WO2015190606A1 - 二本鎖核酸分子、ｄｎａ、ベクター、癌細胞増殖抑制剤、癌細胞移動抑制剤、及び医薬 - Google Patents

二本鎖核酸分子、ｄｎａ、ベクター、癌細胞増殖抑制剤、癌細胞移動抑制剤、及び医薬 Download PDF

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double
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acid molecule
seq
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井上　聡
和博 池田
公仁子 井上
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention provides at least one of a double-stranded nucleic acid molecule, a DNA and vector containing the double-stranded nucleic acid molecule, the double-stranded nucleic acid molecule, DNA, and a vector that can be suitably used for prevention or treatment of cancer.
  • the present invention relates to a cancer cell growth inhibitor and a cancer cell migration inhibitor, and a medicament comprising at least one of the cancer cell proliferation inhibitor and the cancer cell migration inhibitor.
  • breast cancer is the most common cancer affecting women, and the number of patients has been increasing in recent years with the Westernization of diet and the aging of the population.
  • estrogen receptor-positive or progesterone receptor-positive tumors that are expected to have estrogen sensitivity are subjected to hormonal therapy with an anti-estrogen agent or an aromatase inhibitor that inhibits estrogen production. Hormone therapy is also performed in advanced breast cancer.
  • Non-Patent Document 1 Possible causes include overexpression and activation of estrogen receptors that can occur after estrogen depletion, and that the action of molecules that are originally estrogen receptor target factors and cause cancer growth is enhanced after the acquisition of resistance. Therefore, treatment targeting a factor downstream of the estrogen signal and particularly associated with cancer growth is expected as an effective therapeutic technique replacing conventional hormone therapy.
  • the detailed molecular mechanism of hormone therapy resistance is not yet clear, and sufficient treatments for breast cancer and resistance-resistant breast cancer after acquisition of resistance have not yet been developed.
  • molecular target therapies such as monoclonal antibody therapy for HER2 are also performed for tumors that are positive for the growth factor HER2 molecule.
  • breast cancers that are estrogen receptor negative, progesterone receptor negative, and HER2 negative.
  • the present invention targets a non-coding RNA containing at least one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 and a part thereof, and suppresses the expression of these non-coding RNAs, thereby allowing cancer cells to Double-stranded nucleic acid molecule that can effectively suppress the growth of DNA and can be suitably used for the prevention or treatment of cancer, DNA and vector comprising the double-stranded nucleic acid molecule, the double-stranded nucleic acid molecule, DNA
  • Another object of the present invention is to provide a cancer cell growth inhibitor and a cancer cell migration inhibitor containing at least one of the above and a vector, and a medicament containing at least one of the cancer cell proliferation inhibitor and the cancer cell migration inhibitor.
  • a double-stranded nucleic acid molecule for suppressing the expression of non-coding RNA is (A) a sense strand comprising a nucleotide sequence corresponding to the target sequence represented by any of SEQ ID NOs: 5-11 and 26-31; (B) an antisense strand comprising a nucleotide sequence complementary to the sense strand forming a double strand with the sense strand of (a),
  • the non-coding RNA is a double-stranded nucleic acid molecule comprising at least one of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 and a part thereof.
  • ⁇ 2> DNA comprising the nucleotide sequence encoding the double-stranded nucleic acid molecule according to ⁇ 1>.
  • ⁇ 3> A vector comprising the DNA according to ⁇ 2>.
  • ⁇ 4> A cancer cell growth inhibitor comprising at least one of the double-stranded nucleic acid molecule according to ⁇ 1>, the DNA according to ⁇ 2>, and the vector according to ⁇ 3>. It is.
  • ⁇ 5> A method for inhibiting the growth of cancer cells, comprising causing the cancer cell proliferation inhibitor according to ⁇ 4> to act on cancer cells.
  • ⁇ 6> A cancer cell migration inhibitor comprising at least one of the double-stranded nucleic acid molecule according to ⁇ 1>, the DNA according to ⁇ 2>, and the vector according to ⁇ 3>. It is.
  • ⁇ 7> A method for inhibiting cancer cell migration, comprising causing the cancer cell migration inhibitor according to ⁇ 6> to act on cancer cells.
  • ⁇ 8> A medicament for preventing or treating cancer, comprising at least one of the cancer cell proliferation inhibitor according to ⁇ 4> and the cancer cell migration inhibitor according to ⁇ 6>. It is a featured medicine.
  • ⁇ 9> A method for preventing or treating cancer, comprising administering the medicine according to ⁇ 8> to an individual.
  • RNAs containing at least one of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 and a part thereof are targeted and these non-coding
  • a double-stranded nucleic acid molecule that can be suitably used for the prevention or treatment of cancer
  • a cancer cell growth inhibitor and cancer cell migration inhibitor comprising at least one of a vector, the double-stranded nucleic acid molecule, DNA, and a vector, and at least one of the cancer cell proliferation inhibitor and the cancer cell migration inhibitor
  • a medicament containing the same can be provided.
  • FIG. 1A is a diagram showing the results of analyzing the expression of TMPO-AS1 in Test Example 2-1-1.
  • FIG. 1B is a diagram showing the results of analyzing the expression of TMPO-AS1 in Test Example 2-1-2.
  • FIG. 1C is a diagram showing the results of analyzing the expression of TMPO-AS1 in Test Example 2-1-3.
  • FIG. 1D is a diagram showing the results of analyzing the expression of TMPO-AS1 in Test Example 2-1-4.
  • FIG. 1E shows the results of analyzing the expression of TMPO-AS1 in Test Example 2-1-5.
  • FIG. 2A is a diagram showing the results of analyzing the expression of COL18A1-ASx in Test Example 2-2-1.
  • FIG. 2B is a diagram showing the results of analyzing the expression of COL18A1-ASx in Test Example 2-2-2.
  • FIG. 2C is a diagram showing the results of analyzing the expression of COL18A1-ASx in Test Example 2-2-3.
  • FIG. 2D is a diagram showing the results of analyzing the expression of COL18A1-ASx in Test Example 2-2-4.
  • FIG. 2E is a diagram showing the results of analyzing the expression of COL18A1-ASx in Test Example 2-2-5.
  • FIG. 3A is a graph showing the results of the expression level of TMPO-AS1 (SEQ ID NO: 1) in Test Example 3-1.
  • FIG. 3B is a graph showing the results of the cell proliferation test in Test Example 3-2.
  • FIG. 3C is a graph showing the results of the expression level of TMPO-AS1 (SEQ ID NO: 1) in Test Example 3-3.
  • FIG. 3D is a graph showing the results of cell proliferation test in Test Example 3-4.
  • FIG. 3E is a graph showing the results of the expression level of TMPO-AS1 (SEQ ID NO: 1) in Test Example 3-5.
  • FIG. 3F is a graph showing the results of cell proliferation test in Test Example 3-6.
  • FIG. 4A is a graph showing the results of the expression level of COL18A1-ASx (SEQ ID NOs: 2 to 4) in Test Example 4-1.
  • FIG. 4B is a graph showing the results of the cell proliferation test in Test Example 4-2.
  • FIG. 4C is a graph showing the results of the expression level of COL18A1-ASx (SEQ ID NOs: 2 to 4) in Test Example 4-3.
  • FIG. 4D is a graph showing the results of cell proliferation test in Test Example 4-4.
  • FIG. 4E is a graph showing the results of the expression levels of COL18A1-ASx (SEQ ID NOs: 2 to 4) in Test Example 4-5.
  • FIG. 4F is a graph showing the results of cell proliferation test in Test Example 4-6.
  • FIG. 5A is a diagram showing a typical tumor state taken in Test Example 5.
  • FIG. FIG. 5B is a graph showing changes in tumor volume in Test Example 5.
  • FIG. 6A is a graph showing the results of the cell migration test of Test Example 6-1.
  • FIG. 6B is a graph showing the results of the cell migration test of Test Example 6-2.
  • FIG. 7A is a diagram showing a typical tumor state imaged in Test Example 7.
  • FIG. 7B is a graph showing changes
  • the double-stranded nucleic acid molecule of the present invention is a double-stranded nucleic acid molecule for suppressing the expression of non-coding RNA, and is represented by (a) any one of SEQ ID NOs: 5 to 11 and 26 to 31.
  • a sense strand comprising a nucleotide sequence corresponding to the target sequence; and (b) an antisense strand comprising a nucleotide sequence complementary to the sense strand forming a double strand with the sense strand of (a).
  • the “double-stranded nucleic acid molecule” refers to a double-stranded nucleic acid molecule obtained by hybridizing a desired sense strand and an antisense strand.
  • the non-coding RNA includes at least one of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 and a part thereof.
  • the non-coding RNA is induced to estrogen-dependently as shown in the test examples described later.
  • TMPO-AS1 The base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the base sequence of TMPO-AS1.
  • the TMPO-AS1 is considered as an antisense transcript of TMPO (thympoietin) gene.
  • the sequence information of TMPO-AS1 can be easily obtained through a public database such as a RefSeq database (NCBI Reference Sequence database).
  • TMPO-AS1 Homo sapiens TMPO antisense RNA 1 (TMPO-AS1), long non-coding RNA” (NR — 0277.17.1; gi 224489948)
  • TMPO-AS1 long non-coding RNA
  • the RNA length is 3,161 bp, and the genome position is chr12: 989066751-98910004 (hg19).
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 2 to 4 are COL18A1-ASx base sequences.
  • the COL18A1-ASx is located in the antisense direction in the vicinity of COL18A1-AS2, which is an antisense transcript of the COL18A1 gene, immediately upstream of the transcription start point of COL18A1, and is present on the estrogen receptor ⁇ -binding region.
  • the sequence information of the COL18A1-ASx can be easily obtained through a public database such as a RefSeq database (NCBI Reference Sequence database).
  • the COL18A1-ASx has the following three variants registered in the RefSeq database as “Homo sapiens uncharacterized LOC101987545”.
  • LOC101928745 transcript variant X1, ncRNA (XR — 254050.1; gi 530438803)
  • the estimated RNA length is 746 bp (see SEQ ID NO: 2), and the genomic position is chr21: 46823724-46825332.
  • the estimated RNA length is 1,121 bp (see SEQ ID NO: 3), and the genomic position is chr21: 46823724-46826253.
  • the COL18A1-ASx is an RNA sequence in which the 170th to 746th region of SEQ ID NO: 2, the 545th to 1,121st region of SEQ ID NO: 3, or Expression of the 230th to 806th region of SEQ ID NO: 4 was confirmed. Therefore, the non-coding RNA is a part of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 2 to 4, the region from the 170th to the 746th of SEQ ID NO: 2, the 545th to 1, the SEQ ID NO: 3 It may include the 121st region or the 230th to 806th regions of SEQ ID NO: 4.
  • a non-coding RNA comprising at least one of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 and a part thereof is a target of the double-stranded nucleic acid molecule, and the double-stranded nucleic acid molecule Since the expression is suppressed, the non-coding RNA may be referred to as “target RNA” of the double-stranded nucleic acid molecule in the present specification.
  • the non-coding RNA comprising at least one of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 and a part thereof is derived from at least one of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 and a part thereof. It may be.
  • RNA sequences including the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 and at least one part thereof.
  • a double-stranded nucleic acid molecule comprising an antisense strand comprising a nucleotide sequence complementary to any one of 5 to 11 and 26 to 31) has a remarkably excellent expression suppressing effect on the non-coding RNA. I found it.
  • the double-stranded nucleic acid molecule of the present invention comprises (a) a sense strand comprising a nucleotide sequence corresponding to a target sequence represented by any of SEQ ID NOs: 5 to 11 and 26 to 31, and (b) the above-mentioned And (a) a sense strand and an antisense strand comprising a nucleotide sequence complementary to the sense strand forming a double strand.
  • the sense strand and the antisense strand may be RNA strands or RNA-DNA chimeric strands.
  • the sense strand and the antisense strand can hybridize with each other to form the double-stranded nucleic acid molecule.
  • SEQ ID NOs: 5 to 11 and 26 to 31 SEQ ID NOs: 5 to 11 are part of the TMPO-AS1
  • SEQ ID NOs: 26 to 31 are part of the COL18A1-ASx. .
  • the sense strand has a nucleotide sequence corresponding to the target sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 27, 28, 29, 30, and 31. It is preferable that the sense strand contains a nucleotide sequence corresponding to the target sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 and 28.
  • the sense strand is the preferred sense strand, it is advantageous in that a strong expression suppression effect on the target RNA can be obtained even if the amount of the double-stranded nucleic acid molecule used is small.
  • the sense strand in the double-stranded nucleic acid molecule only needs to include a nucleotide sequence corresponding to the target sequence of the predetermined sequence number, and may include other nucleotide sequences. It preferably consists of a nucleotide sequence corresponding to the target sequence.
  • the antisense strand in the double-stranded nucleic acid molecule only needs to contain a nucleotide sequence that is complementary to the extent that it can hybridize with the sense strand, and may contain other nucleotide sequences,
  • the nucleotide sequence complementary to the sense strand is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and particularly preferably 90% or more.
  • the type of the double-stranded nucleic acid molecule is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include double-stranded RNA (dsRNA) and double-stranded RNA-DNA chimera. Is mentioned. Among these, double-stranded RNA is preferable.
  • double-stranded RNA refers to a double-stranded nucleic acid molecule in which both sense strand and antisense strand are composed of RNA sequences
  • double-stranded RNA-DNA chimera refers to sense Both strands and antisense strands refer to double-stranded nucleic acid molecules composed of a chimeric sequence of RNA and DNA.
  • the double-stranded RNA is particularly preferably siRNA (small interfering RNA).
  • the siRNA is a small double-stranded RNA having a length of 18 to 29 bases, which cleaves a target RNA having a sequence complementary to the antisense strand (guide strand) of the siRNA, Has a function of suppressing expression.
  • the terminal structure is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the purpose.
  • the siRNA may have a blunt end or may have a protruding end (overhang).
  • the siRNA preferably has a structure in which the 3 ′ end of each strand protrudes from 2 to 6 bases, and more preferably has a structure in which the 3 ′ end of each strand protrudes by 2 bases.
  • siRNA examples include siRNA consisting of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, siRNA consisting of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, siRNA consisting of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, SiRNA consisting of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19, siRNA consisting of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, siRNA consisting of SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: SiRNA consisting of 25, siRNA consisting of SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33, siRNA consisting of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35, siRNA consisting of SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: : SiRNA consisting of 38 and SEQ ID NO: 39, siRNA consisting of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: such as siRNA consisting of 43 and the like.
  • siRNA consisting of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 siRNA consisting of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, siRNA consisting of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 SiRNA consisting of SEQ ID NO: 23, siRNA consisting of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35, siRNA consisting of SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39
  • siRNA consisting of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41, siRNA consisting of SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43 are preferred, siRNA consisting of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 36 And siRNA consisting of SEQ ID NO: 37 is more preferred.
  • the double-stranded RNA may be shRNA (short hairpin RNA).
  • shRNA is a single-stranded RNA comprising a dsRNA region of about 18 to 29 bases and a loop region of about 3 to 9 bases.
  • ShRNA is expressed in base pairs by being expressed in vivo.
  • the shRNA is cleaved by Dicer (RNase III enzyme) to become siRNA, which can function to suppress the expression of the target RNA.
  • Dicer Dicer
  • the terminal structure of the shRNA is not particularly limited as in the case of the siRNA, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the terminal structure may have a blunt end or a protruding end (overhang). It may be a thing.
  • the double-stranded RNA-DNA chimera is particularly preferably a chimeric siRNA.
  • the chimera siRNA refers to a small double-stranded RNA-DNA chimera having a length of 18 to 29 bases, in which a part of the siRNA RNA sequence is converted to DNA.
  • the chimeric siRNA has a function of suppressing the expression of the target RNA.
  • the chimera siRNA includes a mode in which a part of the sequence converted to DNA is converted back to RNA.
  • the terminal structure of the chimeric siRNA is not particularly limited as in the case of the siRNA, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, it may have a blunt end or a protruding end (overhang). You may have.
  • the chimeric siRNA double-stranded RNA-DNA chimera is advantageous in that it has high blood stability, low immune response induction, and low production costs.
  • the double-stranded nucleic acid molecule may have an appropriate modification depending on the purpose.
  • the double-stranded nucleic acid molecule is modified with 2′O-methylation or phosphorothioated. (S) modification, LNA (Locked Nucleic Acid) modification, and the like can be applied.
  • S 2′O-methylation or phosphorothioated.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • the 5 ′ end or 3 ′ end of the sense strand of the double-stranded nucleic acid molecule is modified with nanoparticles, cholesterol, a cell membrane-passing peptide, or the like. You can also.
  • limiting in particular as a method of giving such a modification to the said double stranded nucleic acid molecule A conventionally well-known method can be utilized suitably.
  • the siRNA can be synthesized chemically using an existing DNA / RNA automatic synthesizer or the like, each of which has a base length of 18 to 29 bases corresponding to the desired sense strand and antisense strand. However, it can be produced by annealing them.
  • a commercial product of annealed double-stranded siRNA can be obtained, or can be obtained by requesting synthesis from a siRNA synthesis contractor.
  • siRNA can also be produced using the intracellular reaction.
  • the chimeric siRNA can be prepared, for example, by chemically synthesizing a sense strand and an antisense strand that are chimeric nucleic acid molecules, and annealing them.
  • the DNA of the present invention is a DNA comprising a nucleotide sequence encoding the above-described double-stranded nucleic acid molecule of the present invention
  • the vector of the present invention is a vector comprising the DNA.
  • the DNA is not particularly limited as long as it includes a nucleotide sequence encoding the above-described double-stranded nucleic acid molecule of the present invention, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • a promoter sequence for controlling transcription of the double-stranded nucleic acid molecule is preferably linked upstream (5 ′ side) of the encoded nucleotide sequence.
  • limiting in particular as said promoter sequence According to the objective, it can select suitably, For example, pol III type
  • a terminator sequence for terminating the transcription of the double-stranded nucleic acid molecule is linked downstream (3 ′ side) of the nucleotide sequence encoding the double-stranded nucleic acid molecule.
  • a transcription unit including the promoter sequence, the nucleotide sequence encoding the double-stranded nucleic acid molecule, and the terminator sequence is a preferred embodiment of the DNA.
  • the transfer unit can be constructed using a conventionally known method.
  • the vector is not particularly limited as long as it contains the DNA, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • examples thereof include a plasmid vector and a virus vector.
  • the vector is preferably an expression vector capable of expressing the double-stranded nucleic acid molecule.
  • a method of expressing siRNA as a double stranded nucleic acid molecule two short single stranded RNAs are used. Examples thereof include a method of expression (tandem type) and a method of expressing single-stranded RNA as shRNA (hairpin type).
  • the tandem siRNA expression vector includes a DNA sequence encoding a sense strand constituting the siRNA and a DNA sequence encoding an antisense strand, and upstream (5 ′ side) of the DNA sequence encoding each strand. And a promoter sequence, and a terminator sequence linked to the downstream (3 ′ side) of the DNA sequence encoding each strand.
  • the DNA sequence encoding the sense strand constituting the siRNA and the DNA sequence encoding the antisense strand are arranged in opposite directions, and the sense strand DNA sequence and the antisense strand DNA
  • the sequence includes DNAs that are connected to each other via a loop sequence, and that has a promoter sequence linked upstream (5 ′ side) and a terminator sequence linked downstream (3 ′ side).
  • Each of the vectors can be constructed using a conventionally known technique.
  • the vector can be constructed by ligating the DNA to a cleavage site of a vector that has been cleaved with a restriction enzyme in advance.
  • the promoter By introducing (transfecting) the DNA or the vector into a cell, the promoter is activated and the double-stranded nucleic acid molecule can be generated.
  • the tandem vector the sense strand and the antisense strand are generated when the DNA is transcribed in a cell, and siRNA is generated by hybridizing them.
  • the hairpin vector the DNA is transcribed in a cell to first generate hairpin RNA (shRNA), and then siRNA is generated by processing with a dicer.
  • the cancer cell growth inhibitor of the present invention is a cancer cell growth inhibitor (sometimes referred to as “tumor growth inhibitor”) for suppressing the growth of cancer cells, and the double-stranded nucleic acid molecule of the present invention described above. , DNA, and vector, and other components as necessary.
  • the details of the DNA and vector are as described in the item of the DNA and vector of the present invention.
  • the content of at least one of the double-stranded nucleic acid molecule, DNA, and vector in the cancer cell growth inhibitor is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the cancer cell growth inhibitor may be at least one of the double-stranded nucleic acid molecule, DNA, and vector.
  • the other component is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • a physiological condition for diluting at least one of the double-stranded nucleic acid molecule, DNA, and vector to a desired concentration examples include diluents such as saline and culture solutions, and transfection reagents for introducing (transfecting) at least one of the double-stranded nucleic acid molecules, DNA, and vectors into the cells of interest.
  • diluents such as saline and culture solutions
  • transfection reagents for introducing (transfecting) at least one of the double-stranded nucleic acid molecules, DNA, and vectors into the cells of interest.
  • transfection reagents for introducing (transfecting) at least one of the double-stranded nucleic acid molecules, DNA, and vectors into the cells of interest.
  • the cancer cells to which the cancer cell proliferation inhibitor is applied are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • breast cancer cells endometrial cancer cells, cervical cancer cells, prostate cancer Cell, liver cancer cell, bladder cancer cell, osteosarcoma cell, rhabdomyosarcoma cell and the like.
  • breast cancer cells are preferable, and hormone therapy resistant breast cancer cells are more preferable.
  • the cancer cells may be cells cultured outside the body, or may be cells present in the body of a patient suffering from cancer. These cells can be obtained from, for example, ATCC (American Type Culture Collection) or JCRB cell bank.
  • the cancer cell growth inhibitor can be allowed to act on the cells, for example, by introducing (transfecting) them into the cancer cells.
  • the introduction method is not particularly limited and can be appropriately selected from conventionally known methods according to the purpose. For example, a method using a transfection reagent, a method using electroporation, a method using magnetic particles And methods using virus infection.
