JP5489459B2 - 乳癌の診断、予後及び治療のためのマイクロｒｎａに基づいた方法及び組成物 - Google Patents

乳癌の診断、予後及び治療のためのマイクロｒｎａに基づいた方法及び組成物 Download PDF

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Description

政府援助
本発明は、全部もしくは一部、National Cancer InstituteからのProgram Project Grant P01CA76259、P01CA81534及びP30CA56036により援助された。政府は本発明に特定の権利を有する。
背景技術
乳癌は、米国及び世界中の女性にとって重大な健康問題である。本疾患の検出及び治療は進歩してきたが、乳癌は女性における２番目の癌関連死のままであり、毎年、米国において１８０，０００人以上が罹患している。北アメリカの女性について、乳癌になる生涯確率は現在８人に１人である。
乳癌の治療又は予防のために普遍的に成功した方法は現在利用できる状態ではない。乳癌の管理は現在、早期診断（例えば、定期的胸部検査法）及び攻撃的治療の組み合わせに頼っており、手術、放射線療法、化学療法及びホルモン療法のような多様な治療の一つまたはそれ以上を含むことができる。特定の乳癌のための治療過程は、特異的腫瘍マーカーの解析を含む多様な予後パラメーターに基づいてしばしば選択される。例えば、Porter-Jordan and Lippman,Breast Cancer 8:73-100 (1994) を参照されたい。
ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の発見は、乳癌に関与する主要な遺伝的因子を同定する重要な工程ではあったけれども、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２中の突然変異は乳癌に対する遺伝的感受性の一部のみを説明することが明らかになった (Nathanson, K.L. et al., Human Mol. Gen. 10(7):7l5-720 (2001); Anglican Breast Cancer Study Group. Br. J. Cancer 83(10):l30l-08 (2000); 及びSyrjakoski K., et al., J. Natl. Cancer Inst. 92: 1529-31 (2000)) 。乳癌に対する療法についてのかなりの研究にもかかわらず、乳癌は効果的に診断する及び治療するのが困難なままであり、及び乳癌患者において観察される高い死亡率は、本疾患の診断、治療及び予防における改善が必要とされていることを示している。
マイクロＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）標的にハイブリダイズし及び翻訳抑止又は頻度は少ないが分解の引き金を引くことにより遺伝子発現を制御する、小さな非コードＲＮＡのクラスである。ｍｉＲＮＡの発見及び研究は、生物体発生及び細胞分化、細胞増殖及び細胞死のような多様な細胞プロセスに重要な役割を果たす、ｍｉＲＮＡ仲介遺伝子調節機構を明らかにした(Cheng, A.M., et al, Nucleic Acids Res. 33: 1290-1297 (2005)) 。最近の研究は、特定のｍｉＲＮＡの異常発現が、神経障害(Ishizuka, A., et al, Genes Dev. 16:2497-2508 (2002))及び癌のようなヒト疾患に関与することができることを示唆している。特に、ｍｉＲ−１６−１及び／又はｍｉＲ−１５ａの誤発現がヒト慢性リンパ性白血病で観察されている(Calin, G.A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:15524-15529 (2002)) 。
すべての既知のヒトマイクロＲＮＡを含有するマイクロアレイの開発及び使用は、サンプル中の全てのｍｉＲＮＡの発現の同時分析を可能にした(Liu, C.G., et al, Proc Natl. Acad. Sci U.S.A. 707:9740-9744 (2004)) 。これらのマイクロＲＮＡマイクロアレイは、ヒトＣＬＬ細胞においてｍｉＲ−１６−１が調節解除されていることを確認するためだけでなく、ヒトＣＬＬの明確な臨床病理学的特徴に関連するｍｉＲＮＡ発現シグニチャー(signature) を発生させるためにも使用された(Calin, G.A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 707:1175-11760 (2004)) 。
正常細胞及び乳癌細胞間で異なって発現されるマイクロＲＮＡのグループ（即ち、発現シグニチャー又は発現プロファイル）を同定するためのマイクロＲＮＡマイクロアレイの使用は、乳癌に関与する特異的ｍｉＲＮＡを、正確に示すことを助けることができる。さらに、これらの推定標的の同定は、それらの病理学的役割を解明することを助けることができる。本発明は乳癌の診断、予後及び治療のための新規方法及び組成物を提供する。
発明の要旨
本発明は、一部、正常対照細胞と比較して、乳癌細胞中で異なって発現されるｍｉＲＮＡの乳癌特異的シグニチャーの同定に基づいている。
従って、本発明は、対象が乳癌を有しているか、又は発生するリスクがあるかどうかを診断する方法を包含し、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定すること、及び該試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することを含んでなる。対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較して、試験サンプル中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける変化（例えば、増加、減少）は、該対象が乳癌を有するか又は発生するリスクがあることを示す。特定の態様において、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１０ｂ及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、当業者には公知の多様な技術を使用して測定し得る。一つの態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、ノーザンブロット解析を使用して測定される。別の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対象から得られた試験サンプルからのＲＮＡを逆転写することにより標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んでなるマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズさせて試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そして試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルを対照サンプルから発生させたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することにより測定する。対照サンプルと比較して、試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルにおける変化は、該対象が乳癌を有しているか又は発生するリスクがあることを示す。特定の態様において、該マイクロアレイはヒトｍｉＲＮｏｍの大部分についてのｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んでなる。さらなる態様において、該マイクロアレイは、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−ｌ０ｂ、ｍｉＲ−００９−１（ｍｉＲ１３１−１）、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−１７０）、ｍｉＲ−１０２（ｍｉＲ−２９ｂ）、ｍｉＲ−１２３（ｍｉＲ−１２６）、ｍｉＲ−１４０−ａｓ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ−ｌ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１３、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｄ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖｌ）、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｌｅｔ−７ｉ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ２）、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１０及びそれらの組み合わせから成る群より選択される一つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡについてのｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んでなる。
本発明は一つ又はそれ以上の予後マーカーに関連する乳癌を診断する方法も提供し、対象からの乳癌試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定すること、そして乳癌試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することを含んでなる。乳癌は、限定されるわけではないが、エストロゲンレセプター発現、プロゲステロンレセプター発現、陽性リンパ結節転移、高増殖指数、検出可能ｐ５３発現、進行した腫瘍及び高血管浸潤のような乳癌に関連する一つ又はそれ以上の有害な予後マーカーと関連付け得る。一つの態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対象から得られた試験サンプルからのＲＮＡを逆転写することにより標的オリゴデオキシヌクレオチドの組を提供し、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んでなるマイクロアレイに標的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズさせて試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そして試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルを対照サンプルから発生させたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することにより測定する。対照サンプルと比較して、試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルにおける変化は、該対象が一つ又はそれ以上の予後マーカーに関連する乳癌を有しているか又は発生するリスクがあることを示す。特定の態様において、該マイクロアレイは、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−１０２（ｍｉＲ−２９ｂ）、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１２、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−９−２、ｍｉＲ−１５−ａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０ａ−ｓ、ｍｉＲ−１３３ａ−１、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１５３−２、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１３、ｌｅｔ−７ｆ−ｌ、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−９−３、ｍｉＲ−ｌ０ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−１２３、ｍｉＲ−２０５、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１６ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ及びそれらの組み合わせから成る群より選択されるｍｉＲＮＡのための少なくとも一つのｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んでなる。
本発明は、対象において乳癌を治療するための方法も包含し、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は対象の癌細胞中で調節解除（例えば、下方調節、上方調節）されている。乳癌細胞中で少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が下方調節されている場合、本方法は、対象中の癌細胞の増殖が阻害されるように、少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量を投与することを含んでなる。一つの態様において、本方法は、対象中の癌細胞の増殖が阻害されるように、少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物、但し該ｍｉＲ遺伝子はｍｉＲ−１５ａ又は、ｍｉＲ−１６−１ではない、の有効量を投与することを含んでなる。癌細胞中で少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が上方調節されている場合、本方法は、乳癌細胞の増殖が阻害されるように、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子の発現を阻害するための少なくとも一つの化合物の有効量を対象に投与することを含んでなる。
関連する態様において、本発明は対象において乳癌を治療する方法を提供し、対照細胞と比較して、対象からの乳癌細胞中での少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の量を決定することを含んでなる。もし、該ｍｉＲ遺伝子産物が乳癌細胞中で調節解除されていたら、本発明はさらに、乳癌細胞中で発現される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の量を変化させることを含んでなる。もし、該癌細胞で発現される該ｍｉＲ遺伝子産物の量が、対照細胞中で発現される該ｍｉＲ遺伝子産物の量よりも少ないならば、本方法は少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量を投与することを含んでなる。一つの態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。もし、該癌細胞で発現される該ｍｉＲ遺伝子産物の量が、対照細胞中で発現される該ｍｉＲ遺伝子産物の量よりも多いならば、本方法は該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子の発現を阻害するために、少なくとも一つの化合物の有効量を対象に投与することを含んでなる。一つの態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。
本発明はさらに、乳癌を治療するための医薬組成物を提供する。一つの態様において、該医薬組成物は少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物及び薬学的に許容できる坦体を含んでなる。特定の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、適した対照細胞と比較して減少した乳癌細胞中での発現のレベルを有するｍｉＲ遺伝子産物に相当する。特定の態様において、該単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２３（ｍｉＲ−１２６）、ｍｉＲ−１４０−ａｓ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−２５ｂ−２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｄ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ１）、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１４３及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
