CN113481296A - 一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒 - Google Patents
一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113481296A CN113481296A CN202110519099.6A CN202110519099A CN113481296A CN 113481296 A CN113481296 A CN 113481296A CN 202110519099 A CN202110519099 A CN 202110519099A CN 113481296 A CN113481296 A CN 113481296A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- breast cancer
- geneid
- diagnostic kit
- cancer risk
- genes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 36
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 36
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 101001075432 Homo sapiens DNA-binding protein RFX5 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102100020986 DNA-binding protein RFX5 Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 12
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 4
- 101100194594 Homo sapiens RFX5 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150074379 RFX5 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150030763 Vegfa gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 abstract description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及医学和生物技术领域，尤其为一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，包括一个标准品，一个长链非编码RNA，两个特异基因及内参基因的引物，针对的检测基因及内参基因分别为：LINC00504(GeneID:201853)，RFX5(GeneID:5993)，VEGFA(GeneID:7422)和β‑actin(GeneID:60)；目前对乳腺癌进行发病风险评估多用SNP位点等方法进行分析，存在实用性差且缺乏有效的敏感性和特异性，很少能用于实际的检测和应用，本发明所用检测的基因组合包括了长链非编码RNA一个，乳腺癌相关特异表达基因2个，同时使用标准品及内参基因对检测结果进行有效的校正，通过组合检测分析，能够有效的预测乳腺癌的发病风险，当所检测的3个基因的ct值均小于标准品的ct值时，预警乳腺癌患病为高风险。
Description
技术领域
本发明涉及医学和生物技术领域，具体为早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒。
背景技术
乳腺癌在全世界范围内都是女性最常见的恶心肿瘤之一，而且发病率常年位于女性肿瘤首位，其发病率已占全身各种恶性肿瘤的7％以上，基于乳腺癌具有较强的转移能力，一般患者的预后效果并不理想。随着环境和人口老龄化的加剧，乳腺癌的发病率有明显上升的趋势。早期发现并及时治疗是乳腺癌的防治关键。
长链非编码RNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码蛋白的小分子RNA，目前很多研究证明了长链非编码RNA在多种肿瘤中起着关键的作用。本发明试剂盒中提供的长链非编码RNA LINC00504基因引物能特异的检测样品中 LINC00504的丰度，根据目前的研究数据显示，LINC00504的表达丰度跟乳腺癌的风险成正相关性，同时配合转录因子RFX5及特异表达基因VEGFA这两个基因的联合检测，能有效的增加对乳腺癌风险评估的准确率。
与乳腺癌发病直接或间接相关的基因有很多个，因此寻找出一些关联基因的组合检测能大大提高对乳腺癌风险评估的时效性跟准确性，因此建立简单、可靠、快速的关联基因检测的高效检测方法能及时筛查出乳腺癌易感高危人群，从而根据结果尽快采取预防措施，这对提高乳腺癌的早期诊断和治疗有着重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，解决了目前常见的对乳腺癌进行发病风险评估多用SNP位点等方法进行分析，存在实用性差且缺乏有效的敏感性和特异性，很少能用于实际的检测和应用的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，包括一个标准品，一个长链非编码RNA，两个特异基因及内参基因的引物，针对的检测基因及内参基因分别为：LINC00504(GeneID:201853)，RFX5 (GeneID:5993)，VEGFA(GeneID:7422)和β-actin(GeneID:60)，引物能特异的扩增出对应的基因。
优选的，所述LINC00504基因部分序列：
