CN112481299A - 用于调节PD-1/PD-L1通路的RNAi表达质粒 - Google Patents

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Abstract

本申请属于肿瘤防治技术领域，具体涉及一种用于调节PD‑1/PD‑L1通路的RNAi表达质粒专利申请事宜。表达质粒shPD‑L1通过引物设计、PCR扩增、酶切、与pSicoR‑GFP vector连接、转化、筛选、鉴定等步骤制备获得。本申请通过构建靶向PD‑L1的RNAi质粒shPD‑L1，并将该质粒负载到带有正电荷的MSN‑NH2的介孔中，并进一步利用挤压法制备成B16‑OVA细胞膜包裹的全抗原基因传递纳米载体CCM/MSN@shPD‑L1。该纳米载体不仅具有良好的生物相容性，同时可以同源靶向肿瘤细胞下调免疫检查点分子PD‑L1表达，重新激活CD8+ T细胞引发强烈的CTL免疫反应。

Description

用于调节PD-1/PD-L1通路的RNAi表达质粒
技术领域
本申请属于肿瘤防治技术领域，具体涉及一种用于调节PD-1/PD-L1通路的RNAi表达质粒专利申请事宜。
背景技术
程序性死亡受体1（Programmed death 1），是一种重要的免疫抑制分子，它表达于肿瘤微环境中的免疫细胞，包括活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞（NK）等，尤其高表达于CTL（细胞毒性T淋巴细胞）。PD-1有两个配体，分别是程序性死亡配体1（Programmed death ligand 1，PD-L1，也称为CD274或B7-H1）和程序性死亡配体2（Programmed death ligand 2， PD-L2；也称为CD273或B7-DC）。其中PD-L1是PD-1的主要配体，它主要表达于乳腺癌、黑色素瘤、肺癌等肿瘤细胞。已有研究认为，PD-1 / PD-L1并不直接参与细胞凋亡途径，而是通过相互作用抑制T淋巴细胞的活化和增殖，间接影响肿瘤细胞的死亡。基于这些研究，借助于抗体的应用，通过阻断PD-1/PD-L1的相互作用在部分肿瘤的防控和治疗中已经表现出了较好应用效果。但抗体治疗的高剂量和长期应用需要，使得该技术成本高昂，而且容易“脱靶”，使得开发新的PD-1/PD-L1通路抑制药物仍然具有十分重要的技术意义。
RNA干扰作为基因功能研究的支撑技术，在医疗领域，已在各种由于基因活性改变导致的疾病中得到了初步应用，包括癌症、自身免疫性疾病、遗传性显性疾病等。RNAi可以高度特异性的调节靶基因，其在细胞中的主要作用是下调特定目标蛋白的表达。在基因治疗中，RNAi可以通过两种不同的途径触发：一种是基于RNA的方法，人工合成小干扰RNA（Small interfering RNAs，siRNAs），将其传递至靶细胞。siRNA通常是一段由21个核苷酸组成的双链RNA，它具有较好特异性RNAi触发活性。另一种是基于DNA的策略，合成更长的短发夹RNA（Short hairpin RNAs，shRNAs），进一步克隆到质粒载体中，并在靶细胞内被Dicer加工成siRNA，这使得构建RNAi质粒载体以沉默哺乳动物细胞内的基因表达成为可能。因此，如能基于RNA干扰技术开发一种针对现有PD-1和PD-L1抗体治疗的替代性技术，对于相关疾病的治疗是具有积极的技术意义的。但实际技术开发而言，尽管RNAi技术原理较为成熟，但如何将所构建的siRNAs或者shRNA输送到患病部位，则是该技术能否实现预期的关键。
现有技术中，以相关纳米材料作为载体来运输和携带相关药物已有较多研究。其中聚乙烯亚胺（PEI）即是一种研究得较为广泛的RNAi递送系统。然而，由于其不良的毒性和体内不稳定性（尤其是在全身给药期间），限制了其进一步的临床应用。近年来，一些无机纳米生物材料，如介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs）、金纳米颗粒（Aus）、碳纳米管（CNT）等在生物医药中的应用研究得到了较多重视。其中，具有中孔结构的介孔二氧化硅纳米粒子（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs）更是由于具有较大的表面积、可调节的孔径体积等可以增加其对药物分子和抗原的负载量的技术优势，得到了更多关注。因此，在确保应用效果基础上，如能基于现有纳米材料，结合RNA干扰技术开发一种新的PD-1/PD-L1通路调节技术，对于相关肿瘤的防控具有十分重要的科研意义和技术价值。
发明内容
本申请目的在于提供一种用于调节PD-1/PD-L1通路的RNAi表达质粒，同时结合相关纳米载体的应用，可为相关肿瘤防治奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
用于调节PD-1/PD-L1通路的RNAi表达质粒，该表达质粒命名为shPD-L1，具体通过如下步骤构建获得：
（一）设计引物
根据PD-L1基因序列（Genbank登录号：NM_021893.3），设计上下游引物如下：
PD-L1引物上游：5’- GCCGAAATGATACACAATTCGA-3’，
PD-L1引物下游：5’- CCGAAATGATACACAATTCGA-3’；
（二）提取RNA提取，并反转录成cDNA备用
以B16-OVA细胞（黑色素瘤细胞）基因组为提取对象，提取其总RNA，并反转录为cDNA备用；
（三）PCR扩增
以步骤（二）中的cDNA为模板，利用步骤（一）中所设计引物进行PCR扩增，并回收目的DNA片段；
具体PCR扩增序列（114bp）如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
TGCCGAAATGATACACAATTCGACTCGAGTCGAATTGTGTATCATTTCGGTTTTTTCACGGCTTTACTATGTGTTAAGCTGAGCTCAGCTTAACACATAGTAAAGCCAAAAAAG；
（四）酶切，并与pSicoR-GFP vector连接
利用HpaI、XhoI酶分别对步骤（三）所回收目的DNA片段与pSicoR-GFP vector进行双酶切；
酶切后分别回收酶切产物，并利用T4 DNA连接酶进行连接；
（五）转化、筛选和鉴定
采用热激转化法，将步骤（四）中连接产物转化S3感受态细胞，并进行筛选，检测和鉴定，确保质粒连接重组正确，并将重组正确的质粒命名为：shPD-L1。
具体应用时，通过静电吸附方式，将质粒shPD-L1负载到MSN-NH2的介孔后，在MSN（介孔二氧化硅）表面再包覆CCM（Cancer cell membrane，癌细胞膜），并将之命名为：CCM/MSN@shPD-L1纳米载体，从而便于应用；具体通过如下步骤制备：
（一）制备MSN@shPD-L1纳米复合物
首先，采用无菌水对电位为正电荷的氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒（平均粒径为200 nm）进行清洗；
随后，在圆底烧瓶中加入前述清洗后的MSN纳米粒和质粒shPD-L1（以质量比计，MSN：shPD-L1=10~40:1，优选情况下，MSN比值不应低于30），再加入适量PBS7.2溶液，磁力搅拌器搅拌过夜以进行静电吸附；
最后，4℃、12000 rpm离心30 min，所得沉淀即为MSN@shPD-L1纳米复合物；
（二）提取B16-OVA细胞膜，并制备细胞膜囊泡
首先，培养B16-OVA细胞，并选取生长状态良好的细胞用PBS 7.2清洗一遍，之后用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞（尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解膜蛋白），离心收集细胞备用；
随后，对所收集的细胞进行匀浆裂解，具体而言：向每1×107个细胞沉淀中加入500 µL CER试剂，再加1/100蛋白酶抑制剂PMSF，震荡重悬后冰浴2分钟，再转移到冰预冷的玻璃匀浆器内，在冰水浴中充分匀浆处理，确保细胞充分破碎；
再后，将破碎后的细胞转移到新的离心管中，4℃、800g离心5min，收集上清液（胞膜-胞浆混合物）于新的离心管中；