  • limiting in particular as the quantity of the said cancer cell growth inhibitor made to act with respect to a cancer cell Although it can select suitably according to the kind of cell, the grade of a desired effect, etc., for example, 1 * 10 ⁇ 6>.
  • the amount of the active ingredient is preferably about 0.1 ⁇ g, more preferably about 5 ⁇ g, and particularly preferably about 15 ⁇ g with respect to the number of cells.
  • the cancer cell growth inhibitor includes at least one of the double-stranded nucleic acid molecule, DNA, and vector, by acting on a cancer cell, through suppression of expression of at least one of the non-coding RNAs, Cancer cell growth can be effectively suppressed. Therefore, the present invention is referred to as a cancer cell growth inhibition method (“tumor growth inhibition method”), which comprises allowing at least one of the double-stranded nucleic acid molecule, DNA, and vector to act on cancer cells. Also).
  • the cancer cell is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • breast cancer cell For example, breast cancer cell, endometrial cancer cell, cervical cancer cell, prostate cancer cell, liver cancer cell, bladder cancer cell, bone Examples include sarcoma cells and rhabdomyosarcoma cells. Among these, breast cancer cells are preferable, and hormone therapy resistant breast cancer cells are more preferable.
  • the cancer cell migration inhibitor of the present invention is a cancer cell migration inhibitor for suppressing cancer cell migration (sometimes referred to as “cancer cell migration inhibitor”), and the double-stranded nucleic acid of the present invention described above. It contains at least one of molecule, DNA, and vector, and further contains other components as necessary.
  • the double-stranded nucleic acid molecule is as described in the item of the double-stranded nucleic acid molecule of the present invention described above. Since the double-stranded nucleic acid molecule can effectively suppress the expression of at least one of the targeted non-coding RNAs, the active ingredient of the cancer cell migration inhibitor for inhibiting cancer cell migration It is suitable as.
  • the details of the DNA and vector are as described in the item of the DNA and vector of the present invention.
  • the content of at least one of the double-stranded nucleic acid molecule, DNA, and vector in the cancer cell migration inhibitor is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the cancer cell migration inhibitor may be at least one of the double-stranded nucleic acid molecule, DNA, and vector.
  • the other component is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • a physiological condition for diluting at least one of the double-stranded nucleic acid molecule, DNA, and vector to a desired concentration examples include diluents such as saline and culture solutions, and transfection reagents for introducing (transfecting) at least one of the double-stranded nucleic acid molecules, DNA, and vectors into the cells of interest.
  • diluents such as saline and culture solutions
  • transfection reagents for introducing (transfecting) at least one of the double-stranded nucleic acid molecules, DNA, and vectors into the cells of interest.
  • transfection reagents for introducing (transfecting) at least one of the double-stranded nucleic acid molecules, DNA, and vectors into the cells of interest.
  • the cancer cells to which the cancer cell migration inhibitor is applied are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • breast cancer cells endometrial cancer cells, cervical cancer cells, prostate cancer Cell, liver cancer cell, bladder cancer cell, osteosarcoma cell, rhabdomyosarcoma cell and the like.
  • breast cancer cells are preferable, and hormone therapy resistant breast cancer cells are more preferable.
  • the cancer cells may be cells cultured outside the body, or may be cells present in the body of a patient suffering from cancer. These cells can be obtained from, for example, ATCC (American Type Culture Collection) or JCRB cell bank.
  • the cancer cell migration inhibitor can act on the cells, for example, by introducing (transfecting) them into the cancer cells.
  • the introduction method is not particularly limited and can be appropriately selected from conventionally known methods according to the purpose. For example, a method using a transfection reagent, a method using electroporation, a method using magnetic particles And methods using virus infection.
  • limiting in particular also as the quantity of the said cancer cell migration inhibitor made to act with respect to a cancer cell Although it can select suitably according to the kind of cell, the grade of a desired effect, etc., for example, 1 * 10 ⁇ 6>.
  • the amount of the active ingredient is preferably about 0.1 ⁇ g, more preferably about 5 ⁇ g, and particularly preferably about 15 ⁇ g with respect to the number of cells.
  • the present invention also relates to a method for suppressing migration of cancer cells, which comprises causing at least one of the double-stranded nucleic acid molecule, DNA, and vector to act on cancer cells.
  • the cancer cell is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • breast cancer cell For example, breast cancer cell, endometrial cancer cell, cervical cancer cell, prostate cancer cell, liver cancer cell, bladder cancer cell, bone Examples include sarcoma cells and rhabdomyosarcoma cells. Among these, breast cancer cells are preferable, and hormone therapy resistant breast cancer cells are more preferable.
  • the medicament of the present invention is a medicament for preventing or treating cancer, and includes at least one of the above-described cancer cell growth inhibitor and cancer cell migration inhibitor of the present invention, and further contains other components as necessary. Including.
  • ⁇ At least one of a cancer cell growth inhibitor and a cancer cell migration inhibitor ⁇ At least one of a cancer cell growth inhibitor and a cancer cell migration inhibitor> Details of the cancer cell growth inhibitor and the cancer cell migration inhibitor are as described in the item of the cancer cell proliferation inhibitor and cancer cell migration inhibitor of the present invention described above.
  • the cancer cell growth inhibitor includes at least one of the above-described double-stranded nucleic acid molecule, DNA, and vector of the present invention
  • cancer can be prevented through suppression of expression of at least one of the non-coding RNAs targeted.
  • Cell proliferation can be effectively suppressed.
  • the cancer cell migration inhibitor includes at least one of the above-described double-stranded nucleic acid molecule, DNA, and vector of the present invention
  • cancer can be prevented through suppression of expression of at least one of the non-coding RNAs targeted.
  • Cell migration can be effectively suppressed. That is, the cancer cell proliferation inhibitor and the cancer cell migration inhibitor can be suitably used as a medicament for preventing or treating cancer.
  • the cancer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • breast cancer endometrial cancer, cervical cancer, prostate cancer, liver cancer, bladder cancer, osteosarcoma, rhabdomyosarcoma, etc. Is mentioned.
  • breast cancer is preferable, and hormone therapy resistant breast cancer is more preferable.
  • the content of at least one of the cancer cell proliferation inhibitor and the cancer cell migration inhibitor in the medicament is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the medicament may be at least one of the cancer cell growth inhibitor and the cancer cell migration inhibitor.
  • the double-stranded nucleic acid molecule serving as the active ingredient of the medicament an unmodified double-stranded nucleic acid molecule itself may be used, but in order to appropriately obtain preventive or therapeutic effects, It is preferable to use a double-stranded nucleic acid molecule in a form suitable for administration of
  • the double-stranded nucleic acid molecule is preferably modified in that the stability of the double-stranded nucleic acid molecule in vivo can be improved.
  • the type of modification that can be applied to the double-stranded nucleic acid molecule is not particularly limited, and examples thereof include 2′O-methylation modification, phosphorothioate (S) modification, and LNA (Locked Nucleic Acid) modification.
  • the 5 ′ end or 3 ′ end of the sense strand of the double-stranded nucleic acid molecule is modified with nanoparticles, cholesterol, a cell membrane-passing peptide, etc. It is also preferable.
  • limiting in particular as a method to give the said modification to the said double stranded nucleic acid molecule A conventionally well-known method can be utilized suitably.
  • the double-stranded nucleic acid molecule forms a complex with a liposome, a polymer matrix, or the like in that the introduction efficiency into the target cell can be increased.
  • a conventionally well-known method can be utilized suitably.
  • the other components are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • examples thereof include pharmaceutically acceptable carriers.
  • pharmaceutically acceptable carriers There is no restriction
  • limiting in particular also as content of the said other component in the said pharmaceutical According to the objective, it can select suitably.
  • the pharmaceutical dosage form is not particularly limited, and can be appropriately selected according to a desired administration method as described later, for example, oral solid preparations (tablets, coated tablets, granules, powders, capsules). Agents), oral liquids (internal solutions, syrups, elixirs, etc.), injections (solutions, suspensions, solid preparations for erection, etc.), ointments, patches, gels, creams, external powders, Examples include sprays and inhaled powders.
  • Examples of the oral solid preparation include, for example, excipients, and further additives such as binders, disintegrants, lubricants, colorants, flavoring / flavoring agents, and the like, in addition to the active ingredients.
  • Examples of the excipient include lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium carbonate, kaolin, microcrystalline cellulose, and silicic acid.
  • Examples of the binder include water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropyl starch, methylcellulose, ethylcellulose, shellac, calcium phosphate, polyvinylpyrrolidone and the like. It is done.
  • Examples of the disintegrant include dry starch, sodium alginate, agar powder, sodium hydrogen carbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, and lactose.
  • Examples of the lubricant include purified talc, stearate, borax, and polyethylene glycol.
  • Examples of the colorant include titanium oxide and iron oxide.
  • Examples of the flavoring / flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like.
  • the oral solution can be produced by a conventional method, for example, by adding additives such as a flavoring / flavoring agent, a buffering agent, and a stabilizer to the active ingredient.
  • additives such as a flavoring / flavoring agent, a buffering agent, and a stabilizer
  • the flavoring / flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like.
  • the buffer include sodium citrate.
  • the stabilizer include tragacanth, gum arabic, and gelatin.
  • a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, a tonicity agent, a local anesthetic, and the like are added to the active ingredient, and subcutaneous, intramuscular and intravenous use are performed by a conventional method. Etc. can be produced.
  • the pH adjusting agent and the buffering agent include sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate and the like.
  • the stabilizer include sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid, and the like.
  • the isotonic agent include sodium chloride and glucose.
  • the local anesthetic include procaine hydrochloride and lidocaine hydrochloride.
  • a known base, stabilizer, wetting agent, preservative and the like may be blended with the active ingredient and mixed by a conventional method.
  • the base include liquid paraffin, white petrolatum, white beeswax, octyldodecyl alcohol, paraffin and the like.
  • the preservative include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, and the like.
  • a cream, gel, paste or the like as the ointment can be applied to a known support by a conventional method.
  • the support include woven fabric, nonwoven fabric, soft vinyl chloride, polyethylene, polyurethane and other films made of cotton, suf, and chemical fibers, and foam sheets.
  • the medicament is suitable for prevention or treatment of cancer. Therefore, the said medicine can be conveniently used by administering to the patient suffering from cancer.
  • the animal to which the pharmaceutical is administered is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include humans, mice, rats, cows, pigs, monkeys, dogs, and cats. Among them, human is particularly preferable.
  • the administration method of the medicine is not particularly limited, and for example, either local administration or systemic administration can be selected according to the pharmaceutical dosage form, the type of disease, the patient's condition, and the like.
  • the active ingredient of the medicine (the double-stranded nucleic acid molecule) can be administered by directly injecting it to a desired site (for example, a tumor site).
  • a desired site for example, a tumor site
  • a conventionally known method such as injection can be appropriately used.
  • systemic administration for example, oral administration, intraperitoneal administration, administration into blood, etc.
  • the active ingredient of the medicament is stable to a desired site (for example, a tumor site).
  • it is preferable to appropriately apply a conventionally known drug delivery technique so that it can be efficiently delivered.
  • dosage of the said medicine there is no restriction
  • the amount of the active ingredient (the double-stranded nucleic acid molecule) is preferably 1 mg to 100 mg.
  • the number of administrations of the medicine is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the age, weight, desired degree of effect, etc. of the patient to be administered.
  • the medicament is capable of inhibiting the growth and migration of cancer cells and is excellent in the effect of preventing tumor growth due to the proliferation and migration of the cancer cells. It may be desirable to administer as early as possible.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating cancer, which comprises administering the medicine to an individual.
  • the cancer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, breast cancer, endometrial cancer, cervical cancer, prostate cancer, liver cancer, bladder cancer, osteosarcoma, rhabdomyosarcoma, etc. Is mentioned. Among these, breast cancer is preferable, and hormone therapy resistant breast cancer is more preferable.
  • test examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these test examples.
  • the cells were cultured at 37 ° C. in an incubator containing 5% carbon dioxide gas in the air.
  • the cell culture medium was MCF-7 cells, T47D cells, Ishikawa cells, HeLa cells, VCaP cells, 22Rv1 cells, HepG2 cells, EJ cells, MG63 cells, SaoS cells, HOS cells, and RD cells.
  • HHUA cells used were HamF12 medium (Nacalai Tesque) containing 10% fetal bovine serum (FBS, Sigma), 100 ⁇ g / mL streptomycin, 100 U / mL penicillin (Invitrogen), Hec1A cells, T24 For cells and RT4 cells, McCoy's 5A medium (Life Technologies) containing 10% fetal bovine serum (FBS, Sigma), 100 ⁇ g / mL streptomycin, 100 U / mL penicillin (Invitrogen) was used.
  • RNA sequence analysis> After culturing MCF-7 cells in the following hormone-deficient cell culture medium for 1 day, after adding any of the following drugs at the following concentrations and stimulating for 4 hours, all of them are prepared using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.). RNA was recovered from the cells.
  • -Hormone-deficient cell culture- Phenol red-free DMEM medium (Sigma) containing 10% fetal bovine serum (dccFBS), hormone removed by charcoal dextran treatment (Sigma), 100 ⁇ g / mL streptomycin, and 100 U / mL penicillin (Invitrogen) Made).
  • -Drug- (1) 17 ⁇ -estradiol (hereinafter sometimes referred to as “E2”): 100 nM.
  • E2 4-hydroxy tamoxifen
  • OHT 4-hydroxy tamoxifen
  • solvent control final concentration of 0.1%.
  • RNA sequence analysis was subjected to RNA sequence analysis by preparing a library using a next-generation sequencer GAIIx (manufactured by Illumina).
  • the obtained sequence information is mapped on the RefSeq database (NCBI Reference Sequence database), the tag count is 50 or more in any sample, and the previously reported estrogen receptor ⁇ (ER ⁇ ) binding region (hereinafter referred to as “ERBS”) Carroll JS et al., Nature Genetics. 38, 1289-97, 2006)
  • ERBS estrogen receptor ⁇ binding region
  • TMPO-AS1 which is one of the long non-coding RNAs showing an expression increase of more than twice that of the solvent control by E2
  • COL18A1-AS2 which is an antisense transcript of the COL18A1 gene, and in the vicinity thereof is located immediately upstream of the transcription start point of COL18A1 in the antisense direction and on the ERBS.
  • IGV Integrative Genomics Viewer
  • Genome Explorer National Institute of Genetics
  • TMPO-AS1 is registered in the RefSeq database as “Homo sapiens TMPO antisense RNA 1 (TMPO-AS1), long non-coding RNA” (NR — 0277.17.1; gi 2245498948), and the RNA length is 3,161 bp ( SEQ ID NO: 1), and genomic position is chr12: 989066751-98910004 (hg19).
  • the COL18A1-ASx has three types of variants registered in the RefSeq database as “Homo sapiens uncharacterized LOC101987545”.
  • the three types of variants are as follows. (1) LOC101928745, transcript variant X1, ncRNA (XR — 254050.1; gi 530438803)
  • the estimated RNA length is 746 bp (see SEQ ID NO: 2), and the genomic position is chr21: 46823724-46825332.
  • expression of the 170th to 746th region of SEQ ID NO: 2 was confirmed.
  • Test Example 2-1 Expression of TMPO-AS1 in various cancer cells and breast cancer clinical samples
  • ⁇ Test Example 2-1-1> After culturing MCF-7 cells in the following hormone-deficient cell culture medium for 1 day, after adding any of the following drugs at the following concentrations and stimulating for 4 hours, all of them are prepared using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.). RNA was recovered from the cells.
  • RNA was analyzed using GAIIx (manufactured by Illumina), which is a next-generation sequencer. Genome Explorer was used for the visualization analysis of the sequence.
  • FIG. 1A shows the result of analyzing the expression of TMPO-AS1 in MCF-7 cells.
  • FIG. 1A the regions of “Refseq gene (+ strand)”, “Refseq gene ( ⁇ strand)”, “Refseq mRNA (+ strand)” and “Refseq mRNA ( ⁇ strand)” in the human genome are schematically illustrated in order from the top.
  • FIG. 1B shows the results of analysis of TMPO-AS1 expression in MDA-MB-231 cells, MCF-7 cells, or T47D cells.
  • MDA-MB-231 (+ chain) MDA-MB-231 (+)
  • MDA-MB-231 ( ⁇ chain) MDA-MB-231 ( ⁇ )
  • MCF-7 (+ chain) MDA-MB-231 (+)
  • MCF-7 (+ chain) MDA-MB-231 (+)
  • MCF-7 (+ chain) MDA-MB-231 (+)
  • MMF-7 (+ chain) MDF-7 (+ chain)
  • MCF-7 ( ⁇ chain) MCF-7 ( ⁇ )
  • T47D (+ chain) T47D (+ chain
  • T47D ( ⁇ chain) T47D ( ⁇ )
  • Ishikawa cells were treated with E2 (24 hours) and then total RNA was collected using ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd.), and 22Rv1 cells were treated with dihydrotestosterone (DHT) (24 hours). Thereafter, total RNA was recovered using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.).
  • IGV (Integrative Genomics Viewer) browser was used for the visualization analysis of the sequence.
  • FIG. 1C shows the results of analyzing the expression of TMPO-AS1 in Ishikawa cells, HHUA cells, Hec1A cells, LNCaP cells, VCaP cells, 22Rv1 cells, DU145 cells, or PC3 cells.
  • Ishikawa cells Ishikawa E2
  • HHUA cells HHUA
  • Hec1A Hec1A
  • LNCaP LNCaP
  • VCaP cells VaP
  • 22Rv1 D5D D14
  • D14 H14
  • TMPO-AS1 expression of TMPO-AS1 was also confirmed in Ishikawa cells, HHUA cells, and Hec1A cells, which are endometrial cancer cells, and LNCaP, VCaP, 22Rv1, DU145, and PC3, which are prostate cancer cells. .
  • IGV Intelligent Genomics Viewer
  • FIG. 1D shows the results of analyzing the expression of TMPO-AS1 in HeLa cells, HepG2 cells, EJ cells, T24 cells, RT4 cells, MG63 cells, SaoS cells, HOS cells, SJCRH30 cells, or RD cells.
  • HeLa HeLa
  • HepG2 cells HepG2 cells
  • EJ EJ
  • T24 cells T24
  • RT4 cells RT4 cells
  • MG63 cells MG63
  • SaoS cells SaoS cells
  • the results of HOS cells (HOS), SJCRH30 cells (SJCRH30), and RD cells (RD) are shown. From the result of FIG.
  • HeLa cells that are cervical cancer cells HepG2 cells that are liver cancer cells
  • EJ cells that are bladder cancer cells EJ cells that are bladder cancer cells
  • T24 cells T24 cells
  • RT4 cells MG63 cells that are osteosarcoma cells
  • SaoS cells and HOS TMPO-AS1 expression was also confirmed in SJCRH30 cells and RD cells, which are rhabdomyosarcoma cells.
  • FIG. 1E shows the results of analysis of TMPO-AS1 expression in clinical samples (BC1 to BC10) of breast cancer tumor tissues.
  • FIG. 1E shows the results of BC1 to BC10 in order from the top. From the results in FIG. 1E, TMPO-AS1 expression was also confirmed in clinical samples of breast cancer tumor tissue.
  • Test Example 2-2 Expression of COL18A1-ASx in various cancer cells and breast cancer clinical samples
  • ⁇ Test Example 2-2-1> After culturing MCF-7 cells in the following hormone-deficient cell culture medium for 1 day, after adding any of the following drugs at the following concentrations and stimulating for 4 hours, all of them are prepared using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.). RNA was recovered from the cells.
  • FIG. 2A shows the results of analyzing the expression of COL18A1-ASx in MCF-7 cells.
  • the regions of “Refseq gene (+ strand)”, “Refseq gene ( ⁇ strand)”, “Refseq mRNA (+ strand)” and “Refseq mRNA ( ⁇ strand)” in the human genome are schematically shown in the order from the top.
  • FIG. 2B shows the results of analyzing the expression of COL18A1-ASx in MDA-MB-231 cells, MCF-7 cells, or T47D cells.
  • MDA-MB-231 (+ chain) MDA-MB-231 (+)
  • MDA-MB-231 ( ⁇ chain) MDA-MB-231 ( ⁇ )
  • MCF-7 (+ chain) MDA-MB-231 (+)
  • MCF-7 (+ chain) MDA-MB-231 (+)
  • MMF-7 (+ chain) MMF-7 (+)
  • MCF-7 ( ⁇ chain) MCF-7 ( ⁇ )
  • T47D (+ chain) T47D (+ chain
  • T47D (-chain) T47D (-chain)
  • Ishikawa cells were subjected to E2 treatment (24 hours) and then total RNA was collected using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), and 22Rv1 cells were subjected to DHT treatment (24 hours) and ISOGEN (corporation) Total RNA was recovered using Nippon Gene.
  • IGV (Integrative Genomics Viewer) browser was used for the visualization analysis of the sequence.
  • FIG. 2C shows the results of analyzing the expression of COL18A1-ASx in Ishikawa cells, HHUA cells, Hec1A cells, LNCaP cells, VCaP cells, 22Rv1 cells, DU145 cells, or PC3 cells.
  • Ishikawa cells Ishikawa E2
  • HHUA cells HHUA
  • Hec1A Hec1A
  • LNCaP LNCaP
  • VCaP cells VaP
  • 22Rv1 D5D D14
  • D14 D14 cells
  • 22Rv1 D5D14 cells 22Rv1 D5D14 cells
  • the expression of COL18A1-ASx was also confirmed in Ishikawa cells, HHUA cells, and Hec1A cells, which are endometrial cancer cells, and LNCaP, VCaP, 22Rv1, DU145, and PC3, which are prostate cancer cells. .
  • IGV Intelligent Genomics Viewer
  • FIG. 2D shows the results of analyzing the expression of COL18A1-ASx in HeLa cells, HepG2 cells, EJ cells, T24 cells, RT4 cells, MG63 cells, SaoS cells, HOS cells, SJCRH30 cells, or RD cells.
