本发明的另一目的在于提供所述的膜融合纳米核酸载体的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述的膜融合纳米核酸载体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种膜融合纳米核酸载体,包括融合性细胞膜(FN)和负载核酸的纳米内核(G@NA)。
所述的融合性细胞膜为可与细胞发生膜融合的细胞膜。
所述的融合性细胞膜为工程化细胞的细胞膜和黑色素瘤细胞的细胞膜杂合后得到;优选为按质量比1~3:1~3的比例杂合后得到。
所述的工程化细胞为通过适配体结合、脂质插入、基因工程方法修饰细胞膜后得到的细胞。
所述的工程化细胞为工程化HEK-293T细胞,优选为表达mVSV-G的HEK-293T细胞(293T-mVSV-G)。
所述的黑色素瘤细胞包括B16细胞、B16-F1细胞、B16-F10细胞、HME细胞、A375细胞、NW38细胞中的至少一种;优选为B16-F10细胞。
所述的融合性细胞膜能够响应微酸性环境(pH=5.0~6.8)和细胞膜发生膜融合,从而将负载核酸的纳米内核递送至细胞质。
所述的负载核酸的纳米内核为Zn2+与核酸交联后得到。
所述的负载核酸的纳米内核能够保护核酸,使其免受核酸酶的降解。
所述的负载核酸的纳米内核为经过核苷酸的修饰的负载核酸的纳米内核,优选为经过单磷酸鸟苷(GMP)修饰。
所述的负载核酸的纳米内核能够响应细胞质中过表达的谷胱甘肽释放出核酸分子。
所述的核酸包括DNA、RNA中的至少一种,优选为包括质粒DNA、siRNA、miRNA、mRNA、sgRNA、shRNA、5`-pppdsRNA中的至少一种。
所述的融合性细胞膜为通过适配体结合、脂质插入、基因工程方法修饰细胞膜后提取得到。
上述膜融合纳米核酸载体的制备方法,包括以下步骤:
(1)将人胚胎肾细胞的细胞膜和黑色素瘤细胞的细胞膜混匀得到融合性细胞膜;
(2)在搅拌下,向ZnCl2溶液中加入核酸,之后调节pH,离心,重悬沉淀,得到负载核酸的纳米内核;
(3)将步骤(1)中得到的融合性细胞膜和步骤(2)中得到的负载核酸的纳米内核混匀,加入挤出机挤出得到膜融合纳米核酸载体。
步骤(1)中所述的人胚胎肾细胞的细胞膜和黑色素瘤细胞的细胞膜的质量比为1~3:1~3,优选为1:1。
步骤(2)中所述的搅拌的条件为500~700rpm,优选为600rpm。
步骤(2)中所述的ZnCl2与核酸分子的质量比为20~1000:1,优选为100~300:1,更优选为200:1。
步骤(2)中所述的调节pH为调节到pH 6~9,优选为pH 7.4。
步骤(2)中所述的离心的条件为2~6℃下,10000~14000rpm离心8~12min,优选为4℃下,12000rpm离心10min。
步骤(3)中所述的融合性细胞膜和负载核酸的纳米内核的质量比为1~2:1~2,优选为1:1。
步骤(3)中所述的挤出的条件为使用挤出机通过聚碳酸酯多孔膜挤出9~15次,优选为使用挤出机通过聚碳酸酯多孔膜挤出11次。
上述的聚碳酸酯多孔膜的孔径为190~400nm,优选为200nm。
为了更好地实现本发明,步骤(2)中还包括以下步骤:
得到的负载核酸的纳米内核一边搅拌一边加入GMP溶液,继续搅拌,之后再次离心,重悬,洗涤后得到GMP修饰的负载核酸的纳米内核。
上述的GMP溶液的浓度为0.05~1mM,优选为0.05~0.20mM,更优选为0.1mM。
上述的继续搅拌的条件为500~700rpm,优选为600rpm。
上述的再次离心的条件为2~6℃下,10000~14000rpm离心8~12min,优选为4℃下,12000rpm离心10min。
上述的洗涤的条件为2~6℃下,10000~14000rpm离心8~12min清洗沉淀2~3次,优选为4℃下,12000rpm离心10min清洗沉淀2次。