最后，加入上清液1/10体积的MER（Membrane Extraction Reagent，北京普利莱基因技术有限公司的Nuc-Cyto-Mem Preparation Kit（胞核-胞浆-胞膜制备试剂盒）中的一个试剂）与上清液混合，冰浴5分钟后，4ºC、14000rpm离心30 min，收取沉淀物即为欲提取的B16-OVA细胞膜碎片；
制备细胞膜囊泡时，在上述所提取的细胞膜碎片沉淀物中加入适量PBS 7.2，超声处理，以重悬细胞膜；再用组装有400nm聚碳酸酯薄膜的挤出机挤压细胞膜悬液，从而最终获得细胞膜囊泡；
（三）制备CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物
首先，将步骤（一）中所制备的MSN@shPD-L1纳米复合物与步骤（二）所制备细胞膜囊泡混合均匀；
混合时，可参考如下比例：每1mg MSN和1×107细胞所提取的细胞膜；
随后，用组装有200nm聚碳酸酯薄膜的挤出机挤压混合液，以产生细胞膜包裹的纳米粒子，最终所得即为CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物。
所述RNAi表达质粒shPD-L1 或CCM/MSN@shPD-L1纳米载体在制备抗肿瘤药剂中的应用，所述肿瘤，具体例如为黑色素瘤；具体应用时，还可配合化疗应用。
瘤免疫疗法开启了肿瘤治疗的新时代，免疫治疗通常依赖于肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）内免疫细胞的相互作用。肿瘤细胞通过免疫检查点抑制T细胞活性，造成肿瘤细胞免疫逃逸。所以阻断免疫检查点可以重新激活CD8+ T细胞介导的免疫应答，其中最具代表性的就是靶向PD-1/ PD-L1信号通路的免疫检查点抑制剂。基于基因疗法原理，使用shRNA可以特异性下调肿瘤细胞免疫检查点分子的表达，从而阻断免疫检查点重新激活T细胞。而为将RNAi分子输送到肿瘤部位且进入靶细胞，本申请充分利用了介孔二氧化硅（MSNs）良好的生物相容性和负载能力，通过将肿瘤细胞的整个细胞膜涂布在MSN表面以赋予其同源靶向和免疫逃逸的能力。
基于上述技术构思，本申请中通过构建靶向PD-L1的RNAi质粒shPD-L1，并将该质粒负载到带有正电荷的MSN-NH2的介孔中，并进一步利用挤压法制备成B16-OVA细胞膜包裹的全抗原基因传递纳米载体CCM/MSN@shPD-L1。初步研究结果表明，该纳米载体可以被B16-OVA细胞内化摄取，B16-OVA细胞膜的存在赋予了该纳米载体同源靶向和免疫逃逸的能力。而体外RNAi实验结果表明，纳米载体CCM/MSN@shPD-L1被B16-OVA细胞摄取后能够产生有效的RNAi作用，显著降低B16-OVA细胞PD-L1基因的表达。进一步动物实验结果表明，该载体在小鼠体内可以有效降低B16-OVA肿瘤细胞PD-L1的表达，解除肿瘤细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用。进而增加了CD8+ T在肿瘤组织中的浸润比例，同时促进了IFN-γ、TNF-α、perforin和GrzB等一系列细胞因子的表达量，最终诱导CTL免疫应答，从而有效地抑制肿瘤生长。
总之，本申请所制备的全抗原基因递送纳米载体CCM/MSN@shPD-L1，不仅具有良好的生物相容性，同时可以同源靶向肿瘤细胞下调免疫检查点分子PD-L1表达，重新激活CD8+ T细胞引发强烈的CTL免疫反应。而且由于该纳米载体可以与放射疗法结合使用，因此对于调节放疗引起的免疫抑制微环境变化，增强肿瘤细胞免疫原性死亡，提高相关肿瘤防控效果具有积极的技术意义，同时也为相关疾病的防控提供了新的技术思路和借鉴参考。
附图说明
图1为质粒转染B16-OVA后的荧光显微镜图片（左侧为绿色荧光图，右侧为白场下的图像）；
图2为质粒转染B16-OVA后的流式检测结果；
图3为 B16-OVA细胞中PD-L1 mRNA的表达效率（***P＜0.001）；
图4为MSN@shPD-L1载体的制备情况；其中：A为利用Nanodrop 2000测定上清中游离的shRNA，再计算不同质量比下shRNA被MSN的负载率；B为琼脂糖凝胶电泳检测MSN负载shRNA的情况；
图5为功能化纳米载体的表征情况；其中：A为TEM表征MSN@shPD-L1、CCM/MSN@shPD-L1；B为SDS-PAGE分析蛋白质组分marker，（lane 1）癌细胞裂解物，（lane 2）癌细胞膜囊泡，（lane 3）CCM/MSN@shPD-L1；C为MSN@shPD-L1、CCM、CCM/MSN@shPD-L1的水动力学尺寸分布；D为MSN@shPD-L1、CCM、CCM/MSN@shPD-L1的Zeta电位；E为CCM/MSN@shPD-L1在7天内的水动力学尺寸分布和Zeta电位变化情况；
图6为各实验组对B16-OVA细胞的细胞毒性研究；图中（以24h组别为例），从左至右分别为（以shPD-L1含量计，每个组别下从左至右分别为0 µg/mL,3 µg/mL,15 µg/mL,30 µg/mL）：shPD-L1、MSN/@shPD-L1、CCM/MSN@shNC、CCM/MSN@shPD-L1实验组；
图7为CCM/MSN@shPD-L1纳米载体可被B16-OVA细胞内化结果；其中：A为B16-OVA细胞与纳米载体共孵育2 h后的共聚焦成像；纳米载体由FITC（绿色通道）标记的MSN和DiI（红色通道）标记的癌细胞膜制成；B16-OVA细胞核用Hoechst 33342（蓝色通道）染色；黄色代表纳米载体的核信号和壳信号的共定位；比例尺= 10 μm；B为流式检测不同内吞抑制剂对B16-OVA细胞摄取纳米载体的影响；结果表示为平均值±SD（n = 3），*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；
图8为 CCM/MSN@shPD-L1同源靶向B16-OVA细胞；其中：A为B16-OVA、4T1、MC38、MCF-7、HUVEC、DC 2.4和RAW 264.7细胞分别与纳米载体CCM/MSN@shPD-L1和MSN@shPD-L1共孵育2 h后的共聚焦成像；绿色代表DIO（绿色通道）标记的MSN；各细胞核用Hoechst 33342（蓝色通道）染色。比例尺= 25 μm；B为B16-OVA、4T1、MC38、MCF-7、HUVEC、DC 2.4和RAW264.7细胞分别与纳米载体CCM/MSN@shPD-L1和MSN@shPD-L1共孵育2 h后的流式图；MSN终浓度固定为100 μg/mL；结果表示为平均值±SD（n = 3），*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；
图9为CCM/MSN@shPD-L1下调B16-OVA细胞PD-L1表达，B16-OVA细胞分别与shPD-L1和不同纳米载体包括MSN@shPD-L1、CCM/MSN@shNC和CCM/MSN@shPD-L1（按照所含shPD-L1的量计算终浓度为15 μg/mL），PBS组为空白对照组，37℃共孵育48 h；其中：A为纳米载体转染B16-OVA细胞的荧光显微镜图片；B为流式检测B16-OVA细胞GFP表达量；C为流式检测B16-OVA细胞PD-L1表达量；D为qRT-PCR检测B16-OVA细胞中PD-L1在mRNA水平上的相对表达量；结果表示为平均值±SD（n = 3），* P <0.05,** P <0.01,*** P <0.001；
图10为纳米载体的体内抗肿瘤效果；其中：A为治疗方案流程示意图；B为肿瘤体积变化曲线；C为体重变化曲线；结果表示为平均值±SD（n = 5），* P <0.05,** P <0.01,***P <0.001；
图11为纳米载体的体内抗肿瘤效果；其中：A为流式检测肿瘤细胞PD-L1表达量；B为肿瘤部位CD3+ CD8+ T细胞的浸润情况，C为小鼠脾脏中IFN-γ+ CD8+ T细胞的比例；D为淋巴结中IFN-γ+ CD8+ T细胞的比例；结果表示为平均值±SD（n = 5），* P <0.05,** P <0.01,*** P <0.001；
图12 为CCM/MSN@shPD-L1联合放疗体内抗肿瘤效果；其中：A为治疗方案示意图；B为小鼠的肿瘤体积变化曲线；C为小鼠的体重变化曲线；
D为小鼠的肿瘤照片；结果表示为平均值±SD（n = 5），* P <0.05,** P <0.01,*** P <0.001；