  • HeLa HeLa
  • HepG2 cells HepG2 cells
  • EJ EJ
  • T24 cells T24
  • RT4 cells RT4 cells
  • MG63 cells MG63
  • SaoS cells SaoS cells
  • the results of HOS cells (HOS), SJCRH30 cells (SJCRH30), and RD cells (RD) are shown. From the result of FIG.
  • the HepG2 cell which is a liver cancer cell the EJ cell which is a bladder cancer cell, and the T24 cell
  • the MG63 cell which is an osteosarcoma cell
  • the SaoS cell and the HOS cell the RD cell which is a rhabdomyosarcoma cell.
  • the expression of COL18A1-ASx was also confirmed in FIG.
  • FIG. 2E shows the results of analyzing the expression of COL18A1-ASx in clinical samples (BC1 to BC10) of breast cancer tumor tissue.
  • FIG. 2E shows the results of BC1 to BC10 in order from the top. From the result of FIG. 2E, the expression of COL18A1-ASx was also confirmed in a clinical sample of breast cancer tumor tissue.
  • the double-stranded nucleic acid molecule (siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9) of the present invention against a non-coding RNA comprising at least one of the base sequence represented by -4 is The target sequence of each double-stranded nucleic acid molecule (described below) and a sequence containing a complementary portion thereof are synthesized as RNA or RNA-DNA chimera double-stranded at the 3 'end with a two-base overhang.
  • siRNA siControl (manufactured by RNAi) having no off-target effect on all known genes was prepared.
  • the target sequence of each double-stranded nucleic acid molecule and the sequence of the prepared siRNA or chimeric siRNA are shown below.
  • the target sequence represented by SEQ ID NO: 5 corresponds to the 1,379th to 1,399th positions in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • RNA ⁇ SiTMPO-AS1-2 (siRNA)> -Target sequence- 5′-gagccgaactacgaaccaact-3 ′ (SEQ ID NO: 6) -Sequence of siRNA- --Sense strand-- 5′-gagccgaaccuacgaaccu-3 ′ (SEQ ID NO: 14) --Antisense strand-- 5′-ugugucguguagucggcucug-3 ′ (SEQ ID NO: 15)
  • the target sequence represented by SEQ ID NO: 6 corresponds to positions 455 to 475 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • RNA ⁇ SiTMPO-AS1-3 (siRNA)> -Target sequence- 5′-ggacagggtcgtactgctttg-3 ′ (SEQ ID NO: 7) -Sequence of siRNA- --Sense strand-- 5′-ggacaggucguacugucuug-3 ′ (SEQ ID NO: 16) --Antisense strand-- 5′-aaagcaguacaccaccucuccc-3 ′ (SEQ ID NO: 17)
  • the target sequence represented by SEQ ID NO: 7 corresponds to the 755th to 775th positions in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • RNA ⁇ SiTMPO-AS1-5 (siRNA)> -Target sequence- 5′-gaatcctaaacttaacgtttg-3 ′ (SEQ ID NO: 8) -Sequence of siRNA- --Sense strand-- 5′-gaauccuaaaaccuugu-3 ′ (SEQ ID NO: 18) --Antisense strand-- 5′-aacguuuagguuuagugaucuu-3 ′ (SEQ ID NO: 19)
  • the target sequence represented by SEQ ID NO: 8 corresponds to positions 1,281 to 1,301 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • RNA ⁇ SiTMPO-AS1-7 (siRNA)> -Target sequence- 5'-cctaacgtttgataacaaaac-3 '(SEQ ID NO: 9) -Sequence of siRNA- --Sense strand-- 5′-ccuaacguuuugauaacaaac-3 ′ (SEQ ID NO: 20) --Antisense strand-- 5′-uuuguuuuauacaacuguuagguu-3 ′ (SEQ ID NO: 21)
  • the target sequence represented by SEQ ID NO: 9 corresponds to positions 1,291 to 1,311 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • RNA ⁇ SiTMPO-AS1-8 (siRNA)> -Target sequence- 5′-cccgttataccatcatcaaaat-3 ′ (SEQ ID NO: 10) -Sequence of siRNA- --Sense strand-- 5′-cccguauauccgauccaauau-3 ′ (SEQ ID NO: 22) --Antisense strand-- 5′-uuuggaucgguauaacgggguu-3 ′ (SEQ ID NO: 23)
  • the target sequence represented by SEQ ID NO: 10 corresponds to positions 1,421 to 1,441 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • RNA ⁇ SiTMPO-AS1-10 (siRNA)> -Target sequence- 5′-cgcgaacgctttctttttgttcc-3 ′ (SEQ ID NO: 11) -Sequence of siRNA- --Sense strand-- 5′-cgcgaacgcucucuuuuguuccc-3 ′ (SEQ ID NO: 24) --Antisense strand-- 5′-aaacaaaagaagcguucgcgag-3 ′ (SEQ ID NO: 25)
  • the target sequence represented by SEQ ID NO: 11 corresponds to the 1,051st to 1,071th positions in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • ⁇ SiCOL18A1-ASx-1 (chimeric siRNA)> -Target sequence- 5′-gcactgtgaggagaaggaat-3 ′ (SEQ ID NO: 26) -Sequence of chimera siRNA- --Sense strand-- 5′-gcacuguugaggagaaggaaut-3 ′ (SEQ ID NO: 32) --Antisense strand-- 5′-auucucuccacaugucct-3 ′ (SEQ ID NO: 33)
  • the target sequence represented by SEQ ID NO: 26 is from the 673 th to 691 th in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and from the 1,048 th to 1st in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • siControl used for the negative control is shown below.
  • ⁇ SiControl> Sense strand- 5′-guaccgcacguucauucguauc-3 ′ (SEQ ID NO: 44)
  • MCF-7 cells which are human breast cancer cell lines were used.
  • DMEM fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin 100 U / mL penicillin (manufactured by Invitrogen) was used as a cell culture solution.
  • the cells were cultured at 37 ° C. in an incubator containing 5% carbon dioxide gas in the air.
  • RNA was recovered from the cells using ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd.). Using 1 ⁇ g of the total RNA, cDNA was synthesized by SuperScript (registered trademark) III Reverse Transscriptase (manufactured by Life Technologies). The cDNA was diluted 10-fold, and 2 ⁇ L of the cDNA was used for quantitative real-time PCR. Quantitative real-time PCR is performed using StepOnePlus (registered trademark) Real-Time PCR Systems (manufactured by Life Technologies) and KAPA SYBR Fast PCR kit (manufactured by Nippon Genetics Co., Ltd.).
  • TMPO-AS1 SEQ ID NO: 1
  • TMPO-AS1 SEQ ID NO: 1
  • GAPDH_FW 5′-ggtgggtctcctctgactcaaca-3 ′ (SEQ ID NO: 46)
  • GAPDH_RV 5′-gtgggtcgttggggcaatg-3 ′ (SEQ ID NO: 47)
  • TMPO-AS1- TMPO-AS1_FW 5'-tctccacccttccccttagac-3 '(SEQ ID NO: 50)
  • TMPO-AS1_RV 5′-aacggcgcacaaaagca-3 ′ (SEQ ID NO: 51)
  • FIG. 3A The results are shown in FIG. 3A.
  • “( ⁇ )” indicates the result of no treatment
  • “Reagent” indicates the result of not transfecting the double-stranded nucleic acid molecule (reagent only)
  • “siControl” indicates “ The results of the transfection of “siControl” are shown, and “siTMPO-AS1-1, 2, 3, 5, 7, 8, 10” represents “siTMPO-AS1-1, 2, 3, 5, 7, 8, 10 "shows the result of transfection. From the result of FIG. 3A, it is clear that “siTMPO-AS1-1, 2, 3, 5, 7, 8, 10” of the present invention suppresses the expression of TMPO-AS1 at the RNA level as compared with siControl. became.
  • Test Example 3-2 In vitro cell growth inhibitory effect of double-stranded nucleic acid molecule
  • siTMPO-AS1-1, 2, 3, 5, 7, 8, or 10 obtained in Production Example 1 and measuring the subsequent cell proliferation.
  • the molecular breast cancer cell growth inhibitory effect (knockdown effect) was examined.
  • siControl was used as a control. Details of the experimental method are shown below.
  • MCF-7 cells which are human breast cancer cell lines were used.
  • DMEM fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin 100 U / mL penicillin (manufactured by Invitrogen) was used as a cell culture solution.
  • the cells were cultured at 37 ° C. in an incubator containing 5% carbon dioxide gas in the air.
  • Cell proliferation test The cell proliferation test was carried out by reacting for 2 hours using Cell Count Reagent SF (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.) 1 day and 5 days after transfection, and measuring the cell proliferation ability at an absorbance of 450 nm with a microplate reader. .
  • the tetrazolium salt WST-8 [2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium] was converted to a highly water-soluble formazan dye. The number of viable cells is measured by colorimetric determination of the enzyme activity during reduction.
  • FIG. 3B The results are shown in FIG. 3B.
  • “( ⁇ )” indicates the result of no treatment
  • “Reagent” indicates the result of not transfecting the double-stranded nucleic acid molecule (reagent only)
  • “siControl” indicates “ The results of the transfection of “siControl” are shown, and “siTMPO-AS1-1, 2, 3, 5, 7, 8, 10” represents “siTMPO-AS1-1, 2, 3, 5, 7, 8, 10 "shows the result of transfection.
  • Day 1 and “Day 5” show the results 1 day and 5 days after transfection, respectively.
  • “**” indicates “P ⁇ 0.01”. From the results shown in FIG. 3B, siTMPO-AS1-2 has the most excellent cell growth inhibitory ability, and then significantly suppresses cell proliferation in the order of siTMPO-AS1-1, 8, and 7 (P ⁇ 0.01). It became clear.
  • Test Example 3-3 Examination of target non-coding RNA expression suppression effect by double-stranded nucleic acid molecule
  • siTMPO-AS1-1, 2, 3, 5, 7, 8, or 10 was replaced with siTMPO-AS1-1 or 2, but MCF-7 was used as a breast cancer cell.
  • the inhibitory effect of each double-stranded nucleic acid molecule on the expression of TMPO-AS1 (SEQ ID NO: 1) in OHTR cells in the same manner as in Test Example 3-1, except that the cells were replaced with the following OHTR cells. (Knockdown effect) was examined.
  • the OHTR cells are tamoxifen resistant cells, which are a breast cancer treatment resistance model produced from the MCF-7 cells as follows. ⁇ Production of OHTR cells> By culturing the MCF-7 cells for 3 months or more in a DMEM medium containing 4-hydroxy tamoxifen (1 ⁇ M), an anti-estrogen agent, cells that have acquired resistance to 4-hydroxy tamoxifen (OHTR cells) are produced. did.
  • OHTR cells were prepared by using DMEM (Nacalai Tesque) containing 10% fetal bovine serum (FBS, Sigma), 100 ⁇ g / mL streptomycin, 100 U / mL penicillin (Invitrogen) as a cell culture medium. The cells were cultured at 37 ° C. in an incubator containing 5% carbon dioxide gas.
  • FIG. 3C The result of measuring the non-coding RNA expression level is shown in FIG. 3C.
  • “( ⁇ )” indicates the result of no treatment
  • “Reagent” indicates the result of not transfecting the double-stranded nucleic acid molecule (reagent only)
  • “siControl” indicates “ The results of transfection of “siControl”
  • “siTMPO-AS1-1, 2” show the results of transfection of “siTMPO-AS1-1, 2”, respectively. From the results of FIG. 3C, it was shown that both “siTMPO-AS1-1, 2” of the present invention suppress the expression of TMPO-AS1 in OHTR cells.
  • Test Example 3-4 In vitro cell growth inhibitory effect of double-stranded nucleic acid molecule
  • the point that siTMPO-AS1-1, 2, 3, 5, 7, 8, or 10 was used was replaced with siTMPO-AS1-1 or 2, and MCF-7 was used as a breast cancer cell.
  • FIG. 3D The results of the cell proliferation test are shown in FIG. 3D.
  • “( ⁇ )” indicates the result of no treatment
  • “Reagent” indicates the result of not transfecting the double-stranded nucleic acid molecule (reagent only)
  • “siControl” indicates “ The results of transfection of “siControl”
  • “siTMPO-AS1-1, 2” show the results of transfection of “siTMPO-AS1-1, 2”, respectively.
  • Day 1 and “Day 5” show the results 1 day and 5 days after transfection, respectively.
  • “**” indicates “P ⁇ 0.01”. From the results of FIG. 3D, it was revealed that siTMPO-AS1-1 and siTMPO-AS1-2 significantly suppressed cell proliferation (P ⁇ 0.01) than siControl.
  • Test Example 3-5 Examination of target non-coding RNA expression suppression effect by double-stranded nucleic acid molecule
  • MCF-7 cells were used as breast cancer cells in Test Example 3-3 except that Ishikawa cells as endometrial cancer cells were used.
  • the inhibitory effect (knockdown effect) on the expression of TMPO-AS1 (SEQ ID NO: 1) in Ishikawa cells by the strand nucleic acid molecule was examined.
  • FIG. 3E The result of measuring the non-coding RNA expression level is shown in FIG. 3E.
  • “( ⁇ )” indicates the result of no treatment
  • “Reagent” indicates the result of not transfecting the double-stranded nucleic acid molecule (reagent only)
  • “siControl” indicates “ The results of transfection of “siControl” are shown, and “siTMPO-AS1-1, 2” show the results of transfection of “siTMPO-AS1-1, 2”, respectively.
  • the results of FIG. 3E show that both “siTMPO-AS1-1 and 2” of the present invention suppress the expression of TMPO-AS1 in Ishikawa cells, and that siTMPO-AS1-2 is particularly effective. It was done.
  • Test Example 3-6 In vitro cell growth inhibitory effect of double-stranded nucleic acid molecule
  • MCF-7 cells were used as breast cancer cells in Test Example 3-4 instead of Ishikawa cells, which were endometrial cancer cells
  • the Ishikawa cell growth inhibitory effect (knockdown effect) of the strand nucleic acid molecule was examined.
  • the Ishikawa cells were cultured in the same manner as in Test Example 3-5.
  • FIG. 3F The results of the cell proliferation test are shown in FIG. 3F.
  • “( ⁇ )” indicates the result of no treatment
  • “Reagent” indicates the result of not transfecting the double-stranded nucleic acid molecule (reagent only)
  • “siControl” indicates “ The results of transfection of “siControl”
  • “siTMPO-AS1-1, 2” show the results of transfection of “siTMPO-AS1-1, 2”, respectively.
  • Day 1 and “Day 5” show the results 1 day and 5 days after transfection, respectively.
  • “**” indicates “P ⁇ 0.01”. From the results of FIG. 3F, it was revealed that siTMPO-AS1-1 and siTMPO-AS1-2 significantly suppressed cell proliferation (P ⁇ 0.01) than siControl.
  • Test Example 4-1 Examination of target non-coding RNA expression suppression effect by double-stranded nucleic acid molecule
  • the point where the target non-coding RNA was TMPO-AS1 (SEQ ID NO: 1) was replaced with COL18A1-ASx (SEQ ID NO: 2 to 4), and siTMPO-AS1-1, 2, 3, Expression of TMPO-AS1 (SEQ ID NO: 1) in quantitative real-time PCR in place of siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, or 9 instead of using 5, 7, 8, or 10 MCF-7 of each double-stranded nucleic acid molecule was measured in the same manner as in Test Example 3-1, except that the expression level of COL18A1-ASx (SEQ ID NOs: 2 to 4) was measured.
  • the inhibitory effect (knockdown effect) on the expression of COL18A1-ASx (SEQ ID NOs: 2 to 4) in cells was examined.
  • the primers for COL18A1-ASx (SEQ ID NOs: 2 to 4) used in the quantitative real-time PCR are as follows. -COL18A1-ASx (SEQ ID NO: 2 to 4)- COL18A1-ASx_FW: 5′-gccagggctcatctcctatg-3 ′ (SEQ ID NO: 48) COL18A1-ASx_RV: 5′-ggagatcagggagactggagact-3 ′ (SEQ ID NO: 49)
  • FIG. 4A The results are shown in FIG. 4A.
  • “( ⁇ )” indicates the result of no treatment
  • “Reagent” indicates the result of not transfecting the double-stranded nucleic acid molecule (reagent only)
  • “siControl” indicates “ The results of transfection of “siControl” are shown, and “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” represents “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” respectively. The result of the effect is shown. From the result of FIG.
  • “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” of the present invention shows the expression of COL18A1-ASx (SEQ ID NOs: 2 to 4) at the RNA level as compared with siControl. It became clear to suppress.
  • Test Example 4-2 In vitro cell growth inhibitory effect of double-stranded nucleic acid molecule
  • the point where siTMPO-AS1-1, 2, 3, 5, 7, 8, or 10 was used was replaced with siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, or 9.
  • the MCF-7 cell proliferation inhibitory effect (knockdown effect) of each double-stranded nucleic acid molecule was examined.
  • FIG. 4B The results are shown in FIG. 4B.
  • “( ⁇ )” indicates the result of no treatment
  • “Reagent” indicates the result of not transfecting the double-stranded nucleic acid molecule (reagent only)
  • “siControl” indicates “ The results of transfection of “siControl”
  • “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” represents “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” respectively.
  • the result of the effect is shown.
  • “Day 1” and “Day 5” show the results 1 day and 5 days after transfection, respectively.
  • “**” indicates “P ⁇ 0.01”.
  • siCOL18A1-ASx-2, 5, 6, 7, and 9 significantly suppressed cell proliferation (P ⁇ 0.01) more than siControl. Of these, it was revealed that siCOL18A1-ASx-5 is most excellent in cell growth inhibition ability.
  • Test Example 4-3 Examination of target non-coding RNA expression suppression effect by double-stranded nucleic acid molecule
  • MCF-7 cells were used as breast cancer cells in Test Example 4-1, except that they were replaced with OHTR cells prepared in the same manner as in Test Example 3-2.
  • the inhibitory effect (knockdown effect) on the expression of COL18A1-ASx (SEQ ID NOs: 2 to 4) in OHTR cells of each double-stranded nucleic acid molecule was examined.
  • FIG. 4C The result of measuring the non-coding RNA expression level is shown in FIG. 4C.
  • “( ⁇ )” indicates the result of no treatment
  • “Reagent” indicates the result of not transfecting the double-stranded nucleic acid molecule (reagent only)
  • “siControl” indicates “ The results of transfection of “siControl” are shown, and “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” represents “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” respectively.
  • the result of the effect is shown. From the results in FIG. 4C, “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” of the present invention all suppress the expression of COL18A1-ASx (SEQ ID NOs: 2 to 4) in OHTR cells. It was shown that.
  • Test Example 4-4 In vitro cell growth inhibitory effect of double-stranded nucleic acid molecule
  • MCF-7 cells were used as breast cancer cells in Test Example 4-2 except that they were replaced with OHTR cells prepared in the same manner as in Test Example 3-2.
  • the OHTR cell proliferation inhibitory effect (knockdown effect) of each double-stranded nucleic acid molecule was examined.
  • FIG. 4D The results of the cell proliferation test are shown in FIG. 4D.
  • “( ⁇ )” indicates the result of no treatment
  • “Reagent” indicates the result of not transfecting the double-stranded nucleic acid molecule (reagent only)
  • “siControl” indicates “ The results of transfection of “siControl”
  • “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” represents “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” respectively.
  • the result of the effect is shown.
  • “Day 1” and “Day 5” show the results 1 day and 5 days after transfection, respectively.
  • “**” indicates “P ⁇ 0.01”. From the results of FIG. 4D, it was revealed that siCOL18A1-ASx-1, 2, 5 significantly suppressed cell proliferation (P ⁇ 0.01) more than siControl.
  • Test Example 4-5 Investigation of target non-coding RNA expression suppression effect by double-stranded nucleic acid molecule
  • MCF-7 cells were used as breast cancer cells in Test Example 4-1
  • the cells were replaced with Ishikawa cells that were endometrial cancer cells.
  • the inhibitory effect (knockdown effect) on the expression of COL18A1-ASx (SEQ ID NOs: 2 to 4) in Ishikawa cells by strand nucleic acid molecules was examined.
  • the Ishikawa cells were cultured in the same manner as in Test Example 3-5.
  • FIG. 4E The result of measuring the non-coding RNA expression level is shown in FIG. 4E.
  • “( ⁇ )” indicates the result of no treatment
  • “Reagent” indicates the result of not transfecting the double-stranded nucleic acid molecule (reagent only)
  • “siControl” indicates “ The results of transfection of “siControl” are shown, and “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” represents “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” respectively.
  • the result of the effect is shown. From the results of FIG. 4E, all of “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” of the present invention suppress the expression of COL18A1-ASx (SEQ ID NOs: 2 to 4) in Ishikawa cells. It was shown that.
  • Test Example 4-6 In vitro cell growth inhibitory effect of double-stranded nucleic acid molecule
  • MCF-7 cells were used as breast cancer cells in Test Example 4-2 except that Ishikawa cells as endometrial cancer cells were used.
  • the Ishikawa cell growth inhibitory effect (knockdown effect) of the strand nucleic acid molecule was examined.
  • the Ishikawa cells were cultured in the same manner as in Test Example 3-5.
  • FIG. 4F The results of the cell proliferation test are shown in FIG. 4F.
  • “( ⁇ )” indicates the result of no treatment
  • “Reagent” indicates the result of not transfecting the double-stranded nucleic acid molecule (reagent only)
  • “siControl” indicates “ The results of transfection of “siControl”
  • “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” represents “siCOL18A1-ASx-1, 2, 5, 6, 7, 9” respectively.
  • the result of the effect is shown.
  • “Day 1” and “Day 5” show the results 1 day and 5 days after transfection, respectively.
  • “**” indicates “P ⁇ 0.01”. From the results of FIG. 4F, it was revealed that siCOL18A1-ASx-1, 5, 6, 7, and 9 significantly suppress cell proliferation (P ⁇ 0.01) more than siControl.
