CN110964832A

CN110964832A - 肺癌诊断和治疗的靶基因

Info

Publication number: CN110964832A
Application number: CN201911422785.0A
Authority: CN
Inventors: 杨承刚; 高舒欣; 黄露宁
Original assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-04-07

Abstract

本发明公开了肺癌诊断和治疗的靶基因，所述靶基因为AC103718.1。本发明公开了AC103718.1在肺鳞癌中表达显著上调，为此AC103718.1可充当肺癌的诊断标志物用于判断受试者是否患有肺癌，本发明同时公开了针对AC103718.1的siRNA可以影响癌细胞的增殖和迁移，为此AC103718.1可以作为药物靶标用于肺鳞癌的治疗。

Description

肺癌诊断和治疗的靶基因

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及肺癌诊疗用lncRNA标志物，具体的标志物为AC103718.1。

背景技术

肺癌是癌症相关死亡的主要原因之一，也是全球发生率最高、死亡率最高的肿瘤，根据美国癌症协会统计的数据，2018年美国大约有新的肺癌病例234,030例，其死亡例数大约为154,050例，5年总体生存率仍然很差(10-15％)(Siegel RL,Miller KD and JemalA.Cancer statistics,2019[J].CA Cancer JClin,2019,69(1):7-34.)，并且其男性患者远远高于女性，肺癌在癌症中的高发病率、高死亡率，病情进展快，治疗效果不佳，不仅严重影响国内外人民的生活水平，而且也加重家庭社会经济负担。肺癌的病因目前尚不清楚，可能与先天遗传、后天环境有关，如环境污染、吸烟、电离辐射、放射性物质、饮食等有关。

肺癌按组织病理类型分类，一般分为非小细胞肺癌(Non small cell lungcancer,NSCLC)和小细胞肺癌(Small cell lung cancer)，其中非小细胞肺癌包括肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LUAD)、肺鳞状细胞癌(Lung squamous cell carcinoma，LUSC)和大细胞肺癌，在所有肺癌中，超过85％被归类为非小细胞肺癌(NSCLC)，尽管近年来在肺癌研究、筛查和治疗方面取得了很大进展，但五年生存率并没有大幅度提高，根据地区和阶段的差异，肺鳞癌患者5年生存率从4％-17％不等，非小细胞肺癌目前主要的治疗手段有手术、放疗、化疗、免疫检查点抑制剂治疗及靶向治疗等(Tajima S,Takanashi Y,Koda K,etc.Squamous cell carcinoma of the lung with highly proliferatingfibromatosis-like stroma:a rare phenomenon[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8:5870-5876；Hirsch,FR,etc.Lung cancer:current therapies and new targetedtreatments[J].Lancet,2017,389:299-311.)。在非小细胞肺癌中，肺鳞状细胞癌(LUSC)约占30％，与肺腺癌(LUAD)不同，肺鳞癌起始于鳞状细胞，这些细胞的组织学类型看起来像鱼鳞，所以称之为肺鳞癌，值得关注的是，肺鳞癌和肺腺癌之间有着截然不同的机制，主要表现在肿瘤发生发展过程中遗传和表观遗传学特征的显著不同(Takamochi K,Ohmiya H,Itoh M,etc.Novel biomarkers that assist in accurate discrimination ofsquamous cell carcinoma from adenocarcinoma of the lung[J].BMC Cancer,2016,16:760.)。