图13为CCM/MSN@shPD-L1联合放疗体内抗肿瘤效果，其中：A为流式检测肿瘤细胞PD-L1表达量；B为流式检测DC细胞PD-L1表达量；C为肿瘤部位CD3+ CD8+ T细胞的浸润情况；小鼠脾脏（D）和引流淋巴结（E）中IFN-γ+CD8+、TNF-α+CD8+、perforin+CD8+和GrzB+CD8+的比例；F为肿瘤部位IFN-γ+CD8+、TNF-α+CD8+的比例；结果表示为平均值±SD（n = 5），*P <0.05,** P <0.01,*** P <0.001；
图14为各实验组小鼠脏器组织（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）的HE染色，比例尺=100μm。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
Stable 3感受态细胞，北京全式金生物技术公司；
psPAX2、pMD2.G，Addgene；
C57BL/6J雌性小鼠，购买于北京维通利华实验动物技术公司，SPF级鼠房中饲养，6~8周龄时用于实验；
原癌细胞系B16-OVA，中国科学院生物物理研究所王盛典老师惠赠；
pSicoR-GFP vector，购自addgene（货号11579）；
主要试剂：
RPMI-1640液体培养基、Dulbecco's Modified Eagle Medium液体培养基、胎牛血清，Biological Industries（BI）；Opti-MEM培养基，Gibco；胰蛋白胨、胰蛋白酶、RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit，赛默飞世尔科技有限公司；PT293转染试剂，思享生物；Polybrene，Solarbio；DNA Marker，宝日医生物技术(北京)有限公司；质粒提取试剂盒，康为世纪；
Nuc-Cyto-Mem Preparation Kit，北京普利莱基因技术有限公司；总RNA提取试剂盒，郑州贝贝生物公司；LightCycler 480 SYBR Green I Master，罗氏公司；MSN（介孔二氧化硅）、MSN-NH2，，上海羧菲生物科技公司；
OVA257-264多肽，已公开多肽，由发明人参考现有技术合成；
anti-mCD3-PerCP-eflour 710（Clone:17A2）、anti-mCD8α-PE（Clone:53-6.7）、anti-mIFN-γ-APC（Clone:XMG1.2）、anti-mCD45-FITC（Clone:30-F11）、anti-mCD8α-APC（Clone:53-6.7）、anti-mCD274(PD-L1)-APC（Clone:MIH5）、anti-mCD11b-PerCP-Cy5.5（Clone:M1/70）、anti-mCD11c-PE（Clone:N418）、anti-mF4/80-eFluor 450（Clone:BM8）、anti-mPerforin-APC（Clone:eBioOMAK-D），eBioscience公司；
anti-mTNF-α-BV510（Clone:MP6-XT22）、anti-mGrzB-BV421，BD公司；
LB固体培养基、LB液体培养基、PBS（PH =7.2）缓冲液、0.25% 胰蛋白酶溶液、EDTA消化液、细胞冻存液、0.5M Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS、10%过硫酸铵（AP）、2×SDS上样缓冲液（loading buffer）、10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液、脱色液、考马斯亮蓝染液、10×红细胞裂解液、水合氯醛（4%）等，常规配制及操作即可；
主要仪器：
FACS Celesta流式细胞仪，BD公司；荧光倒置显微镜，日本奥林巴斯特公司；PCR仪，Takara公司；
凝胶成像系统，赛默飞世尔科技有限公司；透射电镜（Tecnai G2 F20-S-TWIN），FEI公司；挤出机，Avanti；粒径电位分析仪（Nano-S90），Malvern公司；
实施例1
RNA干扰（RNAi）是一种诱导转录后基因沉默的现象，可调节各种真核生物基因的表达。基于RNAi的基因疗法在肿瘤特异性基因治疗中受到了广泛的关注。在治疗中，RNAi通过递送小分子双链RNA，在细胞内形成RNA诱导沉默复合体，切割目标信使RNA（mRNA），从而根源上控制肿瘤相关基因的表达。在肿瘤细胞中，肿瘤细胞通过上调PD-L1的表达，与T淋巴细胞的PD-1相互作用，造成淋巴细胞功能衰竭并介导肿瘤的免疫逃逸。因此，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路可以逆转T淋巴细胞的衰竭状态，进而重新恢复和提升其对肿瘤细胞的杀伤能力。
本申请中，发明人构建了特异性靶向PD-L1的RNAi表达质粒shPD-L1，本实施例首先就该质粒的构建过程简介如下。
（一）设计引物
根据PD-L1基因序列（Genbank登录号：NM_021893.3），设计上下游引物如下（引物序列由北京六合华大基因科技有限公司合成提供）：
PD-L1引物上游：5’- GCCGAAATGATACACAATTCGA-3’，
PD-L1引物下游：5’- CCGAAATGATACACAATTCGA-3’；
（二）提取RNA提取，并反转录成cDNA备用
以B16-OVA细胞（黑色素瘤细胞）基因组为提取对象，具体操作可参考如下：
首先，将冷冻保藏的B16-OVA细胞进行复苏，并利用RPMI 1640培养基在5% CO2、37℃条件下培养至对数期；随后，收集处于对数期的B16-OVA细胞，弃去旧培养基，用PBS 7.2洗涤一遍，并用0.25%的胰酶消化后，加入含10% FBS的RPMI 1640培养基吹匀，收集细胞于1.5mL EP管中，4℃、3000 rpm离心5 min，再PBS 7.2洗两遍；再后，参考总RNA提取试剂盒说明书进行操作，获得B16-OVA细胞总RNA，测定浓度并调整RNA的浓度为200 ng/µL备用；最后，利用上述所提取总RNA反转录成cDNA，相关操作参考现有常规操作即可，也可具体参考如下。
反转录制备cDNA时，首先，将20µL混合物（模板RNA，11 μL；Oligo (dT)18引物，1 μL；DEPC水，8 μL）于PCR仪中65℃孵育5 min，迅速置于冰上冷却；再加入5×ReactionBuffer，4 μL；RiboLockTM RNase酶抑制剂，1 μL；10 mM dNTP Mix，2 μL；Revert-AidTMM-MuLV逆转录酶，1 μL，于PCR仪器中42℃孵育60 min，70℃孵育5 min，16℃终止反应，所得产物即为cDNA模板。
（三）PCR扩增
PCR扩增时，20µL扩增体系参考设计如下：
Mix，10 µL；F引物（PD-L1引物上游），10 mM、0.5 µL；R引物（PD-L1引物下游），10mM、0.5 µL；
cDNA模板，1 µL；DEPC H2O，8 µL
具体PCR反应程序如下：95 ℃、预变性5 min；95 ℃、30 s，55℃、30s，72℃、1min，30个循环；72℃、延伸5min。
对PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并切取对应胶块，参考Axygen胶回收试剂盒说明书进行操作，回收目的DNA片段。
具体PCR扩增片段序列如下：
TGCCGAAATGATACACAATTCGACTCGAGTCGAATTGTGTATCATTTCGGTTTTTTCACGGCTTTACTATGTGTTAAGCTGAGCTCAGCTTAACACATAGTAAAGCCAAAAAAG。
（四）酶切，并与pSicoR-GFP vector连接
利用HpaI、XhoI酶分别对步骤（三）所回收目的DNA片段与pSicoR-GFP vector进行双酶切，50µL酶切体系设计如下：目的DNA（或pSicoR-GFP vector），4 µL；10×Cutsmart，5µL；HpaI，2 µL；XhoI，2 µL；dd H2O加至50 µL；37℃双酶切过夜。
