CN115141827B - Gal-9作为靶点在筛选或制备治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用 - Google Patents

Gal-9作为靶点在筛选或制备治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抑制Gal‑9表达的shRNA、shRNA表达载体和纳米颗粒及其应用，所述shRNA为shGal‑9‑01、shGal‑9‑02、shGal‑9‑03或shGal‑9‑04；本发明通过该shRNA、shRNA表达载体和纳米颗粒靶向Gal‑9基因降低其表达水平，抑制B细胞淋巴瘤的增殖，从而治疗B细胞淋巴瘤。与现有的放射性治疗和化疗药物相比，本发明提供的shRNA、shRNA表达载体和纳米颗粒的毒副作用小，也没有遗传风险，且比靶向治疗中的单克隆抗体的生产成本低，有利于后期的转化应用。

Description

Gal-9作为靶点在筛选或制备治疗B细胞淋巴瘤的药物中的 应用
技术领域
本发明涉及Gal-9作为靶点在筛选或制备治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
背景技术
恶性淋巴瘤作为原发于淋巴结和其他器官淋巴组织的恶性肿瘤，是造血系统的恶性疾病之一，分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lyphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma，NHL)两大类，其中，B细胞淋巴瘤(B cell lymphoma,BCL)占恶性淋巴瘤的绝大部分：HL为起源于B细胞的肿瘤，且NHL中80％～85％为B细胞型。半乳糖苷凝集素9(Galectin-9，Gal-9)是β半乳糖苷凝集素家族的一员，可通过非经典分泌途径被分泌到细胞外，同时具有细胞内和细胞外功能，参与多种生理及病理过程的调控。目前尚未见到靶向Gal-9用于治疗B细胞淋巴瘤的报道。
RNA干扰(RNAi)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，该过程通过双链RNA(dsRNA)使目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。沉默机制可导致由小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)诱导实现靶mRNA的降解。目前，siRNA稳定性不理想、药代动力学特征较差、可能诱导脱靶效应等缺点，限制了其在体内的应用，而shRNA比siRNA的优势包括能够使用质粒载体进行转染，减少脱靶效应等，但同样面临系统给药时到达靶细胞的各种体内屏障，为了克服这个问题，可以将shRNA与纳米颗粒结合，以实现安全传输。
当前B淋巴瘤的治疗技术有放化疗和靶向治疗，存在毒副作用大，完全患者复发转移率高等特点，因而靶向治疗是B淋巴瘤的发展方向，但是单克隆抗体存在研发成本高，半衰期短，特异性不确定等特点，siRNA技术相对来说研发成本相对较低，与纳米技术结合之后，体内稳定性好，特异性强等特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制Gal-9表达的shRNA、shRNA表达载体和纳米颗粒及其应用，本发明通过该shRNA、shRNA表达载体和纳米颗粒靶向Gal-9基因降低其表达水平，抑制B细胞淋巴瘤的增殖，从而治疗B细胞淋巴瘤。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种抑制Gal-9表达的shRNA，所述shRNA为shGal-9-01、shGal-9-02、shGal-9-03或shGal-9-04；
所述shGal-9-01的正义链序列如SEQ ID NO:7所示，所述shGal-9-01的反义链序列如SEQ ID NO:8所示；
所述shGal-9-01的正义链序列如SEQ ID NO:9所示，所述shGal-9-01的反义链序列如SEQ ID NO:10所示；
所述shGal-9-01的正义链序列如SEQ ID NO:11所示，所述shGal-9-01的反义链序列如SEQ ID NO:12所示；
所述shGal-9-01的正义链序列如SEQ ID NO:13所示，所述shGal-9-01的反义链序列如SEQ ID NO:14所示。
本发明提供了一种抑制Gal-9表达的shRNA表达载体，所述shRNA表达载体是将上述所述的shRNA连接至基础载体上而得到的。
优选地，所述基础载体为pLKO.1-TRC克隆载体。
本发明提供了一种上述所述的shRNA表达载体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将上述所述的shRNA的正义链和反义链混合后进行退火，得到双链寡核苷酸；酶切基础载体得到线性化载体；将所述双链寡核苷酸和所述线性化载体进行连接，得到所述shRNA表达载体。
优选地，所述酶切所用的酶包括EcoRI和AgeI；所述连接所用的酶为T4DNA连接酶。
本发明提供了一种抑制Gal-9表达的纳米颗粒，所述纳米颗粒负载有上述所述的shRNA或者上述所述的shRNA表达载体。
本发明提供了Gal-9作为靶点在筛选或制备治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
本发明提供了抑制Gal-9表达的试剂在制备治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