  • tumor cells human breast cancer cell line MCF-7 cells were used.
  • mouse As the mouse, a female 8-week-old nude mouse (BALB / cAJcl-nu / nu) purchased from CLEA Japan was used.
  • the MCF-7 cells were prepared in 75 ⁇ L of DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) so as to be 4 ⁇ 10 6 per nude mouse, and further mixed with 75 ⁇ L of Matrigel (manufactured by BD bioscience). The mixture was injected subcutaneously into mice.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • RNAi MAX RNAi MAX
  • Mouse tumor size was measured twice a week.
  • the tumor volume was measured at two locations, the major axis (r1) and the minor axis (r2, r3). (Mm) ⁇ / 2].
  • FIG. 5A is a diagram showing the state of a typical tumor taken 6 weeks after the start of administration of double-stranded nucleic acid molecules (upper: administered siControl, middle: administered siTMPO-AS1-2, lower: siCOL18A1-ASx- 5).
  • FIG. 5B is a graph showing changes in tumor volume.
  • “*” represents p ⁇ 0.05. From the results shown in FIGS. 5A and 5B, it was revealed that administration of siTMPO-AS1-2 or siCOL18A1-ASx-5 significantly suppressed the growth of tumors derived from MCF-7 cells in mice.
  • MCF-7 cells which are human breast cancer cell lines were used.
  • DMEM fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin 100 U / mL penicillin (manufactured by Invitrogen) was used as a cell culture solution.
  • the cells were cultured at 37 ° C. in an incubator containing 5% carbon dioxide gas in the air.
  • Cell migration test In the cell migration test, cells were placed in a culture chamber (Cell Culture Insert with 8.0- ⁇ m pore size PET filter (manufactured by BD bioscience)) at 50,000 cells / hole 2 or 3 days after transfection. Seeded at concentration and further incubated for 3 days. Thereafter, the culture chamber was fixed with methanol, stained with Giemsa staining solution, and the cells that passed through the filter of the culture chamber were measured by measuring at least 5 visual fields under a microscope.
  • FIG. 6A The results are shown in FIG. 6A.
  • TF ( ⁇ ) indicates the result of no treatment
  • siControl indicates the result of transfection of “siControl”
  • siTMPO-AS1-1, 2 indicates “siTMPO”.
  • -AS1-1, 2 transfection results are shown.
  • ** indicates “p ⁇ 0.01”. From the results shown in FIG. 6A, it is clear that MCF-7 cells treated with siTMPO-AS1-1 or 2 have a smaller cell migration number than MCF-7 cells treated with siControl as a control. This single-stranded nucleic acid molecule has been shown to suppress cancer cell migration.
  • Test Example 6-2 In vitro cell migration inhibitory effect of double-stranded nucleic acid molecule
  • siTMPO-AS1-1 or 2 was replaced with siCOL18A1-ASx-1 or 5 in Test Example 6-1.
  • the cell migration inhibitory effect of the strand nucleic acid molecule was examined.
  • FIG. 6B The results are shown in FIG. 6B.
  • TF ( ⁇ ) indicates the result of no treatment
  • siControl indicates the result of transfection of “siControl”
  • siCOL18A1-ASx-1, 5 indicates “siCOL18A1”, respectively.
  • -ASx-1, 5 "transfection results are shown.
  • “*” Indicates “P ⁇ 0.05”, and “**” indicates “P ⁇ 0.01”. From the result of FIG. 6B, it is clear that MCF-7 cells treated with siCOL18A1-ASx-1 or 5 have a smaller number of cell migration than MCF-7 cells treated with siControl as a control. This single-stranded nucleic acid molecule has been shown to suppress cancer cell migration.
  • OHTR cells which are tamoxifen resistant cells, which are a model for treatment of breast cancer.
  • the OHTR cells were produced in the same manner as in Test Example 3-3.
  • mouse As the mouse, a female 8-week-old nude mouse (BALB / cAJcl-nu / nu) purchased from CLEA Japan was used.
  • OHTR cells [Subcutaneous transplantation of tumor cells]
  • the OHTR cells were adjusted to 75 ⁇ L of DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) so that there were 20,000,000 cells per nude mouse, and further mixed with 75 ⁇ L of Matrigel (manufactured by BD bioscience). The mixture was injected subcutaneously into mice.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • RNAi MAX RNAi MAX
  • Mouse tumor size was measured twice a week.
  • the tumor volume was measured at two locations, the major axis (r1) and the minor axis (r2, r3). (Mm) ⁇ / 2].
  • FIG. 7A is a diagram showing the state of a representative tumor taken 6 weeks after the start of administration of double-stranded nucleic acid molecules (upper left: administered siControl, lower left: administered siCOL18A1-ASx-1, upper right: siCOL18A1-ASx- 5 is administered, lower right: siTMPO-AS1-2 is administered).
  • FIGS. 7A and 7B reveal that administration of siTMPO-AS1-2, siCOL18A1-ASx-1, or siCOL18A1-ASx-5 significantly suppresses the growth of tumors derived from OHTR cells in mice. It was.
  • TMPO-AS1 and COL18A1-ASx identified as new non-coding RNA using breast cancer cell MCF-7 according to Test Example 1 to Test Example 7 described above are those other than breast cancer cells other than MCF-7 cells and those other than breast cancer. It was also expressed in cancer-derived cells, and the expression was also revealed by analysis using clinical samples of breast cancer. Therefore, it was suggested that TMPO-AS1 and COL18A1-ASx are involved in various cancers including breast cancer clinically.
  • double-stranded nucleic acid molecules having a high knockdown effect with respect to TMPO-AS1 and COL18A1-ASx were obtained. It was confirmed that the double-stranded nucleic acid molecule suppresses cell proliferation in MCF-7 cells, OHTR cells which are a model for treatment of breast cancer, and Ishikawa cells derived from endometrial cancer. Even if the double-stranded nucleic acid molecule has the same sequence, the difference in the effect between cells seems to be due to the difference in transfection efficiency and gene expression level.
  • siTMPO-AS1-2 and siCOL18A1-ASx-5 which were excellent in the expression suppression efficiency of non-coding RNA and the cell growth suppression effect, showed a remarkable tumor growth suppression effect. Therefore, double-stranded nucleic acid molecules that have been confirmed to have effects at other cellular levels are also considered useful for cancer treatment.
  • the double-stranded nucleic acid molecule of the present invention has been shown to suppress the migration of breast cancer cells. Furthermore, the double-stranded nucleic acid molecule was also confirmed to suppress tumor growth in mice transplanted with treatment resistant breast cancer cells.
  • the non-coding RNA has a function of promoting tumor growth in various cancers including breast cancer including hormone therapy-resistant breast cancer, and can be a molecular target for breast cancer treatment and diagnosis. Furthermore, inhibitors of the expression of these non-coding RNAs, particularly siRNA, have a growth-suppressing effect on various cancer cells including breast cancer cells including hormone therapy-resistant breast cancer cells and can be clinically applied to the treatment of these cancers. It is.
  • the double-stranded nucleic acid molecule targeting the non-coding RNA can be a new therapeutic molecule target having a different action mechanism from existing breast cancer therapeutic agents against HER2 and estrogen action.
  • a double-stranded nucleic acid molecule for suppressing the expression of non-coding RNA is (A) a sense strand comprising a nucleotide sequence corresponding to the target sequence represented by any of SEQ ID NOs: 5-11 and 26-31; (B) an antisense strand comprising a nucleotide sequence complementary to the sense strand forming a double strand with the sense strand of (a),
  • the non-coding RNA is a double-stranded nucleic acid molecule comprising at least one of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 and a part thereof.
  • ⁇ 2> The sense strand, wherein the sense strand includes a nucleotide sequence corresponding to a target sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 27, 28, 29, 30, and ⁇
  • ⁇ 3> The two strands according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 2>, wherein the sense strand is a sense strand including a nucleotide sequence corresponding to the target sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6 and 28 A strand nucleic acid molecule.
  • ⁇ 4> The double-stranded nucleic acid molecule according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, which is either a double-stranded RNA or a double-stranded RNA-DNA chimera.
  • ⁇ 5> The double-stranded nucleic acid molecule according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the double-stranded nucleic acid molecule is any of siRNA and chimeric siRNA.
  • ⁇ 6> The double-stranded nucleic acid molecule according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, which is an siRNA.
  • ⁇ 7> DNA comprising a nucleotide sequence encoding the double-stranded nucleic acid molecule according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>.
  • a vector comprising the DNA according to ⁇ 7>.
  • ⁇ 9> At least one of the double-stranded nucleic acid molecule according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, the DNA according to ⁇ 7>, and the vector according to ⁇ 8>.
  • ⁇ 11> The cancer cell proliferation inhibitor according to ⁇ 10>, wherein the breast cancer cells are hormone therapy-resistant breast cancer cells.
  • ⁇ 12> A method for inhibiting the proliferation of cancer cells, comprising causing the cancer cell proliferation inhibitor according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 11> to act on cancer cells.
  • ⁇ 13> The method for inhibiting the growth of cancer cells according to ⁇ 12>, wherein the cancer cells are breast cancer cells.
  • ⁇ 14> The method according to ⁇ 13>, wherein the breast cancer cells are hormone therapy-resistant breast cancer cells.
  • ⁇ 15> at least one of the double-stranded nucleic acid molecule according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, the DNA according to ⁇ 7>, and the vector according to ⁇ 8>. It is a cancer cell migration inhibitor.
  • ⁇ 16> The cancer cell migration inhibitor according to ⁇ 15>, wherein the cancer cell is a breast cancer cell.
  • ⁇ 17> The cancer cell migration inhibitor according to ⁇ 16>, wherein the breast cancer cells are hormone therapy resistant breast cancer cells.
  • a method for inhibiting cancer cell migration comprising causing the cancer cell migration inhibitor according to any one of ⁇ 15> to ⁇ 17> to act on a cancer cell.
  • ⁇ 19> The cancer cell migration suppression method according to ⁇ 18>, wherein the cancer cell is a breast cancer cell.
  • ⁇ 20> The method according to ⁇ 19>, wherein the breast cancer cells are hormone therapy-resistant breast cancer cells.
  • ⁇ 21> A medicament for preventing or treating cancer, the cancer cell proliferation inhibitor according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 11>, and any one of ⁇ 15> to ⁇ 17>
  • a pharmaceutical comprising at least one of the cancer cell migration inhibitors.
  • ⁇ 22> The medicament according to ⁇ 21>, wherein the cancer is breast cancer.
  • ⁇ 23> The pharmaceutical according to ⁇ 22>, wherein the breast cancer is hormone therapy-resistant breast cancer.
  • ⁇ 24> A method for preventing or treating cancer, comprising administering the pharmaceutical according to any one of ⁇ 21> to ⁇ 23> to an individual.
  • ⁇ 25> The cancer prevention or treatment method according to ⁇ 24>, wherein the cancer is breast cancer.
  • ⁇ 27> The cancer prevention or treatment method according to ⁇ 25>, wherein the breast cancer is hormone therapy-resistant breast cancer.

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Abstract

　（ａ）配列番号：５～１１、及び２６～３１のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖と二本鎖を形成する該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含み、配列番号：１～４で表される塩基配列及びその一部の少なくともいずれかを含む非コードＲＮＡの発現を抑制するための二本鎖核酸分子などである。

Description

二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、ベクター、癌細胞増殖抑制剤、癌細胞移動抑制剤、及び医薬
　本発明は、癌の予防乃至治療に好適に用いることができる二本鎖核酸分子、該二本鎖核酸分子を含むＤＮＡ及びベクター、該二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含む癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤、並びに該癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤の少なくともいずれかを含む医薬に関する。
　癌の中で、乳癌は女性が罹患する最も頻度の高い癌であり、食生活の欧米化及び人口の高齢化に伴い、患者数は近年増加し続けている。
　乳癌の治療技術として、臨床的には、乳腺摘出術を始めとする外科的治療、抗癌剤による化学療法、及び放射線治療が広く応用されている。
　乳腺上皮は、女性ホルモンであるエストロゲンの作用により増殖するため、エストロゲン受容体陽性の乳癌においても、エストロゲン依存性に増殖が刺激される。そのため、一般に、エストロゲン感受性が予想されるエストロゲン受容体陽性又はプロゲステロン受容体陽性の腫瘍に対しては、抗エストロゲン薬や、エストロゲン産生阻害をもたらすアロマターゼ阻害薬によるホルモン療法が行われている。また、進行乳癌においてもホルモン療法が行われている。
　一方、当初ホルモン療法に有効性が認められる乳癌であっても、治療過程において耐性を獲得することが問題となっている（例えば、非特許文献１参照）。その原因として、エストロゲン枯渇状態後に起こりうるエストロゲン受容体の過剰発現や活性化、本来エストロゲン受容体標的因子であって癌増殖をもたらす分子の作用が耐性獲得後も増強するなどが考えられている。
　よって、エストロゲンシグナルの下流分子であって、特に癌増殖に結びつく因子を標的とした治療は、従来のホルモン療法に代わる効果的な治療技術として期待されている。
　しかしながら、ホルモン療法耐性の詳細な分子メカニズムは未だ明らかではなく、耐性獲得後の乳癌及び治療抵抗性乳癌に対する十分な治療法は、未だ開発されていない。
　また、エストロゲン受容体陰性乳癌のうち、増殖因子のＨＥＲ２分子が陽性の腫瘍に対しては、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体療法などの分子標的療法も行われている。しかし、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性、ＨＥＲ２陰性の乳癌に対しては、有効な治療法がないのが現状である。
　以上のように、従来の治療技術だけでは限界があり、従来の乳癌治療技術に対して有効性が認められない難治性乳癌を含む乳癌を抑制する方法の速やかな開発が強く求められているのが現状である。
　また、乳癌以外の癌についても、癌を抑制する方法の速やかな開発が強く求められているのが現状である。
Ｍｕｓｇｒｏｖｅ　ＥＡ，　Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ　ＲＬ．　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ．　Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｃａｎｃｅｒ．　９：６３１－６４３，　２００９
　本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、配列番号：１～４で表される塩基配列及びその一部の少なくともいずれかを含む非コードＲＮＡを標的として、これらの非コードＲＮＡの発現を抑制することにより、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができ、癌の予防乃至治療に好適に用いることができる二本鎖核酸分子、該二本鎖核酸分子を含むＤＮＡ及びベクター、該二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含む癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤、並びに該癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤の少なくともいずれかを含む医薬を提供することを目的とする。
　前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞　非コードＲＮＡの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
　前記二本鎖核酸分子が、
（ａ）配列番号：５～１１、及び２６～３１のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖と二本鎖を形成する該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含み、
　前記非コードＲＮＡが、配列番号：１～４で表される塩基配列及びその一部の少なくともいずれかを含むことを特徴とする二本鎖核酸分子である。
＜２＞　前記＜１＞に記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡである。
＜３＞　前記＜２＞に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクターである。
＜４＞　前記＜１＞に記載の二本鎖核酸分子、前記＜２＞に記載のＤＮＡ、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞増殖抑制剤である。
＜５＞　癌細胞に、前記＜４＞に記載の癌細胞増殖抑制剤を作用させることを特徴とする癌細胞の増殖抑制方法である。
＜６＞　前記＜１＞に記載の二本鎖核酸分子、前記＜２＞に記載のＤＮＡ、及び前記＜３＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞移動抑制剤である。
＜７＞　癌細胞に、前記＜６＞に記載の癌細胞移動抑制剤を作用させることを特徴とする癌細胞の移動抑制方法である。
＜８＞　癌を予防乃至治療するための医薬であって、前記＜４＞に記載の癌細胞増殖抑制剤、及び前記＜６＞に記載の癌細胞移動抑制剤の少なくともいずれかを含むことを特徴とする医薬である。
＜９＞　個体に、前記＜８＞に記載の医薬を投与することを特徴とする癌の予防乃至治療方法である。
　本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、配列番号：１～４で表される塩基配列及びその一部の少なくともいずれかを含む非コードＲＮＡを標的として、これらの非コードＲＮＡの発現を抑制することにより、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができ、癌の予防乃至治療に好適に用いることができる二本鎖核酸分子、該二本鎖核酸分子を含むＤＮＡ及びベクター、該二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含む癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤、並びに該癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤の少なくともいずれかを含む医薬を提供することができる。