酶切后分别回收酶切产物，并利用T4 DNA连接酶进行连接。10µL连接体系设计如下：pSicoR-GFP vector酶切产物，1 µL；目的DNA酶切产物，3 µL；2×Ligation Buffer，5 µL；T4 DNA Ligase，1 µL；4℃过夜连接。
（五）转化、筛选，并提取重组正确的质粒
采用热激转化法，将步骤（四）中连接产物转化S3感受态细胞，并进行筛选。具体操作而言：取5μL步骤（四）的连接产物加入到50 uL的S3感受态细胞中，冰上放置30 min；再42℃热激感受态细胞45s，随后立即置于冰上冰浴2 min，最后加入450uL预热（42℃）好的LB液体培养基；37℃、震荡培养1 h后，取200uL菌液涂布于含氨苄青霉素钠（Ampicilin，100μg/mL）的LB平板上，37℃、倒置培养18 h； 随后，挑取阳性菌落接种于含100μg/mL Amp+的LB液体培养基中，37℃、震荡培养12h后进行测序鉴定，确保质粒连接重组正确，并将其命名为：shPD-L1；进一步，利用去内毒素质粒中提试剂盒对测序正确菌液进行质粒提取，并测定调节质粒浓度为500 ng/μL备用。
对于所构建的重组质粒shPD-L1，以空质粒shNC为空白对照，利用病毒介导的细胞转染实验，并利用qRT-PCR和流式细胞术验证本申请所构建质粒shPD-L1靶向PD-L1的沉默效果，从而为后续实验的展开提供参考依据。具体实验情况介绍如下。
（1）转染
取长势良好的HEK-293T细胞，接种至6孔培养板，第二天待细胞覆盖板底80%-90%时进行转染；具体操作参考如下：
首先，分别制备混合物A、混合物B，混匀后分别室温孵育5 min；
混合物A：Opti-MEM减血清培养基、250 uL，PT 293转染试剂、40 uL；混合物B：Opti-MEM减血清培养基、250 uL，重组质粒shPD-L1、8 uL，psPAX2、6 uL，pMD2.G、2 uL；
随后，将上述混合物A、混合物B合并混匀，室温孵育20 min，制备脂质体-DNA复合物；
再后，用新鲜无双抗的DMEM培养基替换HEK-293T细胞的旧培养基后，加入500 uL上述脂质体-DNA复合物；37℃培养6 h后，更换为新鲜完全培养基继续培养48 h；
培养完成后，收集病毒悬液，并用0.45 μm孔径的滤膜过滤除杂；
最后，将病毒悬液加入到B16-OVA细胞中，并加入终浓度为8μg/mL的Ploybrene；置于培养箱中继续培养，并于荧光倒置显微镜下观察拍照。
肿瘤细胞通过表达PD-L1，与T淋巴细胞的PD-1相互作用介导肿瘤的免疫逃逸。本申请所构建的质粒shPD-L1用以敲低B16-OVA细胞PD-L1基因的表达。由于所构建的质粒具有绿色荧光蛋白GFP标签，因此转染有shNC和shPD-L1的B16-OVA细胞均可表达出绿色荧光（结果如图1所示，绿色荧光表明均成功进行了转染）
（2）流式鉴定转染效率
转染结束后，收集各组细胞于1.5 mL EP管中，4℃、3000 rpm离心5 min，PBS 7.2洗两次后，加入PBS 7.2稀释的流式抗体，冰上孵育30 min后流式上机检测。
检测结果如图2所示，可以看出，转染效率在90%以上，这为该质粒的进一步应用奠定了良好应用基础。
（3）实时荧光定量PCR鉴定转染效率
参考前述操作及现有技术，提取总RNA并反转录，以β-actin为内参基因，进行qRT-PCR反应。
qRT-PCR反应时，20µL反应体系设计如下：
cDNA，5 µL；F引物，10 mM、0.5 µL；R引物，10 mM、0.5 µL；2×LightCycle 480SYBR Green I Master，6 µL；DEPC水，8 μL；
反应程序如下：95℃、预变30 s；95℃、5s，60℃、20s，40个循环；溶解曲线：45℃-95℃，0.1℃/s。反应结束后，根据溶解曲线，计算B16-OVA细胞PD-L1在mRNA水平上的表达效率。
荧光定量PCR检测PD-L1基因在mRNA水平的表达效率结果如图3所示。可以看出，转染质粒shPD-L1组的B16-OVA细胞PD-L1基因表达效率仅为23.5%，与对照组相比显著降低，而空质粒shNC组几乎无变化。这一结果说明质粒shPD-L1具有良好的RNAi效果，即，较好降低了PD-L1的表达。
实施例2
理想的药物传输系统，不仅要具备良好的负载能力，还要具备免疫逃逸和精准靶向的功能，并且要有良好的生物相容性。介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs）因其良好的生物相容性、较大的表面积、可调节的孔径体积以及表面易被进一步功能化修饰等众多改善的生物学特性，被广泛用于药物运输的载体。而细胞膜涂层技术可以完全保存膜的复杂性及其所有脂质、蛋白质和碳水化合物，细胞膜包被的纳米颗粒继承了源细胞膜的许多特征，例如免疫逃逸和同源靶向等。
本申请中，发明人以MSN-NH2为基础，一方面负载实施例1中所构建的质粒shPD-L1，另一方面在其表面涂抹一层B16-OVA癌细胞膜，从而制备可以靶向黑色素瘤细胞的纳米药物运输系统CCM/MSN@shPD-L1。本实施例就这一药物运输系统，即CCM/MSN@shPD-L1纳米载体的构建过程简介如下。
（一）制备MSN@shPD-L1纳米复合物
首先，采用无菌水对电位为正电荷的氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒（平均粒径为200 nm）进行清洗；（具体而言，移液枪吸取介孔二氧化硅纳米颗粒于Ep管内，加无菌水进行超声重悬，随后4℃、12000 rpm离心30 min，可重复操作两次以确保清洗效果）
随后，在圆底烧瓶中加入前述清洗后的MSN纳米粒和实施例1中所制备的shRNA（为确定介孔二氧化硅纳米颗粒的负载情况，以质量比计，分别设计MSN：shRNA=10:1、20:1、30:1、40:1实验组），PBS7.2定容到2 mL，磁力搅拌器搅拌过夜；
最后，4℃、12000 rpm离心30 min，所得沉淀即为MSN@shPD-L1纳米复合物；对离心后上清液，用Nanodrop 2000测定上清中未负载的shRNA，并根据以下公式计算负载率；同时采用琼脂糖凝胶电泳直观观察分析shRNA的负载情况。
Figure 282280DEST_PATH_IMAGE001
本申请中，主要通过静电吸附作用将质粒负载到MSN的介孔孔道中。具体实验结果如图4所示。可以看出，随着MSN：shRNA（w/w）的增加，MSN对shRNA的负载逐渐增大，直到MSN：shRNA（w/w）为30时，负载率达到92.4%。继续增加投入MSN，负载率基本不变。琼脂糖凝胶电泳分析的结果也是如此（图4B），当MSN: shRNA（w/w）为30时，shRNA的条带基本消失，说明此比例下shRNA被大量吸附到MSN的介孔中。因此，后续实验中采用MSN：shRNA（w/w）=30作为相关材料的制备比例。
（二）提取B16-OVA细胞膜，并制备细胞膜囊泡
首先，培养B16-OVA细胞，并选取生长状态良好的细胞用PBS 7.2清洗一遍，之后用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞（尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解膜蛋白），离心收集细胞备用（具体参考前述操作即可）；
随后，对所收集的细胞进行匀浆裂解，具体而言：向每1×107个细胞沉淀中加入500 µL CER试剂，再加1/100蛋白酶抑制剂PMSF，震荡重悬后冰浴2分钟，再转移到冰预冷的玻璃匀浆器内，在冰水浴中充分匀浆处理，确保细胞充分破碎；
再后，将破碎后的细胞转移到新的离心管中，4℃、800g离心5min，收集上清液（胞膜-胞浆混合物）于新的离心管中；
最后，加入上清液1/10体积的MER与上清液混合，冰浴5分钟后，4ºC、14000rpm离心30 min，收取沉淀物即为欲提取的B16-OVA细胞膜碎片；
制备细胞膜囊泡时，在上述所提取的细胞膜碎片沉淀物中加入适量PBS 7.2，超声处理，以重悬细胞膜；再用组装有400nm聚碳酸酯薄膜的挤出机挤压细胞膜悬液11次，从而最终获得细胞膜囊泡。
（三）制备CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物
首先，将步骤（一）中所制备的MSN@shPD-L1纳米复合物与步骤（二）所制备细胞膜囊泡混合均匀；