优选地，所述抑制Gal-9表达的试剂为上述所述的shRNA、上述所述的shRNA表达载体或者上述所述的纳米颗粒。
优选地，所述B细胞淋巴瘤为与EBV相关的B细胞淋巴瘤。
有益效果：
与现有的放射性治疗和化疗药物相比，本发明提供的shRNA、shRNA表达载体和纳米颗粒的毒副作用小，也没有遗传风险，且比靶向治疗中的单克隆抗体的生产成本低，有利于后期的转化应用。
附图说明
图1：pLKO.1-TRC克隆载体的图谱。
图2：本发明构建的shRNA表达质粒对Gal-9表达的敲低效果。
图3：免疫组化染色及原位杂交检测Gal-9及其它标注指标的表达结果，及其Gal-9表达水平与EBV感染及疾病分期的相关性分析结果。
图4.免疫杂交检测靶向Gal-9的shRNA阻断LCL细胞系中Gal-9的蛋白表达。
图5：纳米颗粒负载Gal-9shRNA尾静脉注射治疗NCG免疫缺陷鼠LCL皮下移植肿瘤结果。
图6：纳米颗粒负载Gal-9shRNA治疗小鼠LCL肿瘤模型的内脏毒性结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明发现B细胞淋巴瘤的发生与EBV感染和异常免疫调控密切相关,研究表明，Gal-9在EBV+的BCL中表达水平明显升高，且高水平Gal-9与BCL的疾病分期和不良预后相关。EBV具有感染B细胞的专一性，可以刺激受感染的B细胞持续性生长并引起细胞无限期传代，从而形成淋巴母细胞样细胞系(LCL)，为研究B细胞淋巴瘤肿瘤发生提供了良好的体外模型。在EBV体外感染B细胞的模型中，Gal-9表达水平在正常B细胞向LCL转化过程中进行性升高，阻断Gal-9可以影响EBV潜伏感染的建立及LCL的形成。综上所述，Gal-9参与B细胞淋巴瘤的肿瘤发生并与其预后相关，因此，Gal-9可作为B淋巴细胞瘤的潜在治疗靶点。
实施例1
1、Gal-9shRNA的靶序列：
shGal-9-01的靶序列:5′-CGGACTTCAGATCACTGTCAA-3′；
shGal-9-02的靶序列:5′-GCCTTTCATCACCACCATTCT-3′；
shGal-9-03的靶序列:5′-CAGTGGAAATGACATTGCCTT-3′；
shGal-9-04的靶序列:5′-CCCACCATCAACAGACTGGAA-3′。
2、Gal-9的mRNA序列：
ATGGCCTTCAGCGGTTCCCAGGCTCCCTACCTGAGTCCAGCTGTCCCCTTTTCTGGGACTATTCAAGGAGGTCTCCAGGACGGACTTCAGATCACTGTCAATGGGACCGTTCTCAGCTCCAGTGGAACCAGGTTTGCTGTGAACTTTCAGACTGGCTTCAGTGGAAATGACATTGCCTTCCACTTCAACCCTCGGTTTGAAGATGGAGGGTACGTGGTGTGCAACACGAGGCAGAACGGAAGCTGGGGGCCCGAGGAGAGGAAGACACACATGCCTTTCCAGAAGGGGATGCCCTTTGACCTCTGCTTCCTGGTGCAGAGCTCAGATTTCAAGGTGATGGTGAACGGGATCCTCTTCGTGCAGTACTTCCACCGCGTGCCCTTCCACCGTGTGGACACCATCTCCGTCAATGGCTCTGTGCAGCTGTCCTACATCAGCTTCCAGAACCCCCGCACAGTCCCTGTTCAGCCTGCCTTCTCCACGGTGCCGTTCTCCCAGCCTGTCTGTTTCCCACCCAGGCCCAGGGGGCGCAGACAAAAACCTCCCGGCGTGTGGCCTGCCAACCCGGCTCCCATTACCCAGACAGTCATCCACACAGTGCAGAGCGCCCCTGGACAGATGTTCTCTACTCCCGCCATCCCACCTATGATGTACCCCCACCCCGCCTATCCGATGCCTTTCATCACCACCATTCTGGGAGGGCTGTACCCATCCAAGTCCATCCTCCTGTCAGGCACTGTCCTGCCCAGTGCTCAGAGGTTCCACATCAACCTGTGCTCTGGGAACCACATCGCCTTCCACCTGAACCCCCGTTTTGATGAGAATGCTGTGGTCCGCAACACCCAGATCGACAACTCCTGGGGGTCTGAGGAGCGAAGTCTGCCCCGAAAAATGCCCTTCGTCCGTGGCCAGAGCTTCTCAGTGTGGATCTTGTGTGAAGCTCACTGCCTCAAGGTGGCCGTGGATGGTCAGCACCTGTTTGAATACTACCATCGCCTGAGGAACCTGCCCACCATCAACAGACTGGAAGTGGGGGGCGACATCCAGCTGACCCATGTGCAGACATAG。
3、Gal-9的蛋白序列：
MAFSGSQAPYLSPAVPFSGTIQGGLQDGLQITVNGTVLSSSGTRFAVNFQTGFSGNDIAFHFNPRFEDGGYVVCNTRQNGSWGPEERKTHMPFQKGMPFDLCFLVQSSDFKVMVNGILFVQYFHRVPFHRVDTISVNGSVQLSYISFQNPRTVPVQPAFSTVPFSQPVCFPPRPRGRRQKPPGVWPANPAPITQTVIHTVQSAPGQMFSTPAIPPMMYPHPAYPMPFITTILGGLYPSKSILLSGTVLPSAQRFHINLCSGNHIAFHLNPRFDENAVVRNTQIDNSWGSEERSLPRKMPFVRGQSFSVWILCEAHCLKVAVDGQHLFEYYHRLRNLPTINRLEVGGDIQLTHVQT。
