CN115120572A - 一种基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡及其制备与应用 - Google Patents

一种基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基因工程化细胞膜涂层的脂质体纳米囊泡Adar1‑LNPs@mPD1及制备方法和应用。纳米囊泡的外层是PD1生物细胞膜构成，Adar1‑siRNA(siAdar1)负载到其脂质体的内核中。基因工程化细胞膜表面表达的PD1可与癌细胞上的PD‑L1蛋白结合，阻断相关免疫抑制通路；脂质体(LNP)纳米颗粒具有高的核酸负载效率及良好的生物相容性；siAdar1可以有效地沉默ADAR1的表达以诱导肿瘤炎症，使肿瘤对干扰素更加敏感。通过上述功能的有机整合，Adar1‑LNPs@mPD1可激活系统的抗肿瘤免疫，实现显著的肿瘤生长消退、远端肿瘤预防和有效抑制肺转移。

Description

一种基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡及其制备与应用
技术领域
本发明涉及一种基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡及其制备方法，以及其在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
背景技术
近年来备受关注的免疫疗法是利用免疫系统特征进行癌症治疗。免疫疗法被视为生物疗法的一种，它是基于患者免疫系统对癌症的敏感性，增加选择性并减少副作用，其功效已通过临床研究以及体外和体内研究得到证实。癌症免疫疗法因临床试验中的成功被《科学》杂志评选为“2013年度十大科学突破之一”。目前，有许多免疫治疗药物被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于癌症治疗：用于肾癌细胞治疗的重组人IL-2；首个针对B细胞恶性肿瘤的单克隆抗体；首个用于前列腺癌治疗的基于DC的癌症疫苗；嵌合抗原受体(CAR)工程细胞治疗B细胞淋巴瘤；黑色素瘤的程序性死亡配体-1(PD-L1)免疫检查点阻断剂等。程序性死亡蛋白1(PD1)是T细胞表面常见的免疫抑制成员，在下调免疫系统和提高自身耐受性方面发挥着重要作用。其配体PD-L1在恶性肿瘤细胞表面过表达，与PD1结合，抑制PD1阳性细胞增殖，参与肿瘤免疫逃逸导致治疗失败。基于PD1/PD-L1通路在肿瘤免疫治疗中具有重要价值，近年来已成为重要的免疫检查点。因此，了解PD1/PD-L1的作用机制对于联合免疫治疗以及改善患者预后具有重要意义。PD1/PD-L1抑制剂已在许多类型肿瘤中显示出临床疗效，例如，用特异性抗体阻断PD1或PD-L1可增强T细胞反应并介导抗肿瘤活性。尽管免疫检查点阻断疗法在临床上取得了巨大成功，但免疫疗法的响应率仍然很低。研究表明，只有10-30％的患者在接受PD1/PD-L1抑制剂后可以产生长期和持续的疗效。大多数患者对治疗没有明显反应或保持对治疗的抵抗力，其根源在于患者对靶向抑制剂不敏感。PD1/PD-L1抗体耐药的发展涉及许多肿瘤相关过程，包括PD-L1表达、肿瘤新抗原表达和传递、相关细胞信号通路、肿瘤微环境和表观遗传修饰。肿瘤抗原的缺乏，导T细胞无法识别PD1/PD-L1抗体，导致耐药。此外，处理和传递抗原的分子，例如MHC I类分子和β2微球蛋白，在其遗传密码发生改变时也会导致对免疫检查点抑制剂(ICIs)的耐药性。异常的细胞信号传导也是导致免疫治疗耐药的一个因素，如PI3K/Akt通路、Wnt/β-连锁蛋白通路、JAK/STAT/IFN-γ通路和丝裂原活化蛋白激酶通路。因此，需要探索克服肿瘤对免疫检查点阻断(ICB)耐药的替代方法。最近，研究人员发现RNA编辑酶ADAR1可以调节染色体末端基因组的稳定性，这是癌细胞生长所必需的。众所周知，原癌基因ADAR1在乳腺癌、肝癌、肺癌等肿瘤中过表达，促进肿瘤的进展。此外，Ishizuka等人发现，肿瘤细胞中ADAR1活性的丧失使肿瘤对干扰素更加敏感，并增强肿瘤炎症反应。因此，根据相关研究表明，设计ADAR1靶点是改善ICB治疗的新策略。
发明内容
本发明目的是提供一种递送核酸的脂质体纳米囊泡，特异性沉默基因和蛋白的表达，使肿瘤微环境发生炎症反应并对干扰素更加敏感，同时阻断PD1/PD-L1抑制轴，实现增强肿瘤免疫检查阻断治疗。
本发明采用的技术方案是：
一种基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡Adar1-LNPs@mPD1，由生物细胞膜和脂质混合物构成，粒径50～200nm，所述生物细胞膜表面转配有程序性死亡受体1(PD1)，脂质混合物内部负载Adar1-siRNA(siAdar1)，Adar1-siRNA为两条反向互补的DNA链，包括如SEQ ID No.4所示的正义链和如SEQ ID No.5所示的反义链。
所述的生物细胞膜来源于工程化CHO细胞株，细胞膜表面表达有PD1蛋白。
所述的脂质混合物由DOTAP、DPPC、CHO-HP、DSPE-mPEG2000与siAdar1混合后，通过乙醇注入法获得。所述的纳米囊泡为细胞膜与脂质混合物共混后，通过水浴超声获得。