別の態様において、本発明の医薬組成物は少なくとも一つのｍｉＲ発現阻害化合物を含んでなる。特定の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ発現阻害化合物は、その発現が対照細胞よりも乳癌細胞において多いｍｉＲ遺伝子に特異的である。特定の態様において、該ｍｉＲ発現阻害化合物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−００９−１（ｍｉＲ１３１−１）、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−１７０）、ｍｉＲ−１０２（ｍｉＲ−２９ｂ）、ｍｉＲ−２１３、ｌｅｔ−７ｉ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ２）、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１３及びそれらの組み合わせから成る群より選択される一つ又はそれ以上のｍｉＲ遺伝子産物に特異的である。
本発明は、抗乳癌剤を同定する方法も包含し、細胞に試験剤を提供すること、及び細胞中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含んでなる。一つの態様において、本方法は細胞に試験剤を提供すること、及び乳癌細胞で減少した発現レベルに関連する少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含んでなる。適した対照細胞と比較して、該細胞中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加は、試験剤が抗乳癌剤であることを示す。特定の態様において、乳癌細胞での減少した発現レベルに関連する該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２３（ｍｉＲ−１２６）、ｍｉＲ−１４０−ａｓ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｄ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ１）、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１４３及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
他の態様において、本方法は細胞に試験剤を提供すること、及び乳癌細胞で増加した発現レベルに関連する少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含んでなる。適した対照細胞と比較して、該細胞中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの減少は、試験剤が抗乳癌剤であることを示す。特定の態様において、乳癌細胞での増加した発現レベルに関連する該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−００９−１（ｍｉＲ１３１−１）、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−１７０）、ｍｉＲ−１０２（ｍｉＲ−２９ｂ）、ｍｉＲ−２１３、ｌｅｔ−７ｉ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ２）、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１３及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
発明の詳細な説明
本発明は、一部、その発現が正常対照細胞と比較して乳癌細胞中で変化を受けた特定のｍｉＲＮＡの同定、及びその発現が、特定の予後特徴に関連する乳癌細胞において、こうした特徴を欠く乳癌細胞と比較して変化を受けたマイクロＲＮＡに基づいている。
本明細書において相互交換的に使用される、「ｍｉＲ遺伝子産物」、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲ」又は「ｍｉＲＮＡ」とは、プロセッシングされていない又はプロセッシングされたｍｉＲ遺伝子からのＲＮＡ転写体を指す。ｍｉＲ遺伝子産物はタンパク質に翻訳されないので、用語「ｍｉＲ遺伝子産物」はタンパク質を含んでいない。プロセッシングされていないｍｉＲ遺伝子転写体は「ｍｉＲ前駆体」とも称され、そして典型的には約７０〜１００ヌクレオチド長のＲＮＡ転写体を含んでなる。ｍｉＲ前駆体は、ＲＮＡｓｅ（例えば、ダイサー、アルゴノート又はＲＮＡｓｅ ＩＩＩ、例えば、大腸菌ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ）での消化により、活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子にプロセッシングし得る。この活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、「プロセッシングされた」ｍｉＲ遺伝子転写体又は「成熟」ｍｉＲＮＡとも称される。
活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、天然のプロセッシング経路（例えば、無傷の細胞又は細胞溶解物を使用して）を介して、又は合成プロセッシング経路（例えば、ダイサー、アルゴノート又はＲＮＡａｓｅ ＩＩＩのような単離されたプロセッシング酵素を使用して）によりｍｉＲ前駆体から得ることが可能である。活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、ｍｉＲ前駆体からプロセッシングされることなく、生物学的に又は化学合成により直接的に生成し得ることも理解されている。
１８７のｍｉＲ遺伝子産物の配列が表１に提供されている。本明細書のすべての核酸配列は５’から３’方向で与えられている。加えて、遺伝子はイタリック体により表されており、及び遺伝子産物は通常の活字で表されている；例えば、ｍｉｒ−１７は遺伝子であり及びｍｉＲ−１７は遺伝子産物である。
本発明は、対象が乳癌を有しているか、又は発生するリスクがあるかどうかを診断する方法を包含し、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定すること、及び該試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することを含んでなる。本明細書で使用される「対象」は、乳癌を有する、又は有していると疑われるいずれかの哺乳動物であり得る。特定の態様において、該対象は、乳癌を有する、又は有していると疑われるヒトである。
該乳癌は乳癌のいずれの形態でもよく、及び、限定されるわけではないが、エストロゲンレセプター発現、プロゲステロンレセプター発現、リンパ節転移、高増殖指数、検出可能ｐ５３発現、進行した腫瘍及び高血管浸潤を含む一つ又はそれ以上の予後マーカー又は特徴と関連していてもよい。該予後マーカーは有害な又は負の予後と関連することが可能であり、又は良好な又は正の予後と関連していてもよい。
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少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対象から得られた生物学的サンプルの細胞中で測定し得る。例えば、組織サンプルは、関連する乳癌を有していると疑われた対象から、慣用的生検技術により除去し得る。別の例において、血液試料を対象から除去することが可能であり、そして標準技術によりＤＮＡ抽出のために白血球細胞を単離する。血液及び白血球サンプルは好ましくは放射線療法、化学療法及びホルモン療法又は他の治療の開始に先立って得られる。対応する対照組織又は血液サンプルは、対象の影響されていない組織から、正常ヒト個体又は正常個体の集団から、又は患者の試料中の大多数の細胞に対応している培養細胞から得ることが可能である。対照組織又は血液サンプルは次ぎに、対象のサンプルからの細胞中の所与のｍｉＲ遺伝子から産生されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、対照サンプルの細胞からの対応するｍｉＲ遺伝子産物レベルと比較できるように、対象からのサンプルとともに処理する。
対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較して、対象から得られたサンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（即ち、増加又は減少）は、対象における乳癌の存在を示す。一つの態様において、試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い（即ち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「上方調節」されている）。本明細書で使用するｍｉＲ遺伝子産物の発現が「上方調節」されているとは、対象からの細胞又は組織サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物の量が、対照細胞又は組織中の同一遺伝子産物の量よりも多い場合である。別の態様において、試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い（即ち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「下方調節」されている）。本明細書で使用するｍｉＲ遺伝子産物の発現が「下方調節」されているとは、対象からの細胞又は組織サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物の量が、対照細胞又は組織中の同一遺伝子産物の量よりも少ない場合である。対照及び正常サンプル中の相対的ｍｉＲ遺伝子発現は、一つ又はそれ以上のＲＮＡ発現標品に対して決定し得る。該標品は、例えば、ゼロｍｉＲ遺伝子発現レベル、標準細胞株中でのｍｉＲ遺伝子発現レベル、又は正常ヒト対照の集団について以前に得られているｍｉＲ遺伝子発現の平均レベルを含むことが可能である。
サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、生物学的サンプル中のＲＮＡ発現レベルを決定するために適するいずれかの技術を使用して測定し得る。生物学的サンプルからの細胞中のＲＮＡ発現レベルを決定するために適した技術（例えば、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイツハイブリダイゼーション）は当業者には公知である。特定の態様において、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルはノーザンブロット解析を使用して検出される。例えば、全細胞ＲＮＡを、核酸抽出緩衝剤の存在下での均質化により、及び続いての遠心分離により細胞から精製し得る。核酸を沈澱させ、ＤＮａｓｅによる処理及び沈澱によりＤＮＡが除去される。ＲＮＡ分子は次ぎに、標準技術に従ってアガロースゲル上でのゲル電気泳動により分離され、ニトロセルロースフィルターに移される。ＲＮＡは次ぎに加熱によりフィルター上に固定される。特異的ＲＮＡの検出及び定量は、問題とするＲＮＡに相補的である、適切に標識されたＤＮＡ又はＲＮＡプローブを使用して達成される。例えば、その全開示が本明細書において援用される、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, ７章、を参照されたい。
所与のｍｉＲ遺伝子産物のノーザンブロットハイブリダイゼーションに適したプローブは、表１に提供した核酸配列から生成し得る。標識されたＤＮＡ及びＲＮＡプローブの製造法、及び標的ヌクレオチド配列へのそれらのハイブリダイゼーションについての条件は、その開示が本明細書において援用される、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, １０及び１１章、に記載されている。
例えば、核酸プローブは、例えば、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、又は３５Ｓのような放射性核種；重金属；又は標識化リガンドのための特異的結合対メンバーとして機能することが可能であるリガンド（例えば、ビオチン、アビジン又は抗体）、蛍光分子、ケミルミネッセント分子、酵素などで標識化し得る。
プローブは、それらの全開示が本明細書において援用される、Rigby et al. (1977), J. MoI. Biol. 113:237-251 、のニックトランスレーション法によるか、又はFienberg et al. (1983), Anal. Biochem. 132:6-13 、のランダムプライミング法により高比活性で標識し得る。後者は、一本鎖ＤＮＡから、又はＲＮＡ鋳型から高比活性の３２Ｐ−標識プローブを合成するために選択される方法である。例えば、ニックトランスレーション法に従って、既存のヌクレオチドを高放射性ヌクレオチドで置き換えることにより、１０８ｃｐｍ／マイクログラムをかなり上回る比活性を有する３２Ｐ−標識核酸プローブを製造することが可能である。次ぎにハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー検出を、ハイブリダイズされたフィルターを写真フィルムに暴露することにより実施し得る。ハイブリダイズされたフィルターにより暴露された写真フィルムのデンシトメトリックスキャニングは、ｍｉＲ遺伝子転写体レベルの正確な測定を提供する。Amersham Biosciences, Piscataway, NJ. から入手可能なMolecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager のような別のアプローチを使用して、ｍｉＲ遺伝子転写体レベルをコンピューター化されたイメージングシステムにより定量し得る。
ＤＮＡ又はＲＮＡプローブの放射性核種標識化が実際的ではない場合、プローブ分子内に類似体、例えば、ｄＴＴＰ類似体５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−エプシロン−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジン三リン酸を取り込ませるために、ランダム−プライマー法を使用し得る。ビオチニル化プローブオリゴヌクレオチドは、アビジン、ストレプトアビジン及び蛍光色素に結合された抗体（例えば、抗ビオチン抗体）又は呈色反応を生み出す酵素のような、ビオチン結合性タンパク質との反応により検出し得る。
ノーザン及び他のＲＮＡハイブリダイゼーション技術に加えて、ＲＮＡ転写体のレベルを決定することは、インサイツハイブリダイゼーションの技術を使用して達成し得る。この技術は、ノーザンブロッティング技術よりも少ない細胞数しか必要とせず、及び全細胞を顕微鏡カバーガラス上に沈着させること、及び放射活性又は他の方法で標識化された核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ）プローブを含有する溶液で、細胞の核酸内容物を探査することを含む。この技術は、対象からの組織生険サンプルを分析するために特によく適している。インサイツハイブリダイゼーション技術の実際は、その全開示が本明細書において援用される米国特許第５，４２７，９１６号において詳細に記載されている。所与のｍｉＲ遺伝子産物のインサイツハイブリダイゼーションに適したプローブは、前記のように、表１に提供した核酸配列から生成し得る。
細胞中のｍｉＲ遺伝子転写体の相対数は、ｍｉＲ遺伝子転写体の逆転写により、及び続いてのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による逆転写された転写体の増幅によっても決定し得る。ｍｉＲ遺伝子転写体のレベルは、内部標準、例えば、同一サンプル中に存在する「ハウスキーピング」遺伝子からのｍＲＮＡのレベルと比較して定量し得る。内部標準として使用するために適した「ハウスキーピング」遺伝子には、例えば、ミオシン又はグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）が含まれる。定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びそれらの変法についての方法は当業者の範囲内である。
いくつかの例において、サンプル中の複数の異なったｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを同時に決定することが望ましいであろう。他の例において、癌に相関するすべての既知のｍｉＲ遺伝子の転写体の発現レベルを決定することが望ましいであろう。数百のｍｉＲ遺伝子について癌特異的発現レベルを評価することは多大な時間を必要とし、及び大量の総ＲＮＡ（各ノーザンブロットについて少なくとも２０μｇ）及び放射性同位元素を必要とするオートラジオグラフィー技術を要求する。