上述膜融合纳米核酸载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明构建了膜融合纳米核酸载体系统(如图1所示)。该载体利用膜融合蛋白工程化的内源性细胞膜包覆负载核酸的纳米内核,用于向体内递送核酸分子。首先,将膜融合纳米核酸载体注射入体内后,载体表面细胞膜和内核中GMP修饰保护了核酸分子,使其免受血液中核酸酶的降解和免疫系统的清除。当该纳米载体进入组织后,载体表面的膜融合蛋白响应组织的微酸性环境和细胞发生膜融合,由此将负载核酸的纳米内核递送进细胞质,此过程类似病毒通过膜融合感染细胞。负载核酸的纳米内核可以响应细胞质中高表达的谷胱甘肽发生降解,并释放出核酸分子。根据释放在细胞质中的核酸分子的种类,可以发挥基因治疗、疫苗、免疫佐剂等作用。本发明设计的膜融合仿生纳米核酸载体,有望克服核酸递送过程中核酸易被降解清除和难以穿透细胞屏障问题,在体内实现高效的核酸递送。所用细胞膜和内核材料多为内源性物质,在体内应用时具有较高的生物相容性,因此具有较高的临床应用前景。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明提供了一种膜融合纳米核酸载体及其制备方法与应用。本发明设计的膜融合纳米核酸载体利用通过膜融合的方式向细胞质递送核酸分子。膜融合递送方式绕过了经典的细胞内吞途径,由此避免了核酸分子在进入细胞内体或溶酶体后被核酸酶降解造成的损耗。因此,该载体提高了核酸递送的效率。例如,当利用该载体递送siRNA时,体外24小时基因沉默效率达到75%,当其用于体内时72小时几乎完全沉默目的基因。当利用该载体递送核酸佐剂5`-pppdsRNA时,可将肿瘤部位的细胞毒性T淋巴细胞比例提升至8.92%。
(2)与传统的核酸载体相比(如腺病毒载体、脂质体纳米颗粒、阳离子聚合物),本发明所设计的仿生膜融合纳米载体免疫原性和细胞毒性更低,因此其在体内应用时具有更好的安全性。这一方面是因为仿生膜融合纳米载体所用原料(如GMP、Zn2+、细胞膜)多来源与内源性物质。另一方面,细胞膜包覆进一步提高了载体的生物相容性。
(3)本发明提出了一种新的核酸保护和释放策略。在Zn2+交联核酸后使用GMP修饰可以增强对核酸的保护。此外,负载核酸的纳米内核在过表达谷胱甘肽的胞质环境下,可以响应谷胱甘肽释放出核酸。
附图说明
图1是本发明膜融合纳米核酸载体的合成方法和作用机制示意图。
图2是不同质量比下siRNA与ZnCl2的复合物对核酸的保护效果图。
图3是不同浓度的GMP修饰siR-Zn所得纳米凝胶的Zeta电位分析图。
图4是膜融合纳米核酸载体的透射电镜图。
图5是膜融合纳米核酸载体的粒径与电位分析图。
图6是核酸酶存在下纳米内核对核酸的保护效果图。
图7是纳米内核响应GSH发生降解导致的粒径变化效果图。
图8是纳米内核响应GSH释放核酸效果图。
图9是不同处理组的体外基因沉默结果分析图。
图10是动物实验中不同处理组的体内基因沉默结果分析图。
图11是动物实验中不同处理组的肿瘤部位细胞毒性T淋巴细胞比例分析图。
图12是动物实验中10天内肿瘤大小变化结果分析图。
图13是动物实验中10天内小鼠体重变化图。
图14是动物实验中10天内不同处理组小鼠肿瘤照片图。
图15是动物试验中小鼠血液九种生化成分检测结果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
下面实施方案中若未注明具体试验条件,则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等,若无特殊说明,均为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1Zn2+与siRNA质量比的不同对纳米载体负载核酸能力的表征
通过Zn2+和siRNA交联得到siR-Zn。在该制备过程中,本发明探索了不同的siRNA和ZnCl2的比例对siRNA的负载效果。