4、shRNA载体信息(如图1所示)：pLKO.1-TRC克隆载体(pLKO.1-TRC CloningVector，https://www.addgene.org/protocols/plko/)，具有1.9kb的填充容量，可用于插入shRNA序列，可通过EcoRI和AgeI酶切后打开。
5、构建Gal-9shRNA表达质粒:
(1)合成带有茎环结构及粘性末端的shRNA引物：
shGal-9-01
F：CCGGCGGACTTCAGATCACTGTCAACTCGAGTTGACAGTGATCTGAAGTCCGTTTTT(SEQ IDNO:7)；
R：AATTAAAAACGGACTTCAGATCACTGTCAACTCGAGTTGACAGTGATCTGAAGTCCG(SEQ IDNO:8)。
shGal-9-02
F：CCGGGCCTTTCATCACCACCATTCTCTCGAGAGAATGGTGGTGATGAAAGGCTTTTT(SEQ IDNO:9)；
R：AATTAAAAAGCCTTTCATCACCACCATTCTCTCGAGAGAATGGTGGTGATGAAAGGC(SEQ IDNO:10)。
shGal-9-03
F：CCGGCAGTGGAAATGACATTGCCTTCTCGAGAAGGCAATGTCATTTCCACTGTTTTT(SEQ IDNO:11)；
R：AATTAAAAACAGTGGAAATGACATTGCCTTCTCGAGAAGGCAATGTCATTTCCACTG(SEQ IDNO:12)。
shGal-9-04
F：CCGGCCCACCATCAACAGACTGGAACTCGAGTTCCAGTCTGTTGATGGTGGGTTTTT(SEQ IDNO:13)；
R：AATTAAAAACCCACCATCAACAGACTGGAACTCGAGTTCCAGTCTGTTGATGGTGGG(SEQ IDNO:14)。
(2)引物退火及线性载体的制备：质粒pLKO.1-TRC的酶切
(3)T4连接酶连接：将准备好的退火引物和线性化载体用T4连接酶连接，将连接产物转化Stab3感受态细胞，平板测序，将测序正确的菌株提取质粒，即可获得Gal-9shRNA表达质粒；
6、验证shGal-9质粒对Gal-9表达的敲低效果：如图2所示，选择敲低效果最好的shRNA质粒，即shGal-9-01质粒，后续试验都采用shGal-9-01质粒进行。
7、小鼠LCL肿瘤模型验证Gal-9shRNA质粒(shGal-9-01质粒)的治疗效果。
通过对B淋巴瘤患者的肿瘤组织切片进行免疫组化染色,发现临床分期(AnnArbor分期)III、IV期患者比I、II期患者的Gal-9表达水平更高(图3A-B)，且在EBV+B淋巴细胞瘤患者的肿瘤组织中有更多的Gal-9富集(图3C-D)，因此，我们在裸鼠皮下LCL肿瘤模型中验证靶向Gal-9的shRNA对肿瘤生长的作用：首先，运用纳米颗粒负载shRNA质粒可以有效转运shRNA质粒至LCL细胞内，对细胞内Gal-9的表达水平进行调控(图4)；尾静脉注射负载Gal-9shRNA质粒的纳米颗粒(Nano+shGal-9)可以降低肿瘤生长速度(图5A-C)，而没有明显的肝肺脾等器官毒性(图6)。
纳米颗粒负载shRNA质粒的方法：按照纳米颗粒：shGal-9表达载体体积为10:1的比例充分涡旋混合，用等体积的5倍于纳米颗粒浓度的牛血清白蛋白溶液包裹上述混合液，即可得到负载shRNA表达载体的纳米颗粒混合物。
本发明首次发现Galectin-9介导EBV在B细胞中建立潜伏感染及永生化的调控机制。本发明首次发现shRNA靶向Galectin-9可在体外干预B细胞的永生化，及纳米颗粒负载shRNA质粒可在动物模型中阻止LCL-肿瘤的生长。本发明发现Galectin-9在淋巴瘤组织高表达且与EBV感染相关，该靶点有望在EBV相关的B细胞淋巴瘤治疗中展开基于RNAi技术的应用。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 中山大学肿瘤防治中心
<120> Gal-9作为靶点在筛选或制备治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
cggacttcag atcactgtca a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
gcctttcatc accaccattc t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
cagtggaaat gacattgcct t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
cccaccatca acagactgga a 21
<210> 5
<211> 1068
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
atggccttca gcggttccca ggctccctac ctgagtccag ctgtcccctt ttctgggact 60
attcaaggag gtctccagga cggacttcag atcactgtca atgggaccgt tctcagctcc 120
agtggaacca ggtttgctgt gaactttcag actggcttca gtggaaatga cattgccttc 180
cacttcaacc ctcggtttga agatggaggg tacgtggtgt gcaacacgag gcagaacgga 240