随着肺癌的诊疗从最开始的临床症状学到组织病理学，再到现如今的分子生物学水平，逐步走向了精准治疗模式，治疗越来越精细，越来越个体化，其中肺腺癌的研究一步步取得了突破性进展，肺腺癌有着广泛的关键分子突变，这也导致了肺腺癌的研究力度远远大于肺鳞癌，随着研究的深入，越来越多与肺腺癌相关的原癌基因靶点进入公众的视野，成为肺腺癌领域炙手可热的“明星”靶点。而肺鳞癌由于缺乏特异性致癌驱动基因的突变，复发的肺鳞癌患者很少有治疗的选择，导致肺鳞癌患者的生存和预后都很差(Zhang XW,Chen SY,Xue DW,etc.Expression of Nemo-like kinase was increased andnegatively correlated with the expression of TCF4 in lung cancers[J].Int JClin Exp Pathol,2015,8:15086-15092.)，由于缺乏早期能够鉴别肺鳞癌的肿瘤特异性标志物来鉴别高复发、高死亡风险的肺鳞癌患者，很多肺鳞癌患者确诊的时候已经是晚期，失去了手术最佳时期，最后导致肺鳞癌患者5年的存活率仅为7％(Siege RL,Miller KD,andJemal A.Cancer statistics,2015[J].CA:a cancer journal for clinicians,2015,65(1):5-29)。寻找肺鳞癌有效诊断和治疗的靶点成为亟待解决的问题。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供肺癌诊断和治疗的靶基因。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种检测基因的试剂，所述试剂可以检测生物样品中AC103718.1的水平。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别AC103718.1的探针；或特异性扩增AC103718.1的引物。

进一步，所述特异性扩增AC103718.1的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明的第二方面提供了一种产品，所述产品包括本发明第一方面所述的试剂。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。

本发明的第三方面提供了一种组合物，所述组合物包括有效量的AC103718.1的抑制剂。

进一步，所述抑制剂下调AC103718.1的表达水平。其中，所述抑制剂选自：以AC103718.1或其转录本为靶序列、且能够抑制AC103718.1基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

进一步，所述抑制剂为双链分子，该分子包括有义链及其互补反义链。

进一步，所述抑制剂为siRNA。

进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～8所示。

本发明的第四方面提供了一种筛选治疗肺癌的候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：

使测试物质与表达AC103718.1基因的细胞接触；并

选择与在该测试物质不存在时检测到的表达水平相比降低AC103718.1基因的表达水平的测试物质。

本发明的第五方面提供了如下任一项应用：

a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断肺癌的工具中的应用；

b.本发明第二方面所述的产品在制备诊断肺癌的工具中的应用；

c.AC103718.1在构建诊断肺癌的计算模型中的应用；

d.AC103718.1在制备治疗肺癌的药物中的应用；

e.本发明第三方面所述的组合物在制备治疗肺癌的药物中的应用；

f.AC103718.1在筛选治疗肺癌的候选药物中的应用。

附图说明

图1是利用QPCR检测AC103718.1基因在肺癌组织中的表达情况图；

图2是检测siRNA对AC103718.1表达情况影响图；

图3是划痕实验检测AC103718.1对肺癌细胞迁移的影响图。

具体的实施方式

虽然任何与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明的实施方案，但是现在描述优选的方法、装置、和材料。然而，在描述本发明的材料和方法之前，要理解，本发明不限于本文中描述的特定大小、形状、尺度、材料、方法、方案等，因为这些可依照常规实验和优化而变化。还要理解，该描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围。

术语“生物样品”指完整生物体或其组织、细胞或组成部分(例如体液，包括但不仅限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、脐带血、尿液、阴道液和精液)的子集。“生物样品”进一步指从完整生物体或其细胞、组织或组成部分的子集制备的匀浆物、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或其部分。最后，“生物样品”指含有细胞成分(诸如蛋白质或多核苷酸)的培养基，诸如生物体已在其中繁殖的营养汤或凝胶。

术语“表达的水平”或“表达水平”一般指生物学样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本文中使用的，“表达”可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸的，翻译的多肽的，或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)，然后翻译成多肽的基因，还有转录成RNA但不翻译成多肽的基因(例如转运和核糖体RNA、miRNA、lncRNA、circRNA)。在本发明的特定的实施方式中，“表达的基因”是指转录成RNA但不翻译成多肽的基因。

“增加的表达”，“增加的表达水平”，“增加的水平”，“升高的表达”，“升高的表达水平”或“升高的水平”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体，内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的增加的表达或增加的水平。

“减少的表达”，“减少的表达水平”，“减少的水平”，“降低的表达”，“降低的表达水平”或“降低的水平”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体或内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的降低的表达或降低的水平。在一些实施方案中，降低的表达是很少的表达或不表达。