所述的脂质混合物由以下质量比1～10：0.5～3：1～5：0.1～2：0.1～2的物质：DOTAP、DPPC、CHO-HP、DSPE-mPEG2000、siAdar1组成。
所述的细胞膜总蛋白与脂质体纳米颗粒质量比为0.2～2：0.4～4。
具体的，所述的脂质体纳米囊泡由如下方法构建获得：
本发明首先将如SEQ ID No.2所示的编码PD1蛋白的基因序列插入到pCDH-CMV-Puro空载质粒中，获得重组质粒；
使用CHO细胞对重组质粒进行慢病毒包装，浓缩病毒液感染CHO细胞，并加入polybrene增强感染效率，用抗性药物Puro进行细胞筛选，获得稳转细胞株；将成功构建的稳转细胞株进行扩大培养，收集细胞，用细胞膜和细胞蛋白抽提试剂盒提取PD1细胞膜，使用蛋白质定量BCA法进行总蛋白定量；
将DOTAP、DPPC、CHO-HP和DSPE-mPEG2000脂质混合物溶解在乙醇中，将所述Adar1-siRNA溶解在10～50mM柠檬酸缓冲液中，脂质混合物与Adar1-siRNA以体积比1:2混合，冰浴超声1～10分钟后通过超滤并洗涤获得Adar1-LNPs；
PD1细胞膜通过超声使其充分破碎，将质量浓度为0.2～2：0.4～4的Adar1-LNPs与PD1细胞膜以体积比1:1冰浴超声1～10分钟，最后,收集产物通过超滤并洗涤获得纳米囊泡Adar1-LNPs@mPD1。
该基因工程化细胞膜纳米囊泡可以特异性沉默肿瘤细胞中的ADAR1的表达，对肿瘤细胞重新编程从而导致对干扰素敏感增加，同时阻断免疫抑制通路，增强肿瘤免疫治疗。
本发明运用基因工程策略构建细胞膜涂层的脂质体纳米囊泡Adar1-LNPs@mPD1。纳米囊泡的外层是PD1生物细胞膜构成，Adar1-siRNA负载到其脂质体的内核中。基因工程化细胞膜表面表达的PD1可与癌细胞上的PD-L1蛋白结合，阻断相关免疫抑制通路；脂质体纳米颗粒具有高的核酸负载效率及良好的生物相容性，促进细胞摄取；siAdar1可以有效地沉默ADAR1的表达以诱导肿瘤炎症，使肿瘤对干扰素更加敏感。通过上述功能的有机整合，Adar1-LNPs@mPD1可激活系统的抗肿瘤免疫，实现显著的肿瘤生长消退、远端肿瘤预防和有效抑制肺转移。
本发明还涉及所述的基因工程化细胞膜纳米囊泡在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡可以有效地沉默ADAR1的表达以诱导肿瘤炎症，使肿瘤对干扰素更加敏感。
本发明还涉及所述的基因工程化细胞膜纳米囊泡在制备肿瘤免疫检查点抑制剂中的应用。Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡可以解除PD1/PD-L1抑制轴的免疫抑制功能。
总之，这项工作提供了一种对ICB治疗反应较差的替代策略，可以通过重组肿瘤细胞来显著提高抗肿瘤疗效。
本发明针对免疫检查点封锁治疗有限的宿主应答率，缺乏免疫浸润的肿瘤经常不能对检查点封锁作出反应，需要联合新的靶点从而使肿瘤微环境(TEM)发生炎症反应的需求，构建了一种基因工程化细胞膜涂层的脂质体纳米囊泡。纳米囊泡可以阻断PD1/PD-L1免疫抑制轴，特异性地沉默基因的表达，诱导肿瘤炎症反应，使肿瘤对干扰素更加敏感，激活强大且系统的抗肿瘤免疫。优选的Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡具有50～200nm的直径，利于其在肿瘤部位的递送和吸收。
本发明所构建的Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡可通过任何已知的递送方法方式给药：静脉注射，动脉内，肿瘤内，胃肠外，肺腔内，局部给药的区域递送形式。
本发明的有益效果主要体现在：
一、本发明所构建的Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡来源于生物体内，与目前其他具有肿瘤细胞免疫治疗的纳米材料相比，该纳米囊泡具有良好的生物相容性、较低毒副作用、强的特异性等优势。该纳米囊泡仅可以递送多种核酸药物，同时这种细胞膜策略保留蛋白分子的生物活性。
二、本发明所构建的Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡可阻断PD1/PD-L1免疫抑制轴，特异性地沉默ADAR1的表达，诱导肿瘤炎症反应，使肿瘤对干扰素更加敏感，激活强大且系统的抗肿瘤免疫。
附图说明
图1为制备Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡所涉及的部分关键表征数据。(A)构建的PD1-mCherry稳转细胞株的激光共聚焦图像。细胞膜上的mCherry(红的荧光信号)证明PD1蛋白可表达在细胞膜表面。(B)PD1-mCherry稳转细胞流式分析结果。(C)Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡的透射电镜(TEM)图像。(D)Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡的DLS图像。(E)Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡的Zeta电位图。