Luc-siRNA具体为pGL3 luciferase siRNA,其序列如下:
luc-siRNA sense:5′-GCUACAUUCUGGAGACAUATT-3′
luc-siRNA antisense:5′-UAUGUCUCCAGAAUGUAGCTT-3′
(购自苏州吉玛基因股份有限公司,末端的碱基序列TT是siRNA的悬坠,用于稳定修饰,无干扰作用)
在600rpm的持续搅拌下,控制ZnCl2/Luc-siRNA质量比为20、100、200、400、1000,利用移液枪将38μL 0.263μg/μL Luc-siRNA分别对应逐滴加入含有不同体积(20μL、100μL、200μL、400μL、1000μL)的10mg/mL ZnCl2溶液中,随后继续搅拌5min。在搅拌下,分别利用不同体积(3μL、15μL、30μL、60μL、150μL)的0.1M的NaOH溶液,将pH调到7.4。为了去除游离的ZnCl2和NaOH,将混合液在4℃、12000rpm下离心10min。用移液枪小心地吸去上清液,并加入400μL无菌无酶水(DEPC水)重悬沉淀,即可得到Luc-siRNA与Zn2+的交联产物。
通过琼脂糖凝胶电泳实验表征载体对siRNA的负载。简而言之,取0.7g琼脂糖,加入70ml TAE缓冲溶液,加热2min使其完全溶解。随后趁热向溶液加入5ul Gold ViewⅡ核酸显影剂,混匀。将溶液倒入制胶板,小心排尽气泡。待凝胶形成后,加入不同质量比的样品,在150V电压下跑胶15min。随后在凝胶成像系统中观察siRNA条带。从图2中可以看出,随着ZnCl2/siRNA(w/w)的增加,siRNA的负载效率不断上升,当ZnCl2/siRNA(w/w)为200时达到最大值,可见Zn2+纳米载体能高效稳定负载核酸分子。
实施例2不同浓度GMP对纳米粒子电荷的影响
在600rpm的持续搅拌下,利用移液枪分别将浓度为0.01mM、0.025mM、0.05mM、0.1mM、0.25mM、0.5mM、1mM的GMP(单磷酸鸟苷)逐滴加入实施例1中制备的Luc-siRNA与Zn2+的交联产物(ZnCl2/siRNA(w/w)为200)中,并继续搅拌5min混匀使反应充分。随后在4℃、12000rpm下离心10min,小心去除上清,得到修饰了鸟苷酸的核酸纳米粒子沉淀。使用DEPC水重悬纳米粒子,4℃、12000rpm下离心10min清洗沉淀两次以完全除去游离的GMP。本发明探索了加入不同浓度GMP对纳米粒子电荷的影响。图3的结果显示,随着GMP浓度的加大,纳米凝胶的的电荷逐步由正电荷向负电荷转变。当GMP浓度为0.1mM时Zeta电位恰好转为负电,约为-11mV。
实施例3负载siRNA的仿生膜融合纳米载体的制备
1、细胞膜的制备
(1)稳定表达mVSV-G的HEK-293T细胞株的构建
将HEK-293T细胞(购买自上海柯雷生物科技有限公司)铺在6孔板中培养,每孔约5x104细胞。所用培养基为DMEM培养基(Gibco),其中含1%(v/v)的青霉素和链霉素并添加10%(v/v)的胎牛血清(FBS)。将细胞置于37℃,含5%CO2潮湿空气的培养箱中培养。
待细胞生长面积约占孔板的80%时开始转染。将细胞的培养基换成无血清的DMEM基础培养基。取一只EP管,加入1μg mVSV-G-mCherry-Puromycin质粒DNA、0.75μg PSPA.X2质粒DNA和0.25μg PMD2.G质粒DNA(PSPA.X2质粒和PMD2.G质粒购自上海柯雷生物科技有限公司,mVSV-G-mCherry-Puromycin委托上海柯雷生物科技有限公司定制),混匀。以N/P=2的比例向质粒溶液中加入4μg聚乙烯亚胺(PEI),混匀,常温下孵育30min。随后将混合溶液加入细胞进行转染,6h后,将细胞的培养基换成含10%FBS的新鲜DMEM完全培养基。24h后,在智能倒置荧光显微镜下观察mCherry(红色荧光)的表达,以对质粒表达做定性判断,细胞发出红色荧光证明目的基因成功表达。将培养基换成含嘌呤霉素(5μg/μL)的DMEM完全培养基继续培养,去除未表达目的基因的细胞。持续筛选14天,得到稳定表达mVSV-G的HEK-293T细胞系(简写为293T-mVSV-G)。