AC103718.1

转录AC103718.1的基因是位于人8号染色体上，本发明中的AC103718.1包括野生型、突变型或其片段。本领域技术人员知道，在进行测序分析时，会将原始测序结果比对到人的参考基因组上，因此筛选结果中的AC103718.1可能会包含不同的转录本，只要可以比对到参考基因组上的AC103718.1即可。在本发明的实施例中，一种代表性的转录AC103718.1基因的核苷酸序列如ENST00000646849.1所示。

根据本发明，测定在自受试者获得的癌细胞或组织中AC103718.1的表达水平，使用本领域已知方法，可在转录(核酸)产物水平上确定表达水平。举例而言，可通过杂交方法(例如，Northern杂交)使用探针定量AC103718.1的RNA。所述检测可在芯片或阵列上实施。对检测AC103718.1的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用AC103718.1的序列信息制备上述探针。举例而言，AC103718.1的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物来标记，例如染料、荧光物质和同位素，且所述基因的表达水平可以作为发生了杂交的标记物的强度检测。

本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件或低严格条件下与AC103718.1的RNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，而且在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下观察到。一般地，严格条件的温度选择比特定序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低大约5℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50％的与其靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm，平衡时50％的探针被占据。典型地，严格条件会是这样的：其中盐浓度小于大约1.0M钠离子，典型地大约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)，pH7.0-8.3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30℃，对于较长的探针或引物是至少大约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂，例如甲酰胺，来实现。

在本发明中，术语“双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，而且包括例如短干扰RNA(siRNA；例如双链核糖核酸(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA))和短干扰DNA/RNA(siD/R-NA；例如DNA和RNA的双链嵌合物(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小发夹嵌合物(shD/R-NA))。在本文中，“双链分子”也称作“双链核酸”、“双链核酸分子”、“双链多核苷酸”、“双链多核苷酸分子”、“双链寡核苷酸”和“双链寡核苷酸分子”。

术语“靶序列”指靶基因的RNA或cDNA序列内的某段核苷酸序列，如果将靶向该序列的双链分子导入表达靶基因的细胞中的话，会导致靶基因的整个基因的转录受到阻抑。对于基因的某个核苷酸序列，若包含与靶序列对应的序列的双链分子抑制表达该基因的细胞中该基因的表达，可确定其为靶序列。阻抑基因表达的双链多核苷酸可以由靶序列和长度为2至5个核苷酸的3’突出端(例如uu)的组成。

当靶序列通过cDNA序列来显示时，使用双链cDNA的有义链序列(即RNA序列转变成DNA序列的序列)来限定靶序列。双链分子包含有义链(其具有与靶序列对应的序列)和反义链(其具有与靶序列互补的序列)，而且该反义链与该有义链在互补序列处杂交以形成双链分子。

本文中使用的术语“siRNA“指阻止靶基因的过表达。使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括其中以DNA为模板转录RNA的那些。所述siRNA包括有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。所述siRNA可如此构建使得单个转录物具有靶基因的有义核酸序列与其互补的反义核酸序列，例如，发夹结构。所述siRNA可为dsRNA或shRNA。

本文中使用的术语“dsRNA”指包含相互互补序列的两个RNA分子的构建体，所述两个RNA分子通过所述互补序列退火以形成双链RNA分子。

在本发明中，术语“shRNA”是指：具有茎-环结构的siRNA，其包含彼此互补的第一区和第二区(即有义链和反义链)。两个区的互补程度和方向足以使两个区之间发生碱基配对，所述第一区和第二区通过环区连接在一起，而所述环是因为环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shRNA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链(intervening single-strand)”。

可通过将细胞与针对AC103718.1基因的双链分子、表达该分子的载体或包含同样分子的组合物接触来抑制表达AC103718.1基因的细胞的生长。可进一步将所述细胞与转染剂接触。合适的转染剂在本领域是已知的。短语“抑制细胞生长”表示所述细胞较之未暴露于所述分子的细胞以较低的速率增殖或具有降低的存活力。细胞生长可通过本领域已知技术测定，例如使用CCK-8、MTT细胞增殖测定。