混合时，每1mg MSN和1×107个细胞提取的细胞膜混合；
随后，用组装有200nm聚碳酸酯薄膜的挤出机挤压混合液11次，以产生细胞膜包裹的纳米粒子，最终所得即为CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物。
对于所制备的CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物（纳米载体），发明人进一步进行了相关表征，以对所制备纳米复合物基本特性进行初步确定。相关表征具体介绍如下。
（1）纳米载体的TEM成像
取适量CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物，用20 μL移液枪逐滴滴加在铜网上，反复滴加20次，37℃烘箱烘干，透射电镜仪观察拍照。
透射电镜（TEM）图如图5A所示。可以看出，MSN@shPD-L1、CCM/MSN@shPD-L1的颗粒形状均近似球形，形态规则，分散性均匀，无沉淀和聚集现象。进一步细节图分析结果表明，与具有裸露球形结构的MSN@shPD-L1相比，CCM/MSN@shPD-L1表现出明显的核壳结构，其均匀的脂质双分子层壳的平均厚度约为10 nm，证明了癌细胞膜的成功包被。这也和后续的马尔文纳米粒度电位分析仪的结果一致（图5C、图5D）。
（2）Zeta电位和粒径检测
分别取1 mL的CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物，分别采用马尔文粒度电位仪检测不纳米粒子的电位和粒径分布。
具体电位和粒径结果如图5C、图5D所示，具体而言：MSN@shPD-L1水动力直径为138.1 nm，当其与细胞膜囊泡（322.2 nm）融合后，最终的CCM/MSN@shPD-L1约为145.8 nm。Zeta电位的测量也表明细胞膜涂层成功，因为CCM/MSN@shPD-L1的表面电荷为-10.6 mV，更趋近于细胞膜囊泡的表面电荷（-13.2 mV），且与其核结构的21.7 mV截然相反。特别值得注意的是，CCM/MSN@shPD-L1的流体动力学尺寸分布和Zeta电位在7天中几乎恒定（图5E），这证实了其具有良好的稳定性。
（3）十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
参考现有常规操作制备分离胶、浓缩胶，上样（事先将待测样品（CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物）与loading buffer按1:1体积比混合后，沸水浴10min以使蛋白变性）进行电泳检测。100 V电泳至溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2 cm处即停止（事先恒压60 V、大约30min，待样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶后再转换为100V）。电泳结束后，使用0.25%考马斯亮蓝染色4 h，随后脱色，直至蛋白质条带清晰为止。最后放入凝胶成像仪中拍照保存。
SDS-PAGE结果如图5B所示。分析可以看出，该纳米载体的细胞膜蛋白条带和纯的细胞膜囊泡条带吻合较好，与全细胞裂解液条带发生了比例变化。也说明了癌细胞膜包被成功，且癌细胞膜蛋白被广泛保留。
实施例3
基于实施例2所制备的CCM/MSN@shPD-L1纳米载体，发明人进一步进行了体外细胞实验，以对其应用效果进行初步分析。主要技术思路设计为：
使用FITC标记的MSN和DiI标记的CCM构建成带有双荧光标记的纳米载体CCM/MSN@shPD-L1（具体制备参考现有技术及结合实施例2即可，不再赘述），利用激光共聚焦技术检测B16-OVA细胞对CCM/MSN@shPD-L1的摄取情况；通过加入网格蛋白介导的细胞内吞抑制剂chlorpromazine和能量阻断剂NaN3，流式验证纳米载体的入胞途径；利用激光共聚焦和流式检测不同种类细胞对纳米载体的吞噬能力。
具体效果评价中，利用MTT检测CCM/MSN@shPD-L1及各实验组对B16-OVA细胞的活性影响；利用流式细胞仪和实时荧光定量PCR检测不同纳米载体实验组对B16-OVA细胞PD-L1基因在蛋白和mRNA水平上的表达量影响，以验证B16-OVA细胞摄取纳米载体后的RNAi效率。
具体实验项目及结果简介如下。
（一）细胞毒性实验
收集对数生长期的B16-OVA细胞，以3000cells/孔接种于96孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中过夜培养；除去旧培养基，加入160 μL新鲜的无血清RPMI-1640培养基，饥饿处理8 h，使细胞同步化；
设置实验组别如下：
调零组：无细胞只有PBS组；
对照组：PBS组；
实验组：shPD-L1组、MSN@shPD-L1组、CCM/MSN@shNC组、CCM/MSN@shPD-L1组；每组设置三个浓度梯度，依次为：3 μg/mL、15 μg/mL、30 μg/mL（按照shPD-L1的终浓度来计算）；
每孔补加20 μL血清，继续培养24 h和48 h；
培养结束后，每孔加入20 μL MTT溶液，置于培养箱中继续培养4 h；
小心弃去旧培养液，避光环境下每孔加入150 μL DMSO，室温震荡10 min，溶解结晶物；酶标仪测定490 nm波长处各孔吸光度（OD）值。
以各实验组为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
具体实验结果如图6所示。分析可以看出，各组纳米载体在0 µg/mL~30 µg/mL（shPD-L1计算）浓度范围内时，随着载体浓度的增加均未导致OD值明显变化。表明各组纳米载体对B16-OVA细胞均无明显毒性作用，均可用于后续的体内外实验的研究。
（二）细胞内化实验
（1）激光共聚焦检测CCM/MSN@shPD-L1的细胞摄取
首先，参考FITC-NHS的说明书和前述实施例2，利用FITC标记MSN后，制备纳米复合物MSN@shPD-L1；随后，利用终浓度为10 μg/mL的细胞膜红色荧光探针（DiI）对B16-OVA细胞进行标记，并参考实施例2操作，制备获得双荧光标记的CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物。
具体实验时：选取对数生长期的B16-OVA细胞，铺于6孔板中，每孔1 mL，含2.5×105个细胞，置于37℃、5% CO2培养箱中，培养24 h；
用含有双荧光标记的CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物的新鲜培养基替换旧培养基，其中MSN-FITC终浓度为100 μg/mL，继续培养1.5 h；
加入终浓度为5 μg/mL的Hoechst 33342，继续培养0.5 h；
除去旧培养基，PBS 7.2洗涤两次，然后使用胰酶消化，收集细胞于1.5 mL EP管中。加入1 mL 4%多聚甲醛固定15 min；
4℃、3000 rpm离心5 min，弃上清；加入10 μL防荧光猝灭剂；重悬制片，置于激光共聚焦显微镜下观察拍照。
（2）流式检测不同内吞抑制剂对细胞摄取的影响
选取对数生长期的B16-OVA细胞，铺于6孔板中，每孔1 mL，含2.5×105个细胞，置于37℃、5% CO2培养箱中，培养24 h；弃去旧培养基，分别加入含终浓度为10 mM叠氮钠（NaN3）和10 μg/mL氯丙嗪（Chlorpromazine）的新鲜培养基，并设置对照孔；预先处理1 h；弃去培养基，用PBS 7.2洗涤3次；加入含有双荧光标记的CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物的新鲜培养基继续培养2 h；除去旧培养基，PBS 7.2洗涤两次，然后使用胰酶消化成单细胞悬液；离心，洗涤后，200 μL PBS 7.2重悬，于流式细胞仪上进行定量分析。
纳米载体能够被B16-OVA细胞成功摄取，是其发挥RNAi作用的关键步骤。借助于FITC（绿色通道）和DiI（红色通道）的双荧光标记，激光共聚焦观察结果如图7A所示。分析可以看出：MSN（绿色）和CCM（红色）高度共定位（黄色），说明纳米载体CCM/MSN@shPD-L1能够被B16-OVA细胞有效摄取；并且MSN和CCM都分布在细胞核周围，表现出高度的共定位性，这表明纳米载体CCM/MSN@shPD-L1的核-壳结构是稳定的，在细胞内化过程中仍能很好地保持其结构完整性。这也在一定程度上表明纳米载体是通过内吞途径，而不是膜融合途径被B16-OVA细胞所摄取。