(2)293T-mVSV-G细胞膜、HEK-293T细胞膜和B16-F10细胞膜的提取
使用膜蛋白提取试剂盒(货号:BB-3103)提取细胞膜。首先,在10cm细胞培养皿中使用DMEM完全培养基培养步骤(1)中得到的293T-mVSV-G细胞。当培养皿的细胞几乎长满时(细胞数量约为1×108个)。用细胞刮刀将细胞刮下,并收集在预冷PBS(10mM,pH=7.4)中。随后,通过1500rpm、4℃离心3分钟,清洗细胞并收集细胞沉淀。之后,在细胞裂解液中加入0.4%(v/v)的蛋白酶抑制剂,并用其重悬细胞沉淀。在冰浴中振摇30分钟,使细胞充分裂解。在4℃下,以12000rpm离心5分钟,分离细胞器和蛋白。将获得的上清液(蛋白)在37℃的恒温水浴中孵育15分钟,直到溶液出现明显的分层,在37℃、1000g下离心5分钟使得分层更加明显。其中上层溶液为胞浆蛋白,下层为膜蛋白,收集下层液体即可得到293T-mVSV-G细胞膜。
HEK-293T细胞膜的制备方法和293T-mVSV-G细胞膜的方法一致。
B16-F10细胞膜的制备方法与293T-mVSV-G细胞膜的方法基本一致,区别仅在于培养B16-F10细胞(购自上海科远迪生物科技有限公司)时培养基使用RPMI 1640完全培养基。
(3)融合性细胞膜的制备
按照1:1的质量比将293T-mVSV-G细胞膜和B16-F10细胞膜混匀,即可得到融合性细胞膜,将其储存在-80℃冰箱中备用。
(4)非融合性细胞膜的制备
按照1:1的质量比将HEK-293T细胞膜和B16-F10细胞膜混匀,即可得到非融合性细胞膜,将其储存在-80℃冰箱中备用。
2、负载Luc-siRNA的纳米内核(G@siR-Zn)的制备
(1)Luc-siRNA交联纳米粒子(siR-Zn)的制备
Luc-siRNA具体为pGL3 luciferase siRNA,其序列如下:
luc-siRNA sense:5′-GCUACAUUCUGGAGACAUATT-3′
luc-siRNA antisense:5′-UAUGUCUCCAGAAUGUAGCTT-3′
(购自苏州吉玛基因股份有限公司)
在600rpm的持续搅拌下,控制ZnCl2/Luc-siRNA质量比为200:1,利用移液枪将38μL 0.263μg/μL Luc-siRNA逐滴加入200μL 10mg/mL ZnCl2溶液中,随后继续搅拌5min。在搅拌下,利用30μL 0.1M的NaOH溶液,将pH调到7.4。为了去除游离的ZnCl2和NaOH,将混合液在4℃、12000rpm下离心10min。用移液枪小心地吸去上清液,并加入400μL无菌无酶水(DEPC水)重悬沉淀,即可得到Luc-siRNA与Zn2+的交联产物siR-Zn。
(2)负载Luc-siRNA的纳米内核(G@siR-Zn)的制备
在600rpm的持续搅拌下,利用移液枪分别将200μL浓度为0.1mM的GMP(单磷酸鸟苷)逐滴加入siR-Zn中,并继续搅拌5min混匀使反应充分。随后在4℃、12000rpm下离心10min,小心去除上清,得到G@siR-Zn沉淀。使用DEPC水重悬G@siR-Zn,4℃、12000rpm下离心10min清洗沉淀两次以完全除去游离的GMP。
3、负载Luc-siRNA的膜融合纳米核酸载体(FN@siR)的制备
按照1:1的质量比将融合性细胞膜和G@siR-Zn混合。之后,使用Avanti微型挤出机,通过机械挤压的方式将混合物在200nm聚碳酸酯多孔膜中共挤出至少11次来合成负载Luc-siRNA的仿生膜融合纳米载体(FN@siR)。制备过程在生理盐水中进行,制备的纳米颗粒保存在4℃下以备使用。