任何种类的细胞的生长均可根据本方法进行阻抑，只要所述细胞表达或过表达本发明所述双链分子的靶基因。可作为例子的细胞包括肺癌细胞，诸如NSCLC和SCLC。

根据本发明的方法，为抑制细胞生长并借此治疗癌症，当施用多种所述双链分子(或表达同样分子的载体或含有同样分子的组合物)时，每个所述分子可具有不同结构，但作用于与相同靶序列匹配的RNA。或者，多种双链分子可作用于与相同基因的不同靶序列匹配的RNA，或作用于与不同基因的不同靶序列匹配的RNA。举例而言，所述方法可使用针对AC103718.1基因不同靶序列的双链分子。或者，例如，本方法可利用针对AC103718.1基因和其它基因的一种、两种或更多种靶序列的双链分子。

为抑制细胞生长，本发明的双链分子可直接以可实现该分子与对应RNA转录物结合的形式导入细胞。另外，如上所述，编码双链分子的DNA可作为载体导入细胞。为将双链分子和载体导入细胞，可使用转染增强剂。

当治疗导致临床效益，诸如AC103718.1基因表达的减少、受试者中癌症的尺寸、患病率(prevalence)、或转移潜力的降低时，可以认为该治疗是“有效”的。当预防性地适用治疗时，“有效”是指其延迟或防止癌症形成，或者预防或缓解癌症的临床症状。有效性结合特定肿瘤类型的任何公知的诊断或治疗方法来加以确定。

治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术去除癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和阻抑癌症发生、肿瘤消退、及降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防可降低患癌个体死亡率及改善其预后，降低其血液中肿瘤标志物的水平，及减轻其伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构成有效治疗和/或预防，包括10％、20％、30％或更多降低，或病情稳定。

为了治疗癌症，还可以将本发明的双链分子与不同于所述双链分子的药剂组合来施用于受试者。或者，本发明的双链分子还可以与其它旨在用于癌症治疗的治疗方法组合来施用于受试者。举例而言，本发明所述双链分子可与现在用于治疗癌症或预防癌症转移的治疗方法(例如，放射疗法，外科手术，以及使用化疗剂，如顺铂、卡铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔红霉素或他莫昔芬等的治疗)组合施用。

在本发明的方法中，双链分子可以裸双链分子的形式、以与投递物质相组合的形式，或者以表达双链分子的重组质粒或者病毒载体的形式施用于受试者。

用于与本发明的双链分子组合施用的合适的投递物质包括Mirus Transit TKO亲脂性物质、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚阳离子(例如聚赖氨酸)、或脂质体。一种优选的投递物质是脂质体。

脂质体能够帮助将双链分子投递至特定的组织如肺肿瘤组织中，还能够增加双链分子的血中半衰期。适合在本发明中使用的脂质体是由常规的囊泡形成性脂质(vesile-forming lipids)形成的，囊泡形成性脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂，以及甾醇，诸如胆固醇。对一些因素的考虑通常可以为脂质的选择提供指导，如期望的脂质体大小以及在血流中的脂质体的半衰期等。

本发明的双链分子可以通过适于将双链分子递送到癌症部位的任何手段来施用给受试者。例如，双链分子可以通过基因枪、电穿孔、或者其它合适的非消化道或肠内施用途径来施用。

合适的肠内施用途径包括口腔、直肠、或鼻内递送。

合适的非消化道施用途径包括血管内施用(例如静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和针对血管网络的导管滴注)，组织周围和组织内注射(例如肿瘤周围和肿瘤内注射)，皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如利用浸透压泵)，直接施加到癌症部位或其附近的区域，例如借助导管或其它放置装置(例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的栓剂或植入物)，和吸入。优选通过注射或输注将双链分子或载体施用到癌症部位或其附近。

本发明的双链分子可以以单一剂量或分多个剂量来施用。当本发明的双链分子的施用为输注方式时，输注可以是单个持续剂量，或者通过多次输注来施用。优选的是将药剂直接注射到癌症部位或其附近的组织中。特别优选的是将药剂多次注射到癌症部位或其附近的组织中。