图2为PD1纳米囊泡与4T1细胞表面的PDL1-EGFP受体的结合效果。PDL1-EGFP(绿色荧光)和PD1-mCherry(红色荧光)的激光共聚焦图像。
图3为4T1细胞对Adar1-LNPs纳米颗粒时间依赖性摄取行为。
图4为Adar1-LNPs纳米颗粒对4T1肿瘤细胞中ADAR1基因的敲低效果。
图5为Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡处理的4T1细胞对干扰素γ敏感性增强。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
(一)构建重组转移载体pCDH-CMV-PD1-mCherry-Puro：
1、构建目的重组基因PD1-mCherry
人工合成通过柔性肽序列(ggaggttctggtggatctggtggaggttctggttctggatcaggtggt，48bp)连接编码PD1蛋白的基因序列(如SEQ ID No.2所示，870bp)与编码mCherry红色荧光蛋白基因序列(如SEQ ID No.3所示，711bp)构建成的融合蛋白PD1-mCherry基因序列(如SEQ ID No.1所示)。
PD1-mCherry基因序列如下:
GCTAGCATGTGGGTCCGGCAGGTACCCTGGTCATTCACTTGGGCTGTGCTGCAGTTGAGCTGGCAATCAGGGTGGCTTCTAGAGGTCCCCAATGGGCCCTGGAGGTCCCTCACCTTCTACCCAGCCTGGCTCACAGTGTCAGAGGGAGCAAATGCCACCTTCACCTGCAGCTTGTCCAACTGGTCGGAGGATCTTATGCTGAACTGGAACCGCCTGAGTCCCAGCAACCAGACTGAAAAACAGGCCGCCTTCTGTAATGGTTTGAGCCAACCCGTCCAGGATGCCCGCTTCCAGATCATACAGCTGCCCAACAGGCATGACTTCCACATGAACATCCTTGACACACGGCGCAATGACAGTGGCATCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGCACCCCAAGGCAAAAATCGAGGAGAGCCCTGGAGCAGAGCTCGTGGTAACAGAGAGAATCCTGGAGACCTCAACAAGATATCCCAGCCCCTCGCCCAAACCAGAAGGCCGGTTTCAAGGCATGGTCATTGGTATCATGAGTGCCCTAGTGGGTATCCCTGTATTGCTGCTGCTGGCCTGGGCCCTAGCTGTCTTCTGCTCAACAAGTATGTCAGAGGCCAGAGGAGCTGGAAGCAAGGACGACACTCTGAAGGAGGAGCCTTCAGCAGCACCTGTCCCTAGTGTGGCCTATGAGGAGCTGGACTTCCAGGGACGAGAGAAGACACCAGAGCTCCCTACCGCCTGTGTGCACACAGAATATGCCACCATTGTCTTCACTGAAGGGCTGGGTGCCTCGGCCATGGGACGTAGGGGCTCAGCTGATGGCCTGCAGGGTCCTCGGCCTCCAAGACATGAGGATGGACATTGTTCTTGGCCTCTTggaggttctggtggatctggtggaggttctggttctggatcaggtggtATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAG
2.构建重组转移载体pCDH-CMV-PD1-mCherry-Puro
将回收的PD1-mCherry插入pCDH-CMV-Puro空载质粒(购自system bioscience)中得到重组质粒pCDH-CMV-PD1-mCherry-Puro。
质粒结构通过基因测序确定。
(二)慢病毒包装并转染CHO细胞
使用CHO细胞(来自ATCC提供保藏信息)对pCDH-CMV-PD1-mCherry-Puro进行慢病毒包装，过程如下：
1、CHO细胞接种在6孔板中，待生长密度为95～99％时用于慢病毒包装；
2、制备a液：960μL Opti-MEMTM I培养基与4μL Lipofectamine 3000试剂充分混匀；
3、制备b液：960μL Opti-MEMTM I培养基与Invitrogen公司的包装质粒:PLP1(7.5μg)、PLP2(3μg)、PLP/VSVG(4μg)、目的质粒pCDH-CMV-PD1-mCherry-Pur(10μg)以及4μLP3000试剂充分混匀；
4、向b液中加入a液并混匀，孵育10～20min后，将复合物加入CHO细胞中摇匀；培养箱中孵育6小时，更换新鲜培养基；
5、分别在转染24h，48h，72h，96h后收集病毒液，经离心(3000～4000rpm，30min)处理，使用过滤器过滤病毒液，通过超速离心法(100000×g，90min)进行浓缩，分装后置于-80℃备用；