4、负载Luc-siRNA的非膜融合纳米核酸载体(NFN@siR)的制备
按照1:1的质量比将非融合性细胞膜和G@siR-Zn混合。之后,使用Avanti微型挤出机,通过机械挤压的方式将混合物在200nm聚碳酸酯多孔膜中共挤出至少11次来合成负载Luc-siRNA的仿生膜融合纳米载体(NFN@siR)。制备过程在生理盐水中进行,制备的纳米颗粒保存在4℃下以备使用。
5、FN@siR的形貌及粒径电位表征
通过透射电子显微镜(TEM)表征FN@siR纳米颗粒的形貌。其结果如图4所示,而FN@siR为球状且呈现核壳结构,这表明细胞膜成功包覆在了纳米内核表面。此外,通过动态光散射仪(DLS)检测siR-Zn、G@siR-Zn与FN@siR的粒径分布和Zeta电位。其结果如图5所示,siR-Zn、G@siR-Zn和FN@siR的水合粒径分别为117.83±7.7nm、201.17±13.27nm、317.27±9.77nm。逐步增大的粒径和GMP修饰以及细胞膜包覆相关。此外,siR-Zn、G@siR-Zn和FN@siR的Zeta电位分别为17.8±0.5mV、-11.17±0.23mV和-18.73±0.83mV。FN@siR的电位更接近天然细胞膜囊泡的电位(Science advances 6(16)(2020)eaay9035),这佐证了细胞膜成功包裹了纳米内核。
6、G@siR-Zn体外抑制核酸酶降解siRNA表征
分别向siRNA、siR-Zn、G@siR-Zn中加入核酸酶RNAase A(0.5μg/μL),在37℃恒温水浴中孵育不同时间(10、30、60、120、240min)。随后,向溶液加入1%(w/w)SDS以终止RNAase A的降解。加入10mM谷胱甘肽(GSH)孵育30min,使材料完全降解并释放出siRNA。随后,利用琼脂糖凝胶电泳检测各组剩余的siRNA。结果如图6所示,和RNAase共孵育240min后,G@siR-Zn中仍然存在部分siRNA,siR-Zn中的siRNA几乎被完全降解,而游离的siRNA在10min时就已被完全降解。由此可见,GMP修饰可增强纳米粒子对siRNA的保护以防核酸酶降解。
7、G@siR-Zn体外释放siRNA表征
向siR-Zn和G@siR-Zn中加入10mM谷胱甘肽(GSH),共孵育30min。随后通过琼脂糖凝胶电泳实验检测siR-Zn与G@siR-Zn所释放的siRNA并利用DLS检测纳米粒子的粒径变化。结果如图7所示,加入GSH后,G@siR-Zn粒径变小,由此可知G@siR-Zn响应GSH发生降解。同时,与未加入GSH相比,加入GSH的G@siR-Zn释放出siRNA(如图8所示)。由此可见纳米内核G@siR-Zn可响应细胞质过表达的GSH降解并释放出核酸。
实施例4负载5`-pppdsRNA的仿生膜融合纳米载体的制备
1、负载5`-pppdsRNA的纳米内核(G@3pdsR-Zn)的制备
(1)5`-pppdsRNA交联纳米粒子(3pdsR-Zn)的制备
在600rpm的持续搅拌下,控制ZnCl2/5`-pppdsRNA(5`-pppdsRNA购自Invivogen,货号tlrl-3prna-100)质量比为200:1,利用移液枪将38μL0.263μg/μL 5`-pppdsRNA逐滴加入200μL 10mg/mL ZnCl2溶液中,随后继续搅拌5min。在搅拌下,利用30μL 0.1M的NaOH溶液,将pH调到7.4。为了去除游离的ZnCl2和NaOH,将混合液在4℃、12000rpm下离心10min。用移液枪小心地吸去上清液,并加入400μL无菌无酶水(DEPC水)重悬沉淀,即可得到5`-pppdsRNA与Zn2+的交联产物3pdsR-Zn。
(2)负载5`-pppdsRNA的纳米内核(G@3pdsR-Zn)的制备