在本发明中，“药物”、“药物组合物”可以通用。本发明的药物组合物特征为至少是无菌且不含热原的。

作为一种优选的实施方式，本发明的药物组合物包含至少一种本发明的双链分子或编码它们的载体(例如，以重量计为0.1％到90％)，或所述分子的生理学上可接受的盐，与生理上可接受的载体介质混合。生理学上可接受的载体介质优选水、缓冲水、生理盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸及类似物。

根据本发明，所述组合物可包含多种双链分子，其中每一个可针对相同基因的不同靶序列或不同基因的不同靶序列。举例而言，所述组合物可包含针对AC103718.1基因靶序列的双链分子。或者，例如，所述组合物可包含针对AC103718.1基因和其它基因的一种、两种或更多种靶序列的双链分子。

本发明的组合物可以是药物组合物。本发明的药物组合物中还可以包含传统的药用赋形剂和/或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定化剂、抗氧化剂、浸透压调节剂、缓冲剂、和pH调节剂。合适的添加剂包括：生理学生物相容性的缓冲剂(例如氨基丁三醇盐酸盐)、补加螯合剂(例如DTPA或DTPA-双酰胺等)，或钙螯合剂复合物(例如、钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)，或者，任选地，补加钙或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。本发明的药物组合物可以进行包装以便作为液体使用，或者也可以加以冷冻干燥。

对于固体组合物，可以使用常规的无毒固态载体；例如，药物级的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。

例如，用于口服施用的固体药物组合物中可以包含上述列举的任意载体和赋形剂，以及10-95％，优选25-75％的本发明的一种或多种双链分子。用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可以包含0.01-20wt％、优选1-10wt％的包被于上述脂质体中的一种或多种本发明的双链分子，以及推进剂。还可以根据需要包含载体，例如用于鼻内投递的卵磷脂等。

除上述之外，本组合物中还可以包含其它药学活性成分，只要它们不抑制本双链分子的体内功能。例如，上述组合物中可以包含常规用于癌症治疗的化疗药物。

统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 QPCR检测AC103718.1在肺癌中的表达情况

1、收集样本

收集46对肺鳞癌组织及其相对应的癌旁组织样本。

纳入标准：

1)病理诊断为肺鳞癌，2)样本的RNA表达量和临床病理信息完整。

排除标准：

1)患有肺鳞癌外其他恶性肿瘤，2)病例在标本收集之前接受过放化疗及靶向药物治疗。

2、RNA样品的制备及定量分析

使用Trizol试剂提取样本组织中的RNA，步骤如下：

将1mL Trizol在超净台里加入至玻璃匀浆瓶中，称取50-100mg的组织放入玻璃匀浆瓶内，将转速调至1500转左右，开始在冰水浴中进行匀浆，每研磨30s，停止30s，反复3-4次即可，样品体积不应超过Trizol体积10％，将加入Trizol的样品在室温放置10min，使核酸蛋白复合物完全分离，加入氯仿(Trizol：氯仿＝5:1)，剧烈振荡2min，每隔1分钟再晃动两下，5-6次后，再静止7min，4℃，12000rpm，离心15min，把上层水相转移到新的EP管中(约400μL，尽量不要吸取到中间层以免污染)，加入500μL异丙醇，室温放置10min，4℃，12000rpm，离心15min，离心后在管底出现白色沉淀，用移液器小心移去上清，加入1mL 75％预冷的乙醇，震荡洗涤沉淀。4℃，7500rpm，离心5min，小心弃掉上清；将EP管倒扣于滤纸上吸去多余的水分，并用10μL枪头小心吸取管内的液体(枪头不要接触RNA)，将EP管室温放置5min；加入50μL无RNase的水(DEPC水)，用naodrop检测OD值与浓度，在管上做好标记；置于-80℃冰箱保存。

3、QPCR

1)逆转录反应

采用天根公司的FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行lncRNA反转录，步骤如下：

首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×Fast RT Bμffer2.0μl，RT Enzyme Mix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH₂O 5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