図１Ａは、試験例２－１－１におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現を解析した結果を示す図である。 図１Ｂは、試験例２－１－２におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現を解析した結果を示す図である。 図１Ｃは、試験例２－１－３におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現を解析した結果を示す図である。 図１Ｄは、試験例２－１－４におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現を解析した結果を示す図である。 図１Ｅは、試験例２－１－５におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現を解析した結果を示す図である。 図２Ａは、試験例２－２－１におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現を解析した結果を示す図である。 図２Ｂは、試験例２－２－２におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現を解析した結果を示す図である。 図２Ｃは、試験例２－２－３におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現を解析した結果を示す図である。 図２Ｄは、試験例２－２－４におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現を解析した結果を示す図である。 図２Ｅは、試験例２－２－５におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現を解析した結果を示す図である。 図３Ａは、試験例３－１におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１（配列番号：１）の発現レベルの結果を示すグラフである。 図３Ｂは、試験例３－２の細胞増殖試験の結果を示すグラフである。 図３Ｃは、試験例３－３におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１（配列番号：１）の発現レベルの結果を示すグラフである。 図３Ｄは、試験例３－４の細胞増殖試験の結果を示すグラフである。 図３Ｅは、試験例３－５におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１（配列番号：１）の発現レベルの結果を示すグラフである。 図３Ｆは、試験例３－６の細胞増殖試験の結果を示すグラフである。 図４Ａは、試験例４－１におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ（配列番号：２～４）の発現レベルの結果を示すグラフである。 図４Ｂは、試験例４－２の細胞増殖試験の結果を示すグラフである。 図４Ｃは、試験例４－３におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ（配列番号：２～４）の発現レベルの結果を示すグラフである。 図４Ｄは、試験例４－４の細胞増殖試験の結果を示すグラフである。 図４Ｅは、試験例４－５におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ（配列番号：２～４）の発現レベルの結果を示すグラフである。 図４Ｆは、試験例４－６の細胞増殖試験の結果を示すグラフである。 図５Ａは、試験例５で撮影した代表的な腫瘍の状態を示す図である。 図５Ｂは、試験例５における腫瘍体積の推移を示すグラフである。 図６Ａは、試験例６－１の細胞移動試験の結果を示すグラフである。 図６Ｂは、試験例６－２の細胞移動試験の結果を示すグラフである。 図７Ａは、試験例７で撮影した代表的な腫瘍の状態を示す図である。 図７Ｂは、試験例７における腫瘍体積の推移を示すグラフである。
（二本鎖核酸分子）
　本発明の二本鎖核酸分子は、非コードＲＮＡの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、（ａ）配列番号：５～１１、及び２６～３１のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖と二本鎖を形成する該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含むことを特徴とする。
　なお、本発明において「二本鎖核酸分子」とは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖の核酸分子をいう。
＜非コードＲＮＡ＞
　前記非コードＲＮＡは、配列番号：１～４で表される塩基配列及びその一部の少なくともいずれかを含む。
　前記非コードＲＮＡは、後述する試験例で示すように、エストロゲン依存性に発現誘導される。
－ＴＭＰＯ－ＡＳ１－
　前記配列番号：１で表される塩基配列は、ＴＭＰＯ－ＡＳ１の塩基配列である。前記ＴＭＰＯ－ＡＳ１は、ＴＭＰＯ（ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｎ）遺伝子のアンチセンス転写物と考えられる。
　前記ＴＭＰＯ－ＡＳ１の配列情報は、ＲｅｆＳｅｑデータベース（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄａｔａｂａｓｅ）などの公共のデータベースを通じて容易に入手することができる。前記配列番号：１で表される塩基配列は、ＲｅｆＳｅｑデータベースにおいて、「Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＴＭＰＯ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　１（ＴＭＰＯ－ＡＳ１），　ｌｏｎｇ　ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ」として登録されており（ＮＲ＿０２７１５７．１；ｇｉ　２２４５４８９４８）、ＲＮＡ長が３，１６１ｂｐ、ゲノム位置がｃｈｒ１２：９８９０６７５１－９８９１０００４（ｈｇ１９）である。
－ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－
　前記配列番号：２～４で表される塩基配列は、ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの塩基配列である。前記ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘは、ＣＯＬ１８Ａ１遺伝子のアンチセンス転写物であるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳ２の近傍でＣＯＬ１８Ａ１の転写開始点のすぐ上流にアンチセンス方向に位置し、かつエストロゲン受容体α結合領域上に存在する。
　前記ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの配列情報は、ＲｅｆＳｅｑデータベース（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄａｔａｂａｓｅ）などの公共のデータベースを通じて容易に入手することができる。
　前記ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘは、ＲｅｆＳｅｑデータベースに「Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ＬＯＣ１０１９２８７４５」として、以下の３種類のバリアント体が登録されている。
（１）ＬＯＣ１０１９２８７４５，　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　Ｘ１，　ｎｃＲＮＡ（ＸＲ＿２５４０５０．１；ｇｉ　５３０４３８８０３）
　推定ＲＮＡ長が７４６ｂｐ（配列番号：２参照）、ゲノム位置がｃｈｒ２１：４６８２３７２４－４６８２５３３２である。
（２）ＬＯＣ１０１９２８７４５，　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　Ｘ２，　ｎｃＲＮＡ（ＸＲ＿２５４０５１．１；ｇｉ　５３０４３８８０４）
　推定ＲＮＡ長が１，１２１ｂｐ（配列番号：３参照）、ゲノム位置がｃｈｒ２１：４６８２３７２４－４６８２６２５３である。
（３）ＬＯＣ１０１９２８７４５，　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　Ｘ３，　ｍｉｓｃ＿ＲＮＡ（ＸＲ＿２５４０５２．１；ｇｉ　５３０４３８８０５）
　推定ＲＮＡ長が８０６ｂｐ（配列番号：４参照）、ゲノム位置がｃｈｒ２１：４６８２３７２４－４６８２４８４５である。
　なお、後述する試験例で示すように、前記ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘは、ＲＮＡシーケンスにおいて、配列番号：２の１７０番目～７４６番目の領域、配列番号：３の５４５番目～１，１２１番目の領域、又は配列番号：４の２３０番目～８０６番目の領域の発現が確認された。
　そのため、前記非コードＲＮＡは、前記配列番号：２～４で表される塩基配列の一部である、配列番号：２の１７０番目～７４６番目の領域、配列番号：３の５４５番目～１，１２１番目の領域、又は配列番号：４の２３０番目～８０６番目の領域を含むものであってもよい。
　本発明では、前記配列番号：１～４で表される塩基配列及びその一部の少なくともいずれかを含む非コードＲＮＡが、前記二本鎖核酸分子の標的となり、前記二本鎖核酸分子によってその発現が抑制されることから、本明細書中において前記非コードＲＮＡを、前記二本鎖核酸分子の「標的ＲＮＡ」と称することがある。
　前記配列番号：１～４で表される塩基配列及びその一部の少なくともいずれかを含む非コードＲＮＡは、前記配列番号：１～４で表される塩基配列及びその一部の少なくともいずれかからなるものであってもよい。
＜センス鎖、アンチセンス鎖＞
　本発明者らは、鋭意検討の結果、前記配列番号：１～４で表される塩基配列及びその一部の少なくともいずれかを含む非コードＲＮＡ配列の中でも、ある特定の標的配列（配列番号：５～１１、及び２６～３１のいずれか）に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子が、前記非コードＲＮＡに対して顕著に優れた発現抑制効果を有することを見出した。したがって、本発明の二本鎖核酸分子は、（ａ）配列番号：５～１１、及び２６～３１のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖と二本鎖を形成する該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含むものである。
　ここで、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ鎖であってもよいし、ＲＮＡ－ＤＮＡキメラ鎖であってもよい。前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とは、互いにハイブリダイズすることで前記二本鎖核酸分子を形成することができる。
　なお、前記配列番号：５～１１、及び２６～３１のうち、配列番号：５～１１は前記ＴＭＰＯ－ＡＳ１の一部であり、配列番号：２６～３１は前記ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの一部である。
　前記二本鎖核酸分子の中でも、前記センス鎖が、配列番号：５、６、９、１０、２７、２８、２９、３０、及び３１のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であることが好ましく、配列番号：６、及び２８のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であることがより好ましい。
　前記センス鎖が、前記好ましいセンス鎖であると、前記二本鎖核酸分子の使用量が少量であっても、前記標的ＲＮＡに対する強い発現抑制効果が得られる点で、有利である。
　なお、前記二本鎖核酸分子におけるセンス鎖は、前記所定の配列番号の標的配列に対応するヌクレオチド配列を含んでいればよく、その他のヌクレオチド配列を含んでいてもよいが、前記所定の配列番号の標的配列に対応するヌクレオチド配列からなることが好ましい。
　また、前記二本鎖核酸分子におけるアンチセンス鎖は、前記センス鎖とハイブリダイズすることができる程度に相補的なヌクレオチド配列を含んでいればよく、その他のヌクレオチド配列を含んでいてもよいが、前記センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を７０％以上含むことが好ましく、８０％以上含むことがより好ましく、９０％以上含むことが特に好ましい。
＜種類＞
　前記二本鎖核酸分子の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ－ＤＮＡキメラなどが挙げられる。これらの中でも、二本鎖ＲＮＡが好ましい。
　ここで、「二本鎖ＲＮＡ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいい、「二本鎖ＲＮＡ－ＤＮＡキメラ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがＲＮＡとＤＮＡとのキメラ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいう。
　前記二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）であることが特に好ましい。ここで、ｓｉＲＮＡとは、１８塩基長～２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖）と相補的な配列をもつ標的ＲＮＡを切断し、標的ＲＮＡの発現を抑制する機能を有する。
　前記ｓｉＲＮＡは、前記したようなセンス鎖及びアンチセンス鎖を有し、かつ前記標的ＲＮＡの発現を抑制し得るものであれば、その末端構造に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｓｉＲＮＡは、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。中でも、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端が２塩基～６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。
　前記ｓｉＲＮＡの具体例としては、配列番号：１２と配列番号：１３とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：１４と配列番号：１５とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：１６と配列番号：１７とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：１８と配列番号：１９とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：２０と配列番号：２１とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：２２と配列番号：２３とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：２４と配列番号：２５とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３２と配列番号：３３とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３４と配列番号：３５とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３６と配列番号：３７とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３８と配列番号：３９とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４０と配列番号：４１とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４２と配列番号：４３とからなるｓｉＲＮＡなどが挙げられる。
　これらの中でも、配列番号：１２と配列番号：１３とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：１４と配列番号：１５とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：２０と配列番号：２１とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：２２と配列番号：２３とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３４と配列番号：３５とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３６と配列番号：３７とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３８と配列番号：３９とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４０と配列番号：４１とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：４２と配列番号：４３とからなるｓｉＲＮＡが好ましく、配列番号：１４と配列番号：１５とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号：３６と配列番号：３７とからなるｓｉＲＮＡがより好ましい。
　また、前記二本鎖ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）であってもよい。ここで、ｓｈＲＮＡとは、１８塩基～２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３塩基～９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであるが、ｓｈＲＮＡは、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ　ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的ＲＮＡの発現抑制に機能することができる。
　前記ｓｈＲＮＡの末端構造としても、前記ｓｉＲＮＡ同様、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
　また、前記二本鎖ＲＮＡ－ＤＮＡキメラは、キメラｓｉＲＮＡであることが特に好ましい。ここで、キメラｓｉＲＮＡとは、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ配列の一部がＤＮＡに変換された、１８塩基長～２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ－ＤＮＡキメラをいう。中でも、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’側の８塩基、及び、アンチセンス鎖の５’側の６塩基がＤＮＡに変換された、２１塩基長～２３塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡ－ＤＮＡキメラであることが好ましい。前記キメラｓｉＲＮＡは、前記ｓｉＲＮＡと同様に、標的ＲＮＡの発現を抑制する機能を有する。なお、前記キメラｓｉＲＮＡには、ＤＮＡに変換された配列の一部をＲＮＡに再度変換した態様も含まれる。
　前記キメラｓｉＲＮＡの末端構造としても、前記ｓｉＲＮＡ同様、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。
　前記キメラｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ－ＤＮＡキメラ）は、血中安定性が高い、免疫応答誘導性が低い、製造コストが低いなどの点で、有利である。
＜修飾＞
　また、前記二本鎖核酸分子は、目的に応じて、適宜修飾を有していてもよい。例えば、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を付与し、培養液中や生体中における安定性を向上させる等の目的から、前記二本鎖核酸分子に、２’Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ化修飾や、ホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）修飾等を施すことができる。また、例えば、細胞への導入効率を高める等の目的から、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともできる。なお、前記二本鎖核酸分子にこのような修飾を施す方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。
＜入手方法＞
　前記二本鎖核酸分子の入手方法としては、特に制限はなく、それぞれ従来公知の手法に基づき作製することができる。
　例えば、前記ｓｉＲＮＡは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とに相当する１８塩基長～２９塩基長の一本鎖ＲＮＡを、それぞれ既存のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置等を利用して化学的に合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる。また、アニーリング済の二本鎖ｓｉＲＮＡの市販品を入手することもできるし、ｓｉＲＮＡ合成受託会社に合成を依頼することにより入手することもできる。また、後述する本発明のベクターのような、所望のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用してｓｉＲＮＡを作製することもできる。
　また、前記キメラｓｉＲＮＡは、例えば、キメラ核酸分子であるセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ化学合成し、それらをアニーリングすることにより、作製することができる。
（ＤＮＡ、ベクター）
　本発明のＤＮＡは、前記した本発明の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであり、また、本発明のベクターは、前記ＤＮＡを含むベクターである。
＜ＤＮＡ＞
　前記ＤＮＡとしては、前記した本発明の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の上流（５’側）に、前記二本鎖核酸分子の転写を制御するためのプロモーター配列が連結されていることが好ましい。前記プロモーター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＭＶプロモーター等のｐｏｌ　ＩＩ系プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター等のｐｏｌ　ＩＩＩ系プロモーターなどが挙げられる。
　また、更に、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の下流（３’側）に、前記二本鎖核酸分子の転写を終結させるためのターミネーター配列が連結されていることがより好ましい。前記ターミネーター配列としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記プロモーター配列、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列、及び前記ターミネーター配列を含む転写ユニットは、前記ＤＮＡにおける好ましい一態様である。なお、前記転写ユニットは、従来公知の手法を用いて構築することができる。
＜ベクター＞
　前記ベクターとしては、前記ＤＮＡを含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。前記ベクターは、前記二本鎖核酸分子を発現可能な発現ベクターであることが好ましい。
　前記二本鎖核酸分子の発現様式としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば二本鎖核酸分子としてｓｉＲＮＡを発現させる方法として、短い一本鎖ＲＮＡを二本発現させる方法（タンデム型）、ｓｈＲＮＡとしての一本鎖ＲＮＡを発現させる方法（ヘアピン型）等が挙げられる。
　前記タンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを含み、かつ、各鎖をコードするＤＮＡ配列の上流（５’側）にプロモーター配列がそれぞれ連結され、また、各鎖をコードするＤＮＡ配列の下流（３’側）にターミネーター配列がそれぞれ連結されたＤＮＡを含む。
　また、前記ヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とが逆向きに配置され、前記センス鎖ＤＮＡ配列とアンチセンス鎖ＤＮＡ配列とがループ配列を介して接続されており、かつ、それらの上流（５’側）にプロモーター配列が、また、下流（３’側）にターミネーター配列が連結されたＤＮＡを含む。
　前記各ベクターは、従来公知の手法を用いて構築することができ、例えば、前記ＤＮＡを、予め制限酵素で切断したベクターの切断部位に連結（ライゲーション）することにより構築することができる。
　前記ＤＮＡ又は前記ベクターを細胞に導入（トランスフェクト）することにより、プロモーターが活性化され、前記二本鎖核酸分子を生成することができる。例えば、前記タンデム型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、センス鎖及びアンチセンス鎖が生成され、それらがハイブリダイズすることによりｓｉＲＮＡが生成される。前記ヘアピン型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、まずヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が生成され、次いで、ダイサーによるプロセシングにより、ｓｉＲＮＡが生成される。
（癌細胞増殖抑制剤）
　本発明の癌細胞増殖抑制剤は、癌細胞の増殖を抑制するための癌細胞増殖抑制剤（「腫瘍増殖抑制剤」と称することがある）であり、前記した本発明の二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
＜二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、ベクター＞
　前記二本鎖核酸分子の詳細としては、前記した本発明の二本鎖核酸分子の項目に記載した通りである。前記二本鎖核酸分子は、標的とする前記非コードＲＮＡの少なくともいずれかの発現を効果的に抑制することができるので、癌細胞の増殖を抑制するための前記癌細胞増殖抑制剤の有効成分として好適である。また、前記ＤＮＡ、ベクターの詳細としても、前記した本発明のＤＮＡ、ベクターの項目に記載した通りである。
　前記癌細胞増殖抑制剤中の前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記癌細胞増殖抑制剤としては、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかそのものであってもよい。
＜その他の成分＞
　前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを所望の濃度に希釈するための生理食塩水、培養液等の希釈用剤や、対象とする細胞内に前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを導入（トランスフェクト）するためのトランスフェクション試薬などが挙げられる。
　前記癌細胞増殖抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜癌細胞＞
　前記癌細胞増殖抑制剤の適用対象となる癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳癌細胞、子宮内膜癌細胞、子宮頸癌細胞、前立腺癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、骨肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞などが挙げられる。これらの中でも、乳癌細胞が好ましく、ホルモン療法抵抗性の乳癌細胞がより好ましい。
　前記癌細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、また、癌を患う患者の体内に存在する細胞であってもよい。
　これらの細胞は、例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）や、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手することができる。
＜作用＞
　前記癌細胞増殖抑制剤は、例えば、癌細胞に導入（トランスフェクト）することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トランスフェクション試薬を用いる方法、エレクトロポレーションによる方法、磁気粒子を用いる方法、ウイルス感染を利用する方法などが挙げられる。
　癌細胞に対して作用させる前記癌細胞増殖抑制剤の量としても、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、１×１０６個の細胞数に対し、有効成分（前記二本鎖核酸分子）の量として、０．１μｇ程度が好ましく、５μｇ程度がより好ましく、１５μｇ程度が特に好ましい。
＜癌細胞増殖抑制方法＞
　前記癌細胞増殖抑制剤は、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、癌細胞に作用させることにより、前記非コードＲＮＡの少なくともいずれかの発現抑制を介して、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを癌細胞に作用させることを特徴とする、癌細胞の増殖抑制方法（「腫瘍増殖抑制方法」と称することがある）にも関する。前記癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳癌細胞、子宮内膜癌細胞、子宮頸癌細胞、前立腺癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、骨肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞などが挙げられる。これらの中でも、乳癌細胞が好ましく、ホルモン療法抵抗性の乳癌細胞がより好ましい。
（癌細胞移動抑制剤）
　本発明の癌細胞移動抑制剤は、癌細胞の移動を抑制するための癌細胞移動抑制剤（「癌細胞遊走抑制剤」と称することがある）であり、前記した本発明の二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
＜二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、ベクター＞
　前記二本鎖核酸分子の詳細としては、前記した本発明の二本鎖核酸分子の項目に記載した通りである。前記二本鎖核酸分子は、標的とする前記非コードＲＮＡの少なくともいずれかの発現を効果的に抑制することができるので、癌細胞の移動を抑制するための前記癌細胞移動抑制剤の有効成分として好適である。また、前記ＤＮＡ、ベクターの詳細としても、前記した本発明のＤＮＡ、ベクターの項目に記載した通りである。
　前記癌細胞移動抑制剤中の前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記癌細胞移動抑制剤としては、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかそのものであってもよい。
＜その他の成分＞
　前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを所望の濃度に希釈するための生理食塩水、培養液等の希釈用剤や、対象とする細胞内に前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを導入（トランスフェクト）するためのトランスフェクション試薬などが挙げられる。
　前記癌細胞移動抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜癌細胞＞
　前記癌細胞移動抑制剤の適用対象となる癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳癌細胞、子宮内膜癌細胞、子宮頸癌細胞、前立腺癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、骨肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞などが挙げられる。これらの中でも、乳癌細胞が好ましく、ホルモン療法抵抗性の乳癌細胞がより好ましい。
　前記癌細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、また、癌を患う患者の体内に存在する細胞であってもよい。
　これらの細胞は、例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）や、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手することができる。
＜作用＞