细胞内吞作用是大分子和颗粒性的物质进入细胞的主要方式，根据摄取物质的大小又分为吞噬作用和胞饮作用两种。由于纳米载体CCM/MSN@shPD-L1的平均粒径在150 nm左右，推测认为是通过网格蛋白介导的内吞途径入胞。为了验证这一猜想，发明人选用网格蛋白介导的内吞抑制剂氯丙嗪（chlorpromazine）和能量阻断剂叠氮化钠（NaN3）分别对B16-OVA细胞进行处理。其中氯丙嗪作用于细胞膜表面的网格蛋白，干扰网格蛋白介导的内吞；另外，网格蛋白介导的内吞是具有能量依赖性，NaN3可作用于细胞色素氧化酶B，阻断呼吸链，有效阻断内吞作用的能量来源，达到抑制细胞内吞作用的目的。然后使用流式细胞仪检测抑制剂处理对B16-OVA细胞内吞纳米载体CCM/MSN@shPD-L1的影响。
流式结果如图7B所示。分析可以看出，与空白对照组相比，氯丙嗪对CCM/MSN@shPD-L1的细胞内化影响具有极显著性差异，说明CCM/MSN@shPD-L1的细胞内化与网格蛋白介导的内吞途径有关。同时，NaN3对CCM/MSN@shPD-L1的细胞内化与空白对照组相比也具有极显著性差异，说明CCM/MSN@shPD-L1的细胞内化有一定的能量依赖性。
综合上述实验结果，可以认定：纳米载体CCM/MSN@shPD-L1可被B16-OVA细胞内化，而且主要是通过网格蛋白介导的内吞途径完成细胞内化，并且表现出一定的能量依赖性。
（三）同源靶向实验
（1）激光共聚焦激光检测CCM/MSN@shPD-L1的同型靶向作用
参考前述“激光共聚焦检测CCM/MSN@shPD-L1的细胞摄取”部分的实验操作，分别DIO荧光标记的CCM/MSN@shPD-L1和MSN@shPD-L1纳米复合物，然后分别以B16-OVA、4T1、MC38、MCF-7、HUVEC、DC 2.4和RAW 264.7细胞为实验对象，进行激光共聚焦显微观察实验。
（2）流式检测CCM/MSN@shPD-L1的同型靶向作用
参考前述“流式检测不同内吞抑制剂对细胞摄取的影响”实验操作，分别以B16-OVA、4T1、MC38、MCF-7、HUVEC、DC 2.4和RAW 264.7细胞为实验对象，进行流式定量分析。
癌细胞具有免疫逃逸和同源结合等多种特性，而这些特性均依赖于癌细胞表面的膜蛋白抗原。为解决这一技术问题，我们将整个细胞膜作为纳米颗粒涂层的材料，通过将细胞膜直接转移到纳米颗粒表面，以完全保存膜的复杂性及其所有脂质、蛋白质和碳水化合物，即保留源癌细胞表面的全抗原，从而避免体内免疫系统对其的清除并能特异性主动靶向到同种癌细胞。为了证明我们的假设，我们将B16-OVA细胞膜包被的CCM/MSN@shPD-L1和裸载体MSN@shPD-L1分别与B16-OVA、4T1、MC38、MCF-7、HUVEC、DC 2.4和RAW 264.7七种细胞系共孵育2小时后进行了实验研究，荧光强度代表吞噬效率。
激光共聚焦和流式实验结果一致表明（图8A，图8B），来自B16-OVA细胞膜包被的CCM/MSN@shPD-L1被相应的源癌细胞B16-OVA的吞噬效率远胜于异型肿瘤细胞，尤其是4T1细胞和MCF-7细胞。而没有B16-OVA细胞膜包被的MSN@shPD-L1被源癌细胞B16-OVA的吞噬料率与异型肿瘤细胞不具备统计学差异。同时B16-OVA细胞对CCM/MSN@shPD-L1的吞噬效率极显著的大于对MSN@shPD-L1的吞噬效率。更有意思的是，加了细胞膜的包裹之后，DC 2.4对其的吞噬效率同样得到了极显著的提升，而RAW 264.7对其的吞噬效率得到了极显著的下降。这些结果表明来自B16-OVA细胞膜包被的CCM/MSN@shPD-L1对源癌细胞B16-OVA具有高度特异性的自我识别亲和力（也即，CCM/MSN@shPD-L1可以同源靶向B16-OVA细胞），并且具备一定的免疫逃逸能力，有利于将药物准确地输送到病灶部位。
（四）RNA干扰实验
首先进行细胞转染，然后流式检测转染效率，并利用实时荧光定量PCR检测PD-L1在mRNA水平上的表达，具体实验操作参考如下。
细胞转染时：
培养B16-OVA细胞，待其生长至对数期时，胰酶消化收集细胞铺于6孔板中，每孔2mL，含1.2×105个细胞，置于37℃、5% CO2培养箱中，培养24 h；弃去旧培养基，加入含有IFN-γ（终浓度为50 ng/mL）的新鲜培养基，刺激培养8 h；弃去旧培养基，用PBS 7.2洗涤三次，然后分别加入含有shPD-L1、MSN@shPD-L1、CCM/MSN@shNC、CCM/MSN@shPD-L1的新鲜培养基，其中shPD-L1的终浓度为15 μg/mL，每组3个复孔；同时设置含有等体积PBS 7.2的对照组；继续培养48 h。
用PBS 7.2洗涤三次，于荧光倒置显微镜下观察拍照；拍照结束后，胰酶消化处理，收集细胞用于后续流式和实时荧光定量PCR实验。
流式检测转染效率时：
取上述步骤中收集的细胞，加入PBS 7.2洗涤两遍；分别加入PBS 7.2稀释好的抗体anti-mCD274-APC和其同型对照Rat IgG2α kappa Isotype Control-APC，重悬细胞，冰上避光孵育30 min；PBS 7.2洗一遍，200 μL的PBS 7.2重悬后流式检测GFP和PD-L1表达效率。
实时荧光定量PCR检测时：
取上述步骤中收集的细胞，加入40 µL的氯仿充分混匀，4℃、12000 g离心10 min后，参考前述实施例及现有常规操作，qRT-PCR检测PD-L1在mRNA水平上的表达量。
前述研究结果虽已证明纳米载体可以被B16-OVA细胞有效摄取，但为验证摄取后是否会进一步产生有效的RNAi作用，仍需进一步的体外细胞转染实验进行验证，即让不同的纳米载体与B16-OVA细胞共孵育，通过检测转染后对B16-OVA细胞PD-L1基因表达量情况来验证干扰效果。
荧光显微镜图片显示（图9A），转染了纳米载体CCM/MSN@shPD-L1的B16-OVA细胞中表达出绿色荧光标签蛋白GFP，而转染纳米载体MSN@shPD-L1的B16-OVA细胞，几乎看不到绿色荧光标签蛋白GFP的表达。流式实验结果也与此保持一致（图9B）。这说明具有细胞膜包被的纳米载体可以将质粒DNA转染至B16-OVA细胞，并且相应的基因可以被成功转录和翻译表达。
为了进一步研究转染后shPD-L1在体外细胞水平的RNAi效果，我们使用流式检测了B16-OVA细胞中PD-L1基因的表达量（图9C）。结果显示，CCM/MSN@shPD-L1组PD-L1基因的表达量极显著低于对照组CCM/MSN@shNC，和另外三组也具有显著性差异。说明纳米载体CCM/MSN@shPD-L1可以携带质粒shPD-L1进入B16-OVA细胞中，下调B16-OVA细胞表面PD-L1蛋白的表达量。
同时，我们还利用实时荧光定量PCR技术检测了B16-OVA细胞中PD-L1基因在mRNA水平的表达情况。实验结果如图9D所示。CCM/MSN@shPD-L1作用于B16-OVA细胞后，细胞中PD-L1 mRNA的表达量与其他各组相比显著降低。说明纳米载体CCM/MSN@shPD-L1在mRNA水平即下调B16-OVA细胞中PD-L1基因的表达。
以上结果共同说明纳米载体CCM/MSN@shPD-L1被B16-OVA细胞摄取以后能够产生有效的RNAi作用，有效降低B16-OVA细胞PD-L1基因的表达效率（即，CCM/MSN@shPD-L1下调了B16-OVA细胞中的PD-L1表达量）。
实施例4
前述实施例中的体外表征和体外细胞实验已经证明CCM/MSN@shPD-L1纳米载体可以有效地运输质粒同源靶向B16-OVA细胞，降低B16-OVA细胞PD-L1基因表达。为了进一步验证CCM/MSN@shPD-L1纳米载体的体内抗肿瘤效果，我们通过建立B16-OVA荷瘤小鼠模型，连续四次给药之后，检测分析了小鼠肿瘤细胞PD-L1基因的表达以及肿瘤部位CD8+ T细胞浸润情况等各项指标，以对CCM/MSN@shPD-L1的体内抗肿瘤活性情况进行进一步验证和分析。具体实验情况简介如下。
（一）CCM/MSN@shPD-L1对于小鼠荷瘤模型抗肿瘤效果的验证