2)引物设计

根据Genebank中AC103718.1基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，其中扩增AC103718.1基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2(F：5’-TTGATTCTGAGACCTTGAC-3’；R：5’-TATCTTCTTCCAGGCATTC-3’)所示，扩增内参基因的引物对序列如SEQ ID NO.3～4(F：5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’，R：5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’)所示。

3)QPCR扩增检验

用ABI 7300型荧光定量PCR仪，采用2^-△△CT法进行数据的相对定量分析。

使用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。Real time反应体系为：2×SuperReal PreMix Plus 10μl，正反向引物(10μM)各0.6μl，5×ROX Reference Dye^△2μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×45个循环，60-95℃绘制熔点曲线。

4、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。对变量AC103718.1进行ROC曲线分析，判断基因的诊断效能、灵敏度和特异性。

5、结果

QPCR结果如图1所示，与癌旁组织相比，AC103718.1在肺癌组织中表达上调，上调约31.6倍，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示AC103718.1在肺癌的诊断中具有较高的应用价值。

ROC曲线分析表明AC103718.1可以作为生物标志物应用于肺鳞癌的诊断。其曲线下面积为0.895，可以有效的区分肺鳞癌患者。

实施例2 AC103718.1基因的沉默

1、细胞培养

采用添加了10％胎牛血清和P/S的DMEM培养基，对肺鳞癌细胞株H2170细胞进行培养。细胞贴壁生长，放置在条件为5％CO₂、湿度37℃恒温培养箱内培养。

2、siRNA的设计

设计合成针对AC103718.1基因的siRNA，siRNA-AC103718.1以及通用阴性对照siRNA-NC购自上海吉码基因化学技术有限公司。针对AC103718.1的siRNA的序列为F：5’-AAUUCACUCACAUUUCCAGUC-3’(SEQ ID NO.5)；R：5’-CUGGAAAUGUGAGUGAAUUCU-3’(SEQ IDNO.6)(siRNA1)；正义链：5’-UUACAUGUAGUAACAUCUCCA-3’(SEQ ID NO.7)，反义链：5’-GAGAUGUUACUACAUGUAAGA-3’(SEQ ID NO.8)(siRNA2)

3、转染

转染前一天，取对数生长期的细胞进行稀释，密度为2×10⁵个/ml，将稀释后的细胞接种在24孔板上，每孔0.5ml，将细胞分为空白对照组，阴性对照组(转染siRNA-NC)、实验组(siRNA1、siRNA2)，标记组别后，放置在37℃、5％CO₂的培养箱中培养过夜，第二天观察细胞生长状态，当细胞的融合度达70％～80％时，进行转染。去除24孔板中的培养基，1×PBS洗涤2次。然后加入0.5ml不含血清的DMEM完全培养基，让细胞饥饿3h。一个EP管中加入Opti-MEM Medium 50μl+RNAiMAX 3μl，在另一EP管中加入Opti-MEM Medium 50μl+siRNA 1μl，小心充分混匀，静置5min。继之将这两个EP管内的溶液充分混合，并在室温下孵育5min。然后将该混合液均匀加注于24孔板内，放置在37℃,5％CO₂细胞培养箱中培养4～6h，更换成含血清和抗生素的常规培养基继续培养。

4、QPCR检测AC103718.1基因的转录水平

细胞总RNA的提取：

弃掉24孔板中的培养基，加入PBS清洗3遍之后弃掉PBS，加入1mL Trizol试剂，混匀，使用移液枪反复吹打涡旋细胞，将所得细胞的悬液转移到1.5mL离心管中，室温静置5min，加入氯仿，剧烈振荡摇匀至乳白色，然后在室温下静置5min，12000g于4℃的条件下离心15min，取上清液于新的1.5mL离心管中，加入提前预冷的异丙醇0.5-1.0mL/管，缓慢摇匀，室温静置10分钟。12000g，4℃离心10min，弃掉上清液，在离心管内加入预冷过的75％乙醇1mL/管，7500g，4℃离心5分钟，弃去上清液，进行干燥，向沉淀中加入20μL无酶水溶解。