これらの制限を克服するため、ｍｉＲ遺伝子のセットに特異的であるプローブオリゴデオキシヌクレオチドのセットを含有しているオリゴライブラリーをマイクロチップフォーマット（即ち、マイクロアレイ）で構築することができる。こうしたマイクロアレイを使用し、生物学的サンプル中の複数のマイクロＲＮＡ発現レベルを、ＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを発生させ、及びそれらをマイクロアレイ上のプローブオリゴデオキシヌクレオチドにハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション又は発現プロファイルを発生させることにより決定し得る。試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルを次ぎに対照サンプルのものと比較して、どのマイクロＲＮＡが乳癌細胞において変化した発現レベルを有しているのかを決定する。本明細書で使用する「プローブオリゴヌクレオチド」又は「プローブオリゴデオキシヌクレオチド」は、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であるオリゴヌクレオチドを指す。「標的オリゴヌクレオチド」又は「標的オリゴデオキシヌクレオチド」とは検出されるべき分子を指す（例えば、ハイブリダイゼーションを介して）。「ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチド」又は「ｍｉＲに対して特異的なプローブオリゴヌクレオチド」は、特異的ｍｉＲ遺伝子産物又は特異的ｍｉＲ遺伝子産物の逆転写体にハイブリダイズするように選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
特定のサンプルの「発現プロファイル」又は「ハイブリダイゼーションプロファイル」は、本質的にサンプルの状態のフィンガープリントである；２つの状態が同様に発現されるいずれかの特定の遺伝子を有することができるが、多くの遺伝子の同時評価は、細胞の状態に独特である遺伝子発現プロファイルの発生を可能にする。即ち、正常細胞を乳癌細胞と区別することができ、及び乳癌組織内での異なった予後状態（例えば、良好な又は悪い長期生存見通し）を決定することができる。異なった状態にある乳癌組織の発現プロファイルを比較することにより、これらの状態の各々においてどの遺伝子が重要であるかに関する情報（遺伝子の上方及び下方調節を含んで）が得られる。乳癌組織又は正常胸部組織において異なって発現された配列、ならびに異なった予後結果を生じる異なった発現の同定は、この情報のさなざまな形での使用を可能にする。例えば、特定の治療計画を評価することができる（例えば、特定の患者において、長期予後を改善するために化学療法薬剤が作用するかどうかを決定するため）。同様に、患者サンプルと既知の発現プロファイルを比較することにより診断を行う又は確認することができる。さらに、これらの遺伝子発現プロファイル（又は個々の遺伝子）は、乳癌発現プロファイルを抑制する、又は悪い予後プロファイルをより良い予後プロファイルに変換する薬剤候補のスクリーニングを可能にする。
従って、本発明は、対象が乳癌を有しているか、又は発生するリスクがあるかどうかを診断する方法を提供し、対象から得られた試験サンプルのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んでなるマイクロアレイにハイブリダイズさせて試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そして試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルと対照サンプルから発生させたハイブリダイゼーションプロファイルを比較することを含んでなり、少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルにおける変化は、対象が乳癌を有しているか、又は発生するリスクがあることを示す。一つの態様において、マイクロアレイはヒトｍｉＲＮｏｍｅの実質的部分についてのｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んでなる。特定の態様において、マイクロアレイは、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−００９−１（ｍｉＲ１３１−１）、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−１７０）、ｍｉＲ−１０２（ｍｉＲ−２９ｂ）、ｍｉＲ−１２３（ｍｉＲ−１２６）、ｍｉＲ−１４０−ａｓ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ−ｌ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１３、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｄ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ１）、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｌｅｔ−７ｉ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ２）、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１０及びそれらの組み合わせから成る群より選択される一つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡのためのｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んでなる。さらなる態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１０ｂ及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
マイクロアレイは既知のｍｉＲＮＡ配列から発生させた遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから調製し得る。アレイは各ｍｉＲＮＡについて２つの異なったオリゴヌクレオチドプローブを含むことができ、１つは活性成熟配列を含んでおり、及び他はｍｉＲＮＡの前駆体に対して特異的である。アレイは、ハイブリダイゼーションストリンジェンシー条件についての対照として働き得る、ヒトオルソログとわずか数塩基が異なっている一つ又はそれ以上のマウス配列のような対照も含むことができる。両方の種からのｔＲＮＡもマイクロチップにプリントされており、特異的ハイブリダイゼーションのための内部、比較的に安定な陽性対照を提供している。非特異的ハイブリダイゼーションのための一つ又はそれ以上の適切な対照もマイクロチップに含ませることができる。この目的には、いずれの既知のｍｉＲＮＡともいずれの相同性も存在しないことに基づいて配列が選択される。
マイクロアレイは当該技術分野で公知の技術を使用して製作することができる。例えば、適切な長さの（例えば、４０ヌクレオチド）のプローブオリゴヌクレオチドが、Ｃ６位で５’−アミン修飾され、商業的に入手可能なマイクロアレイシステム、例えば、GeneMachine OmniGrid（商標）100 Microarrayer 及びAmersham CodeLink（商標）活性化スライド、を使用してプリントされる。標的ＲＮＡに対応する標識ｃＤＮＡオリゴマーは、標的ＲＮＡを標識プライマーで逆転写することにより調製される。第一鎖合成に続いて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させてＲＮＡ鋳型を分解する。このようにして調製された標識された標的ｃＤＮＡをハイブリダイズ条件下、例えば、２５℃で１８時間の６Ｘ ＳＳＰＥ／３０％ホルムアミド、続いて３７℃で４０分の０．７５Ｘ ＴＮＴ中での洗浄、マイクロアレイチップにハイブリダイズさせる。固定化されたプローブＤＮＡがサンプル中の相補的標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置でハイブリダイゼーションが起こる。標識標的ｃＤＮＡは、結合が起こったアレイ上の正確な位置に印を付け、自動的検出及び定量を可能にする。出力はハイブリダイゼーション事象のリストから成っており、特異的ｃＤＮＡ配列の相対的存在量、そしてそれ故、患者サンプル中の対応する相補的ｍｉＲの相対量を示している。一つの態様に従うと、標識ｃＤＮＡオリゴマーは、ビオチン標識プライマーから調製されたビオチン標識ｃＤＮＡである。マイクロアレイは次ぎに、例えば、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートを使用するビオチン含有転写体の直接検出により処理され、慣用的スキャニング法を利用してスキャンする。アレイ上の各スポットのイメージ強度は、患者サンプル中の対応するｍｉＲの存在量に比例する。
アレイの使用は、ｍｉＲＮＡ発現検出にいくつかの利点を有する。第一に、数百の遺伝子の全体的発現が、同一サンプル中で１つの時点で同定し得る。第二に、オリゴヌクレオチドプローブの注意深い設計を通して、成熟及び前駆体分子の両方の発現を同定し得る。第三に、ノーザンブロット解析と比較し、チップは少量のＲＮＡしか必要とせず、及び２．５μｇの総ＲＮＡを使用して再現性のある結果を提供する。比較的限られた数のｍｉＲＮＡ（種当たり数百）は、それぞれに特有のオリゴヌクレオチドプローブを有するいくつかの種のための共通マイクロアレイの構築を可能にする。こうしたツールは、多様な条件下、各々の既知ｍｉＲについての種を越えた発現の分析を可能にするであろう。
特異的ｍｉＲの定量的発現レベルアッセイのための使用に加えて、ｍｉＲＮｏｍｅ、好ましくは全ｍｉＲＮｏｍｅの実質的部分に対応するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含有するマイクロチップは、ｍｉＲ発現パターンの分析のためのｍｉＲ遺伝子発現プロファイリングを実施するために用いることができる。特有のｍｉＲシグニチァーは、確立された疾患マーカーと、又は直接的に疾患状態と関連し得る。
本明細書に記載した発現プロファイリング法に従うと、癌（例えば、乳癌）を有していると疑われる対象からのサンプルの総ＲＮＡが定量的に逆転写されて、サンプル中のＲＮＡに相補的な標識標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供する。標的オリゴデオキシヌクレオチドは次ぎに、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んでなるマイクロアレイへハイブリダイズされて、サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供する。結果は、サンプル中のｍｉＲＮＡの発現パターンを示している、サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルである。該ハイブリダイゼーションプロファイルは、マイクロアレイ中のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドへの、サンプルからの標的オリゴデオキシヌクレオチドの結合からのシグナルを含んでなる。該プロファイルは、結合の存在又は非存在（シグナルｖｓ．ゼロシグナル）として記録することができる。より好ましくは、記録された該プロファイルは、各ハイブリダイゼーションからのシグナルの強度を含む。該プロファイは、正常、即ち、非癌性対照サンプルから発生されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較される。シグナルの変化は、対象における癌の存在を示す。
ｍｉＲ遺伝子発現を測定するための他の技術も当業者の範囲内であり、ＲＮＡ転写及び分解の速度を測定するための多様な技術を含む。
本発明は、一つ又はそれ以上の予後マーカーに関連する乳癌を診断する方法も提供し、対象からの乳癌試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定すること、及び該乳癌試験サンプル中の該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することを含んでなる。対照サンプルと比較して、該試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルにおける変化（例えば、増加、減少）は、該対象が一つ又はそれ以上の予後マーカーに関連する乳癌を有しているか、又は発生するリスクがあることを示す。
該乳癌は、有害な（即ち、負の）予後に関連するマーカー、又は良好な（即ち、正の）予後に関連するマーカーを含む、一つ又はそれ以上の予後マーカー又は特徴に関連し得る。特定の態様において、本明細書に記載した方法を使用して診断される乳癌は、エストロゲンレセプター発現、プロゲステロンレセプター発現、陽性リンパ結節転移、高増殖指数、検出可能ｐ５３発現、進行した腫瘍及び高血管浸潤から成る群より選択される、一つ又はそれ以上の有害な予後特徴に関連する。これらの予後マーカーの各々に関連する乳癌細胞においてその発現が変化する特定のマイクロＲＮＡが本明細書に記載されている（例えば、実施例３及び図４を参照されたい）。一つの態様において、対象から得られた試験サンプルからのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んでなるマイクロアレイにハイブリダイズさせて試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、及び該試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルと対照サンプルから発生させたハイブリダイゼーションプロファイルを比較することにより、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが測定される。
いずれか１つの理論に束縛されるものではないが、細胞中の一つ又はそれ以上のｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける変化は、これらのｍｉＲのための一つ又はそれ以上の意図された標的の調節解除を生じることができ、それは乳癌の形成へ導き得る。それ故、ｍｉＲ遺伝子産物のレベルを変化させることで（例えば、乳癌細胞中で上方調節されているｍｉＲのレベルを減少させることにより、乳癌細胞中で下方調節されているｍｉＲのレベルを減少させることにより）、乳癌を成功裏に治療することができる。乳癌組織中で調節解除されているｍｉＲＮＡに対する推定遺伝子標的の例は、本明細書に記載されている（例えば、実施例２及び表４を参照されたい）。
従って、本発明は対象において乳癌を治療する方法を包含し、該対象の癌細胞中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は調節解除（例えば、下方調節、上方調節）されている。該少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が乳癌細胞中で下方調節されている場合、本方法は、対象中の癌細胞の増殖が抑制されるように、該少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物、但し、該ｍｉＲ遺伝子はｍｉＲ１５又はｍｉＲ１６ではない、の有効量を投与することを含んでなる。該少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が該細胞中で上方調節されている場合、本方法は、乳癌細胞の増殖が阻害されるように、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子の発現を阻害するための少なくとも一つの化合物、本明細書においてｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物と称される、の有効量を対象に投与することを含んでなる。
本明細書で使用される用語「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、疾患又は状態、例えば、乳癌に関連する症状を寛解させることを指し、疾患症状の発症を防止する又は遅延すること、及び／又は疾患又は状態の症状の重度又は頻度を減らすことを含んでいる。用語「対象」及び「個体」は、限定されるわけではないが、霊長類、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス又は他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類又はマウス種を含む哺乳類のような動物を含むことが本明細書において定義される。好ましい態様において、該動物はヒトである。