　前記癌細胞移動抑制剤は、例えば、癌細胞に導入（トランスフェクト）することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トランスフェクション試薬を用いる方法、エレクトロポレーションによる方法、磁気粒子を用いる方法、ウイルス感染を利用する方法などが挙げられる。
　癌細胞に対して作用させる前記癌細胞移動抑制剤の量としても、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、１×１０６個の細胞数に対し、有効成分（前記二本鎖核酸分子）の量として、０．１μｇ程度が好ましく、５μｇ程度がより好ましく、１５μｇ程度が特に好ましい。
＜癌細胞移動抑制方法＞
　前記癌細胞移動抑制剤は、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、癌細胞に作用させることにより、前記非コードＲＮＡの少なくともいずれかの発現抑制を介して、癌細胞の移動を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、前記二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを癌細胞に作用させることを特徴とする、癌細胞の移動抑制方法にも関する。前記癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳癌細胞、子宮内膜癌細胞、子宮頸癌細胞、前立腺癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、骨肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞などが挙げられる。これらの中でも、乳癌細胞が好ましく、ホルモン療法抵抗性の乳癌細胞がより好ましい。
（医薬）
　本発明の医薬は、癌を予防乃至治療するための医薬であり、前記した本発明の癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤の少なくともいずれかを含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
＜癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤の少なくともいずれか＞
　前記癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤の詳細としては、前記した本発明の癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤の項目に記載した通りである。
　前記癌細胞増殖抑制剤は、前記した本発明の二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、標的とする前記非コードＲＮＡの少なくともいずれかの発現抑制を介して、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。
　前記癌細胞移動抑制剤は、前記した本発明の二本鎖核酸分子、ＤＮＡ、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、標的とする前記非コードＲＮＡの少なくともいずれかの発現抑制を介して、癌細胞の移動を効果的に抑制することができる。
　即ち、前記癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤は、癌を予防乃至治療するための医薬として好適に利用可能である。前記癌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、骨肉腫、横紋筋肉腫などが挙げられる。これらの中でも、乳癌が好ましく、ホルモン療法抵抗性の乳癌がより好ましい。
　前記医薬中の前記癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤の少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬は、前記癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤の少なくともいずれかそのものであってもよい。
　ここで、前記医薬の有効成分となる前記二本鎖核酸分子としては、非修飾の状態の二本鎖核酸分子そのものを用いてもよいが、適切に予防乃至治療効果が得られるよう、生体への投与に適した形態の二本鎖核酸分子を用いることが好ましい。
　例えば、前記二本鎖核酸分子は、生体内における二本鎖核酸分子の安定性を高めることができる点で、修飾が施されていることが好ましい。前記二本鎖核酸分子に施し得る修飾の種類としては、特に制限はなく、例えば、２’Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ化修飾、ホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）修飾などが挙げられる。また、標的細胞への導入効率を高める等の目的から、例えば、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともまた好ましい。前記二本鎖核酸分子に前記修飾を施す方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。
　また、前記二本鎖核酸分子は、標的細胞への導入効率を高めることができる点で、リポソームや高分子マトリックス等と複合体を形成していることも好ましい。前記複合体を形成する方法としても、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。
＜その他の成分＞
　前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜剤型＞
　前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
　前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
　前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
　前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
　前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
　前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
　前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
　前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
　前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
　前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。
＜投与＞
　前記医薬は、癌の予防乃至治療に好適である。したがって、前記医薬は、癌に罹患した患者に投与することにより好適に使用することができる。
　前記医薬の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトが特に好ましい。
　前記医薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬の剤型、疾患の種類、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与においては、前記医薬の有効成分（前記二本鎖核酸分子）を、所望の部位（例えば、腫瘍部位）に直接注入することにより投与することができる。前記注入には、注射等の従来公知の手法を適宜利用することができる。また、全身投与（例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への投与等）においては、前記医薬の有効成分（前記二本鎖核酸分子）が所望の部位（例えば、腫瘍部位）まで安定に、かつ効率良く送達されるよう、従来公知の薬剤送達技術を適宜応用することが好ましい。
　前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたり、有効成分（前記二本鎖核酸分子）の量として、１ｍｇ～１００ｍｇが好ましい。
　また、前記医薬の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
　前記医薬の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。中でも、前記医薬は、癌細胞の増殖及び移動の少なくともいずれかを阻害し、前記癌細胞の増殖及び移動の少なくともいずれかによる腫瘍の増大を防ぐ効果に優れることから、前記医薬は前記疾患の出来る限り早期の段階に投与されることが望ましいと考えられる。
＜予防乃至治療方法＞
　前記医薬は、前記癌細胞増殖抑制剤及び癌細胞移動抑制剤の少なくともいずれかを含むので、癌を患う個体に投与することにより、標的とする前記非コードＲＮＡの少なくともいずれかの発現抑制を介して、癌細胞の増殖及び移動の少なくともいずれかを効果的に抑制し、癌を予防乃至治療することができる。したがって、本発明は、個体に前記医薬を投与することを特徴とする癌の予防乃至治療方法にも関する。前記癌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、骨肉腫、横紋筋肉腫などが挙げられる。これらの中でも、乳癌が好ましく、ホルモン療法抵抗性の乳癌がより好ましい。
　以下に本発明の試験例等を説明するが、本発明は、これらの試験例等に何ら限定されるものではない。
（調製例１：細胞及び培養方法）
　後述する各試験例では、以下の細胞を用いた。これらの細胞は、ＡＴＣＣ、又はＪＣＲＢ細胞バンクより入手した。
＜細胞＞
　・　ＭＣＦ－７細胞（ヒト乳癌細胞）
　・　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ヒト乳癌細胞）
　・　Ｔ４７Ｄ細胞（ヒト乳癌細胞）
　・　Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞（ヒト子宮内膜癌細胞）
　・　ＨＨＵＡ細胞（ヒト子宮内膜癌細胞）
　・　Ｈｅｃ１Ａ細胞（ヒト子宮内膜癌細胞）
　・　ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌細胞）
　・　ＬＮＣａＰ細胞（ヒト前立腺癌細胞）
　・　ＶＣａＰ細胞（ヒト前立腺癌細胞）
　・　２２Ｒｖ１細胞（ヒト前立腺癌細胞）
　・　ＤＵ１４５細胞（ヒト前立腺癌細胞）
　・　ＰＣ３細胞（ヒト前立腺癌細胞）
　・　ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌細胞）
　・　ＥＪ細胞（ヒト膀胱癌細胞）
　・　Ｔ２４細胞（ヒト膀胱癌細胞）
　・　ＲＴ４細胞（ヒト膀胱癌細胞）
　・　ＭＧ６３細胞（ヒト骨肉腫細胞）
　・　ＳａｏＳ細胞（ヒト骨肉腫細胞）
　・　ＨＯＳ細胞（ヒト骨肉腫細胞）
　・　ＳＪＣＲＨ３０細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞）
　・　ＲＤ細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞）
＜細胞培養＞
　前記各細胞は、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。
　細胞培養液は、ＭＣＦ－７細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＶＣａＰ細胞、２２Ｒｖ１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＥＪ細胞、ＭＧ６３細胞、ＳａｏＳ細胞、ＨＯＳ細胞、及びＲＤ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ培地（ナカライテスク株式会社製）を用い、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ＤＵ１４５細胞、ＰＣ３細胞、ＳＪＣＲＨ３０細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク株式会社製）を用い、ＨＨＵＡ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＨａｍＦ１２培地（ナカライテスク株式会社製）を用い、Ｈｅｃ１Ａ細胞、Ｔ２４細胞、ＲＴ４細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いた。
（調製例２：乳癌腫瘍組織の臨床サンプル）
　乳癌腫瘍組織の臨床サンプル（ＢＣ１～ＢＣ１０）は、学校法人埼玉医科大学国際医療センター乳腺腫瘍科より提供を受けた。前記サンプルはプライバシー、人権、個人の利益の保護等を念頭に置いたインフォームドコンセントを得た上で採取された。本研究は、学校法人埼玉医科大学国際医療センター治験審査委員会において承認されている（申請番号６７５）。
（試験例１：非コードＲＮＡ（ＴＭＰＯ－ＡＳ１及びＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ）の同定）
＜ＲＮＡシーケンス解析＞
　ＭＣＦ－７細胞を以下のホルモン欠乏細胞培養液にて１日間培養後、以下のいずれかの薬剤を以下の濃度で添加して４時間刺激した後、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを前記細胞より回収した。
－ホルモン欠乏細胞培養液－
　チャーコールデキストラン処理（Ｓｉｇｍａ社製）によりホルモン除去を行った１０％ウシ胎児血清（ｄｃｃＦＢＳ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むフェノールレッド非含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社製）。
－薬剤－
（１）１７β－エストラジオール（以下、「Ｅ２」と称することがある）：１００ｎＭ。
（２）４－ヒドロキシタモキシフェン（以下、「ＯＨＴ」と称することがある）：１μＭ。
（３）エタノール（以下、「溶媒コントロール」と称することがある）：最終濃度０．１％。
　得られたＲＮＡを、次世代シーケンサーであるＧＡＩＩｘ（イルミナ株式会社製）を用いてライブラリー作製を行い、ＲＮＡシーケンス解析を行った。
　得られたシーケンス情報をＲｅｆＳｅｑデータベース（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄａｔａｂａｓｅ）上にマッピングし、タグカウントがいずれかのサンプルにおいて５０以上であり、既報のエストロゲン受容体α（ＥＲα）結合領域（以下、「ＥＲＢＳ」と称することがある、Ｃａｒｒｏｌｌ　ＪＳ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．　３８，　１２８９－９７，　２００６）データベースの近傍（５ｋｂ以内）に位置する非コードＲＮＡデータ（ＲｅｆＳｅｑ遺伝子ＮＲシリーズ）約２，０００転写物を選択した。
　前記非コードＲＮＡのうち、ショートＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ＲＮＡ）とコード遺伝子の非コードＲＮＡバリアント遺伝子を除く約３００転写物を選択した。
　約３００転写物のうち、Ｅ２により溶媒コントロールの２倍以上の発現上昇を示す長鎖非コードＲＮＡの１つで、ＴＭＰＯ（ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｎ）遺伝子のアンチセンス転写物と考えられるＴＭＰＯ－ＡＳ１を選択した。
　また、約３００転写物の集団の１つとして、ＣＯＬ１８Ａ１遺伝子のアンチセンス転写物であるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳ２があり、その近傍でＣＯＬ１８Ａ１の転写開始点のすぐ上流にアンチセンス方向に位置し、かつＥＲＢＳ上に存在し、Ｅ２により発現上昇する新規非コードＲＮＡを新たに発見し、ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘと命名した。
　シーケンスの視覚化解析にはＩＧＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ）　ｂｒｏｗｓｅｒ（Ｂｒｏａｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、又はＧｅｎｏｍｅ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（国立遺伝学研究所）を利用した。
　前記ＴＭＰＯ－ＡＳ１は、前記ＲｅｆＳｅｑデータベースに「Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＴＭＰＯ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　１（ＴＭＰＯ－ＡＳ１），　ｌｏｎｇ　ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ」として登録されており（ＮＲ＿０２７１５７．１；ｇｉ　２２４５４８９４８）、ＲＮＡ長が３，１６１ｂｐ（配列番号：１参照）、ゲノム位置がｃｈｒ１２：９８９０６７５１－９８９１０００４（ｈｇ１９）である。
　前記ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘは、前記ＲｅｆＳｅｑデータベースに「Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ＬＯＣ１０１９２８７４５」として３種類のバリアント体が登録されている。
　前記３種類のバリアント体は、以下のとおりである。
（１）ＬＯＣ１０１９２８７４５，　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　Ｘ１，　ｎｃＲＮＡ（ＸＲ＿２５４０５０．１；ｇｉ　５３０４３８８０３）
　推定ＲＮＡ長が７４６ｂｐ（配列番号：２参照）、ゲノム位置がｃｈｒ２１：４６８２３７２４－４６８２５３３２である。
　なお、前記ＲＮＡシーケンスでは、配列番号：２の１７０番目～７４６番目の領域の発現が確認された。
（２）ＬＯＣ１０１９２８７４５，　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　Ｘ２，　ｎｃＲＮＡ（ＸＲ＿２５４０５１．１；ｇｉ　５３０４３８８０４）
　推定ＲＮＡ長が１，１２１ｂｐ（配列番号：３参照）、ゲノム位置がｃｈｒ２１：４６８２３７２４－４６８２６２５３である。
　なお、前記ＲＮＡシーケンスでは、配列番号：３の５４５番目～１，１２１番目の領域の発現が確認された。
（３）ＬＯＣ１０１９２８７４５，　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｖａｒｉａｎｔ　Ｘ３，　ｍｉｓｃ＿ＲＮＡ（ＸＲ＿２５４０５２．１；ｇｉ　５３０４３８８０５）
　推定ＲＮＡ長が８０６ｂｐ（配列番号：４参照）、ゲノム位置がｃｈｒ２１：４６８２３７２４－４６８２４８４５である。
　なお、前記ＲＮＡシーケンスでは、配列番号：４の２３０番目～８０６番目の領域の発現が確認された。
（試験例２－１：ＴＭＰＯ－ＡＳ１の各種癌細胞、及び乳癌臨床サンプルにおける発現）
＜試験例２－１－１＞
　ＭＣＦ－７細胞を以下のホルモン欠乏細胞培養液にて１日間培養後、以下のいずれかの薬剤を以下の濃度で添加して４時間刺激した後、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを前記細胞より回収した。
－ホルモン欠乏細胞培養液－
　チャーコールデキストラン（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて処理することによってホルモン除去を行った１０％ウシ胎児血清（ｄｃｃＦＢＳ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むフェノールレッド非含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社製）。
－薬剤－
（１）１７β－エストラジオール（以下、「Ｅ２」と称することがある）：１００ｎＭ。
（２）４－ヒドロキシタモキシフェン（以下、「ＯＨＴ」と称することがある）：１μＭ。
（３）エタノール（以下、「溶媒コントロール」と称することがある）：最終濃度０．１％。
　得られたＲＮＡを、次世代シーケンサーであるＧＡＩＩｘ（イルミナ株式会社製）を用いて解析した。シーケンスの視覚化解析には、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒを利用した。
　図１Ａに、ＭＣＦ－７細胞におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現を解析した結果を示す。図１Ａでは、上段から順に、ヒトゲノムにおける「Ｒｅｆｓｅｑ遺伝子（＋鎖）」、「Ｒｅｆｓｅｑ遺伝子（－鎖）」、「Ｒｅｆｓｅｑ　ｍＲＮＡ（＋鎖）」、「Ｒｅｆｓｅｑ　ｍＲＮＡ（－鎖）」の領域を模式的に示しており、その下段に、「溶媒で処理したＭＣＦ－７細胞（＋鎖）」（ＭＣＦ－７　Ｖｅｈｉｃｌｅ　４ｈ（＋））、「溶媒で処理したＭＣＦ－７細胞（－鎖）」（ＭＣＦ－７　Ｖｅｈｉｃｌｅ　４ｈ（－））、「Ｅ２で処理したＭＣＦ－７細胞（＋鎖）」（ＭＣＦ－７　Ｅ２　４ｈ（＋））、「Ｅ２で処理したＭＣＦ－７細胞（－鎖）」（ＭＣＦ－７　Ｅ２　４ｈ（－））、「ＯＨＴで処理したＭＣＦ－７細胞（＋鎖）」（ＭＣＦ－７　ＯＨＴ　４ｈ（＋））、「ＯＨＴで処理したＭＣＦ－７細胞（－鎖）」（ＭＣＦ－７　ＯＨＴ　４ｈ（－））の結果を示す。
　図１Ａの結果から、ＭＣＦ－７細胞では、ＯＨＴによってＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現が抑制された。
＜試験例２－１－２＞
　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＭＣＦ－７細胞、又はＴ４７Ｄ細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを回収した。
　得られたＲＮＡを、次世代シーケンサーであるＧＡＩＩｘ（イルミナ株式会社製）を用いて解析した。シーケンスの視覚化解析には、ＩＧＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ）　ｂｒｏｗｓｅｒを利用した。
　図１Ｂに、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＭＣＦ－７細胞、又はＴ４７Ｄ細胞におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現を解析した結果を示す。図１Ｂでは、上段から順に、「ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（＋鎖）」（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（＋））、「ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（－鎖）」（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（－））、「ＭＣＦ－７（＋鎖）」（ＭＣＦ－７（＋））、「ＭＣＦ－７（－鎖）」（ＭＣＦ－７（－））、「Ｔ４７Ｄ（＋鎖）」（Ｔ４７Ｄ（＋））、「Ｔ４７Ｄ（－鎖）」（Ｔ４７Ｄ（－））の結果を示す。
　図１Ｂの結果から、ＭＣＦ－７細胞以外にも、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、Ｔ４７Ｄ細胞においてもＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現が確認された。
＜試験例２－１－３＞
　Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞、ＨＨＵＡ細胞、Ｈｅｃ１Ａ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ＶＣａＰ細胞、２２Ｒｖ１細胞、ＤＵ１４５細胞、又はＰＣ３細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを回収した。
　なお、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞は、Ｅ２による処理（２４時間）を行った後にＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを回収し、２２Ｒｖ１細胞は、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）による処理（２４時間）を行った後にＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを回収した。
　得られたＲＮＡを、次世代シーケンサーであるＧＡＩＩｘ（イルミナ株式会社製）を用いて解析した。シーケンスの視覚化解析には、ＩＧＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ）　ｂｒｏｗｓｅｒを利用した。
　図１Ｃに、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞、ＨＨＵＡ細胞、Ｈｅｃ１Ａ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ＶＣａＰ細胞、２２Ｒｖ１細胞、ＤＵ１４５細胞、又はＰＣ３細胞におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現を解析した結果を示す。図１Ｃでは、上段から順に、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞（Ｉｓｈｉｋａｗａ　Ｅ２）、ＨＨＵＡ細胞（ＨＨＵＡ）、Ｈｅｃ１Ａ細胞（Ｈｅｃ１Ａ）、ＬＮＣａＰ細胞（ＬＮＣａＰ）、ＶＣａＰ細胞（ＶＣａＰ）、２２Ｒｖ１細胞（２２Ｒｖ１　ＤＨＴ）、ＤＵ１４５細胞（ＤＵ１４５）、ＰＣ３細胞（ＰＣ３）の結果を示す。
　図１Ｃの結果から、子宮内膜癌細胞であるＩｓｈｉｋａｗａ細胞、ＨＨＵＡ細胞、及びＨｅｃ１Ａ細胞、並びに前立腺癌細胞であるＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、２２Ｒｖ１、ＤＵ１４５、及びＰＣ３においてもＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現が確認された。
＜試験例２－１－４＞
　ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＥＪ細胞、Ｔ２４細胞、ＲＴ４細胞、ＭＧ６３細胞、ＳａｏＳ細胞、ＨＯＳ細胞、ＳＪＣＲＨ３０細胞、又はＲＤ細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを回収した。
　得られたＲＮＡを、次世代シーケンサーであるＧＡＩＩｘ（イルミナ株式会社製）を用いて解析した。シーケンスの視覚化解析には、ＩＧＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ）　ｂｒｏｗｓｅｒを利用した。
　図１Ｄに、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＥＪ細胞、Ｔ２４細胞、ＲＴ４細胞、ＭＧ６３細胞、ＳａｏＳ細胞、ＨＯＳ細胞、ＳＪＣＲＨ３０細胞、又はＲＤ細胞におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現を解析した結果を示す。図１Ｄでは、上段から順に、ＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ）、ＨｅｐＧ２細胞（ＨｅｐＧ２）、ＥＪ細胞（ＥＪ）、Ｔ２４細胞（Ｔ２４）、ＲＴ４細胞（ＲＴ４）、ＭＧ６３細胞（ＭＧ６３）、ＳａｏＳ細胞（ＳａｏＳ）、ＨＯＳ細胞（ＨＯＳ）、ＳＪＣＲＨ３０細胞（ＳＪＣＲＨ３０）、ＲＤ細胞（ＲＤ）の結果を示す。
　図１Ｄの結果から、子宮頸癌細胞であるＨｅＬａ細胞、肝癌細胞であるＨｅｐＧ２細胞、膀胱癌細胞であるＥＪ細胞、Ｔ２４細胞、及びＲＴ４細胞、骨肉腫細胞であるＭＧ６３細胞、ＳａｏＳ細胞、及びＨＯＳ細胞、並びに横紋筋肉腫細胞であるＳＪＣＲＨ３０細胞、及びＲＤ細胞においてもＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現が確認された。
＜試験例２－１－５＞
　乳癌腫瘍組織の臨床サンプル（ＢＣ１～ＢＣ１０）から、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを回収した。
　得られたＲＮＡを、次世代シーケンサーであるＧＡＩＩｘ（イルミナ株式会社製）を用いて解析した。シーケンスの視覚化解析には、ＩＧＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ）　ｂｒｏｗｓｅｒを利用した。
　図１Ｅに、乳癌腫瘍組織の臨床サンプル（ＢＣ１～ＢＣ１０）におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現を解析した結果を示す。図１Ｅでは、上段から順に、ＢＣ１～ＢＣ１０の結果を示す。
　図１Ｅの結果から、乳癌腫瘍組織の臨床サンプルにおいてもＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現が確認された。
（試験例２－２：ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの各種癌細胞、及び乳癌臨床サンプルにおける発現）
＜試験例２－２－１＞
　ＭＣＦ－７細胞を以下のホルモン欠乏細胞培養液にて１日間培養後、以下のいずれかの薬剤を以下の濃度で添加して４時間刺激した後、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを前記細胞より回収した。
－ホルモン欠乏細胞培養液－
　チャーコールデキストラン（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて処理することによりホルモン除去を行った１０％ウシ胎児血清（ｄｃｃＦＢＳ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むフェノールレッド非含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社製）。
－薬剤－
（１）１７β－エストラジオール（以下、「Ｅ２」と称することがある）：１００ｎＭ。
（２）４－ヒドロキシタモキシフェン（以下、「ＯＨＴ」と称することがある）：１μＭ。
（３）エタノール（以下、「溶媒コントロール」と称することがある）：最終濃度０．１％。
　得られたＲＮＡを、次世代シーケンサーであるＧＡＩＩｘ（イルミナ株式会社製）を用いて解析した。シーケンスの視覚化解析には、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒを利用した。
　図２Ａに、ＭＣＦ－７細胞におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現を解析した結果を示す。図２Ａでは、上段から順に、ヒトゲノムにおける「Ｒｅｆｓｅｑ遺伝子（＋鎖）」、「Ｒｅｆｓｅｑ遺伝子（－鎖）」、「Ｒｅｆｓｅｑ　ｍＲＮＡ（＋鎖）」、「Ｒｅｆｓｅｑ　ｍＲＮＡ（－鎖）」の領域を模式的に示しており、その下段に、「溶媒で処理したＭＣＦ－７細胞（＋鎖）」（ＭＣＦ－７　Ｖｅｈｉｃｌｅ　４ｈ（＋））、「溶媒で処理したＭＣＦ－７細胞（－鎖）」（ＭＣＦ－７　Ｖｅｈｉｃｌｅ　４ｈ（－））、「Ｅ２で処理したＭＣＦ－７細胞（＋鎖）」（ＭＣＦ－７　Ｅ２　４ｈ（＋））、「Ｅ２で処理したＭＣＦ－７細胞（－鎖）」（ＭＣＦ－７　Ｅ２　４ｈ（－））、「ＯＨＴで処理したＭＣＦ－７細胞（＋鎖）」（ＭＣＦ－７　ＯＨＴ　４ｈ（＋））、「ＯＨＴで処理したＭＣＦ－７細胞（－鎖）」（ＭＣＦ－７　ＯＨＴ　４ｈ（－））の結果を示す。
　図２Ａの結果から、ＭＣＦ－７細胞では、エストロゲンによってＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現が誘導された。
＜試験例２－２－２＞
　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＭＣＦ－７細胞、又はＴ４７Ｄ細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを回収した。
　得られたＲＮＡを、次世代シーケンサーであるＧＡＩＩｘ（イルミナ株式会社製）を用いて解析した。シーケンスの視覚化解析には、ＩＧＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ）　ｂｒｏｗｓｅｒを利用した。
　図２Ｂに、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＭＣＦ－７細胞、又はＴ４７Ｄ細胞におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現を解析した結果を示す。図２Ｂでは、上段から順に、「ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（＋鎖）」（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（＋））、「ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（－鎖）」（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（－））、「ＭＣＦ－７（＋鎖）」（ＭＣＦ－７（＋））、「ＭＣＦ－７（－鎖）」（ＭＣＦ－７（－））、「Ｔ４７Ｄ（＋鎖）」（Ｔ４７Ｄ（＋））、「Ｔ４７Ｄ（－鎖）」（Ｔ４７Ｄ（－））の結果を示す。
　図２Ｂの結果から、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞においてもＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現が確認された。