agctgggggc ccgaggagag gaagacacac atgcctttcc agaaggggat gccctttgac 300
ctctgcttcc tggtgcagag ctcagatttc aaggtgatgg tgaacgggat cctcttcgtg 360
cagtacttcc accgcgtgcc cttccaccgt gtggacacca tctccgtcaa tggctctgtg 420
cagctgtcct acatcagctt ccagaacccc cgcacagtcc ctgttcagcc tgccttctcc 480
acggtgccgt tctcccagcc tgtctgtttc ccacccaggc ccagggggcg cagacaaaaa 540
cctcccggcg tgtggcctgc caacccggct cccattaccc agacagtcat ccacacagtg 600
cagagcgccc ctggacagat gttctctact cccgccatcc cacctatgat gtacccccac 660
cccgcctatc cgatgccttt catcaccacc attctgggag ggctgtaccc atccaagtcc 720
atcctcctgt caggcactgt cctgcccagt gctcagaggt tccacatcaa cctgtgctct 780
gggaaccaca tcgccttcca cctgaacccc cgttttgatg agaatgctgt ggtccgcaac 840
acccagatcg acaactcctg ggggtctgag gagcgaagtc tgccccgaaa aatgcccttc 900
gtccgtggcc agagcttctc agtgtggatc ttgtgtgaag ctcactgcct caaggtggcc 960
gtggatggtc agcacctgtt tgaatactac catcgcctga ggaacctgcc caccatcaac 1020
agactggaag tggggggcga catccagctg acccatgtgc agacatag 1068
<210> 6
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr
20 25 30
Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn
35 40 45
Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro
50 55 60
Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly
65 70 75 80
Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly
85 90 95
Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val
100 105 110
Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe
115 120 125
His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr
130 135 140
Ile Ser Phe Gln Asn Pro Arg Thr Val Pro Val Gln Pro Ala Phe Ser
145 150 155 160
Thr Val Pro Phe Ser Gln Pro Val Cys Phe Pro Pro Arg Pro Arg Gly
165 170 175
Arg Arg Gln Lys Pro Pro Gly Val Trp Pro Ala Asn Pro Ala Pro Ile
180 185 190
Thr Gln Thr Val Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe
195 200 205
Ser Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro His Pro Ala Tyr Pro
210 215 220
Met Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu Tyr Pro Ser Lys Ser
225 230 235 240
Ile Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala Gln Arg Phe His Ile
245 250 255
Asn Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His Leu Asn Pro Arg Phe
260 265 270
Asp Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile Asp Asn Ser Trp Gly
275 280 285
Ser Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro Phe Val Arg Gly Gln
290 295 300
Ser Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His Cys Leu Lys Val Ala
305 310 315 320