本明細書で使用される単離されたｍｉＲ遺伝子産物の「有効量」は、乳癌を患っている対象中の癌細胞の増殖を阻害するために十分な量である。当業者は、対象のサイズ及び体重；疾患浸透の程度；対象の年齢、健康及び性；投与経路；及び投与が局所的であるか又は全身的であるかどうかのような因子を考慮に入れて、所与の対象に投与すべきｍｉＲ遺伝子産物の有効量を容易に決定し得る。
例えば、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、治療されるべき腫瘍のおよその重量に基づき得る。腫瘍塊のおよその重量は、塊のおよその容量を計算することにより決定することが可能であり、１立方センチメーターの容量は大体１グラムに等しい。腫瘍塊の重量に基づいた、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、腫瘍塊のグラム当たり約１０〜５００マイクログラムの範囲であり得る。特定の態様において、有効量は少なくとも、腫瘍塊のグラム当たり少なくとも約１０マイクログラム、腫瘍塊のグラム当たり少なくとも約６０マイクログラム又は少なくとも腫瘍塊のグラム当たり約１００マイクログラムでもあり得る。
単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、治療されるべき対象のおよその又は推定体重にも基づき得る。好ましくは、こうした有効量は、本明細書に記載したように、非経口的に又は経腸的に投与される。例えば、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、体重ｋｇ当たり約５〜３０００マイクログラム、体重ｋｇ当たり約７００〜１０００マイクログラムの範囲で、又は体重ｋｇ当たり約１０００マイクログラムを超えて対象に投与される。
当業者は、所与の対象への単離されたｍｉＲ遺伝子産物の適切な投与計画も容易に決定し得る。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物は対象に一度に投与し得る（例えば、単回注射又はデポジションとして）。もしくは、ｍｉＲ遺伝子産物は、約３〜約２８日、より特定的には約７日〜約１０日の期間、対象に１日１回又は２回投与し得る。特定の投与計画において、ｍｉＲ遺伝子産物は７日にわたって１日１回投与される。投与計画が複数の投与を含んでなる場合、対象に投与されるｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、全投与計画にわたって投与された遺伝子産物の総量を含んでなることが理解される。
本明細書で使用される「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物は、合成された又はヒトの介在により天然の状態から変化された又は除去されたものである。例えば、合成ｍｉＲ遺伝子産物又はその天然の状態で同時に存在する物質から部分的に又は完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産物が、「単離されて」いると考えられる。単離されたｍｉＲ遺伝子産物は実質的に精製された形態で存在することが可能であり、又はｍｉＲ遺伝子産物が送達されている細胞内に存在することが可能である。それ故、細胞へ計画的に送達された又は細胞中で発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物と考えられる。ｍｉＲ前駆分子から細胞内部で産生されたｍｉＲ遺伝子産物も「単離された」分子であると考えられる。
単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、多くの標準技術を使用して得ることが可能である。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物は当該技術分野で公知の方法を使用して化学的に合成又は組換え的に産生し得る。一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び慣用的ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用して化学的に合成される。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の商業的供給元には、例えば、Proligo (Hamburg, Germany), Dharmacon Research (Lafayette, CO, U.S.A.), Pierce Chemical (Perbio Science の一部門, Rockford, IL, U.S.A.), Glen Research (Sterling, VA, U.S.A.), ChemGenes (Ashland, MA, U.S.A.) 及びCruachem (Glasgow, UK) が含まれる。
もしくは、ｍｉＲ遺伝子産物は、いずれかの適したプロモーターを使用して組換え環状又は直線状ＤＮＡプラスミドから発現し得る。プラスミドからＲＮＡを発現するために適したプロモーターには、例えば、Ｕ６又はＨ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列又はサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適したプロモーターの選択は当業者の範囲内である。本発明の組換えプラスミドは、癌細胞中でのｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導可能又は調節可能プロモーターも含み得る。
組換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、標準技術により培養細胞発現システムから単離し得る。組換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、癌細胞へ送達する、又は癌細胞中で直接発現することも可能である。癌細胞へｍｉＲ遺伝子産物を送達するための組換えプラスミドの使用は、以下により詳細に議論されている。
ｍｉＲ遺伝子産物は別の組換えプラスミドから発現することも、又は同一の組換えプラスミドから発現することも可能である。一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、単一プラスミドからＲＮＡ前駆分子として発現され、そして該前駆分子は、限定されるわけではないが、癌細胞内に実存するプロセッシングシステムを含む適したプロセッシングシステムにより、機能性ｍｉＲ遺伝子産物にプロセッシングされる。適したプロセッシングシステムには、例えば、インビトロショウジョウバエ細胞溶解システム（例えば、その全開示が本明細書において援用される、Tuschl et al. による米国公開特許出願番号2002/0086356に記載されているような）及び大腸菌（E.coli）ＲＮＡｓｅＩＩＩシステム（例えば、その全開示が本明細書において援用される、Yang et al. による米国公開特許出願番号2004/0014113に記載されているような）が含まれる。
ｍｉＲ遺伝子産物を発現するために適したプラスミドの選択、プラスミド内へ遺伝子産物を発現するための核酸配列を挿入する方法、及び組換えプラスミドを問題とする細胞へ送達する方法は当業者の範囲内である。例えば、その全開示が本明細書において援用される、Zeng et al. (2002), Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002), Nat.Biotechnol, 20:446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296:550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16:948-958; Lee et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:500-505; 及び Paul et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:505-508 を参照されたい。
一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物を発現しているプラスミドは、ＣＭＶ中間初期プロモーター制御下のｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードしている配列を含んでなる。本明細書において使用されるプロモーターの「制御下」とは、プロモーターがｍｉＲ遺伝子産物コード配列の転写を開始できるように、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸配列が該プロモーターの３’に位置していることを意味する。
ｍｉＲ遺伝子産物は組換えウイルスベクターからも発現し得る。ｍｉＲ遺伝子産物が２つの別の組換えウイルスベクターから、又は同一のウイルスベクターから発現し得ることが企図される。組換えウイルスベクターから発現されたＲＮＡは、標準技術により培養細胞発現システムから単離することが可能であり、又は癌細胞中で直接発現することも可能である。癌細胞へｍｉＲ遺伝子産物を送達するための組換えウイルスベクターの使用は以下により詳細に議論されている。
本発明の組換えウイルスベクターは、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列及びＲＮＡ配列を発現するためのいずれかの適したプロモーターを含んでなる。適したプロモーターには、例えば、Ｕ６又はＨ１ ＲＮＡｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列又はサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適したプロモーターの選択は当業者の範囲内である。本発明の組換えプラスミドは、癌細胞中でのｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導可能又は調節可能プロモーターも含み得る。
ｍｉＲ遺伝子産物のコード配列を受容することが可能ないずれかのウイルスベクターを使用し得る；例えば、アデノウイルス（ＡＶ）； アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルスなどに由来するベクター。ウイルスベクターの向性は、他のウイルスからの外被タンパク質又は他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることにより、又は適切に異なったウイルスカプシドタンパク質で置換することにより修飾し得る。
例えば、本発明のレンチウイルスベクターを、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質でシュードタイピングし得る。本発明のＡＡＶベクターは、異なったカプシドタンパク質血清タイプを発現するようにベクターを工学処理することにより、異なった細胞を標的とするようにできる。例えば、血清タイプ２ゲノム上の血清タイプ２カプシドを発現しているＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と称される。このＡＡＶ２／２ベクター中の血清タイプ２カプシド遺伝子を血清タイプ５カプシド遺伝子で置き換えることができて、ＡＡＶ２／５ベクターが産生される。異なったカプシドタンパク質血清タイプを発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は、当業者の範囲内である；例えば、その全開示が本明細書において援用される、Rabinowitz, J.E., et al. (2002), J. Virol. 76:791-801を参照されたい。
本発明での使用に適した組換えウイルスベクターの選択、ベクター内へのＲＮＡを発現するための核酸配列を挿入する方法、ウイルスベクターを問題とする細胞へ送達する方法及び発現されたＲＮＡ産物の回収は当業者の範囲内である。例えば、その全開示が本明細書において援用される、Dornburg (1995), Gene Therap. 2:301-310; Eglitis (1988), Biotechniques 6:608-614; Miller (1990), Hum. Gene Therap. 1:5-14; 及びAnderson (1998), Nature 392:25-30 、を参照されたい。
特に適したウイルスベクターはＡＶ及びＡＡＶに由来するものである。ｍｉＲ遺伝子産物を発現するために適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、及び標的細胞内に該ベクターを送達するための方法は、その全開示が本明細書において援用される、Xia et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010 に記載されている。ｍｉＲ遺伝子産物を発現するために適したＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターを構築するための方法、及び標的細胞内に該ベクターを送達するための方法は、その全開示が本明細書において援用される、Samulski et al. (1987), J. Virol. 61:3096-3101; Fisher et al. (1996), J. Virol, 70:520-532; Samulski et al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826；米国特許第5,252,479号；米国特許第5,139,941号；国際特許出願番号WO 94/13788 ；及び国際特許出願番号WO 93/24641 に記載されている。一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ＣＭＶ中間初期プロモーターを含んでなる単一組換えＡＡＶベクターから発現される。
特定の態様において、本発明の組換えＡＡＶウイルスベクターは、ヒトＵ６ＲＮＡプロモーター制御下、ポリＴ終結配列と作動可能なように連結されたｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる。本明細書において使用される「ポリＴ終結配列と作動可能なように連結された」とは、センス又はアンチセンス鎖をコードする核酸配列が、ポリＴ終結シグナルと５’方向ですぐに隣接していることを意味する。ベクターからのｍｉＲ配列の転写の間、ポリＴ終結シグナルは転写を終結させるように作用する。
本発明の治療法の他の態様において、ｍｉＲ発現を阻害する少なくとも一つの化合物の有効量も対象に投与し得る。本明細書において使用される「ｍｉＲ発現を阻害する」とは、治療後のｍｉＲ遺伝子産物の活性成熟形態の産生が、治療以前に産生された量よりも少ないことを意味する。当業者は、例えば、診断法について上で議論したｍｉＲ転写体レベルを決定するための技術を使用して、癌細胞においてｍｉＲ発現が阻害されたかどうかを容易に決定し得る。阻害は遺伝子発現のレベル（即ち、ｍｉＲ遺伝子産物をコードするｍｉＲ遺伝子の転写を阻害することにより）、又はプロセッシングのレベル（例えば、ｍｉＲ前駆体の成熟活性ｍｉＲへのプロセッシングを阻害することにより）で起こり得る。
本明細書で使用される、ｍｉＲ発現を阻害する化合物の「有効量」とは、癌関連染色体特徴に関連した癌を罹患した対象中の、癌細胞の増殖を阻害するために十分な量である。当業者は、対象のサイズ及び体重；疾患浸透の程度；対象の年齢、健康及び性；投与経路；及び投与が局所的であるか又は全身的であるかどうかのような因子を考慮に入れて、所与の対象に投与すべきｍｉＲ発現阻害化合物の有効量を容易に決定し得る。
例えば、発現阻害化合物の有効量は、治療されるべき腫瘍のおよその重量に基づき得る。腫瘍塊のおよその重量は、塊のおよその容量を計算することにより決定することが可能であり、１立方センチメーターの容量は大体１グラムに等しい。腫瘍塊の重量に基づいた有効量は、腫瘍塊のグラム当たり約１０〜５００マイクログラムの間、腫瘍塊のグラム当たり少なくとも約１０マイクログラム、腫瘍塊のグラム当たり少なくとも約６０マイクログラム、及び少なくとも腫瘍塊のグラム当たり約１００マイクログラムであり得る。
ｍｉＲ発現を阻害する化合物の有効量は、治療されるべき対象のおよその又は推定体重にも基づき得る。こうした有効量は、本明細書に記載したように、非経口的に又は経腸的に投与される。例えば、対象に投与されるべき発現阻害化合物の有効量は、体重ｋｇ当たり約５〜３０００マイクログラム、体重ｋｇ当たり約７００〜１０００マイクログラムの範囲であることができ、又はそれは体重ｋｇ当たり約１０００マイクログラムを超えていてもよい。