在600rpm的持续搅拌下,利用移液枪分别将200μL浓度为0.1mM的GMP逐滴加入3pdsR-Zn中,并继续搅拌5min混匀使反应充分。随后在4℃、12000rpm下离心10min,小心去除上清,得到G@3pdsR-Zn沉淀。使用DEPC水重悬G@3pdsR-Zn,4℃、12000rpm下离心10min清洗沉淀两次以完全除去游离的GMP。
2、负载5`-pppdsRNA的膜融合纳米核酸载体的制备
按照1:1的质量比将实施例1中制备得到的融合性细胞膜和G@3pdsR-Zn混合。之后,使用Avanti微型挤出机,通过机械挤压的方式将混合物在200nm聚碳酸酯多孔膜中共挤出至少11次来合成负载5`-pppdsRNA的仿生膜融合纳米载体(FN@3pdsR)。制备过程在生理盐水中进行,制备的纳米颗粒保存在4℃下以备使用。
3、负载5`-pppdsRNA的非膜融合纳米核酸载体(NFN@3pdsR)的制备
按照1:1的质量比将实施例1中制备得到的非融合性细胞膜和G@3pdsR-Zn混合。之后,使用Avanti微型挤出机,通过机械挤压的方式将混合物在200nm聚碳酸酯多孔膜中共挤出至少11次来合成负载siRNA的仿生膜融合纳米载体(NFN@3pdsR)。制备过程在生理盐水中进行,制备的纳米颗粒保存在4℃下以备使用。
实施例5负载siRNA的膜融合纳米核酸载体的基因沉默研究
1、体外基因沉默实验
将过表达萤火虫荧光素酶的B16-F10细胞(B16-F10-luc)(购自上海科远迪生物科技有限公司)铺于24孔板中,每孔2×104个细胞,加入RPMI 1640完全培养基培养。待12h后,将每孔的培养基换成PBS(pH=6.8)。随后,分别加入等体积的PBS、FN@siR和NFN@siR。实验组中FN@siR与NFN@siR由实施例1制备得到,PBS为空白对照。控制实验组中每组所负载的Luc-siRNA质量都为2μg,在37℃、5%CO2下与细胞共孵育4h。随后,更换新鲜培养基继续作用24h。
按照萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒(购自翌圣生物科技上海有限公司)的操作方法检测各组的萤火虫荧光素酶活性。首先,去除各组培养基,加入细胞裂解液并冰浴5min使细胞充分裂解。然后,取细胞裂解产物,加入荧光素稀释液(含ATP)。使用多功能酶标仪检测各组的自发光,结果如图9所示,不具有膜融合能力的NFN@siR仅使萤火虫荧光素酶的表达量下降19%,而FN@siR通过与细胞膜融合使细胞萤火虫荧光素酶的表达量下降75%。这表明,通过膜融合的方式递送siRNA,大幅提升了siRNA的递送效率。此外,与现有的细胞膜仿生siRNA载体的基因沉默效率(50±10%)(ACS Biomaterials Science&Engineering 4(11)(2018)3895-3905)相比,FN@siR的基因沉默效率大幅提升。而且,FN@siR体外基因沉默效率接近商用转染试剂Lipofectamine2000(83.2%)(Theranostics 10(7)(2020)3325)。这表明,膜融合纳米核酸载体在体外可有效递送核酸。
2、体内基因沉默研究
(1)动物模型构建
将1×107个过表达萤火虫荧光素酶的B16-F10细胞(B16-F10-luc)接种在C57BL/6J雄性小鼠(3~5周)的背部左侧建模,当肿瘤体积达到70mm3时,得到荷瘤小鼠用于体内基因沉默实验。
(2)体内基因沉默实验