ggggtgtggaaagaggccatgaagaagaaagaggatttgaaagaagagagaggaatgaagaaa gacttctaataaatatgcttgctacgatcaattctgtgtcctcccttttctataaaatatgatccttggcccctata atttcttgactctaaatgtttgaaagagtgaatcagcattatcatggaacaatatgtgctgatgggtatagtctc cccctttgattggtactttgcaagtttcacaaataactaaccacctgagaacttgtctcccttgaactgaattcc attttaattttgttcaccttcttgattctcttctttttgtgtcaaaattgtacttttgcaaagatgatttcaaaagtgtttt ctttctgatttagtgcggccagttttcaacattcggtctgaaattgaggagttgctgtatgaaaagtgaatttatt tgaatggtaaagtttcctgtgaacagaaataaagtattgtttcactctgaaa(SEQ ID NO：9)。
优选的，所述RFX5基因部分序列：
gccaggaccttggggctgggctggagtgaaggtggctacgagttttccagatttaggagacttc agaaaggtggggcagatagaatggagatggcaaagatctctttgggcatatatgggcctggcgaagta atggaataatttctaattttcggagaaggcaagtgccctcatgccgggatggcagaagatgagcctga tgctaagagccccaagactgggggaagggcccccccaggtggtgctgaggctggggaacctaccaccc ttcttcagaggctccgaggtaccatttccaaggccgtgcagaacaaagtagaggggatcctgcaagat gtacagaaattttctgacaatgacaagctgtatctctaccttcagctcccctcaggacccaccactgg agacaaaagctcagagccaagtacactgagcaatgaggagtacatgtatgcctataggtggatccgca accacctggaagagcacactgacacctg(SEQ ID NO：10)。
优选的，所述VEGFA基因部分序列：
gattccctccacatgctgcacgcgcatctcgcccccaggggcactgcctggaagattcaggagc ctgggcggccttcgcttactctcacctgcttctgagttgcccaggagaccactggcagatgtcccggc gaagagaagagacacattgttggaagaagcagcccatgacagctccccttcctgggactcgccctcat cctcttcctgctccccttcctggggtgcagcctaaaaggacctatgtcctcacaccattgaaaccact agttctgtccccccaggagacctggttgtgtgtgtgtgagtggttgaccttcctccatcccctggtcc ttcccttcccttcccgaggcacagagagacagggcaggatccacgtgcccattgtggaggcagagaaa agagaaagtgttttatatacggtacttatttaatatccctttttaattagaaattaaaacagttaatt taattaaagagtagggttttttttcagt(SEQ ID NO：11)。
优选的，所述β-actin基因部分序列：
gttgctatccaggctgtgctatccctgtacgcctctggccgtaccactggcatcgtgatggact ccggtgacggggtcacccacactgtgcccatctacgaggggtatgccctcccccatgccatcctgcgt ctggacctggctggccgggacctgactgactacctcatgaagatcctcaccgagcgcggctacagctt caccaccacggccgagcgggaaatcgtgcgtgacattaaggagaagctgtgctacgtcgccctggact tcgagcaagagatggccacggctgcttccagctcctccctggagaagagctacgagctgcctgacggc caggtcatcaccattggcaatgagcggttccgctgccctgaggcactcttccagccttccttcctggg catggagtcctgtggcatccacgaaactaccttcaactccatcatgaagtgtgacgtggacatccgca aagacctgtacgccaacacagtgctgtc(SEQ ID NO：12)。
优选的，所述的试剂盒的每一人份包括：
1.逆转录翻译体系：5X逆转录缓冲液4ul，10nm的dNTP 1ul，oligo引物1ul，随机引物1ul，逆转录酶1ul，RNA酶抑制剂0.5ul，无酶水12ul；
2.PCR反应体系：SYBR GREEN 2XPCR混合反应缓冲液10ul，每条引物各1ul，ddH2O7ul；
3.标准品：4ul。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
目前常见的对乳腺癌进行发病风险评估多用SNP位点等方法进行分析，存在实用性差且缺乏有效的敏感性和特异性，很少能用于实际的检测和应用，本发明所用检测的基因组合包括了长链非编码RNA一个，乳腺癌相关特异表达基因2 个，同时使用标准品及内参基因对检测结果进行有效的校正，通过组合检测分析，能够有效的预测乳腺癌的发病风险，当所检测的3个基因的ct值均小于标准品的ct值时，预警乳腺癌患病为高风险。
附图说明
图1为本发明专利的分析对比示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