当業者は、所与の対象へｍｉＲ発現阻害化合物を投与することについての適切な投与計画も容易に決定し得る。例えば、発現阻害化合物は対象に一度に投与し得る（例えば、単回注射又はデポジションとして）。もしくは、発現阻害化合物は、約３〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の期間、対象に１日１回又は２回投与し得る。特定の投与計画において、発現阻害化合物は７日にわたって１日１回投与される。投与計画が複数の投与を含んでなる場合、対象に投与される発現阻害化合物の有効量は、全投与計画にわたって投与された化合物の総量を含んでなることが理解される。
ｍｉＲ遺伝子発現を阻害するために適した化合物には、二本鎖ＤＮＡ（短い又は小さな干渉ＲＮＡ又は「ｓｉＲＮＡ」のような）、アンチセンス核酸及びリボザイムのような酵素的ＲＮＡ分子が含まれる。これらの化合物の各々は、所与のｍｉＲ遺伝子産物へ標的化することが可能であり、標的ｍｉＲ遺伝子産物を破壊する又は破壊を誘導する。
例えば、所与のｍｉＲ遺伝子の発現は、ｍｉＲ遺伝子産物の少なくとも一部と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列相同性を有する単離された二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子でｍｉＲ遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導することにより阻害し得る。特定の態様において、ｄｓＲＮＡ分子は、「短い又は小さな干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」である。
本方法に有用なｓｉＲＮＡは、約１７ヌクレオチドから約２９ヌクレオチド長の、好ましくは約１９〜約２５ヌクレオチド長の短い二本鎖ＤＮＡを含んでなる。該ｓｉＲＮＡは、標準ワトソン−クリック塩基対形成相互作用により（以後「塩基対形成された」）一緒にアニーリングされたセンスＲＮＡ鎖及び相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含んでなる。センス鎖は、標的ｍｉＲ遺伝子産物内に含有されている核酸配列と実質的に同一である核酸配列を含んでなる。
本明細書で使用される、標的ｍＲＮＡ内に含有されている標的配列と「実質的に同一である」ｓｉＲＮＡ中の核酸配列は、標的配列と同一である、又は１又は２ヌクレオチドだけ標的配列と異なっている核酸配列である。ｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含んでなることが可能であり、又は２つの相補的部分が塩基対形成された、及び一本鎖「ヘアピン」領域により共有結合で連結された単一分子を含んでなることも可能である。
該ｓｉＲＮＡは、一つ又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変により天然に存在するＲＮＡとは異なった改変ＲＮＡであることも可能である。こうした改変は、ｓｉＲＮＡの末端（単数又は複数）に対する又はｓｉＲＮＡの一つ又はそれ以上の内部ヌクレオチドに対する非ヌクレオチド物質の付加、又はヌクレアーゼ消化に対してｓｉＲＮＡを耐性にする修飾、又はデオキシリボヌクレオチドによるｓｉＲＮＡ中の一つ又はそれ以上のヌクレオチドの置換を含むことができる。
ｓｉＲＮＡの１つ又は両方の鎖は、３’オーバーハングも含み得る。本明細書において使用される「３’オーバーハング」は、二重鎖形成したＲＮＡ鎖の３’末端から伸長する少なくとも一つの、対を形成していないヌクレオチドを指す。それ故、特定の態様において、ｓｉＲＮＡは、１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む）長、１〜約５ヌクレオチド長、１〜約４ヌクレオチド長、又は約２〜約４ヌクレオチド長の少なくとも一つの３’オーバーハングを含んでなる。特定の態様において、３’オーバーハングはｓｉＲＮＡの両方の鎖上に存在し、及び２ヌクレオチド長である。例えば、ｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）又はジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’オーバーハングを含んでなることができる。
ｓｉＲＮＡは、化学的又は生物学的、又は単離されたｍｉＲ遺伝子産物について前に記載した組換えプラスミド又はウイルスベクターから発現することも可能である。ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子を産生する又は試験する方法の例は、それらの全開示が本明細書において援用される、Gewirtz による米国公開特許出願番号2002/0173478及びReich et al. による米国公開特許出願番号2004/0018176 に記載されている。
所与のｍｉＲ遺伝子の発現は、アンチセンス核酸によっても阻害し得る。本明細書で使用される「アンチセンス核酸」とは、標的ＲＮＡの活性を変化させ、ＲＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ペプチド核酸相互作用により標的ＲＮＡに結合する核酸分子を指す。本方法における使用のために適したアンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物中の近接する核酸配列に相補的な核酸配列を一般的に含んでなる、一本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ＰＮＡ）である。アンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物中の近接する核酸配列と５０〜１００％相補的、７５〜１００％相補的、又は９５〜１００％相補的である核酸配列を含んでなることができる。ｍｉＲ遺伝子産物についての核酸配列は表１に提供されている。いずれかの理論に束縛されるものではないが、アンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物／アンチセンス核酸二重鎖を消化するＲＮａｓｅ Ｈ又は別の細胞ヌクレアーゼを活性化すると信じられている。
アンチセンス核酸は、標的特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達又は分子の有効性に関する他の特性を増強するため、核酸主鎖への又は糖及び塩基部分（またはそれらの均等物）への修飾も含有し得る。こうした修飾には、コレステロール部分、アクリジンのような二重鎖インターカレーター、又は一つ又はそれ以上のヌクレアーゼ抵抗性基が含まれる。
アンチセンス核酸は、化学的又は生物学的、又は単離されたｍｉＲ遺伝子産物について前に記載した組換えプラスミド又はウイルスベクターから発現することも可能である。産生する又は試験する方法の例は、当業者の範囲内である；例えば、それらの全開示が本明細書において援用される、Stein and Cheng (1993), Science 261 :1004及びWoolf et al., による米国特許第5,849,902号を参照されたい。
所与のｍｉＲ遺伝子の発現は、酵素的核酸によっても阻害し得る。本明細書で使用される「酵素的核酸」とは、ｍｉＲ遺伝子産物の近接する核酸配列に相補性を有する基質結合領域を含んでなる核酸を指し、それはｍｉＲ遺伝子産物を特異的に切断することができる。酵素的核酸基質結合領域は、ｍｉＲ遺伝子産物中の近接する核酸配列と、例えば、５０〜１００％相補的、７５〜１００％相補的又は９５〜１００％相補的であり得る。酵素的核酸は、塩基、糖及び／又はリン酸基に修飾を含んでなることもできる。本方法における使用のための酵素的核酸の例はリボザイムである。
該酵素的核酸は、化学的又は生物学的、又は単離されたｍｉＲ遺伝子産物について前に記載した組換えプラスミド又はウイルスベクターから発現することも可能である。ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子を産生する又は試験する方法の例は、それらの全開示が本明細書において援用される、Werner and Uhlenbeck (1995), Nucl Acids Res. 23:2092-96; Hammann et al. (1999), Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 9:25-31 ；及びCech et al. による米国特許第4,987,071 号に記載されている。
少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物、又はｍｉＲ発現を阻害するための少なくとも一つの化合物の投与は、癌関連染色体特徴に関連する癌を有する対象中での癌細胞の増殖を阻害するであろう。本明細書で使用される「癌細胞の増殖を阻害する」とは、該細胞を殺す、又は該細胞の増殖を持続的又は一時的に休止させる又は遅らせることを意味する。もし、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物の投与後に対象中のこうした細胞の数が一定に残るか又は減少したら、癌細胞増殖の阻害が推測できる。もし、こうした細胞の絶対数が増加しても、腫瘍増殖の速度が低下したら、癌細胞増殖の阻害がまた推測できる。
対象体内の癌細胞の数は、直接測定により、又は原発性又は転移性腫瘍塊のサイズからの推定により決定し得る。例えば、対象中の癌細胞の数は、免疫組織学的方法、フローサイトメトリー、又は癌細胞の特徴的表面マーカーを検出するように設計された他の技術により測定し得る。
腫瘍塊のサイズは、直接視覚的観察により、又はＸ線、磁気共鳴映像法、超音波及びシンチグラフィーのようなイメージング診断法により確認し得る。腫瘍塊のサイズを確認するために使用されるイメージング診断法は、当該技術分野では公知の造影剤を用いることができるが、又は用いなくてもよい。腫瘍塊のサイズは、組織塊の触診のような物理的手段により、又はキャリパーのような計測器での組織塊の測定によっても確認し得る。
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、対象の癌細胞へこれらの化合物を送達するために適したいずれかの手段により対象に投与し得る。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、これらの化合物で、又はこれらの化合物をコードする配列を含んでなる核酸で対象の細胞をトランスフェクトするために適した方法により投与される。一つの態様において、該細胞は、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を含んでなるプラスミド又はウイルスベクターでトランスフェクトされる。
真核細胞のためのトランスフェクション法は当該技術分野では公知であり、そして例えば、細胞の核又は前核内への直接注入；エレクトロポレーション；リポソーム輸送又は親油性物質により仲介される輸送；レセプター仲介核酸送達；生物弾道又は粒子加速；リン酸カルシウム沈澱、及びウイルスベクターにより仲介されるトランスフェクションが含まれる。
例えば、細胞はリポソーム輸送化合物、例えば、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート、Boehringer-Mannheim ）又はLIPOFECTINのような均等物でトランスフェクトし得る。使用される核酸の量は、本発明の実施には決定的ではない；０．１〜１００マイクログラム核酸／１０５細胞で受容可能な結果が達成できる。例えば、１０５細胞当たり、３マイクログラムのＤＯＴＡＰ中に約０．５マイクログラムのプラスミドベクターの比で使用し得る。
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、いずれかの適した経腸又は非経口投与経路によっても対象に投与し得る。本方法のために適した経腸投与経路には、例えば、経口、直腸又は鼻孔内送達が含まれる。適した非経口投与経路には、例えば、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス投与、静脈内注入、動脈内ボーラス投与、動脈内注入、及び血管系内へのカテーテル点滴注入）；組織周辺及び内注射（例えば、腫瘍周囲及び腫瘍内注射、網膜内注射又は網膜下注射）；皮下注入（浸透圧ポンプによるような）を含む皮下注射又はデポジション；カテーテル又は他の設置デバイス（例えば、網膜ペレット又は座剤、又は多孔質、非多孔質又はゲル状物質を含んでなる移植片）による目的の組織への直接適用；及び吸入が含まれる。特に適した投与経路は注射、注入及び腫瘍内への直接注射である。
本方法において、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、裸のＲＮＡとして、送達試薬と組み合わせて、又はｍｉＲ遺伝子産物又は発現阻害化合物を発現する配列を含んでなる核酸（例えば、組換えプラスミド又はウイルスベクター）として対象に投与し得る。適した送達試薬には、例えば、Mirus Transit TKO 親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクチン；セルフェクチン；ポリカチオン（例えば、ポリリジン）及びリポソームが含まれる。
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物を発現する配列を含んでなる組換えプラスミド又はウイルスベクター、及びこうしたプラスミド及びベクターを癌細胞に送達するための技術は本明細書に記載されている。
特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又はそれらをコードする配列を含んでなる核酸）を対象に送達するためにリポソームが使用される。リポソームは該遺伝子産物又は核酸の血中半減期を増加させることもできる。本発明で使用するために適したリポソームは、一般的に中性又は陰性に荷電したリン脂質及びコレステロールのようなステロールを含む、標準小胞形成脂質から形成し得る。脂質の選択は、所望のリポソームサイズ及び血流中のリポソームの半減期のような因子の考慮により一般的に導かれる。例えば、それらの全開示が本明細書において援用される、Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467；及び米国特許第4,235,871、4,501,728、4,837,028及び5,019,369 号に記載されているように、リポソームを作製するための多様な方法が知られている。
本方法で使用するためのリポソームは、リポソームに癌細胞を標的とさせるリガンド分子を含むことができる。腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体のような、癌細胞に蔓延しているレセプターに結合するリガンドが好ましい。
本方法で使用するためのリポソームは、単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）及び細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるクリアランスを避けるために修飾され得る。こうした修飾リポソームは、表面上又はリポソーム構造内に組み入れられたオプソニン化阻害部分を有する。特に好ましい態様において、本発明のリポソームはオプソニン化阻害部分及びリガンドの両方を含むことが可能である。
本発明のリポソームの作製において使用するオプソニン化阻害部分は、典型的にはリポソーム膜へ結合された大きな親水性ポリマーである。本明細書で使用する、オプソニン化阻害部分がリポソーム膜に「結合されて」いるとは、例えば、膜それ自身内への脂溶性アンカーのインターカレーションにより、又は膜脂質の活性基への直接結合により化学的又は物理的に膜に結合されている場合である。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは保護的表面層を形成し、ＭＭＳ及びＲＥＳによるリポソームの取り込みを著しく減少させる；例えば、その全開示が本明細書において援用される米国特許第4,920,016号に記載されているように。
リポソームを修飾するために適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは、約５００〜約４０，０００ダルトン、及びより好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有する水溶性ポリマーである。こうしたポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えば、メトキシＰＥＧ及びＰＰＧ、又はＰＥＧ及びＰＰＧステアレート；ポリアクリルアミド又はポリＮ−ビニルピロリドンのような合成ポリマー；直鎖状、分枝又は樹状のポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えば、カルボキシ又はアミノ基が化学的に結合されたポリビニルアルコール及びポリキシリトール、ならびにガングリオシドＧＭｌのようなガングリオシド、が含まれる。ＰＥＧのコポリマー、メトキシＰＥＧ又はメトキシＰＰＧ又はそれらの誘導体も適している。加えて、該オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧとポリアミノ酸、ポリサッカリド、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン又はポリヌクレオチドとのブロックコポリマーでもあり得る。該オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸又はカルボン酸、例えば、ガラクツロ酸、グルクロン酸、マンノン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナンを含有する天然のポリサッカリド；アミノ化ポリサッカリド又はオリゴサッカリド（直鎖又は分枝）；又は、例えば、生じたカルボキシル基で繋がっている炭酸の誘導体と反応させたカルボキシル化ポリサッカリド又はオリゴサッカリドでもあり得る。好ましくは、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ又はそれらの誘導体である。ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、しばしば「ＰＥＧ化リポソーム」と称される。