将步骤(1)中建模得到的荷瘤小鼠随机分成3组,每组3只。通过尾静脉注射分别向3组小鼠注射100μL PBS、FN@siR、NFN@siR,其中FN@siR、NFN@siR均负载10μg siRNA。随后,分别在0、12、24、48、72h几个不同的时间点通过小动物活体成像系统获取荧光图像,结果如图10所示。每次拍照前15min,都向各组小鼠腹腔注射200μL 15mg/mL萤火虫荧光素钾盐。注射PBS和NFN@siR的小鼠体内荧光增强,这是因为随着肿瘤的生长萤火虫荧光素酶的表达不断在增多。尽管NFN@siR也能产生轻微的基因沉默效果,但其效果过弱,无法覆盖因肿瘤生长而带来的荧光增强。与之相反,在注射FN@siR载体12h后,小鼠体内荧光强度和面积大幅度降低,并在之后逐步的减弱。最终,在注射FN@siR载体72h后小鼠体内荧光几乎完全消失。这表明FN@siR在体内也可高效沉默基因,具有应用于RNAi体内治疗的潜力。同时,也证明了膜融合纳米核酸载体在体内也具有良好的核酸递送性能。
实施例6负载5`-pppdsRNA的膜融合纳米核酸载体的免疫治疗研究
(1)动物模型构建
将1×107个B16-F10细胞接种在C57BL/6J雄性小鼠(3~5周)的背部左侧。B16-F10购自上海科远迪生物科技有限公司。当肿瘤体积达到70mm3时,将这些小鼠用于肿瘤免疫治疗研究。
(2)体内肿瘤治疗评价
将荷瘤小鼠随机分为三组并做好标记,每组3只,在第0天和第3天分别向小鼠尾静脉注射PBS、NFN@3pdsR和FN@3pdsR,控制第二组、第三组试剂中的5`-3pdsRNA的含量在5μg。其中NFN@3pdsR与FN@3pdsR由实施例2制备得到。注射药物后,每隔两天记录小鼠体重以及肿瘤的长和宽。根据公式:肿瘤体积=(长×宽2)/2,计算得小鼠肿瘤体积。实验开始后第10天,对小鼠实施安乐死,并收集小鼠的肿瘤。拍照记录小鼠的肿瘤大小。根据记录的数据,绘制治疗过程中小鼠的肿瘤体积和体重随时间的变化曲线,结果如图12~14所示。注射FN@3pdsR可以显著抑制肿瘤的生长。在治疗结束后,FN@3pdsR治疗的小鼠肿瘤明显小于注射PBS或NFN@3pdsR。此外,FN@3pdsR没有显著降低小鼠的体重,这表明FN@3pdsR在发挥抗肿瘤效果的同时无体内毒副作用。这些结果表明FN@3pdsR具有良好的抗肿瘤效果的同时具有较小的毒副作用。
(3)肿瘤部位免疫细胞浸润分析
将步骤(2)中获取的肿瘤组织置于冰浴中研磨,并经过200目铜网过滤获得组织悬液。组织悬液置于1500rpm离心5min,将细胞和组织液分离。收集细胞和组织液备用。
为了分析细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在肿瘤部位的浸润情况。我们首先使用100μLAnti-CD3-FITC(购自Biolegend)稀释液与肿瘤组织中收集的细胞共孵育30min。1500rpm离心5min,去除上清。随后向细胞加入Anti-CD8-APC(购自Biolegend)和Anti-CD4-PE(购自Biolegend)稀释液,共同孵育30min。1500rpm离心5min,去除上清以除去未标记的抗体稀释液。加入0.5mL PBS重悬细胞。通过流式细胞仪分析上述荧光抗体标记的细胞悬液,结果如图11所示,注射NFN@3pdsR不会明显地提高CD8+T细胞的在肿瘤部位的浸润,而FN@3pdsR可将浸润在肿瘤部位的CD8+T细胞的比例由2.5%上调至8.92%。CD8+T细胞浸润得到大幅改善。由此可见,FN@3pdsR具有高效递送5`-3pdsRNA并有效改善肿瘤免疫微环境,这意味着FN@3pdsR具有巨大的潜力用于增强肿瘤免疫检查点(ICB)疗法的疗效。
实施例7体内生物安全性研究
将3~5周大小的C57BL/6J雄性小鼠随机分成3组,每组3只。在第0天分别向小鼠尾静脉注射PBS、NFN@siR和FN@siR,第一组为PBS组,第二组为非融合组(NFN@siR),第三组是融合组(FN@siR)。NFN@siR与FN@siR均由实施例1制得。其中,第二组、第三组每组的试剂中的siRNA含量为10μg。3天后通过眼眶取血收集小鼠血液,静置一小时后4000min离心5分钟取上层血清。然后使用以下检测试剂盒(均购自南京建成生物工程研究所)分别对9项血液指标进行检测:
(1)丙氨酸氨基转移酶(谷丙转氨酶/ALT/GPT)测试盒(赖氏法)微板法
(2)天门冬氨酸氨基转移酶(谷草转氨酶/AST/GOT)测试盒(微板法)
(3)尿素氮(BUN)测试盒(脲酶法)
(4)肌酐(Cr)测定试剂盒(肌氨酸氧化酶法)(微板法)
(5)乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(微板法)
(6)葡萄糖(Glu)测试盒(手工/半自动)
(7)总胆固醇(TCH酶法)测试盒(液体)
(8)低密度脂蛋白胆固醇(LDL)测定试剂盒(双试剂直接法)(酶标仪及生化分析仪)
(9)白蛋白(ALB)测定试剂盒(带标准:溴甲酚绿法)(微板法)。
结果如图15所示,各组别小鼠9项指标均无明显差异,说明该剂量的药物对正常小鼠基本无毒性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种膜融合纳米核酸载体,其特征在于:
包括融合性细胞膜和负载核酸的纳米内核;
所述的融合性细胞膜为表达mVSV-G的HEK-293T细胞的细胞膜和黑色素瘤细胞B16-F10的细胞膜杂合后得到;
所述的负载核酸的纳米内核为GMP修饰的Zn2+与核酸的交联产物。
2.根据权利要求1所述的膜融合纳米核酸载体,其特征在于:
所述的核酸包括质粒DNA、siRNA、miRNA、mRNA、sgRNA、shRNA、5`-pppdsRNA中的至少一种。
3.权利要求1~2任一所述的膜融合纳米核酸载体的制备方法,包括以下步骤:
(1)将人胚胎肾细胞的细胞膜和黑色素瘤细胞的细胞膜混匀得到融合性细胞膜;
(2)在搅拌下,向ZnCl2溶液中加入核酸,之后调节pH,离心,重悬沉淀,得到Zn2+与核酸的交联产物;将得到的Zn2+与核酸的交联产物一边搅拌一边加入GMP溶液,继续搅拌,之后再次离心,重悬,洗涤后得到GMP修饰的负载核酸的纳米内核;
(3)将步骤(1)中得到的融合性细胞膜和步骤(2)中得到的负载核酸的纳米内核混匀,加入挤出机挤出得到膜融合纳米核酸载体。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的人胚胎肾细胞的细胞膜和黑色素瘤细胞的细胞膜的质量比为1~3:1~3。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:
步骤(2)中所述的搅拌的条件为500~700rpm;
步骤(2)中所述的ZnCl2与核酸分子的质量比为20~1000:1;
步骤(2)中所述的调节pH为调节到pH 6~9;
步骤(2)中所述的离心的条件为2~6℃下,10000~14000rpm离心8~12min;
步骤(2)中所述的GMP溶液的浓度为0.05~1mM;
步骤(2)中所述的继续搅拌的条件为500~700rpm;
步骤(2)中所述的再次离心的条件为2~6℃下,10000~14000rpm离心8~12min;
步骤(3)中所述的挤出的条件为使用挤出机通过聚碳酸酯多孔膜挤出9~15次;所述的聚碳酸酯多孔膜的孔径为190~400nm。
6.权利要求1~5任一所述的膜融合纳米核酸载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
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同源细胞膜包覆智能释药纳米粒用于肝癌靶向治疗;夏颖;夏菁;崔洪燕;钱明;张留伟;陈麒先;王静云;;应用化学;20200110(01);第77-87页 * |
智能型荧光纳米递送系统用于乳腺癌细胞的示踪和增殖抑制研究;张贝贝;黄维兰;梅玉影;邵悦馨;张璐;李瑞芳;;药学学报;20190517(06);第175-183页 * |
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