用含有polybrene(溴化己二甲铵)(5μg/mL)的病毒液感染CHO细胞，增强感染效率，2天后用抗性药物Puro(嘌呤霉素)进行细胞筛选，稳转细胞株，最后通过激光共聚焦显微镜观察以及流式细胞术等实验验证PD1稳转细胞株的成功构建，结果如图1a和1b所示。细胞膜上的mCherry(红的荧光信号)证明PD1蛋白表达在细胞膜表面。
(三)CHO细胞扩大培养表达PD1-mCherry CHO细胞膜
在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养稳定表达PD1-mCherry的CHO细胞。胰蛋白酶消化并收集细胞，用冷PBS洗涤3次，800×g离心10min，然后用细胞膜和细胞质蛋白提取试剂盒(Cytosol Protein Extraction Kit)提取细胞膜。用含1mM PMSF的A试剂重悬细胞，置于冰上30分钟。随后，细胞悬液在液氮和室温下反复冻融三次，取上清，5000×g离心10min,40000×g离心1h，沉淀为PD1-mCherry CHO细胞膜(mPD1)。将细胞膜重新分散于PBS溶液中，并保存于-80℃冰箱中备用。采用EasyⅡ蛋白定量试剂盒BCA法定量膜蛋白浓度。
将表达PD1蛋白的细胞膜分散在PBS中进行充分混匀，转移至挤膜器中依次通过1000nm、400nm、200nm和100nm孔径滤膜重复挤压11次，收集制备好的细胞膜囊泡NVs/PD1，并置于-80℃冰箱保存备用。
(四)Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡制备
1.通过乙醇注入法制备Adar1-LNPs
将DOTAP(溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵)、DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、CHO-HP(高纯胆固醇)和DSPE-mPEG2000(硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)分别溶于乙醇中(浓度为10mg/mL)，将DOTAP、DPPC、CHO-HP、DSPE-mPEG2000的乙醇溶液按摩尔比为50:10:38.5:1.5混合，得到脂质混合物。将Adar1-siRNA(RNA编辑酶ADAR1的小干扰RNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，Adar1-siRNA为两条反向互补的DNA链，包括如SEQ ID No.4所示的正义链和如SEQ ID No.5所示的反义链分别为：Sense:5′-UUGACGCUUGUUUCCUUGGTT-3′；Antisense strand:5′-CCAAGGAAACAAGCGUCAATT-3′)溶解在20mM柠檬酸缓冲液(pH4.0)中。将脂质混合物与siRNA(是Adar1-siRNA，后文简写为siAdar1)(20μM)以1:2(v/v)混合并在冰浴中超声5分钟。收集囊泡并加入10倍的体积PBS，通过超滤(MWCO膜：100kDa；4500rpm,10min)离心洗涤两次并浓缩获得纳米颗粒Adar1-LNPs。产物中的siRNA浓度由(NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific,USA)测定。
2.通过超声法制备Adar1-LNPs@mPD1
取mPD1(0.8mg/mL)超声5分钟使其充分破碎。然后，将Adar1-LNPs(1mg/mL)和mPD1(总蛋白0.8mg)以1:1体积比混合并冰浴超声5分钟。最后，通过超滤(MWCO膜：100kDa；4500rpm,10min)离心洗涤两次并浓缩获得纳米囊泡Adar1-LNPs@mPD1。产物形貌通过TEM表征，结果如图1c所示，结果显示纳米囊泡粒径范围为50～200nm；通过粒度分析仪表征，结果如图1d和1e所示，通过DLS(动态光散射)法测量溶液状态下Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡粒径分布在180nm左右，略大于TEM结果，而Zeta表面电位在-7mV左右。
(五)肿瘤细胞上PD1和PD-L1的特异性结合验证
将4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)置于共聚焦皿中培养至贴壁，使用
Figure BDA0003719008620000061