オプソニン化阻害部分は、多数の公知の技術のいずれか１つによりリポソーム膜に結合し得る。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシサクシニミドエステルはホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーへ結合することができ、そして次ぎに膜へ結合される。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３及び３０：１２の比でのテトラヒドロフラン及び水のような溶媒混合物を使用した６０℃での還元的アミノ化を介して、ステアリルアミン脂溶性アンカーで誘導体化し得る。
オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、循環系において無修飾リポソームよりも長く残存する。このような理由のため、こうしたリポソームはしばしば「ステルス」リポソームと称される。ステルスリポソームは、多孔質又は「漏出性」微小血管系から栄養を受けている組織で蓄積されることが知られている。それ故、こうした微小血管系欠陥により特徴付けられる組織、例えば、固形腫瘍はこれらのリポソームを効率的に蓄積するであろう；Gabizon, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 18:6949-53 を参照されたい。加えて、ＲＥＳによる減少した取り込みは、肝臓及び脾臓におけるリポソームの有意な蓄積を防止することにより、ステルスリポソームの毒性を低下させる。それ故、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又はそれらをコードする配列を含んでなる核酸）を腫瘍細胞に送達するのに特に適している。
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、当該技術分野で公知の技術に従って、それらを対象に投与することに先立って、医薬組成物として製剤することができる（しばしば「医薬」と称される）。従って、本発明は乳癌を治療するための医薬組成物を包含する。一つの態様において、該医薬組成物は、少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物及び薬学的に許容できる坦体を含んでなる。特定の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、適した対照細胞と比較して乳癌細胞中で減少したレベルの発現を有するｍｉＲ遺伝子産物に対応する。特定の態様において、該単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２３（ｍｉＲ−１２６）、ｍｉＲ−４０−ａｓ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ−ｌ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｄ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ１）、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１４３及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
他の態様において、本発明の医薬組成物は、少なくとも一つのｍｉＲ発現阻害化合物を含んでなる。特定の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ発現阻害化合物は、その発現が対照細胞よりも乳癌細胞で多いｍｉＲ遺伝子に特異的である。特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−００９−１（ｍｉＲ１３１−１）、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−１７０）、ｍｉＲ−１０２（ｍｉＲ−２９ｂ）、ｍｉＲ−２１３、ｌｅｔ−７ｉ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ２）、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１３及びそれらの組み合わせから成る群より選択される一つ又はそれ以上のｍｉＲ遺伝子産物に特異的である。
本発明の医薬組成物は少なくとも無菌で及び発熱物質が含まれていないことで特徴付けられる。本明細書で使用される「医薬製剤」は、ヒト及び獣医学使用のための製剤を含む。本発明の医薬組成物を製造するための方法は、例えば、その全開示が本明細書において援用される、Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985) に記載されているように、当業者の範囲内である。
本医薬製剤は、医薬として受容可能な坦体と混合された、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又はそれらをコードする配列を含んでなる少なくとも一つの核酸）（例えば、０．１〜９０重量％）又はそれらの生理学的に受容可能な塩を含んでなる。本発明の医薬製剤は、リポソームで被包されている少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は、それらをコードする配列を含んでなる少なくとも一つの核酸）及び薬学的に許容できる坦体も含むことができる。一つの態様において、該医薬組成物は、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１４３及び／又はｍｉＲ−１４５ではないｍｉＲ遺伝子又は遺伝子産物を含んでなる。
特に適した薬学的に許容できる坦体は、水、緩衝化水、通常の生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などである。
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、ヌクレアーゼによる分解に耐性である少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は、それらをコードする配列を含んでなる少なくとも一つの核酸）を含んでなる。当業者は、例えば、２’位が修飾されている一つ又はそれ以上のリボヌクレオチドをｍｉＲ遺伝子産物内に取り込ませることにより、ヌクレアーゼ耐性である核酸を容易に合成し得る。適した２’修飾リボヌクレオチドには、フルオロ、アミノ、アルキル、アルコキシ及びＯ−アリルで２’位が修飾されているものが含まれる。
本発明の医薬組成物は、慣用的医薬賦形剤及び／又は添加剤も含むことができる。適した医薬賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調節剤、緩衝剤及びｐＨ調整剤が含まれる。適した添加剤には、例えば、生理学的生体適合性緩衝剤（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キレート剤の添加（例えば、ＤＴＰＡ又はＤＴＰＡ−ビスアミドのような）又はカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドのような）又は、随意に、カルシウム又はナトリウム塩の添加（例えば、塩化カルシウム、アスコビル酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は乳酸カルシウム）が含まれる。本発明の医薬組成物は液体形態での使用のために包装することができ、又は凍結乾燥することができる。
本発明の固形医薬組成物のためには、慣用的無毒固体の薬学的に許容できる坦体を使用することができる；例えば、医薬用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなど。
例えば、経口投与のための固形医薬組成物は、上に列挙したいずれかの坦体及び賦形剤、及び１０〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は、それらをコードする配列を含んでなる少なくとも一つの核酸）を含み得る。エアロゾル（吸入）投与のための医薬組成物は、０．０１〜２０重量％、好ましくはｌ％〜１０重量％の上記のようにリポソーム中に被包された少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は、それらをコードする配列を含んでなる少なくとも一つの核酸）及び噴霧剤を含み得る。望むなら坦体も含ませ得る；例えば、鼻腔内送達のためのレシチン。
本発明は、抗乳癌剤を同定するための方法も包含し、細胞に試験剤を提供すること、及び細胞中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含んでなる。一つの態様において、本方法は細胞に試験剤を提供すること、及び乳癌細胞において減少した発現レベルに関連する少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含んでなる。適した対照細胞と比較して、該細胞中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加は、試験剤が抗乳癌剤であることを示す。特定の態様において、乳癌細胞中での減少した発現レベルに関連する少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２３（ｍｉＲ−１２６）、ｍｉＲ−１４０−ａｓ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ−ｌ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｄ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ１）、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１４３及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
他の態様において、本方法は細胞に試験剤を提供すること、及び乳癌細胞において増加した発現レベルに関連する少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含んでなる。適した対照細胞と比較して、該細胞中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの減少は、試験剤が抗乳癌剤であることを示す。特定の態様において、乳癌細胞中での増加した発現レベルに関連する少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−００９−１（ｍｉＲ１３１−ｌ）、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−１７０）、ｍｉＲ−１０２（ｍｉＲ−２９ｂ）、ｍｉＲ−２１３、ｌｅｔ−７ｉ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ２）、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１３及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
適した剤には、限定されるわけではないが、薬剤（例えば、小分子、ペプチド）及び生物学的巨大分子（例えば、タンパク質、核酸）が含まれる。該剤は、組換え的に、合成的に製造することができ、又はそれは天然源から単離する（即ち、精製する）ことができる。細胞へこうした剤を提供するための多様な手段（例えば、トランスフェクション）は当該技術分野では公知であり、こうした方法のいくつかが以下に記載されている。少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を検出するための方法（例えば、ノーザンブロッティング、インサイツハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、発現プロファイリング）も当該技術分野では公知である。これらの方法のいくつかも以下に記載されている。
本発明はここで以下の非制限実施例により例示されるであろう。
実施例１：乳癌組織を正常組織と識別するマイクロＲＮＡ発現シグニチャーの同定
材料及び方法
乳癌サンプル及び細胞株 原発性腫瘍からのＲＮＡは、University of Ferrara (Italy), Istituto Nazionale dei Tumori, Milano (Italy) 及びThomas Jefferson University (Philadelphia, PA) で集められた７６のサンプルから得られた。臨床−病理学的情報は５８の腫瘍サンプルについて利用可能であった。正常サンプルからのＲＮＡは各５つの正常胸部組織からのＲＮＡの６つのプール、ならびに４つの追加の単一胸部組織からのＲＮＡから成っていた。乳癌ＲＮＡは以下の細胞株から得られた：Ｈｓ５７８−Ｔ、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＢＴ２０、ＳＫ−ＢＲ−３、ＨＢＬ１００、ＨＣＣ２２１８、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３及びＭＤＡＭＢ−４６８。
ｍｉＲＮＡマイクロアレイ 総ＲＮＡ単離は、製造元の指示書に従ってトリゾール試薬（Invitrogen）で実施した。マイクロＲＮＡマイクロアレイチップ上でのＲＮＡ標識及びハイブリダイゼーションは以前に記載されているように実施した(Liu, C-G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:9740-9744 (2004)) 。簡単には、各サンプルからの５μｇのＲＮＡを、ランダムヘキサマーを使用して逆転写の間にビオチンで標識した。ハイブリダイゼーションは、２４５のヒト及びマウスｍｉＲＮＡ遺伝子を含む３６８のプローブを含むｍｉＲＮＡマイクロアレイチップ上で３重に実施した（ＫＣＩバージョン１．０）(Liu, C-G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:9740-9744 (2004))。ハイブリダイゼーションシグナルは、Perkin-Elmer ScanArray XL5K を使用し、ストレプトアビジン−Alexa647コンジュゲートへのビオチンの結合により検出した。スキャナーイメージはQuantarray ソフトウェア(Perkin Elmer)により定量した。
マイクロアレイデータの統計学的及び生物情報学的解析
生データはGeneSpring（登録商標）ソフトウエア、バージョン７．２ (SiliconGenetics, Redwood City, CA) を使用して規格化し及び解析した。発現データは中央値に集められた。統計的比較は、偽陽性減少のためのBenjamini及びHochberg補正を使用し、ＡＮＯＶＡ（分散分析）により実施した。腫瘍又は正常クラス予測についての予後ｍｉＲＮＡは、ＰＡＭソフトウエア(http://www.stat.stanford.edu/~tibs/PAM/index.htmlから入手可能なマイクロアレイ予測分析) (Tibshirani, R., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:6567-6572 (2002)) 及びサポートベクターマシン(Spport Vector Machine) (Furey, T.S., et al. Bioinformatics 16: 906-914 (2000)) ソフトウエアの両方を使用して決定した。両方のアルゴリズムをクロス確認及びテストセット予測に使用した。全てのデータはMIAMExpress を使用してArray Express データベースへ提出された（受けるべき受入番号は修正後に）。