逆转录与QPCR检测步骤同实施例2。

5、结果

结果如图2显示，与空白对照组和阴性对照组siRNA-NC组相比，实验组(siRNA1～2)能显著低AC103718.1的水平(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组之间没有显著的差异；其中siRNA1的效果最为显著，因此选择siRNA1进行后续实验。

实施例3 AC103718.1对肺癌细胞的影响

1)MTT法检测AC103718.1对肺鳞癌细胞增殖的影响：

将转染后的细胞株用PBS液进行清洗，去掉死细胞，胰酶消化，制备单细胞悬液，对细胞悬液进行稀释，调整密度为5×10⁴个/ml，然后接种于96孔培养板内，每孔加入细胞悬液100μl，把96孔培养板放入37℃，5％CO₂的细胞培养箱内继续培养48h，向每孔中加入1×MTT，继续培养4h，吸弃上清液，在每个内孔中加入DMSO，震荡10min，用酶标仪测定波长450nm时每个孔的OD值。

MTT结果显示，转染siRNA1组的细胞生长增殖速度(0.385±0.013)显著低于空白对照组(0.598±0.022)和转染siRNA-NC(0.586±0.017)组(P<0.05)，而空白对照组和转染siRNA-NC组之间则无显著差异，说明下调AC103718.1的表达水平可以显著抑制肺鳞癌细胞的增殖。

2)划痕实验检测AC103718.1对肺鳞癌细胞迁移能力的影响：

将转染后对数生长状态良好的细胞，用1×PBS冲洗3遍，去掉死细胞，胰酶消化，制备单细胞悬液，对细胞悬液进行稀释，调整密度为5×10⁵个/ml，用记号笔在培养皿背面画一横线作为标志，向每个培养皿中加入1ml细胞悬液，摇匀，放入培养箱中培养，当细胞覆盖面积为95％时，进行下一步操作，用100μl闪移液器枪头在单层细胞中间划“一”字形划痕，然后用PBS液冲洗细胞3遍，加入DMEM培养基后放入培养箱内培养。24小时取出培养皿，去掉培养基，用PBS液清洗培养皿3遍，观察细胞情况，测量伤痕距离并记录。

结果如图3所示，与空白对照组及siRNA-NC组相比，下调AC103718.1在肺鳞癌细胞内的表达水平后，肺鳞癌的细胞迁移能力显著下降(P<0.05)，提示干扰AC103718.1的表达可以显著抑制肺鳞癌细胞的迁移能力。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 肺癌诊断和治疗的靶基因

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgattctga gaccttgac 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatcttcttc caggcattc 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aauucacuca cauuuccagu c 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cuggaaaugu gagugaauuc u 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uuacauguag uaacaucucc a 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagauguuac uacauguaag a 21

Claims

1.一种检测基因的试剂，其特征在于，所述试剂可以检测AC103718.1的水平。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂选自：

特异性识别AC103718.1的探针；或特异性扩增AC103718.1的引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增AC103718.1的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

4.一种产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-3任一项所述的试剂。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。

6.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括有效量的AC103718.1的抑制剂，优选的，所述抑制剂下调AC103718.1的表达水平。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述抑制剂为双链分子，该分子包括有义链及其互补反义链，优选的，所述双链分子为靶向目的基因AC103718.1序列的siRNA。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，siRNA的序列如SEQ ID NO.5～8所示。

9.一种筛选治疗肺癌的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:

使测试物质与表达AC103718.1基因的细胞接触；并

10.如下任一项应用：

a.权利要求1-3任一项所述的试剂在制备诊断肺癌的工具中的应用；

b.权利要求4或5所述的产品在制备诊断肺癌的工具中的应用；

c.AC103718.1在构建诊断肺癌的计算模型中的应用；

d.AC103718.1在制备治疗肺癌的药物中的应用；

e.权利要求6-8任一项所述的组合物在制备治疗肺癌的药物中的应用；

f.AC103718.1在筛选治疗肺癌的候选药物中的应用。