3000试剂盒将pCDH-CMV-PDL1-mCherry-Blastcidin质粒(先前在M.Wu,D.Zheng,D.Zhang,P.Yu,L.Peng,F.Chen,Z.Lin,Z.Cai,J.Li,Z.Wei,Converting immune cold into hot bybiosynthetic functional vesicles to boost systematic antitumorimmunity.Iscience.23,101341(2020).公布过)通过瞬转实验导入4T1细胞中，使PD-L1-EGFP(绿色荧光)在4T1细胞表面过表达。瞬转24h后，换成含有PD1-mCherry(红色荧光)纳米囊泡(NVs/PD1)(NVs/PD1是用PD1-mCherry CHO细胞膜通过超声获得的单纯的膜囊泡)的新鲜培养基在4℃下共孵育30min，通过CLSM观察两者的荧光共定位效果。结果如图2所示，清晰的绿色信号与红色信号共同定位在4T1细胞上，即PD1与肿瘤细胞上过表达的PD-L1结合。此外，未结合的红色荧光点的存在表明NVs/PD1也可能在4T1细胞中结合内源性的PD-L1(程序性死亡配体-1)。这些结果表明，NVs/PD1可以通过PD1和PD-L1之间的分子相互作用特异性结合到肿瘤细胞上。
(六)脂质体对细胞摄取Adar1的作用验证
将4T1细胞接种在共聚焦培养皿中培养24小时，一份加入含有Adar1-FAM-LNPs的培养基(Adar1-FAM-LNPs是上海吉玛制药技术有限公司购买的带5-FAM标记的siAdar1)，孵育4h、24h或48h。另一份加入含有游离siAdar1(Free siAdar1，未加入脂质混合物的siAdar1)的培养基作为对照组，孵育448h。4％多聚甲醛固定，DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，荧光染色剂)染色10分钟，然后在CLSM(激光共聚焦扫描显微镜)下成像。结果如图3所示，4T1细胞孵育4小时后，观察到5-FAM标记的siAdar1绿色荧光信号，随着共培养时间的延长，信号增强。而游离siAdar1孵育的4T1细胞几乎没有出现5-FAM荧光。显然，脂质体LNPs可以促进siRNA有效载荷的有效细胞摄取。
(七)脂质体对细胞摄取siAdar1并抑制肿瘤细胞过表达RNA编辑酶ADAR1的作用验证
将4T1细胞在6孔板中培养24小时，与含有Adar1-LNPs的新鲜培养基共培养作为阳性处理，4T1细胞与PBS、或NC-LNPs(用无意义序列NC替换Adar1的序列合成的NC-LNPs纳米颗粒)、或Free siAdar1共孵育作为阴性对照，Lipofectamine 3000转染siAdar1处理阳性对照组。孵育48h后，胰蛋白酶消化细胞。采用qRT-PCR检测4T1细胞中ADAR1 mRNA的水平，以及蛋白质免疫印迹(Western Blot)评估细胞中ADAR1蛋白表达量。结果如图4所示，与阳性对照Lipo 3000组结果相似，Adar1-LNPs处理的4T1细胞中，ADAR1 mRNA(RNA编辑酶ADAR1mRNA)以及蛋白表达明显下调。而阴性对照组ADAR1表达几乎没有变化。说明显然，脂质体LNPs可以促进siRNA有效载荷的有效细胞摄取，并抑制肿瘤细胞过表达RNA编辑酶ADAR1。
(八)Adar1-LNPs@mPD1与治疗肿瘤的药物联用时在治疗肿瘤中的应用
4T1细胞在96孔板中孵育12h，用含有Adar1-LNPs@mPD1纳米囊泡(siAdar1浓度为100nM)的培养基孵育48h，加入含不同浓度IFN-γ(γ干扰素能激活效应细胞，提高自然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞和肿瘤浸润淋巴细胞活性。促进单核细胞循环；增强免疫细胞表面抗原和抗体的表达；刺激白介素-2、肿瘤坏死因子、干扰素-α等细胞因子的产生；抑制肿瘤细胞分裂，诱导基因合成抗病毒蛋白)(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/mL)的培养基，孵育24h。用CCK-8法检测细胞活力。结果如图5和表1所示，与对照组相比，Adar1-LNPs@mPD1孵育后4T1细胞经IFN-γ(0.5μg/mL)刺激后，细胞活力受到显著抑制。Adar1-LNPs和mPD1混合使用时对细胞活力的抑制效果，大于两者单独使用时对细胞活力的抑制效果的累加，因此，IFNs的感应足以引起ADAR1低表达肿瘤细胞的生长停滞。
表1
Figure BDA0003719008620000071
对照组为4T1细胞在96孔板中孵育12h，用含有NVs/PD1、或Adar1-LNPs、或Adar1-LNPs+anti-PD1的培养基孵育48h，加入含不同浓度IFN-γ(0.5μg/mL)的培养基，孵育24h，用CCK-8法检测细胞活力。anti-PD1是PD1抗体。
序列表
<110> 福建医科大学孟超肝胆医院（福州市传染病医院）
<120> 一种基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡及其制备与应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1629
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctagcatgt gggtccggca ggtaccctgg tcattcactt gggctgtgct gcagttgagc 60
tggcaatcag ggtggcttct agaggtcccc aatgggccct ggaggtccct caccttctac 120