通过对1085例乳腺癌患者及291例正常对照的进行长链非编码RNA的表达分析，结果显示LINC00504显著提高乳腺癌的发病风险，数据显示具有显著的差异性。
早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，包括一个标准品，一个长链非编码RNA，两个特异基因及内参基因的引物，针对的检测基因及内参基因分别为： LINC00504(GeneID:201853)，RFX5(GeneID:5993)，VEGFA(GeneID:7422) 和β-actin(GeneID:60)，引物能特异的扩增出对应的基因。
本实施例中，LINC00504基因部分序列：
ggggtgtggaaagaggccatgaagaagaaagaggatttgaaagaagagagaggaatgaagaaa gacttctaataaatatgcttgctacgatcaattctgtgtcctcccttttctataaaatatgatccttggcccctata atttcttgactctaaatgtttgaaagagtgaatcagcattatcatggaacaatatgtgctgatgggtatagtctc cccctttgattggtactttgcaagtttcacaaataactaaccacctgagaacttgtctcccttgaactgaattcc attttaattttgttcaccttcttgattctcttctttttgtgtcaaaattgtacttttgcaaagatgatttcaaaagtgtttt ctttctgatttagtgcggccagttttcaacattcggtctgaaattgaggagttgctgtatgaaaagtgaatttatt tgaatggtaaagtttcctgtgaacagaaataaagtattgtttcactctgaaa(SEQ ID NO：9)。
本实施例中，RFX5基因部分序列：
gccaggaccttggggctgggctggagtgaaggtggctacgagttttccagatttaggagacttc agaaaggtggggcagatagaatggagatggcaaagatctctttgggcatatatgggcctggcgaagta atggaataatttctaattttcggagaaggcaagtgccctcatgccgggatggcagaagatgagcctga tgctaagagccccaagactgggggaagggcccccccaggtggtgctgaggctggggaacctaccaccc ttcttcagaggctccgaggtaccatttccaaggccgtgcagaacaaagtagaggggatcctgcaagat gtacagaaattttctgacaatgacaagctgtatctctaccttcagctcccctcaggacccaccactgg agacaaaagctcagagccaagtacactgagcaatgaggagtacatgtatgcctataggtggatccgca accacctggaagagcacactgacacctg(SEQ ID NO：10)。
本实施例中，VEGFA基因部分序列：
gattccctccacatgctgcacgcgcatctcgcccccaggggcactgcctggaagattcaggagc ctgggcggccttcgcttactctcacctgcttctgagttgcccaggagaccactggcagatgtcccggc gaagagaagagacacattgttggaagaagcagcccatgacagctccccttcctgggactcgccctcat cctcttcctgctccccttcctggggtgcagcctaaaaggacctatgtcctcacaccattgaaaccact agttctgtccccccaggagacctggttgtgtgtgtgtgagtggttgaccttcctccatcccctggtcc ttcccttcccttcccgaggcacagagagacagggcaggatccacgtgcccattgtggaggcagagaaa agagaaagtgttttatatacggtacttatttaatatccctttttaattagaaattaaaacagttaatt taattaaagagtagggttttttttcagt(SEQ ID NO：11)。
本实施例中，β-actin基因部分序列：
gttgctatccaggctgtgctatccctgtacgcctctggccgtaccactggcatcgtgatggact ccggtgacggggtcacccacactgtgcccatctacgaggggtatgccctcccccatgccatcctgcgt ctggacctggctggccgggacctgactgactacctcatgaagatcctcaccgagcgcggctacagctt caccaccacggccgagcgggaaatcgtgcgtgacattaaggagaagctgtgctacgtcgccctggact tcgagcaagagatggccacggctgcttccagctcctccctggagaagagctacgagctgcctgacggc caggtcatcaccattggcaatgagcggttccgctgccctgaggcactcttccagccttccttcctggg catggagtcctgtggcatccacgaaactaccttcaactccatcatgaagtgtgacgtggacatccgca aagacctgtacgccaacacagtgctgtc(SEQ ID NO：12)。