ノーザンブロッティング ノーザンブロット解析は以前に記載されているように実施した(Calin, G.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 99:15524-29 (2002)) 。ＲＮＡサンプル（各１０μｇ）を１５％アクリルアミド、７Ｍ尿素Criterionプレキャストゲル(Bio-Rad)で電気泳動し、そしてHybond-N+膜（Amersham Pharmacia Biotech）上に移した。ハイブリダイゼーションは７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／０．２Ｍ Ｎａ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）中３７℃で１６時間実施した。膜を４２℃で２回、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ）及び０．１％ＳＤＳを補給した標準食塩水リン酸液（０．１８Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４）、及び０．５Ｘ ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。オリゴヌクレオチドプローブは対応する成熟マイクロＲＮＡの配列と相補的であった（http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/ のmiR Registryを参照されたい)：ｍｉＲ−２１ 5’-TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A-3’（配列番号：２８７）；ｍｉＲ−１２５ｂ１：5’-TCA CAA GTT AGG GTC TCA GGG A-3’（配列番号：２８８）；ｍｉＲ−１４５：5’-AAG GGA TTC CTG GGA AAA CTG GAC-3’（配列番号：２８９）。Ｕ６ ＲＮＡ（5’-GCA GGG GCC ATG CTA ATC TTC TCT GTA TCG-3’（配列番号：２９０））と相補的であったオリゴヌクレオチドを、発現レベルを規格化するために使用した。２００ｎｇの各プローブは、ポリヌクレオチドキナーゼ（Roche）を使用し、１００ｍＣｉ［ガンマ−３２Ｐ］−ＡＴＰで末端標識した。再ハイブリダイゼーションの前に沸騰させた０．１％ＳＤＳ溶液中で１０分、ノーザンブロットをストリップした。
結果
１０の正常及び７６の腫瘍性胸部組織について、マイクロＲＮＡ発現プロファイルを発生させるためにマイクロＲＮＡマイクロアレイ(Liu, C-G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:9740-9744 (2004)) を使用した。各腫瘍サンプルは単一の検体に由来し、一方、１０の正常サンプルの内の６は、５つの異なった正常胸部組織から作製されたＲＮＡのプールから成っていた。それ故、本研究においては３４の正常胸部サンプルが実際には試験されていた。
正常及び腫瘍サンプル間で異なって発現された、及びそれ故、癌性胸部組織から正常組織を区別するために使用することが可能であるｍｉＲＮＡを同定するため、分散分析及びクラス予測統計学的ツールを利用した。規格化されたデータに対するＡＮＯＶＡ分析の結果は、正常及び癌性胸部組織間で異なって発現されたｍｉＲＮＡのプロファイルを発生した（ｐ＜０．０５）（表２）。異なって発現されたｍｉＲＮＡに基づいたクラスター解析は、正常及び癌組織間に明白な差違を有するツリーを発生した（図１Ａ）。
乳癌組織から正常組織を区別することができる予測的ｍｉＲＮＡのセットを正確に同定するため、サポートベクターマシン(Support Vector Machine)（GeneSpringソフトウエア）及びＰＡＭ（マイクロアレイの予測解析） (http://wwwstat.stanford.edu/~tibs/) を使用した。２つのクラス予測解析からの結果は大部分が重なっていた（表３及び図１Ｂ）。表３に列挙したｍｉＲＮＡの中で、１５の内の１１が０．０５未満のＡＮＯＶＡ ｐ値を有している。マイクロアレイ解析により得られた結果を確認するため、我々はノーザンブロット解析を行って、正常及び癌性胸部組織において異なって発現されたマイクロＲＮＡの下位集団、即ち、ｍｉｒ−１２５ｂ、ｍｉｒ−１４５及びｍｉｒ−２１についての発現レベルを評価した。ノーザンブロット解析はマイクロアレイ解析により得られた結果を確認した。多くの場合において、発現の相違はマイクロアレイ研究により予期されたものよりも強いように思われた（図１Ｃ）。
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マイクロアレイ解析に従うと、その発現が有意に（ｐ＜０．０５）調節解除されている２９のｍｉＲＮＡの内、１５のｍｉＲＮＡのセットは、１００％の精度で分析されたサンプルの性質を正しく予測することが可能であった（即ち、正常ｖｓ腫瘍）。異なって発現されたｍｉＲＮＡ中で、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ１４５、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−１５５が、乳癌サンプルで最も一貫して調節解除されたｍｉＲＮＡであった。これらの３つ、即ち、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２５ｂ及びｍｉＲ−１４５は下方調節されており、一方残りの２つ、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−１５５は上方調節されており、それらが各々腫瘍抑制遺伝子又は癌遺伝子として働くことができることを示唆している。
実施例２：乳癌中で調節解除されているｍｉＲＮＡの推定遺伝子標的の決定。
現在、真実の（bona fide）ｍｉＲＮＡ遺伝子標的についての知識の欠如は、どの生物学的機能が、異常ｍｉＲＮＡ発現により特徴づけられた癌において調節解除されているのかの完全な理解を妨げている。我々の研究で最も著しく調節解除されているｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−１５５（実施例１を参照されたい）の推定標的を同定するため、複数のコンピューターによるアプローチを利用した。特に、該分析は、ヒトｍｉＫＮＡ遺伝子標的を予測するために普通に使用されている３つのアルゴリズム、ｍｉＲａｎｄａ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ及びＰｉｃＴａｒを使用した(Enright, A.J., et al. Genome Biol. J:R1(2003); Lewis, B.P. et al, Cell 115:787-798 (2003); Krek, A., et al,, Nat. Genet. 37:495-500 (2005)) 。３つのアルゴリズムの各々を使用して得られた結果をお互いに相互参照して推定標的を確認し、そして３つのアルゴリズムの内の少なくとも２つで同定された標的のみを考慮した。この分析の結果は表４に示されている。
潜在的発癌性機能を有するいくつかの遺伝子が、乳癌サンプル中で下方調節されているｍｉＲＮＡの推定標的として同定された。特に、癌遺伝子がｍｉＲ−１０ｂ（例えば、ＦＬＴｌ、ｖ−ｃｒｋ相同体、増殖因子ＢＤＮＦ及びトランスデューシン因子ＳＨＣ１）、ｍｉＲ−１２５ｂ（例えば、ＹＥＳ、ＥＴＳ１、ＴＥＬ、ＡＫＴ３、増殖因子レセプターＦＧＦＲ２及びマイトジェン活性シグナル伝達経路ＶＴＳ５８６３５、ＭＡＰ３Ｋ１０、ＭＡＰ３Ｋ１１、ＭＡＰＫ１４）及びｍｉＲ−１４５（例えば、ＭＹＣＮ、ＦＯＳ、ＹＥＳ及びＦＬＩ１、フレンド白血病ウイルスの組み込み部位、サイクリンＤ２のような細胞周期プロモーター、及びＬ１、ＭＡＰ３Ｋ３及びＭＡＰ４Ｋ４のようなＭＡＰＫ伝達タンパク質）の標的として同定された。プロトオンコジーン、ＹＥＳ、及びコア結合転写因子、ＣＢＦＢ、がｍｉＲ−１２５及びｍｉＲ−１４５両方の潜在的標的であると決定された。
これらの発見と一致して、多腫瘍抑制遺伝子が、乳癌細胞中で上方調節されているｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−１５５の標的として同定された。ｍｉＲ−２１について、ＴＧＦＢ遺伝子が３つの方法により標的として予測された。ｍｉＲ−１５５については、潜在的標的には腫瘍抑制遺伝子、ＳＯＣＳｌ及びＡＰＣ、及びＣｄｃ２の活性をブロックし、及び有糸分裂に入るのを防止するキナーゼ、ＷＥＥ１が含まれる。低酸素誘導可能因子、ＨＩＦ１ＡもｍｉＲ−１５５の標的として予測された。特に、三者間モチーフ含有タンパク質、ＴＲＩＭ２、プロトオンコジーン、ＳＫＩ、及びＲＡＳ相同体、ＲＡＢ６Ａ及びＲＡＢ６ＣがｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−１５５両方の潜在的標的として観察された。
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実施例３：背物病理学的特徴及びマイクロＲＮＡ発現
材料及び方法
乳癌サンプルの免疫組織学的分析
染色手順は記載されているように(Querzoli, P., et al, Anal. Quant. Cytol. Histol. 27:151-160 (1999)) 実施した。ホルモンレセプターは、エストロゲンレセプターα（ＥＲ）については６Ｆｌ１抗体、及びプロゲステロンレセプター（ＰＲ）についてはＰＧＲ−１Ａ６抗体で評価した(Ventana, Tucson, AZ, U.S.A.) 。増殖指数はＭＩＢ１抗体 (DAKO, Copenhagen) で評価した。ＥＲＢＢ２は、ＣＢ１１抗体 (Ventana, Tucson, AZ, U.S.A.) で検出し、及びｐ５３タンパク質発現は、ＤＯ７抗体 (Ventana, Tucson, AZ, U.S.A.) で試験した。ＥＲ、ＰＲ、Ｍｉｂ１及びｐ５３について明瞭な核免疫染色を有する腫瘍細胞のみ陽性と記録した。腫瘍細胞は、ＥＲＢＢ２が明瞭な膜免疫反応性を示した場合、ＥＲＢＢ２について陽性と考えた。
これら多様な生物学的マーカーの発現の定量的分析を実施するため、Eureka Menarini コンピューター化イメージ解析システムを使用した。各腫瘍切片について、浸潤癌の少なくとも２０顕微鏡視野を４０ｘの対物レンズを使用して測定した。以下のカットオフ値を用いた：ＥＲ、ＰＲ、ｃ−ｅｒｂＢ２及びｐ５３について１０％の陽性核領域、Ｍｉｂｌを発現している１３％の核、を高及び低増殖活性のケースを識別するために導入した。
結果
乳癌に関連する多様な生物病理学的特徴と特定のｍｉＲＮＡの発現間に相関が存在するかどうかを評価するため、特定の乳癌特徴の存在又は非存在に関連する多様な癌サンプルについて、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを発生させ及び比較した。特に、乳癌と小葉又は管組織タイプ、乳癌とエストロゲンレセプターアルファ（ＥＲ）か又はプロゲステロンレセプター、及び乳癌とリンパ節転移、血管浸潤、増殖指数及びＥＲＢＢ２及びｐ５３の発現における差異、を分析した。
小葉又は管及び＋／−ＥＲＢＢ２発現クラスの発現プロファイルは、異なって発現されたいずれのマイクロＲＮＡも明らかにしなかったが、全ての他の比較は少数の異なって発現されたマイクロＲＮＡｓ（Ｐ＜０．０５）を明らかにした。腫瘍グレードは分析されていない。この分析の結果は図４に示されている。
異なって発現されたｍｉＲＮＡファミリーを、ヒト乳癌に関連する多様な生物病理学的特徴について同定した。例えば、すべてのｍｉＲ−３０ ｍｉＲＮＡはＥＲ−及びＰＲ−腫瘍の両方において下方調節されており、ｍｉＲ−３０ ｍｉＲＮＡの発現がこれらのホルモンにより調節されていることを示唆している。加えて、多様なｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡが、リンパ節転移か又は高増殖指数を有する乳癌サンプルにおいて下方調節されており、減少したｌｅｔ−７発現が悪い予後と関連付け得ることを示唆しており、結果は以前の発見と一致している(Takamizawa, J., et al., Cancer Res. 39: 167-169(2004)) 。ｍｉＲＮＡのｌｅｔ−７ファミリーがＲＡＳ癌遺伝子ファミリーの発現を調節するという発見は、ヒト癌におけるｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡの役割についての説明の可能性を提供する(Johnson, S.M., et al., Cell 120:635-647 (2005)) 。
その発現で癌又は正常組織を区別できる２つのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１４５及びｍｉＲ−２１も、異なった増殖指数又は異なった腫瘍ステージを有する癌において異なって発現されていた。特に、ｍｉＲ−１４５は、正常胸部から高増殖指数を有する癌まで連続的に下方調節されている。同様に、ｍｉＲ−２１は、正常胸部から高い腫瘍ステージを有する癌まで連続的に上方調節されている。これらの発見は、これら２つのｍｉＲＮＡの調節解除が、腫瘍進行に関与する決定的な分子事象に影響できることを示唆する。
癌進行に関与する可能性のある別のｍｉＲＮＡはｍｉＲ−９−３である。ｍｉＲ−９−３は、高血管浸潤か又はリンパ節転移を有する乳癌において下方調節されており、その下方制御は腫瘍進行の過程、特に転移能の獲得の間に獲得されていることを示唆している。
明確に援用されていなかった、本明細書で引用されたすべての出版物の関連する教示は、その全体が本明細書において援用される。本発明はそれらの好ましい態様に関して特定的に示され及び記述されてきたが、付随する特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から離れることなく、形態及び詳細の多様な変更をその中で行えることを当業者は理解するであろう。
本特許又は出願ファイルは、カラーで作成されている少なくとも一つの図を含む。カラーの図を含む本特許又は特許出願の印刷物は、依頼及び必要な料金の支払い後、本事務所により提供されるであろう。
図１は、異なったマイクロＲＮＡ発現（Ｐ＜０．０５）に基づいて正常組織からの乳癌の分離を示している、クラスター解析により発生したツリーを描いている。図の下部のバーは癌（赤）又は正常胸部組織（黄）の群を示している。 図２は、ＰＡＭ解析に基づいた、癌性又は正常組織である各サンプルの確率（０．０〜１．０）を描いているグラフである。すべての乳癌及び正常組織は、表２に示されたｍｉＲシグニチャーにより正しく予測された。 図３Ａは、正常サンプルならびに乳癌患者（Ｐ）からのいくつかの腫瘍サンプル中の、ｍｉＲ−１２５ｂ相補的プローブを使用したｍｉＲ−１２５ｂの発現レベルを描いているノーザンブロットである。各サンプルについての発現レベルの規格化のため、Ｕ６プローブを使用した。 図３Ｂは、正常サンプルならびに乳癌患者（Ｐ）からのいくつかの腫瘍サンプル中の、ｍｉＲ−１４５相補的プローブを使用したｍｉＲ−１４５の発現レベルを描いているノーザンブロットである。各サンプルについての発現レベルの規格化のため、Ｕ６プローブを使用した。 図３Ｃは、正常サンプルならびに乳癌患者（番号付けされた患者として名前を付けられている）からのいくつかの腫瘍サンプル中の、ｍｉＲ−１２５ｂ相補的プローブを使用したｍｉＲ−１２５ｂの発現レベルを描いているノーザンブロットである。各サンプルについての発現レベルの規格化のため、Ｕ６プローブを使用した。 図３Ｄは、種々の乳癌株におけるマイクロＲＮＡ ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５及びｍｉＲ−２１の発現レベルを描いているノーザンブロットである。各マイクロＲＮＡの発現レベルは、正常組織からのサンプルにおいても決定した。各サンプルについての発現レベルの規格化のため、Ｕ６プローブを使用した。 図４Ａは、エストロゲンレセプターの存在（ＥＲ＋）又は非存在（ＥＲ−）に関連して乳癌中で異なって発現されたｍｉＲＮＡを列挙している表である。 図４Ｂは、プロゲステロンレセプターの存在（ＥＲ＋）又は非存在（ＥＲ−）に関連して乳癌中で異なって発現されたｍｉＲＮＡを列挙している表である。 図４Ｃは、ステージ１（ｐＴ１）又はステージ２又は３（ｐＴ２〜３）腫瘍に関連して乳癌中で異なって発現されたｍｉＲＮＡを列挙している表である。 図４Ｂは、リンパ節転移の存在（ｐＮ０）又は非存在（ｐＮ１０＋）に関連して乳癌中で異なって発現されたｍｉＲＮＡを列挙している表である。 図４Ｅは、血管浸潤の存在又は非存在に関連して乳癌中で異なって発現されたｍｉＲＮＡを列挙している表である。 図４Ｆは、高い（ＭＩＢ−１＞３０）又は低い（ＭＩＢ−１＜２０）増殖性指標（ＰＩ）に関連して乳癌中で異なって発現されたｍｉＲＮＡを列挙している表である。 図４Ｇは、ｐ５３の陽性（ｐ５３＋）又は陰性（ｐ５３−）免疫染色に関連して乳癌中で異なって発現されたｍｉＲＮＡを列挙している表である。

Claims (18)