选取生长状态一致的C57BL/6J雌性小鼠，通过皮下荷瘤的方式构建B16-OVA荷瘤小鼠模型，具体而言，将肿瘤细胞（黑色素瘤B16-OVA细胞）接种到小鼠背部右侧靠下的位置，每只小鼠200 μL（细胞密度为1×106个/mL），即2×105个/只；
荷瘤当天记为第0天；荷瘤第7天，选取荷瘤成功的25只小鼠，将其随机分为5组（每组5只小鼠），分别为： Control组、shPD-L1组、MSN@ shPD-L1组、CCM/MSN@shNC组、CCM/MSN@shPD-L1组；第8天，按照10 mg/Kg质量比，每只小鼠尾基根部皮下多点注射200 μL纳米载体溶液，各含30 μg shPD-L1；同时Control组注射同样剂量的生理盐水；每3天给药一次，共给药四次（具体流程方案可参考图10A所示）；从荷瘤后的第七天开始，隔天称量每只小鼠的体重，绘制体重变化曲线。同时使用游标卡尺，隔天测量肿瘤的长径（a）、短径（b）和高度（c），根据公式：肿瘤体积=1/2（a×b×c）。计算肿瘤体积，并绘制肿瘤体积的生长曲线。
实验结束后，分别制备如下细胞样本，以便进行各实验项目检测。
、制备小鼠引流淋巴结的单细胞样本
最后一次给药后的第三天，脱颈处死小鼠，用针头将小鼠的四肢固定在泡沫板上，腹部朝上；解剖，取出腹股沟、腋窝处引流淋巴结；分别放置于盛有PBS 7.2的6孔板中（一个6孔板放3只老鼠的淋巴结，各孔交叉错开）；
分别用PBS 7.2预润过的磨砂玻片进行研磨破碎（每只小鼠互不混用），用PBS 7.2冲洗玻片和皿；通过筛网过滤到15 mL离心管，去除较大组织块，用PBS 7.2定容到14 mL，得到单细胞悬液；混匀计数，接着4℃、3000 rpm离心5 min；用RPMI 1640含血清培养基重悬细胞，调密度为1×107；在24孔板中，每孔加入200 μL上述单细胞悬液，以及800 μL培养基，混匀；此外每孔加1 μL BFA（以进行胞内因子染色）和20 μL OVA257-264多肽（需要解释的是，B16-OVA肿瘤细胞表面携带有OVA抗原，因此以OVA257-264多肽进行刺激时，相当于特异性刺激，以刺激T细胞分泌IFN-γ等细胞因子，故此，以此处理方式作为阳性对照）；每只小鼠铺1个孔；再从剩余细胞中每组小鼠各铺1个孔，只加1 μL BFA，做未刺激对照孔；置于含5% CO2的37℃细胞培养箱培养6 h。
、制备小鼠脾脏的单细胞样本
参考前述“制备小鼠引流淋巴结的单细胞样本”及现有常规操作，取小鼠脾脏组织研磨、并裂解处理（红细胞裂解液（1×ACK）室温裂解10 min）后，进行胞内因子染色。
、制备小鼠肿瘤的单细胞样本
参考前述“制备小鼠引流淋巴结的单细胞样本”相关操作，剥离小鼠背部肿瘤组织，研磨破碎组织后，离心、并用PBS 7.2重悬肿瘤细胞。
基于上述实验过程，具体实验检测项目简介如下。
具体各实验检测项目及实验结果简介如下。
（1）胞内因子染色检测IFN-γ
收集上述经过6 h刺激培养的引流淋巴结和脾脏细胞于1.5 mL EP管中，4℃、3000rpm离心5 min后，弃上清，PBS 7.2洗一遍；
分别加入PBS 7.2稀释的抗体anti-mCD3-eflour710和anti-mCD8α-PE，震荡重悬细胞，冰浴，避光30 min以进行表面抗体孵育；
孵育结束后，再用PBS 7.2清洗，参考现有常规操作，依次用固定剂进行固定处理，和用破膜剂进行破膜处理，再用抗体anti-mIFN-γ-APC进行IFN-γ染色处理，最后用PBS7.2重悬后，流式细胞仪上机检测.
（2）检测肿瘤浸润CD3+ CD8+ T细胞的比率
收集小鼠肿瘤的单细胞样本，4℃、3000 rpm离心5 min后，弃上清，分别加入PBS7.2稀释的抗体anti-mCD45-FITC、anti-mCD3-eflour710和anti-mCD8α-APC，震荡重悬细胞，避光冰浴30 min；孵育结束，每管加入1 mL PBS 7.2，3000 rpm，4℃，5 min离心，弃上清；200 μL PBS 7.2重悬，200目筛网过滤细胞于流式细胞管中，流式细胞仪上机检测。
（3）检测肿瘤细胞PD-L1表达
收集小鼠肿瘤的单细胞样本，4℃、3000 rpm离心5 min后，弃上清，分别加入PBS7.2稀释的抗体anti-mCD274-APC和其同型对照Rat IgG2α kappa Isotype Control-APC，重悬细胞后置于冰上，避光孵育30 min；孵育结束，每管加入1 mL PBS 7.2，3000 rpm，4℃，5 min离心弃上清；200 μL PBS 7.2重悬，200目筛网过滤细胞于流式细胞管中，流式细胞仪上机检测。
实验过程中，具体小鼠的肿瘤体积和体重变化曲线如图10B、图10C所示。结果显示，治疗期间CCM/MSN@shPD-L1组小鼠肿瘤生长得到了控制，四次给药之后，CCM/MSN@shPD-L1组小鼠肿瘤体积仅为299.1 mm3，和对照组CCM/MSN@shNC（988.5 mm3）具有极显著差异。这说明CCM/MSN@shPD-L1具有抑制肿瘤的生长的作用，并且在治疗过程中各组小鼠体重均保持稳定上升，观察小鼠生活状况良好，初步说明了纳米载体具有一定的生物安全性。
肿瘤细胞PD-L1基因表达的下调，以及阻断PD-1 / PD-L1免疫检查点是恢复和提升T淋巴细胞功能的关键。流式对各治疗组小鼠肿瘤细胞PD-L1基因的表达情况检测结果如图11A所示。结果显示，相比于对照组，给与纳米载体CCM/MSN@shPD-L1治疗明显下调小鼠肿瘤细胞PD-L1的表达。此外，给与纳米载体CCM/MSN@shPD-L1治疗可以有效引发抗原特异的CD3+ CD8+ T细胞向肿瘤部位浸润，显著增加小鼠肿瘤部位CD3+ CD8+ T细胞的浸润比例（图11B）。流式检测脾脏和淋巴结胞内IFN-γ的分泌情况（图11C，图11D）发现，相比于对照组CCM/MSN@shNC，给与CCM/MSN@shPD-L1治疗显著增加IFN-γ+ CD8+ T细胞频率。
以上结果表明，CCM/MSN@shPD-L1在用于生物体时，可以解除肿瘤细胞对CD8+ T细胞的免疫抑制，增强抗肿瘤效果。
（二）CCM/MSN@shPD-L1联合放疗对于小鼠荷瘤模型抗肿瘤效果的验证
参考前述B16-OVA荷瘤小鼠模型构建过程，在荷瘤第7天，选取荷瘤成功的20只小鼠，将其随机分为4组（每组5只小鼠），分别为：Control组、Radiotherapy(RT)组、CCM/MSN@shPD-L1组、CCM/MSN@shPD-L1+RT组；
照射X-ray：
在第8天，对RT组和CCM/MSN@shPD-L1+RT组小鼠进行X-ray照射；照射前先对小鼠进行全身麻醉，以0.20 mL/20 g的剂量腹腔注射4%的水合氯醛，待小鼠麻醉后，对每只小鼠肿瘤部位局部照射15 Gy的X-ray；
第9天，重复第8天的X-ray照射操作；
第10天，开始对CCM/MSN@shPD-L1组、CCM/MSN@shPD-L1+RT组按照10 mg/Kg质量比，每只小鼠尾基根部皮下多点注射200 μL纳米载体溶液，各含30 μg shPD-L1；
同时Control组注射同样剂量的生理盐水；
每3天给药一次，共给药四次（具体流程示意图如图12A所示）；
从荷瘤后的第七天开始，隔天记录每只小鼠的体重和瘤体积。
具体实验效果检测评估时，参考前述操作，制备相关淋巴结、脾脏、肿瘤的单细胞样本，并进行相关实验项目检测。
为了进一步验证CCM/MSN@shPD-L1联合放疗是否可以解除肿瘤免疫抑制微环境，提升T细胞的功能。荷瘤后小鼠在第八天和第九天先进行了两次放疗（每次局部照射15Gy），第十天再开始给药。
给药期间小鼠的肿瘤体积和体重变化（图12B，图12C）结果显示，CCM/MSN@shPD-L1+RT对小鼠肿瘤生长的控制能力明显高于其他各组。日常观察小鼠生活状况与体重变化曲线发现，RT组和CCM/MSN@shPD-L1+RT组前期小鼠体重出现下降，推测可能是麻醉剂对小鼠机体有一定毒性作用，也可能是放疗引起的，有待进一步验证。后期小鼠体重逐渐恢复正常，小鼠生长状况良好。而Control对照组小鼠后期出现明显的体重下降情况，精神状态萎靡。最后一次给药后第三天处死小鼠，拍摄小鼠的肿瘤照片（图12D），照片显示小鼠体征和图像结果一致。