ccagcctggc tcacagtgtc agagggagca aatgccacct tcacctgcag cttgtccaac 180
tggtcggagg atcttatgct gaactggaac cgcctgagtc ccagcaacca gactgaaaaa 240
caggccgcct tctgtaatgg tttgagccaa cccgtccagg atgcccgctt ccagatcata 300
cagctgccca acaggcatga cttccacatg aacatccttg acacacggcg caatgacagt 360
ggcatctacc tctgtggggc catctccctg caccccaagg caaaaatcga ggagagccct 420
ggagcagagc tcgtggtaac agagagaatc ctggagacct caacaagata tcccagcccc 480
tcgcccaaac cagaaggccg gtttcaaggc atggtcattg gtatcatgag tgccctagtg 540
ggtatccctg tattgctgct gctggcctgg gccctagctg tcttctgctc aacaagtatg 600
tcagaggcca gaggagctgg aagcaaggac gacactctga aggaggagcc ttcagcagca 660
cctgtcccta gtgtggccta tgaggagctg gacttccagg gacgagagaa gacaccagag 720
ctccctaccg cctgtgtgca cacagaatat gccaccattg tcttcactga agggctgggt 780
gcctcggcca tgggacgtag gggctcagct gatggcctgc agggtcctcg gcctccaaga 840
catgaggatg gacattgttc ttggcctctt ggaggttctg gtggatctgg tggaggttct 900
ggttctggat caggtggtat ggtgagcaag ggcgaggagg ataacatggc catcatcaag 960
gagttcatgc gcttcaaggt gcacatggag ggctccgtga acggccacga gttcgagatc 1020
gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc 1080
aagggtggcc ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc ctcagttcat gtacggctcc 1140
aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc cccgactact tgaagctgtc cttccccgag 1200
ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag 1260
gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc tacaaggtga agctgcgcgg caccaacttc 1320
ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc ctccgagcgg 1380
atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc gagatcaagc agaggctgaa gctgaaggac 1440
ggcggccact acgacgctga ggtcaagacc acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagctg 1500
cccggcgcct acaacgtcaa catcaagttg gacatcacct cccacaacga ggactacacc 1560
atcgtggaac agtacgaacg cgccgagggc cgccactcca ccggcggcat ggacgagctg 1620
tacaagtag 1629
<210> 2
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctagcatgt gggtccggca ggtaccctgg tcattcactt gggctgtgct gcagttgagc 60
tggcaatcag ggtggcttct agaggtcccc aatgggccct ggaggtccct caccttctac 120
ccagcctggc tcacagtgtc agagggagca aatgccacct tcacctgcag cttgtccaac 180
tggtcggagg atcttatgct gaactggaac cgcctgagtc ccagcaacca gactgaaaaa 240