  1. 対象が乳癌を有しているか、又は発生するリスクがあるかどうかについての検出を補助する方法であって、
    該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含んでなり、
    対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較して、該試験サンプル中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化が、該患者が乳癌を有しているか、又は発生するリスクがあることの指標であり、
    ここで当該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１５５である、前記方法。
  2. 該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１２５ｂ−１又はｍｉＲ１２５ｂ−２の１又はそれより多くを追加的に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１４５を追加的に含む、請求項１に記載の方法。
  4. 該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２１を追加的に含む、請求項１に記載の方法。
  5. 該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１０ｂを追加的に含む、請求項１に記載の方法。
  6. 該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−００９−１（ｍｉＲ１３１−１）、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−１７０）、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１３、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｄ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ１）、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｌｅｔ−７ｉ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ２）、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１０及びそれらの組み合わせから成る群より選択される１又はそれより多くのｍｉＲ遺伝子産物を追加的に含む、請求項１に記載の方法。
  7. 該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルがノーザンブロット分析を使用して測定される、請求項１に記載の方法。
  8. 該試験サンプル中の該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが該対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより低い、請求項１に記載の方法。
  9. 該試験サンプル中の該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが該対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより高い、請求項１に記載の方法。
  10. 対象における一つ又はそれより多くの予後マーカーに関連する乳癌の検出を補助する方法であって、
    該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含んでなり、
    予後マーカーに関連しない乳癌を含む対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較して、該試験サンプル中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化が、一つ又はそれより多くの予後マーカーに関連する乳癌を有する患者の指標であり、
    ここで当該一つ又はそれより多くの予後マーカーに関連する乳癌、及び、当該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が：
    （ｉ） 該乳癌がエストロゲンレセプター発現に関連する乳癌であり、及び該ｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−１０２（ｍｉＲ−２９ｂ）、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１２及びそれらの組み合わせから選択され；
    （ｉｉ） 該乳癌がプロゲステロンレセプター発現に関連する乳癌であり、及び該ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ及びそれらの組み合わせから成る群より選択され；
    （ｉｉｉ） 該乳癌が陽性リンパ結節転移に関連する乳癌であり、及び該ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−９−３及びそれらの組み合わせから成る群より選択され；
    （ｉｖ） 該乳癌が高増殖指数に関連する乳癌であり、及び該ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０２、ｍｉＲ−１４５及びそれらの組み合わせから成る群より選択され；
    （ｖ） 該乳癌が検出可能ｐ５３発現に関連する乳癌であり、及び該ｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１６ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ及びそれら組み合わせから成る群より選択され；
    （ｖｉ） 該乳癌が高血管浸潤に関連する乳癌であり、及び該ｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−９−３、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−１２３、ｍｉＲ−２０５及びそれらの組み合わせから成る群より選択され；及び
    （ｖｉｉ） 該乳癌が進行した腫瘍段階に関連する乳癌であり、該ｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−９−２、ｍｉＲ−１５−ａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０ａ−ｓ、ｍｉＲ−１３３ａ−１、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１５３−２、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１３及びそれらの組み合わせから成る群より選択される；から成る群より選択される、前記方法。
  11. 対象が乳癌を有しているか、又は発生するリスクがあるかどうかについての検出を補助する方法であって：
    （１） 該対象から得られた試験サンプルからＲＮＡを逆転写して、標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供すること；
    （２） 該標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ−特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んでなるマイクロアレイにハイブリダイズして、該試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること；及び
    （３） 該試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルを対照サンプルから発生されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較すること；
    を含んでなり、
    ここで、少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルの変化が、該対象が乳癌を有しているか、又は発生するリスクがあることの指標であり、
    ここでｍｉＲＮＡは、少なくともｍｉＲ−１５５遺伝子産物を含み、それは対照サンプルの発現レベルと比較して上方調節されている、前記方法。
  12. 少なくとも一つの追加的なｍｉＲＮＡのシグナルが、該対照サンプルから発生されたシグナルと比較して下方調節されている、請求項１１に記載の方法。
  13. ｍｉＲ−１５５遺伝子産物のシグナルが、該対照サンプルから発生されたシグナルと比較して上方調節されている、請求項１１に記載の方法。
  14. 該マイクロアレイが、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−００９−１（ｍｉＲ１３１−１）、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−１７０）、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１３、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｄ （ｌｅｔ−７ｄ−ｖ１）、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｌｅｔ−７ｉ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ２）、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１０及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、一つ又はそれより多くのｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項１１に記載の方法。
  15. 対象が対象中の一つ又はそれより多くの有害な予後マーカーに関連する乳癌を有しているか、又は発生するリスクがあるかどうかについての検出を補助する方法であって：
    （１） 該対象から得られた試験サンプルからＲＮＡを逆転写して、標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供すること；
    （２） 該標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んでなるマイクロアレイにハイブリダイズし、該試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること；及び
    （３） 該試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルを予後マーカーとは関連しない対照サンプルから発生されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較すること；
    を含んでなり、
    ここで、予後マーカーとは関連しない乳癌で構成される対照サンプルにおける対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対する、該発現レベルの変化が、該対象が一つ又はそれより多くの予後マーカーに関連する乳癌を有しているか、又は発生するリスクがあることの指標であり、
    ここで、当該一つ又はそれより多くの予後マーカーに関連する乳癌、及び、当該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が：
    （ｉ） 該乳癌がエストロゲンレセプター発現に関連する乳癌であり、及び該ｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−１０２（ｍｉＲ−２９ｂ）、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１２及びそれらの組み合わせから選択され；
    （ｉｉ） 該乳癌がプロゲステロンレセプター発現に関連する乳癌であり、及び該ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ及びそれらの組み合わせから成る群より選択され；
    （ｉｉｉ） 該乳癌が陽性リンパ結節転移に関連する乳癌であり、及び該ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−９−３及びそれらの組み合わせから成る群より選択され；
    （ｉｖ） 該乳癌が高増殖指数に関連する乳癌であり、及び該ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０２、ｍｉＲ−１４５及びそれらの組み合わせから成る群より選択され；
    （ｖ） 該乳癌が検出可能ｐ５３発現に関連する乳癌であり、及び該ｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−１６ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ及びそれら組み合わせから成る群より選択され；
    （ｖｉ） 該乳癌が高血管浸潤に関連する乳癌であり、及び該ｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−９−３、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−１２３、ｍｉＲ−２０５及びそれらの組み合わせから成る群より選択され；及び
    （ｖｉｉ） 該乳癌が進行した腫瘍段階に関連する乳癌であり、該ｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲ−９−２、ｍｉＲ−１５−ａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０ａ−ｓ、ｍｉＲ−１３３ａ−１、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１５３−２、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１３及びそれらの組み合わせから成る群より選択される；
    から成る群より選択される、前記方法。
  16. 抗乳癌剤を同定する方法であって、細胞に試験剤を提供すること及び乳癌細胞中の減少した発現レベルに関連する少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含んでなり、適した対照細胞と比較して、該細胞中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加が、該試験剤が抗乳癌剤であることを示す、
    ここで、当該ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−２０４、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｄ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ１）、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１４３及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、
    前記方法。
  17. 抗乳癌剤を同定する方法であって、細胞に試験剤を提供すること及び乳癌細胞中の増加した発現レベルに関連する少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含んでなり、適した対照細胞と比較して、該細胞中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの減少が、該試験剤が抗乳癌剤であることを示す、ここで、当該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５５である、前記方法。
  18. 該ｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−００９−１（ｍｉＲ１３１−ｌ）、ｍｉＲ−３４（ｍｉＲ−１７０）、ｍｉＲ−２１３、ｌｅｔ−７ｉ（ｌｅｔ−７ｄ−ｖ２）、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１３及びそれらの組み合わせから成る群より選択される追加のｍｉＲ遺伝子産物をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
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