＜試験例２－２－３＞
　Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞、ＨＨＵＡ細胞、Ｈｅｃ１Ａ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ＶＣａＰ細胞、２２Ｒｖ１細胞、ＤＵ１４５細胞、又はＰＣ３細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを回収した。
　なお、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞は、Ｅ２処理（２４時間）を行った後にＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを回収し、２２Ｒｖ１細胞は、ＤＨＴ処理（２４時間）を行った後にＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを回収した。
　得られたＲＮＡを、次世代シーケンサーであるＧＡＩＩｘ（イルミナ株式会社製）を用いて解析した。シーケンスの視覚化解析には、ＩＧＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ）　ｂｒｏｗｓｅｒを利用した。
　図２Ｃに、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞、ＨＨＵＡ細胞、Ｈｅｃ１Ａ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ＶＣａＰ細胞、２２Ｒｖ１細胞、ＤＵ１４５細胞、又はＰＣ３細胞におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現を解析した結果を示す。図２Ｃでは、上段から順に、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞（Ｉｓｈｉｋａｗａ　Ｅ２）、ＨＨＵＡ細胞（ＨＨＵＡ）、Ｈｅｃ１Ａ細胞（Ｈｅｃ１Ａ）、ＬＮＣａＰ細胞（ＬＮＣａＰ）、ＶＣａＰ細胞（ＶＣａＰ）、２２Ｒｖ１細胞（２２Ｒｖ１　ＤＨＴ）、ＤＵ１４５細胞（ＤＵ１４５）、ＰＣ３細胞（ＰＣ３）の結果を示す。
　図２Ｃの結果から、子宮内膜癌細胞であるＩｓｈｉｋａｗａ細胞、ＨＨＵＡ細胞、及びＨｅｃ１Ａ細胞、並びに前立腺癌細胞であるＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、２２Ｒｖ１、ＤＵ１４５、及びＰＣ３においてもＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現が確認された。
＜試験例２－２－４＞
　ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＥＪ細胞、Ｔ２４細胞、ＲＴ４細胞、ＭＧ６３細胞、ＳａｏＳ細胞、ＨＯＳ細胞、ＳＪＣＲＨ３０細胞、又はＲＤ細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを回収した。
　得られたＲＮＡを、次世代シーケンサーであるＧＡＩＩｘ（イルミナ株式会社製）を用いて解析した。シーケンスの視覚化解析には、ＩＧＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ）　ｂｒｏｗｓｅｒを利用した。
　図２Ｄに、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＥＪ細胞、Ｔ２４細胞、ＲＴ４細胞、ＭＧ６３細胞、ＳａｏＳ細胞、ＨＯＳ細胞、ＳＪＣＲＨ３０細胞、又はＲＤ細胞におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現を解析した結果を示す。図２Ｄでは、上段から順に、ＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ）、ＨｅｐＧ２細胞（ＨｅｐＧ２）、ＥＪ細胞（ＥＪ）、Ｔ２４細胞（Ｔ２４）、ＲＴ４細胞（ＲＴ４）、ＭＧ６３細胞（ＭＧ６３）、ＳａｏＳ細胞（ＳａｏＳ）、ＨＯＳ細胞（ＨＯＳ）、ＳＪＣＲＨ３０細胞（ＳＪＣＲＨ３０）、ＲＤ細胞（ＲＤ）の結果を示す。
　図２Ｄの結果から、肝癌細胞であるＨｅｐＧ２細胞、膀胱癌細胞であるＥＪ細胞、及びＴ２４細胞、骨肉腫細胞であるＭＧ６３細胞、ＳａｏＳ細胞、及びＨＯＳ細胞、並びに横紋筋肉腫細胞であるＲＤ細胞においてもＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現が確認された。
＜試験例２－２－５＞
　乳癌腫瘍組織の臨床サンプル（ＢＣ１～ＢＣ１０）から、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを回収した。
　得られたＲＮＡを、次世代シーケンサーであるＧＡＩＩｘ（イルミナ株式会社製）を用いて解析した。シーケンスの視覚化解析には、ＩＧＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ）　ｂｒｏｗｓｅｒを利用した。
　図２Ｅに、乳癌腫瘍組織の臨床サンプル（ＢＣ１～ＢＣ１０）におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現を解析した結果を示す。図２Ｅでは、上段から順に、ＢＣ１～ＢＣ１０の結果を示す。
　図２Ｅの結果から、乳癌腫瘍組織の臨床サンプルにおいてもＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘの発現が確認された。
（製造例１：二本鎖核酸分子の作製）
　配列番号：１～４で表される塩基配列及びその一部の少なくともいずれかを含む非コードＲＮＡの発現を抑制するための本発明の二本鎖核酸分子を、以下のようにして準備した。
　配列番号：１で表される塩基配列を含む非コードＲＮＡに対する本発明の二本鎖核酸分子ｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２、３、５、７、８、１０）と、配列番号：２～４で表される塩基配列及びその一部の少なくもいずれかを含む非コードＲＮＡに対する本発明の二本鎖核酸分子（ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９）は、それぞれの二本鎖核酸分子の標的配列（以下に記載）とそれに相補的な部分を含む配列を、３’末端が２塩基オーバーハングするようなＲＮＡ、又はＲＮＡ－ＤＮＡキメラの二本鎖として合成した（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）。これらは、センス鎖由来のオフターゲット効果を防ぐことができるものである。
　また、陰性コントロールとして、全既知遺伝子へのオフターゲット効果がないｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（ＲＮＡｉ社製））を用意した。
　それぞれの二本鎖核酸分子の標的配列、及び作製したｓｉＲＮＡ、又はキメラｓｉＲＮＡの配列を以下に示す。
＜ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１（ｓｉＲＮＡ）＞
－標的配列－
５’－ｇａａｇａｃｔａｇｔｇａｃｃｔａｔａａｔｔ－３’（配列番号：５）
－ｓｉＲＮＡの配列－
－－センス鎖－－
５’－ｇａａｇａｃｕａｇｕｇａｃｃｕａｕａａｕｕ－３’（配列番号：１２）
－－アンチセンス鎖－－
５’－ｕｕａｕａｇｇｕｃａｃｕａｇｕｃｕｕｃｃｕ－３’（配列番号：１３）
　なお、前記配列番号：５で表される標的配列は、配列番号：１で表される塩基配列における１，３７９番目～１，３９９番目に対応する。
＜ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２（ｓｉＲＮＡ）＞
－標的配列－
５’－ｇａｇｃｃｇａａｃｔａｃｇａａｃｃａａｃｔ－３’（配列番号：６）
－ｓｉＲＮＡの配列－
－－センス鎖－－
５’－ｇａｇｃｃｇａａｃｕａｃｇａａｃｃａａｃｕ－３’（配列番号：１４）
－－アンチセンス鎖－－
５’－ｕｕｇｇｕｕｃｇｕａｇｕｕｃｇｇｃｕｃｕｇ－３’（配列番号：１５）
　なお、前記配列番号：６で表される標的配列は、配列番号：１で表される塩基配列における４５５番目～４７５番目に対応する。
＜ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－３（ｓｉＲＮＡ）＞
－標的配列－
５’－ｇｇａｃａｇｇｔｃｇｔａｃｔｇｃｔｔｔｔｇ－３’（配列番号：７）
－ｓｉＲＮＡの配列－
－－センス鎖－－
５’－ｇｇａｃａｇｇｕｃｇｕａｃｕｇｃｕｕｕｕｇ－３’（配列番号：１６）
－－アンチセンス鎖－－
５’－ａａａｇｃａｇｕａｃｇａｃｃｕｇｕｃｃｃｕ－３’（配列番号：１７）
　なお、前記配列番号：７で表される標的配列は、配列番号：１で表される塩基配列における７５５番目～７７５番目に対応する。
＜ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－５（ｓｉＲＮＡ）＞
－標的配列－
５’－ｇａａｔｃｃｔａａａｃｃｔａａｃｇｔｔｔｇ－３’（配列番号：８）
－ｓｉＲＮＡの配列－
－－センス鎖－－
５’－ｇａａｕｃｃｕａａａｃｃｕａａｃｇｕｕｕｇ－３’（配列番号：１８）
－－アンチセンス鎖－－
５’－ａａｃｇｕｕａｇｇｕｕｕａｇｇａｕｕｃｕｕ－３’（配列番号：１９）
　なお、前記配列番号：８で表される標的配列は、配列番号：１で表される塩基配列における１，２８１番目～１，３０１番目に対応する。
＜ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－７（ｓｉＲＮＡ）＞
－標的配列－
５’－ｃｃｔａａｃｇｔｔｔｇａｔａａｃａａａａｃ－３’（配列番号：９）
－ｓｉＲＮＡの配列－
－－センス鎖－－
５’－ｃｃｕａａｃｇｕｕｕｇａｕａａｃａａａａｃ－３’（配列番号：２０）
－－アンチセンス鎖－－
５’－ｕｕｕｇｕｕａｕｃａａａｃｇｕｕａｇｇｕｕ－３’（配列番号：２１）
　なお、前記配列番号：９で表される標的配列は、配列番号：１で表される塩基配列における１，２９１番目～１，３１１番目に対応する。
＜ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－８（ｓｉＲＮＡ）＞
－標的配列－
５’－ｃｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇａｔｃｃａａａｔｔ－３’（配列番号：１０）
－ｓｉＲＮＡの配列－
－－センス鎖－－
５’－ｃｃｃｇｕａｕｕａｃｃｇａｕｃｃａａａｕｕ－３’（配列番号：２２）
－－アンチセンス鎖－－
５’－ｕｕｕｇｇａｕｃｇｇｕａａｕａｃｇｇｇｕｕ－３’（配列番号：２３）
　なお、前記配列番号：１０で表される標的配列は、配列番号：１で表される塩基配列における１，４２１番目～１，４４１番目に対応する。
＜ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１０（ｓｉＲＮＡ）＞
－標的配列－
５’－ｃｇｃｇａａｃｇｃｔｔｃｔｔｔｔｇｔｔｃｃ－３’（配列番号：１１）
－ｓｉＲＮＡの配列－
－－センス鎖－－
５’－ｃｇｃｇａａｃｇｃｕｕｃｕｕｕｕｇｕｕｃｃ－３’（配列番号：２４）
－－アンチセンス鎖－－
５’－ａａｃａａａａｇａａｇｃｇｕｕｃｇｃｇａｇ－３’（配列番号：２５）
　なお、前記配列番号：１１で表される標的配列は、配列番号：１で表される塩基配列における１，０５１番目～１，０７１番目に対応する。
＜ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１（キメラｓｉＲＮＡ）＞
－標的配列－
５’－ｇｃａｃｔｇｔｇａｇｇａａｇｇａａａｔ－３’（配列番号：２６）
－キメラｓｉＲＮＡの配列－
－－センス鎖－－
５’－ｇｃａｃｕｇｕｇａｇｇａａｇｇａａａｕｔｔ－３’（配列番号：３２）
－－アンチセンス鎖－－
５’－ａｕｕｕｃｃｕｕｃｃｕｃａｃａｇｕｇｃｔｔ－３’（配列番号：３３）
　なお、前記配列番号：２６で表される標的配列は、配列番号：２で表される塩基配列における６７３番目～６９１番目、配列番号：３で表される塩基配列における１，０４８番目～１，０６６番目、配列番号：４で表される塩基配列における７３３番目～７５１番目に対応する。
＜ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－２（ｓｉＲＮＡ）＞
－標的配列－
５’－ｇｃｔｔｇａｃｇｇｃｔｔｔｃｔｃｔｇａａａ－３’（配列番号：２７）
－ｓｉＲＮＡの配列－
－－センス鎖－－
５’－ｇｃｕｕｇａｃｇｇｃｕｕｕｃｕｃｕｇａａａ－３’（配列番号：３４）
－－アンチセンス鎖－－
５’－ｕｃａｇａｇａａａｇｃｃｇｕｃａａｇｃｃａ－３’（配列番号：３５）
　なお、前記配列番号：２７で表される標的配列は、配列番号：２で表される塩基配列における２１６番目～２３６番目、配列番号：３で表される塩基配列における５９１番目～６１１番目、配列番号：４で表される塩基配列における２７６番目～２９６番目に対応する。
＜ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－５（ｓｉＲＮＡ）＞
－標的配列－
５’－ｇｇａｃｃａａａｃａｇｃｇｔａｇｔｃｔｃｃ－３’（配列番号：２８）
－ｓｉＲＮＡの配列－
－－センス鎖－－
５’－ｇｇａｃｃａａａｃａｇｃｇｕａｇｕｃｕｃｃ－３’（配列番号：３６）
－－アンチセンス鎖－－
５’－ａｇａｃｕａｃｇｃｕｇｕｕｕｇｇｕｃｃａｇ－３’（配列番号：３７）
　なお、前記配列番号：２８で表される標的配列は、配列番号：２で表される塩基配列における３０１番目～３２１番目、配列番号：３で表される塩基配列における６７６番目～６９６番目、配列番号：４で表される塩基配列における３６１番目～３８１番目に対応する。
＜ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－６（ｓｉＲＮＡ）＞
－標的配列－
５’－ｃｔｔｃａａａｃｃｔｇｇａｇｔｃｃｔｔｃｃ－３’（配列番号：２９）
－ｓｉＲＮＡの配列－
－－センス鎖－－
５’－ｃｕｕｃａａａｃｃｕｇｇａｇｕｃｃｕｕｃｃ－３’（配列番号：３８）
－－アンチセンス鎖－－
５’－ａａｇｇａｃｕｃｃａｇｇｕｕｕｇａａｇｇｃ－３’（配列番号：３９）
　なお、前記配列番号：２９で表される標的配列は、配列番号：２で表される塩基配列における６３７番目～６５７番目、配列番号：３で表される塩基配列における１，０１２番目～１，０３２番目、配列番号：４で表される塩基配列における６９７番目～７１７番目に対応する。
＜ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－７（ｓｉＲＮＡ）＞
－標的配列－
５’－ｇｃｃｔｇｃｔｔｇｇｇａｔｔｃｔｃｃｔｃｔ－３’（配列番号：３０）
－ｓｉＲＮＡの配列－
－－センス鎖－－
５’－ｇｃｃｕｇｃｕｕｇｇｇａｕｕｃｕｃｃｕｃｕ－３’（配列番号：４０）
－－アンチセンス鎖－－
５’－ａｇｇａｇａａｕｃｃｃａａｇｃａｇｇｃｃｃ－３’（配列番号：４１）
　なお、前記配列番号：３０で表される標的配列は、配列番号：２で表される塩基配列における５１５番目～５３５番目、配列番号：３で表される塩基配列における８９０番目～９１０番目、配列番号：４で表される塩基配列における５７５番目～５９５番目に対応する。
＜ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－９（ｓｉＲＮＡ）＞
－標的配列－
５’－ｇｃｃａｇｇｇｃｔｃａｔｃｔｃｃｔａｔｇｃ－３’（配列番号：３１）
－ｓｉＲＮＡの配列－
－－センス鎖－－
５’－ｇｃｃａｇｇｇｃｕｃａｕｃｕｃｃｕａｕｇｃ－３’（配列番号：４２）
－－アンチセンス鎖－－
５’－ａｕａｇｇａｇａｕｇａｇｃｃｃｕｇｇｃｃｇ－３’（配列番号：４３）
　なお、前記配列番号：３１で表される標的配列は、配列番号：２で表される塩基配列における２７８番目～２９８番目、配列番号：３で表される塩基配列における６５３番目～６７３番目、配列番号：４で表される塩基配列における３３８番目～３５８番目に対応する。
　陰性コントロールに用いたｓｉＣｏｎｔｒｏｌの配列を以下に示す。
＜ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ＞
－センス鎖－
５’－ｇｕａｃｃｇｃａｃｇｕｃａｕｕｃｇｕａｕｃ－３’（配列番号：４４）
－アンチセンス鎖－
５’－ｕａｃｇａａｕｇａｃｇｕｇｃｇｇｕａｃｇｕ－３’（配列番号：４５）
（試験例３－１：二本鎖核酸分子による標的非コードＲＮＡ発現抑制効果の検討）
　前記製造例１で得られたｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２、３、５、７、８、又は１０を、乳癌細胞にトランスフェクションし、４８時間培養後に全ＲＮＡを回収してｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲを行うことにより、各二本鎖核酸分子の乳癌細胞におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１（配列番号：１）発現に対する抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
　なお、コントロールとして、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌを用いた。
　実験方法の詳細を以下に示す。
［細胞］
　前記乳癌細胞として、ヒト乳がん細胞株であるＭＣＦ－７細胞を用いた。
［細胞培養］
　ＭＣＦ－７細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社製）を細胞培養液として用い、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。
［トランスフェクション］
　６穴プレートに、ＭＣＦ－７細胞を１×１０５個／穴となるようにまき、その翌日に、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びトランスフェクション試薬であるＲＮＡｉ　ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて二本鎖核酸分子をトランスフェクションした。導入した二本鎖核酸分子の量は、培地中で１ｎＭとなるように調整した。
［非コードＲＮＡ発現レベルの測定］
　トランスフェクションし４８時間培養した後に、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて全ＲＮＡを細胞より回収した。前記全ＲＮＡ　１μｇを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＩＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により、ｃＤＮＡを合成した。
　前記ｃＤＮＡを１０倍希釈し、そのうちの２μＬを用いてｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲを行った。前記ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、及びＫＡＰＡ　ＳＹＢＲ　Ｆａｓｔ　ＰＣＲ　ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社製）を用いて行い、ＴＭＰＯ－ＡＳ１（配列番号：１）及び内部コントロールであるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルを測定した。
　前記ＴＭＰＯ－ＡＳ１（配列番号：１）の発現レベルは、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子に対する発現レベルをＣｙｃｌｅ数からΔΔＣｔ法を用いて算出した。
　なお、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲに用いたプライマーは、以下のとおりである。
－ＧＡＰＤＨ遺伝子－
ＧＡＰＤＨ＿ＦＷ：
５’－ｇｇｔｇｇｔｃｔｃｃｔｃｔｇａｃｔｔｃａａｃａ－３’（配列番号：４６）
ＧＡＰＤＨ＿ＲＶ：
５’－ｇｔｇｇｔｃｇｔｔｇａｇｇｇｃａａｔｇ－３’（配列番号：４７）
－ＴＭＰＯ－ＡＳ１－
ＴＭＰＯ－ＡＳ１＿ＦＷ：
５’－ｔｃｔｃｃａｃｃｃｔｔｃｃｃｃｔｔａｇａｃ－３’（配列番号：５０）
ＴＭＰＯ－ＡＳ１＿ＲＶ：
５’－ａａｃｇｇｃｇｃａｃａａａａｇｃａ－３’（配列番号：５１）
　結果を図３Ａに示した。図３Ａ中、「（－）」は、無処理の結果を示し、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、二本鎖核酸分子をトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２、３、５、７、８、１０」は、それぞれ「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２、３、５、７、８、１０」をトランスフェクションしたものの結果を示す。
　図３Ａの結果から、本発明の「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２、３、５、７、８、１０」は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌに比べてＲＮＡレベルでのＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現を抑制することが明らかになった。
（試験例３－２：二本鎖核酸分子によるｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制効果の検討）
　前記製造例１で得られたｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２、３、５、７、８、又は１０を、乳癌細胞にトランスフェクションし、その後の細胞増殖を測定することにより、各二本鎖核酸分子の乳癌細胞増殖抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
　なお、コントロールとして、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌを用いた。
　実験方法の詳細を以下に示す。
［細胞］
　前記乳癌細胞として、ヒト乳がん細胞株であるＭＣＦ－７細胞を用いた。
［細胞培養］
　ＭＣＦ－７細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社製）を細胞培養液として用い、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。
［トランスフェクション］
　９６穴プレートに、ＭＣＦ－７細胞を３×１０３個／穴となるようにまき、その翌日に、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びトランスフェクション試薬であるＲＮＡｉ　ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて二本鎖核酸分子をトランスフェクションした。導入した二本鎖核酸分子の量は、培地中で１ｎＭとなるように調整した。
［細胞増殖試験］
　細胞増殖試験は、トランスフェクション１日後、５日後にＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）を用いて２時間反応させ、マイクロプレートリーダーにて吸光度４５０ｎｍで細胞増殖能を測定することにより行った。前記試験は、テトラゾリウム塩ＷＳＴ－８［２－（２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（２，４－ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ］を高水溶性ホルマザン色素に還元する際の酵素活性を比色定量することによって生細胞数を測定するものである。
　結果を図３Ｂに示した。図３Ｂ中、「（－）」は、無処理の結果を示し、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、二本鎖核酸分子をトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２、３、５、７、８、１０」は、それぞれ「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２、３、５、７、８、１０」をトランスフェクションしたものの結果を示す。また、「Ｄａｙ１」、「Ｄａｙ５」は、それぞれトランスフェクション１日後、５日後の結果を示す。また、「＊＊」は、「Ｐ＜０．０１」を示す。
　図３Ｂの結果から、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２が最も細胞増殖抑制能に優れており、次いで、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、８、７の順に、有意（Ｐ＜　０．０１）に細胞増殖を抑制することが明らかになった。
（試験例３－３：二本鎖核酸分子による標的非コードＲＮＡ発現抑制効果の検討）
　前記試験例３－１において、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２、３、５、７、８、又は１０を用いていた点を、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、又は２に代え、乳癌細胞としてＭＣＦ－７細胞を用いていた点を下記ＯＨＴＲ細胞に代えた以外は、前記試験例３－１と同様にして、各二本鎖核酸分子のＯＨＴＲ細胞におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１（配列番号：１）発現に対する抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
［細胞］
　前記ＯＨＴＲ細胞は、前記ＭＣＦ－７細胞から以下のようにして作出した乳癌治療抵抗性モデルである、タモキシフェン耐性細胞である。
＜ＯＨＴＲ細胞の作出＞
　前記ＭＣＦ－７細胞を抗エストロゲン剤である４－ヒドロキシタモキシフェン（１μＭ）を含有するＤＭＥＭ培地で３カ月以上培養することにより、４－ヒドロキシタモキシフェンに対して耐性を獲得した細胞（ＯＨＴＲ細胞）を作出した。
［細胞培養］
　ＯＨＴＲ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社製）を細胞培養液として用い、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。
　非コードＲＮＡ発現レベルを測定した結果を図３Ｃに示した。図３Ｃ中、「（－）」は、無処理の結果を示し、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、二本鎖核酸分子をトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２」は、それぞれ「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２」をトランスフェクションしたものの結果を示す。
　図３Ｃの結果から、本発明の「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２」は、いずれもＯＨＴＲ細胞において、ＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現を抑制することが示された。
（試験例３－４：二本鎖核酸分子によるｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制効果の検討）
　前記試験例３－２において、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２、３、５、７、８、又は１０を用いていた点を、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、又は２に代え、乳癌細胞としてＭＣＦ－７細胞を用いていた点を前記試験例３－２と同様にして調製したＯＨＴＲ細胞に代えた以外は、前記試験例３－２と同様にして、各二本鎖核酸分子のＯＨＴＲ細胞増殖抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
　細胞増殖試験の結果を図３Ｄに示した。図３Ｄ中、「（－）」は、無処理の結果を示し、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、二本鎖核酸分子をトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２」は、それぞれ「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２」をトランスフェクションしたものの結果を示す。また、「Ｄａｙ１」、「Ｄａｙ５」は、それぞれトランスフェクション１日後、５日後の結果を示す。また、「＊＊」は、「Ｐ＜０．０１」を示す。
　図３Ｄの結果から、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１及びｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌよりも有意（Ｐ＜　０．０１）に細胞増殖を抑制することが明らかになった。
（試験例３－５：二本鎖核酸分子による標的非コードＲＮＡ発現抑制効果の検討）
　前記試験例３－３において、乳癌細胞としてＭＣＦ－７細胞を用いていた点を子宮内膜癌細胞であるＩｓｈｉｋａｗａ細胞に代えた以外は、前記試験例３－３と同様にして、各二本鎖核酸分子のＩｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＴＭＰＯ－ＡＳ１（配列番号：１）発現に対する抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
［細胞培養］
　Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社製）を細胞培養液として用い、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。
　非コードＲＮＡ発現レベルを測定した結果を図３Ｅに示した。図３Ｅ中、「（－）」は、無処理の結果を示し、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、二本鎖核酸分子をトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２」は、それぞれ「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２」をトランスフェクションしたものの結果を示す。
　図３Ｅの結果から、本発明の「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２」は、いずれもＩｓｈｉｋａｗａ細胞において、ＴＭＰＯ－ＡＳ１の発現を抑制し、特に、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２がその効果が高いことが示された。
（試験例３－６：二本鎖核酸分子によるｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制効果の検討）
　前記試験例３－４において、乳癌細胞としてＭＣＦ－７細胞を用いていた点を子宮内膜癌細胞であるＩｓｈｉｋａｗａ細胞に代えた以外は、前記試験例３－４と同様にして、各二本鎖核酸分子のＩｓｈｉｋａｗａ細胞増殖抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
　なお、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞の培養は、前記試験例３－５と同様にして行った。
　細胞増殖試験の結果を図３Ｆに示した。図３Ｆ中、「（－）」は、無処理の結果を示し、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、二本鎖核酸分子をトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２」は、それぞれ「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２」をトランスフェクションしたものの結果を示す。また、「Ｄａｙ１」、「Ｄａｙ５」は、それぞれトランスフェクション１日後、５日後の結果を示す。また、「＊＊」は、「Ｐ＜０．０１」を示す。
　図３Ｆの結果から、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１及びｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌよりも有意（Ｐ＜　０．０１）に細胞増殖を抑制することが明らかになった。
（試験例４－１：二本鎖核酸分子による標的非コードＲＮＡ発現抑制効果の検討）
　前記試験例３－１において、標的非コードＲＮＡをＴＭＰＯ－ＡＳ１（配列番号：１）としていた点をＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ（配列番号：２～４）に代え、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２、３、５、７、８、又は１０を用いていた点をｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、又は９に代え、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲにおいてＴＭＰＯ－ＡＳ１（配列番号：１）の発現レベルを測定していた点を、ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ（配列番号：２～４）の発現レベルを測定した以外は、前記試験例３－１と同様にして、各二本鎖核酸分子のＭＣＦ－７細胞におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ（配列番号：２～４）発現に対する抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