caggccgcct tctgtaatgg tttgagccaa cccgtccagg atgcccgctt ccagatcata 300
cagctgccca acaggcatga cttccacatg aacatccttg acacacggcg caatgacagt 360
ggcatctacc tctgtggggc catctccctg caccccaagg caaaaatcga ggagagccct 420
ggagcagagc tcgtggtaac agagagaatc ctggagacct caacaagata tcccagcccc 480
tcgcccaaac cagaaggccg gtttcaaggc atggtcattg gtatcatgag tgccctagtg 540
ggtatccctg tattgctgct gctggcctgg gccctagctg tcttctgctc aacaagtatg 600
tcagaggcca gaggagctgg aagcaaggac gacactctga aggaggagcc ttcagcagca 660
cctgtcccta gtgtggccta tgaggagctg gacttccagg gacgagagaa gacaccagag 720
ctccctaccg cctgtgtgca cacagaatat gccaccattg tcttcactga agggctgggt 780
gcctcggcca tgggacgtag gggctcagct gatggcctgc agggtcctcg gcctccaaga 840
catgaggatg gacattgttc ttggcctctt 870
<210> 3
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uugacgcuug uuuccuuggt t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaaggaaac aagcgucaat t 21

Claims (7)

1.一种基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡Adar1-LNPs@mPD1，其特征在于，由生物细胞膜和脂质混合物构成，粒径50～200nm，所述生物细胞膜表面转配有程序性死亡受体1(PD1)，脂质混合物内部负载Adar1-siRNA(siAdar1)，Adar1-siRNA为两条反向互补的DNA链，包括如SEQ ID No.4所示的正义链和如SEQ ID No.5所示的反义链。
2.如权利要求1所述的基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡，其特征在于，所述的生物细胞膜来源于基因工程化CHO细胞株。
3.如权利要求1所述的基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡，其特征在于，所述的脂质混合物由以下质量比1～10：0.5～3：1～5：0.1～2：0.1～2的物质：DOTAP、DPPC、CHO-HP、DSPE-mPEG2000、siAdar1组成。
4.如权利要求1所述的基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡，其特征在于，所述的细胞膜的总蛋白与脂质混合物的质量比为0.2～2：0.4～4。
5.如权利要求1～4任一项所述的基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡的制备方法，其特征在于，由如下方法构建获得：
步骤1.将如SEQ ID No.2所示的编码PD1蛋白的基因序列插入到pCDH-CMV-Puro空载质粒中，获得重组质粒；
步骤2.使用CHO细胞对重组质粒进行慢病毒包装，浓缩病毒液感染CHO细胞，并加入polybrene增强感染效率，用抗性药物Puro进行细胞筛选，获得稳转细胞株；将成功构建的稳转细胞株进行扩大培养，收集细胞，用细胞膜和细胞蛋白抽提试剂盒提取PD1细胞膜，使用蛋白质定量BCA法进行总蛋白定量；
步骤3.将DOTAP、DPPC、CHO-HP和DSPE-mPEG2000脂质混合物溶解在乙醇中，将所述Adar1-siRNA溶解在10～50mM柠檬酸缓冲液中，脂质混合物与Adar1-siRNA以体积比1:2混合，冰浴超声1～10分钟后通过超滤并洗涤获得Adar1-LNPs；
步骤4.PD1细胞膜通过超声使其充分破碎，将质量浓度为0.2～2：0.4～4的Adar1-LNPs与PD1细胞膜以体积比1:1冰浴超声1～10分钟，最后,收集产物通过超滤并洗涤获得纳米囊泡Adar1-LNPs@mPD1。
6.权利要求1～4任一项所述的基因工程化细胞膜纳米囊泡在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
7.权利要求1～4任一项所述的基因工程化细胞膜纳米囊泡在制备肿瘤免疫检查点抑制剂中的应用。
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