Val Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His Arg Leu Arg Asn Leu
325 330 335
Pro Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr His
340 345 350
Val Gln Thr
355
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
ccggcggact tcagatcact gtcaactcga gttgacagtg atctgaagtc cgttttt 57
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
aattaaaaac ggacttcaga tcactgtcaa ctcgagttga cagtgatctg aagtccg 57
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
ccgggccttt catcaccacc attctctcga gagaatggtg gtgatgaaag gcttttt 57
<210> 10
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
aattaaaaag cctttcatca ccaccattct ctcgagagaa tggtggtgat gaaaggc 57
<210> 11
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
ccggcagtgg aaatgacatt gccttctcga gaaggcaatg tcatttccac tgttttt 57
<210> 12
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 12
aattaaaaac agtggaaatg acattgcctt ctcgagaagg caatgtcatt tccactg 57
<210> 13
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 13
ccggcccacc atcaacagac tggaactcga gttccagtct gttgatggtg ggttttt 57
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 14
aattaaaaac ccaccatcaa cagactggaa ctcgagttcc agtctgttga tggtggg 57

Claims (8)

1.一种抑制Gal-9表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA为shGal-9-01、shGal-9-02、shGal-9-03或shGal-9-04；
所述shGal-9-01的正义链序列如SEQ ID NO:7所示，所述shGal-9-01的反义链序列如SEQ ID NO:8所示；
所述shGal-9-01的正义链序列如SEQ ID NO:9所示，所述shGal-9-01的反义链序列如SEQ ID NO:10所示；
所述shGal-9-01的正义链序列如SEQ ID NO:11所示，所述shGal-9-01的反义链序列如SEQ ID NO:12所示；
所述shGal-9-01的正义链序列如SEQ ID NO:13所示，所述shGal-9-01的反义链序列如SEQ ID NO:14所示。
2.一种抑制Gal-9表达的shRNA表达载体，其特征在于，所述shRNA表达载体是将如权利要求1所述的shRNA连接至基础载体上而得到的。
3.根据权利要求2所述的shRNA表达载体，其特征在于，所述基础载体为pLKO.1-TRC克隆载体。
4.一种如权利要求2或3所述的shRNA表达载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将如权利要求1所述的shRNA的正义链和反义链混合后进行退火，得到双链寡核苷酸；酶切基础载体得到线性化载体；将所述双链寡核苷酸和所述线性化载体进行连接，得到所述shRNA表达载体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述酶切所用的酶包括EcoRI和AgeI；所述连接所用的酶为T4 DNA连接酶。
6.一种抑制Gal-9表达的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒负载有如权利要求1所述的shRNA或者如权利要求2或3所述的shRNA表达载体。
7.抑制Gal-9表达的试剂在制备治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用，其特征在于，所述抑制Gal-9表达的试剂为如权利要求1所述的shRNA、如权利要求2或3所述的shRNA表达载体或者如权利要求6所述的纳米颗粒。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述B细胞淋巴瘤为与EBV相关的B细胞淋巴瘤。
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SARS冠状病毒spike基因DNA疫苗的初步研究;李疆;疫苗学;第25卷(第4期);297-301 *

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