　なお、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲに用いたＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ（配列番号：２～４）のプライマーは、以下のとおりである。
－ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ（配列番号：２～４）－
ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ＿ＦＷ：
５’－ｇｃｃａｇｇｇｃｔｃａｔｃｔｃｃｔａｔｇ－３’（配列番号：４８）
ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ＿ＲＶ：
５’－ｇｇａｇａｔｃａｇｇｇａｇａｃｔｇｇａｇａｃｔ－３’（配列番号：４９）
　結果を図４Ａに示した。図４Ａ中、「（－）」は、無処理の結果を示し、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、二本鎖核酸分子をトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」は、それぞれ「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」をトランスフェクションしたものの結果を示す。
　図４Ａの結果から、本発明の「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌに比べてＲＮＡレベルでのＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ（配列番号：２～４）の発現を抑制することが明らかになった。
（試験例４－２：二本鎖核酸分子によるｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制効果の検討）
　前記試験例３－２において、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２、３、５、７、８、又は１０を用いていた点をｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、又は９に代えた以外は、前記試験例３－２と同様にして、各二本鎖核酸分子のＭＣＦ－７細胞増殖抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
　結果を図４Ｂに示した。図４Ｂ中、「（－）」は、無処理の結果を示し、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、二本鎖核酸分子をトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」は、それぞれ「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」をトランスフェクションしたものの結果を示す。また、「Ｄａｙ１」、「Ｄａｙ５」は、それぞれトランスフェクション１日後、５日後の結果を示す。また、「＊＊」は、「Ｐ＜０．０１」を示す。
　図４Ｂの結果から、ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－２、５、６、７、９は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌよりも有意（Ｐ＜０．０１）に細胞増殖を抑制した。このうち、ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－５が最も細胞増殖抑制能に優れていることが明らかになった。
（試験例４－３：二本鎖核酸分子による標的非コードＲＮＡ発現抑制効果の検討）
　前記試験例４－１において、乳癌細胞としてＭＣＦ－７細胞を用いていた点を前記試験例３－２と同様にして調製したＯＨＴＲ細胞に代えた以外は、前記試験例４－１と同様にして、各二本鎖核酸分子のＯＨＴＲ細胞におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ（配列番号：２～４）発現に対する抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
　非コードＲＮＡ発現レベルを測定した結果を図４Ｃに示した。図４Ｃ中、「（－）」は、無処理の結果を示し、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、二本鎖核酸分子をトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」は、それぞれ「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」をトランスフェクションしたものの結果を示す。
　図４Ｃの結果から、本発明の「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」は、いずれもＯＨＴＲ細胞において、ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ（配列番号：２～４）の発現を抑制することが示された。
（試験例４－４：二本鎖核酸分子によるｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制効果の検討）
　前記試験例４－２において、乳癌細胞としてＭＣＦ－７細胞を用いていた点を前記試験例３－２と同様にして調製したＯＨＴＲ細胞に代えた以外は、前記試験例４－２と同様にして、各二本鎖核酸分子のＯＨＴＲ細胞増殖抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
　細胞増殖試験の結果を図４Ｄに示した。図４Ｄ中、「（－）」は、無処理の結果を示し、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、二本鎖核酸分子をトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」は、それぞれ「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」をトランスフェクションしたものの結果を示す。また、「Ｄａｙ１」、「Ｄａｙ５」は、それぞれトランスフェクション１日後、５日後の結果を示す。また、「＊＊」は、「Ｐ＜０．０１」を示す。
　図４Ｄの結果から、ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌよりも有意（Ｐ＜０．０１）に細胞増殖を抑制することが明らかになった。
（試験例４－５：二本鎖核酸分子による標的非コードＲＮＡ発現抑制効果の検討）
　前記試験例４－１において、乳癌細胞としてＭＣＦ－７細胞を用いていた点を子宮内膜癌細胞であるＩｓｈｉｋａｗａ細胞に代えた以外は、前記試験例４－１と同様にして、各二本鎖核酸分子のＩｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ（配列番号：２～４）発現に対する抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
　なお、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞の培養は、前記試験例３－５と同様にして行った。
　非コードＲＮＡ発現レベルを測定した結果を図４Ｅに示した。図４Ｅ中、「（－）」は、無処理の結果を示し、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、二本鎖核酸分子をトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」は、それぞれ「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」をトランスフェクションしたものの結果を示す。
　図４Ｅの結果から、本発明の「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」は、いずれもＩｓｈｉｋａｗａ細胞において、ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ（配列番号：２～４）の発現を抑制することが示された。
（試験例４－６：二本鎖核酸分子によるｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制効果の検討）
　前記試験例４－２において、乳癌細胞としてＭＣＦ－７細胞を用いていた点を子宮内膜癌細胞であるＩｓｈｉｋａｗａ細胞に代えた以外は、前記試験例４－２と同様にして、各二本鎖核酸分子のＩｓｈｉｋａｗａ細胞増殖抑制効果（ノックダウン効果）を検討した。
　なお、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞の培養は、前記試験例３－５と同様にして行った。
　細胞増殖試験の結果を図４Ｆに示した。図４Ｆ中、「（－）」は、無処理の結果を示し、「Ｒｅａｇｅｎｔ」は、二本鎖核酸分子をトランスフェクションしなかったもの（試薬のみ）の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」は、それぞれ「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、２、５、６、７、９」をトランスフェクションしたものの結果を示す。また、「Ｄａｙ１」、「Ｄａｙ５」は、それぞれトランスフェクション１日後、５日後の結果を示す。また、「＊＊」は、「Ｐ＜０．０１」を示す。
　図４Ｆの結果から、ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、５、６、７、９は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌよりも有意（Ｐ＜０．０１）に細胞増殖を抑制することが明らかになった。
（試験例５：二本鎖核酸分子によるｉｎ　ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果の検討）
　前記製造例１で用意した二本鎖核酸分子のうち、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２、及びｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－５のそれぞれについて、マウスの皮下に腫瘍細胞を移植し、その腫瘍に対する増殖抑制効果を検討した。
　前記ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２及びｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－５は、ＭＣＦ－７細胞において、ＲＮＡレベルでの発現抑制効果と細胞増殖抑制効果とが共に高かったものである。
　なお、コントロールとして、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌを用いた。
　実験方法の詳細を以下に示す。
［細胞］
　前記腫瘍細胞として、ヒト乳がん細胞株であるＭＣＦ－７細胞を用いた。
［マウス］
　前記マウスとして、日本クレア株式会社より購入したメスの８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕ）を用いた。
［腫瘍細胞の皮下移植］
　前記ＭＣＦ－７細胞をヌードマウス一匹あたり４×１０６個になるようにＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）７５μＬ中に調整し、更に、マトリゲル（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）７５μＬと混合した。前記混合物をマウスの皮下に注入した。
［二本鎖核酸分子の投与（注入）］
　マウスへ腫瘍細胞を移植後、腫瘍体積が１００ｍｍ３を超えたところから、前記各二本鎖核酸分子の注入を週２回行った。
　前記二本鎖核酸分子腫瘍内への注入は、ＲＮＡｉ　ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて行った。即ち、二本鎖核酸分子　５μｇをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）５０μＬに懸濁したものと、ＲＮＡｉ　ＭＡＸ　１５μＬをＯｐｔｉ－ＭＥＭ　５０μＬに懸濁したものとを混合したものをマウスの腫瘍内へ局注した。
［腫瘍増殖の測定、評価］
　マウスの腫瘍の大きさは、週２回計測した。
　腫瘍体積は、長径（ｒ１）と、短径（ｒ２，ｒ３）を２か所とを計測し、「｛長径（ｒ１）（ｍｍ）×短径（ｒ２）（ｍｍ）×短径（ｒ３）（ｍｍ）｝／２〕の式により算出した。
　結果を図５Ａ及び５Ｂに示した。
　図５Ａは、二本鎖核酸分子投与開始６週間後に撮影した代表的な腫瘍の状態を示す図である（上段：ｓｉＣｏｎｔｒｏｌを投与、中段：ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２を投与、下段：ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－５を投与）。
　図５Ｂは、腫瘍体積の変化を表したグラフである。図５Ｂ中、「■」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」を投与したマウス（ｎ＝８）における結果を示し、「○」は、「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２」を投与したマウス（ｎ＝９）における結果を示し、「▲」は、「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－５」を投与したマウス（ｎ＝８）における結果を示す。また、同図中、「＊」は、ｐ＜０．０５を表す。
　図５Ａ及び５Ｂの結果から、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２又はｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－５の投与により、マウスにおけるＭＣＦ－７細胞由来の腫瘍の増殖が有意に抑制されることが明らかになった。
（試験例６－１：二本鎖核酸分子によるｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞移動抑制効果の検討）
　前記製造例１で得られたｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、又は２を、乳癌細胞にトランスフェクションし、その後、細胞の移動を測定することにより、各二本鎖核酸分子の乳癌細胞移動抑制効果を検討した。
　なお、コントロールとして、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌを用いた。
　実験方法の詳細を以下に示す。
［細胞］
　前記乳癌細胞として、ヒト乳がん細胞株であるＭＣＦ－７細胞を用いた。
［細胞培養］
　ＭＣＦ－７細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社製）、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社製）を細胞培養液として用い、空気中に５％の炭酸ガスを含む培養器内にて３７℃で培養した。
［トランスフェクション］
　９６穴プレートに、ＭＣＦ－７細胞を３×１０３個／穴となるようにまき、その翌日に、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びトランスフェクション試薬であるＲＮＡｉ　ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて二本鎖核酸分子をトランスフェクションした。導入した二本鎖核酸分子の量は、培地中で１０ｎＭとなるように調整した。
［細胞移動試験］
　細胞移動試験は、トランスフェクションの２日後又は３日後に、細胞を培養チャンバー（Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔ　ｗｉｔｈ　８．０－μｍ　ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ　ＰＥＴ　ｆｉｌｔｅｒ（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））内に、５０，０００個／穴の濃度で播種し、更に３日間インキュベーションした。その後、培養チャンバーをメタノール固定後、ギムザ染色液により染色し、培養チャンバーのフィルターを通過した細胞を顕微鏡下で少なくとも５視野以上計測することにより行った。
　結果を図６Ａに示した。図６Ａ中、「ＴＦ（－）」は、無処理の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２」は、それぞれ「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、２」をトランスフェクションしたものの結果を示す。また、「＊＊」は、「ｐ＜０．０１」を示す。
　図６Ａの結果から、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１又は２で処理したＭＣＦ－７細胞は、コントロールであるｓｉＣｏｎｔｒｏｌで処理したＭＣＦ－７細胞よりも細胞移動数が少ないことが明らかになり、本発明の二本鎖核酸分子は、癌細胞の移動を抑制することが示された。
（試験例６－２：二本鎖核酸分子によるｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞移動抑制効果の検討）
　前記試験例６－１において、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－１、又は２を用いていた点をｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、又は５に代えた以外は、前記試験例６－１と同様にして、各二本鎖核酸分子の細胞移動抑制効果を検討した。
　結果を図６Ｂに示した。図６Ｂ中、「ＴＦ（－）」は、無処理の結果を示し、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」をトランスフェクションしたものの結果を示し、「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、５」は、それぞれ「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、５」をトランスフェクションしたものの結果を示す。また、「＊」は、「Ｐ＜０．０５」を示し、「＊＊」は、「Ｐ＜０．０１」を示す。
　図６Ｂの結果から、ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１又は５で処理したＭＣＦ－７細胞は、コントロールであるｓｉＣｏｎｔｒｏｌで処理したＭＣＦ－７細胞よりも細胞移動数が少ないことが明らかになり、本発明の二本鎖核酸分子は、癌細胞の移動を抑制することが示された。
（試験例７：二本鎖核酸分子によるｉｎ　ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果の検討）
　前記製造例１で用意した二本鎖核酸分子のうち、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２、ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、及びｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－５のそれぞれについて、マウスの皮下に腫瘍細胞を移植し、その腫瘍に対する増殖抑制効果を検討した。
　なお、コントロールとして、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌを用いた。
　実験方法の詳細を以下に示す。
［細胞］
　前記腫瘍細胞として、乳癌治療抵抗性モデルである、タモキシフェン耐性細胞であるＯＨＴＲ細胞を用いた。なお、前記ＯＨＴＲ細胞は、前記試験例３－３と同様にして作出した。
［マウス］
　前記マウスとして、日本クレア株式会社より購入したメスの８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕ）を用いた。
［腫瘍細胞の皮下移植］
　前記ＯＨＴＲ細胞をヌードマウス一匹あたり２０，０００，０００個になるようにＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）７５μＬ中に調整し、更に、マトリゲル（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）７５μＬと混合した。前記混合物をマウスの皮下に注入した。
［二本鎖核酸分子の投与（注入）］
　マウスへ腫瘍細胞を移植後、腫瘍体積が３００ｍｍ３を超えたところから、前記各二本鎖核酸分子の注入を週２回行った。
　前記二本鎖核酸分子腫瘍内への注入は、ＲＮＡｉ　ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて行った。即ち、二本鎖核酸分子　５μｇをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）５０μＬに懸濁したものと、ＲＮＡｉ　ＭＡＸ　１５μＬをＯｐｔｉ－ＭＥＭ　５０μＬに懸濁したものとを混合したものをマウスの腫瘍内へ局注した。
［腫瘍増殖の測定、評価］
　マウスの腫瘍の大きさは、週２回計測した。
　腫瘍体積は、長径（ｒ１）と、短径（ｒ２，ｒ３）を２か所とを計測し、「｛長径（ｒ１）（ｍｍ）×短径（ｒ２）（ｍｍ）×短径（ｒ３）（ｍｍ）｝／２〕の式により算出した。
　結果を図７Ａ及び７Ｂに示した。
　図７Ａは、二本鎖核酸分子投与開始６週間後に撮影した代表的な腫瘍の状態を示す図である（左上：ｓｉＣｏｎｔｒｏｌを投与、左下：ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１を投与、右上：ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－５を投与、右下：ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２を投与）。
　図７Ｂは、腫瘍体積の変化を表したグラフである。図７Ｂ中、「■」は、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」を投与したマウス（ｎ＝７）における結果を示し、「○」は、「ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２」を投与したマウス（ｎ＝６）における結果を示し、「□」は、「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１」を投与したマウス（ｎ＝８）における結果を示し、「▲」は、「ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－５」を投与したマウス（ｎ＝７）における結果を示す。また、同図中、「＊」は、「Ｐ＜０．０５」を示し、「＊＊」は、「Ｐ＜０．０１」を示す。
　図７Ａ及び７Ｂの結果から、ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２、ｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－１、又はｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－５の投与により、マウスにおけるＯＨＴＲ細胞由来の腫瘍の増殖が有意に抑制されることが明らかになった。
　以上の試験例１～試験例７により、乳癌細胞ＭＣＦ－７を用いて、新たな非コードＲＮＡとして同定されたＴＭＰＯ－ＡＳ１及びＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘは、ＭＣＦ－７細胞以外の乳癌細胞や乳癌以外の癌由来細胞においても発現しており、更に、乳癌の臨床サンプルを用いた解析によってもその発現が明らかになった。そのため、ＴＭＰＯ－ＡＳ１及びＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘは、臨床においても乳癌をはじめとする様々な癌に関与していることが示唆された。
　また、ＴＭＰＯ－ＡＳ１、ＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘに対して、ノックダウン効果が高い二本鎖核酸分子が得られた。
　前記二本鎖核酸分子は、ＭＣＦ－７細胞、乳癌治療抵抗性モデルであるＯＨＴＲ細胞、子宮内膜癌由来のＩｓｈｉｋａｗａ細胞において細胞増殖を抑制することが確かめられた。前記二本鎖核酸分子が同じ配列でも細胞間による効果の違いが認められたのは、トランスフェクション効率や、遺伝子発現量の差によるものと思われる。
　非コードＲＮＡの発現抑制効率及び細胞増殖抑制効果の優れていた前記ｓｉＴＭＰＯ－ＡＳ１－２及びｓｉＣＯＬ１８Ａ１－ＡＳｘ－５では、顕著な腫瘍増殖抑制効果が認められた。そのため、その他の細胞レベルで効果が認められた二本鎖核酸分子についても癌治療に役立つと考えられる。
　また、本発明の二本鎖核酸分子は、乳癌細胞の移動を抑制することが示された。
　更に、前記二本鎖核酸分子は、治療耐性乳癌細胞を移植したマウスにおける腫瘍の増殖を抑制することも確認された。
　したがって、前記非コードＲＮＡは、ホルモン療法抵抗性の乳癌を含む乳癌をはじめとする各種癌において、腫瘍増殖を促進する働きを有し、乳癌治療及び診断の分子標的となり得ることが示された。更に、これら非コードＲＮＡの発現の抑制剤、特にｓｉＲＮＡは、ホルモン療法抵抗性の乳癌細胞を含む乳癌細胞をはじめとする各種癌細胞において増殖抑制効果を有し、これら癌の治療に臨床応用可能である。
　また、前記非コードＲＮＡを標的とする二本鎖核酸分子は、現存のエストロゲン作用及びＨＥＲ２に対する乳癌治療薬とは作用機構が異なる新しい治療分子標的となりうると考えられる。
　また、前記非コードＲＮＡの作用から癌の増殖メカニズムを解き明かし、病態解明へ応用することも可能となると考えられる。
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞　非コードＲＮＡの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
　前記二本鎖核酸分子が、
（ａ）配列番号：５～１１、及び２６～３１のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、
（ｂ）前記（ａ）のセンス鎖と二本鎖を形成する該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含み、
　前記非コードＲＮＡが、配列番号：１～４で表される塩基配列及びその一部の少なくともいずれかを含むことを特徴とする二本鎖核酸分子である。
＜２＞　センス鎖が、配列番号：５、６、９、１０、２７、２８、２９、３０、及び３１のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖である前記＜１＞に記載の二本鎖核酸分子である。
＜３＞　センス鎖が、配列番号：６、及び２８のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜４＞　二本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ－ＤＮＡキメラのいずれかである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜５＞　ｓｉＲＮＡ及びキメラｓｉＲＮＡのいずれかである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜６＞　ｓｉＲＮＡである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
＜７＞　前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡである。
＜８＞　前記＜７＞に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクターである。
＜９＞　前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、前記＜７＞に記載のＤＮＡ、及び前記＜８＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞増殖抑制剤である。
＜１０＞　癌細胞が、乳癌細胞である前記＜９＞に記載の癌細胞増殖抑制剤である。
＜１１＞　乳癌細胞が、ホルモン療法抵抗性の乳癌細胞である前記＜１０＞に記載の癌細胞増殖抑制剤である。
＜１２＞　癌細胞に、前記＜９＞から＜１１＞のいずれかに記載の癌細胞増殖抑制剤を作用させることを特徴とする癌細胞の増殖抑制方法である。
＜１３＞　癌細胞が、乳癌細胞である前記＜１２＞に記載の癌細胞の増殖抑制方法である。
＜１４＞　乳癌細胞が、ホルモン療法抵抗性の乳癌細胞である前記＜１３＞に記載の癌細胞の増殖抑制方法である。
＜１５＞　前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、前記＜７＞に記載のＤＮＡ、及び前記＜８＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞移動抑制剤である。
＜１６＞　癌細胞が、乳癌細胞である前記＜１５＞に記載の癌細胞移動抑制剤である。
＜１７＞　乳癌細胞が、ホルモン療法抵抗性の乳癌細胞である前記＜１６＞に記載の癌細胞移動抑制剤である。
＜１８＞　癌細胞に、前記＜１５＞から＜１７＞のいずれかに記載の癌細胞移動抑制剤を作用させることを特徴とする癌細胞の移動抑制方法である。
＜１９＞　癌細胞が、乳癌細胞である前記＜１８＞に記載の癌細胞の移動抑制方法である。
＜２０＞　乳癌細胞が、ホルモン療法抵抗性の乳癌細胞である前記＜１９＞に記載の癌細胞の移動抑制方法である。
＜２１＞　癌を予防乃至治療するための医薬であって、前記＜９＞から＜１１＞のいずれかに記載の癌細胞増殖抑制剤、及び前記＜１５＞から＜１７＞のいずれかに記載の癌細胞移動抑制剤の少なくともいずれかを含むことを特徴とする医薬である。
＜２２＞　癌が、乳癌である前記＜２１＞に記載の医薬である。
＜２３＞　乳癌が、ホルモン療法抵抗性の乳癌である前記＜２２＞に記載の医薬である。
＜２４＞　個体に、前記＜２１＞から＜２３＞のいずれかに記載の医薬を投与することを特徴とする癌の予防乃至治療方法である。
＜２５＞　癌が、乳癌である前記＜２４＞に記載の癌の予防乃至治療方法である。
＜２７＞　乳癌が、ホルモン療法抵抗性の乳癌である前記＜２５＞に記載の癌の予防乃至治療方法である。

Claims (10)

  1. 　非コードＲＮＡの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
    　前記二本鎖核酸分子が、
    （ａ）配列番号：５～１１、及び２６～３１のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、
    （ｂ）前記（ａ）のセンス鎖と二本鎖を形成する該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖とを含み、
    　前記非コードＲＮＡが、配列番号：１～４で表される塩基配列及びその一部の少なくともいずれかを含むことを特徴とする二本鎖核酸分子。
  2. 　センス鎖が、配列番号：５、６、９、１０、２７、２８、２９、３０、及び３１のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖である請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
  3. 　センス鎖が、配列番号：６、及び２８のいずれかで表される標的配列に対応するヌクレオチド配列を含むセンス鎖である請求項１から２のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
  4. 　二本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ－ＤＮＡキメラのいずれかである請求項１から３のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
  5. 　ｓｉＲＮＡ及びキメラｓｉＲＮＡのいずれかである請求項１から４のいずれかに記載の二本鎖核酸分子。
  6. 　請求項１から５のいずれかに記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡ。
  7. 　請求項６に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
  8. 　請求項１から５のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、請求項６に記載のＤＮＡ、及び請求項７に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞増殖抑制剤。
  9. 　請求項１から５のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、請求項６に記載のＤＮＡ、及び請求項７に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞移動抑制剤。
  10. 　癌を予防乃至治療するための医薬であって、請求項８に記載の癌細胞増殖抑制剤、及び請求項９に記載の癌細胞移動抑制剤の少なくともいずれかを含むことを特徴とする医薬。
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