流式对小鼠肿瘤细胞的PD-L1表达情况检测结果如图13A所示，CCM/MSN@shPD-L1联合放疗组小鼠肿瘤细胞PD-L1基因的表达与其他各组相比，均有明显降低。这表明CCM/MSN@shPD-L1可以携带质粒进入小鼠体内并有效沉默PD-L1的表达，解除放疗引起的免疫耐受微环境。前期体外实验显示DC细胞对CCM/MSN@shPD-L1也有一定的摄取能力，我们又检测了小鼠肿瘤部位DC细胞的PD-L1表达情况，如图13B所示，CCM/MSN@shPD-L1联合放疗还可降低小鼠肿瘤部位DC细胞PD-L1的表达。
我们还检测了各治疗组小鼠肿瘤部位CD3+ CD8+ T细胞的浸润情况，如图13C所示，CCM/MSN@shPD-L1联合放疗处理组小鼠肿瘤部位CD3+ CD8+ T细胞的浸润比例为25.6%，显著高于其他各组，说明在放疗后给与CCM/MSN@shPD-L1治疗可以有效引发抗原特异CD3+ CD8+ T细胞向肿瘤部位浸润。并且，使用抗原肽OVA257-264体外刺激小鼠脾脏、引流淋巴结和肿瘤部位分离的免疫细胞6 h，检测胞内IFN-γ、TNF-α、perforin和GrzB的变化情况。如图13D、图13E所示，CCM/MSN@shPD-L1联合放疗处理组，IFN-γ、TNF-α、perforin和GrzB阳性CD8+ T细胞频率相比于其他组均有一定的提高。小鼠肿瘤部位CD8+ T细胞中，IFN-γ、TNF-α阳性的比率和脾脏和引流淋巴结趋势一样（图13F）。
以上结果都说明CCM/MSN@shPD-L1联合放疗可以有效地抑制肿瘤生长。
为确定各处理组处理方式对小鼠器官是否存在毒性损伤情况，进一步地，发明人取各组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏器官，进行了HE染色处理。具体结果如图14所示。可以看出，各实验组小鼠器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）没有毒性损伤，也进一步表明本申请所提供CCM/MSN@shPD-L1具有较好的生物安全性。
综合上述各实施例实验结果而言，本申请中，我们首先构建了靶向PD-L1基因的RNAi质粒shPD-L1，进一步地，利用静电吸附原理以介孔二氧化硅（MSNs）作为shPD-L1的递送载体，同时将其B16-OVA细胞膜涂布在该载体表面，从而最终制备了B16-OVA细胞膜包裹的基因递送纳米载体CCM/MSN@shPD-L1。检测结果表明，所制备的纳米载体形态规则、分散性良好、平均粒径大致为150 nm。初步体外细胞实验结果表明，在MSN终浓度为0 µg/mL~1000 µg/mL即shPD-L1终浓度约为0 µg/mL~30 µg/mL范围内，该纳米载体不具有明显的细胞毒性作用。进一步结合体外细胞和活体小鼠实验结果表明，CCM/MSN@shPD-L1纳米载体能够高效和准确的携带质粒shPD-L1到达小鼠肿瘤部位，显著下调肿瘤微环境中肿瘤细胞与DC细胞PD-L1的表达，解除其对T细胞的免疫抑制产生强烈的抗肿瘤免疫反应，进一步地，还可结合放射疗法的使用，调节放疗诱导的免疫抑制微环境，增强肿瘤细胞免疫原性死亡，从而最终实现控制和清除肿瘤细胞的目的。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学
<120> 用于调节PD-1/PD-L1通路的RNAi表达质粒
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tgccgaaatg atacacaatt cgactcgagt cgaattgtgt atcatttcgg ttttttcacg 60
gctttactat gtgttaagct gagctcagct taacacatag taaagccaaa aaag 114

Claims (9)

1.用于调节PD-1/PD-L1通路的RNAi表达质粒，其特征在于，该表达质粒命名为shPD-L1，具体通过如下步骤构建获得：
（一）设计引物
设计上下游引物如下：
PD-L1引物上游：5’- GCCGAAATGATACACAATTCGA-3’，
PD-L1引物下游：5’- CCGAAATGATACACAATTCGA-3’；
（二）提取RNA提取，并反转录成cDNA备用
以B16-OVA细胞基因组为提取对象，提取其总RNA，并反转录为cDNA备用；
（三）PCR扩增
以步骤（二）中的cDNA为模板，利用步骤（一）中所设计引物进行PCR扩增，并回收目的DNA片段；
（四）酶切，并与pSicoR-GFP vector连接
利用HpaI、XhoI酶分别对步骤（三）所回收目的DNA片段与pSicoR-GFP vector进行双酶切；酶切后分别回收酶切产物，并利用T4 DNA连接酶进行连接；
（五）转化、筛选和鉴定
采用热激转化法，将步骤（四）中连接产物转化，并进行筛选，检测和鉴定，确保质粒连接重组正确，并将重组正确的质粒命名为：shPD-L1。
2.利用权利要求1所述RNAi表达质粒所制备的纳米载体，其特征在于，该纳米载体命名为：CCM/MSN@shPD-L1纳米载体，制备时，通过静电吸附方式，将质粒shPD-L1负载到电位为正电荷的MSN-NH2的介孔后，在MSN表面再包覆CCM，具体通过如下步骤制备获得：
（一）制备MSN@shPD-L1纳米复合物
将MSN和质粒shPD-L1进行混合，以使质粒shPD-L1负载到MSN上，以制备获得MSN@shPD-L1纳米复合物；
以质量比计，MSN：shPD-L1=10~40:1；
（二）提取细胞膜，并制备细胞膜囊泡
取培养好的细胞，匀浆裂解处理后，收集细胞膜；利用挤出机，挤压细胞膜悬液，获得细胞膜囊泡；
（三）制备CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物
首先，将步骤（一）中所制备的MSN@shPD-L1纳米复合物与步骤（二）所制备细胞膜囊泡混合均匀；
随后，利用挤出机挤压混合液，以产生细胞膜包裹的纳米粒子，最终所得即为CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物。
3.如权利要求2所述纳米载体，其特征在于，步骤（一）中，以质量比计，MSN：shPD-L1=30:1。
4.权利要求1所述RNAi表达质粒或权利要求2所述纳米载体在制备抗肿瘤药剂中的应用。
5.如权利要求4所述在制备抗肿瘤药剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤。
6.权利要求2所述纳米载体的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（一）制备MSN@shPD-L1纳米复合物
首先，采用无菌水对介孔二氧化硅纳米颗粒进行清洗；
随后，将清洗后的MSN纳米粒和质粒shPD-L1在缓冲液中进行混合，以进行静电吸附；
最后，离心、收集所得沉淀即为MSN@shPD-L1纳米复合物；
（二）提取细胞膜，并制备细胞膜囊泡
首先，培养细胞，并选取生长状态良好的细胞用缓冲液清洗一遍，收集细胞备用；
随后，对所收集的细胞进行匀浆裂解；
再后，将破碎后的细胞转移到离心管中，离心收集上清液；
最后，在上清液中加入膜提取剂，收取细胞膜碎片；
制备细胞膜囊泡时，在上述所提取的细胞膜碎片沉淀物中加入缓冲液重悬；再用挤出机挤压细胞膜悬液，获得细胞膜囊泡；
（三）制备CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物
首先，将步骤（一）中所制备的MSN@shPD-L1纳米复合物与步骤（二）所制备细胞膜囊泡混合均匀；
随后，用挤出机挤压混合液，以产生细胞膜包裹的纳米粒子，最终所得即为CCM/MSN@shPD-L1纳米复合物。
7.如权利要求6所述纳米载体的制备方法，其特征在于，步骤（二）中，对细胞进行匀浆裂解时，具体操作为：向每1×107个细胞中加入500 µL CER试剂，再加1/100蛋白酶抑制剂PMSF，震荡重悬后冰浴2分钟，再转移到冰预冷的玻璃匀浆器内，在冰水浴中匀浆处理。
8.如权利要求6所述纳米载体的制备方法，其特征在于，步骤（二）中，制备细胞膜囊泡时，用组装有400nm聚碳酸酯薄膜的挤出机进行挤压操作。
9.如权利要求6所述纳米载体的制备方法，其特征在于，步骤（三）中，挤压操作时，用组装有200nm聚碳酸酯薄膜的挤出机进行挤压操作。
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