工作原理：早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒在血液样品中使用时，先抽取患者静脉血液1ml，使用氯仿法抽提总RNA，然后对RNA进行定量分析，使用 50nm总RNA作为起始量进行下一步操作，其次在使用试剂盒提供的逆转录试剂进行逆转录反应，体系为20ul，反应条件如下：42℃/60分钟，75℃/5分钟，然后再使用试剂盒提供的PCR试剂进行PCR反应，取上述逆转录反应产物1ul 作为模板，分别单独扩增LINC00504，RXF5,VEGFA及β-actin，所使用的引物分别如下：(1)LINC00504正向引物：5`-GCTACGATCAATTCTGTGTCCTC-3`(SEQ IDNO：1)，反向引物：5`-CCCATCAGCACATATTGTTCC-3`(SEQ ID NO：2)；(2) RFX5正向引物：5`-GATGAGCCTGATGCTAAGAGC-3`(SEQ ID NO：3)，反向引物： 5`-CCCTCTACTTTGTTCTGCACG-3`(SEQ ID NO：4)；(3)VEGFA正向引物：5`- AGGAGACCACTGGCAGATGT-3`(SEQ ID NO：5)，反向引物：5`- CAATGGTGTGAGGACATAGG-3`(SEQ ID NO：6)；(4)β-actin正向引物：5`-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3`(SEQ ID NO：7)，反向引物：5`- AACCGCTCATTGCCAATGGT-3`(SEQID NO：8)，同时进行标准品的PCR反应，取试剂盒内提供的标准品1ul作为模板，分别单独扩增LINC00504，RXF5,VEGFA 及β-actin，所使用的引物分别如下：(5)1)LINC00504正向引物：5`-GCTACGATCAATTCTGTGTCCTC-3`(SEQ ID NO：1)，反向引物： 5`-CCCATCAGCACATATTGTTCC-3`(SEQ ID NO：2)；(6)RFX5正向引物： 5`-GATGAGCCTGATGCTAAGAGC-3`(SEQ ID NO：3)，反向引物： 5`-CCCTCTACTTTGTTCTGCACG-3`(SEQ ID NO：4)；(7)VEGFA正向引物：5`- AGGAGACCACTGGCAGATGT-3`(SEQ ID NO：5)，反向引物：5`- CAATGGTGTGAGGACATAGG-3`(SEQ ID NO：6)；(8)β-actin正向引物：5`-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3`(SEQ ID NO：7)，反向引物：5`- AACCGCTCATTGCCAATGGT-3`(SEQID NO：8)，PCR扩增的反应体系为：SYBR GREEN 2XPCR混合反应缓冲液10ul，每条引物各1ul，ddH2O 7ul，逆转录产物1ul或标准品1ul，而PCR反应条件为：94℃/5分钟变性酶激活，94℃/30秒变性，60℃ /30秒退火，72℃/30秒延伸，共40个循环，使用仪器为实时定量PCR仪器，最后进行结果分析，PCR下机数据采用直接读取ct值的方法，首先通过内参基因进行校正，校正后的数据跟标准品比较，当LINC00504，RFX5及VEGFA基因的ct值同时小于标准品ct值时，预警乳腺癌为高风险；
当早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒在活检组织中使用时，先进行活检取出的组织样品使用氯仿法抽提总RNA，对RNA进行定量分析，使用100nm总RNA作为起始量进行下一步操作，让母后使用试剂盒提供的逆转录试剂进行逆转录反应，体系为20ul，反应条件如下：42℃/60分钟，75℃/5分钟，然后再使用试剂盒提供的PCR试剂进行PCR反应，取上述逆转录反应产物1ul作为模板，分别单独扩增LINC00504，RXF5,VEGFA及β-actin，所使用的引物分别如下：(1) LINC00504正向引物：5`-GCTACGATCAATTCTGTGTCCTC-3`(SEQ ID NO：1)，反向引物：5`-CCCATCAGCACATATTGTTCC-3`(SEQ ID NO：2)；(2)RFX5正向引物：5`-GATGAGCCTGATGCTAAGAGC-3`(SEQ ID NO：3)，反向引物： 5`-CCCTCTACTTTGTTCTGCACG-3`(SEQ ID NO：4)；(3)VEGFA正向引物：5`- AGGAGACCACTGGCAGATGT-3`(SEQ ID NO：5)，反向引物：5`- CAATGGTGTGAGGACATAGG-3`(SEQ ID NO：6)；(4)β-actin正向引物：5`-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3`(SEQ ID NO：7)，反向引物：5`- AACCGCTCATTGCCAATGGT-3`(SEQID NO：8)，同时进行标准品的PCR反应，取试剂盒内提供的标准品1ul作为模板，分别单独扩增LINC00504，RXF5,VEGFA 及β-actin，所使用的引物分别如下：(5)1)LINC00504正向引物：5`-GCTACGATCAATTCTGTGTCCTC-3`(SEQ ID NO：1)，反向引物： 5`-CCCATCAGCACATATTGTTCC-3`(SEQ ID NO：2)；(6)RFX5正向引物： 5`-GATGAGCCTGATGCTAAGAGC-3`(SEQ ID NO：3)，反向引物： 5`-CCCTCTACTTTGTTCTGCACG-3`(SEQ ID NO：4)；(7)VEGFA正向引物：5`- AGGAGACCACTGGCAGATGT-3`(SEQ ID NO：5)，反向引物：5`- CAATGGTGTGAGGACATAGG-3`(SEQ ID NO：6)；(8)β-actin正向引物：5`-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3`(SEQ ID NO：7)，反向引物：5`- AACCGCTCATTGCCAATGGT-3`(SEQID NO：8)，PCR扩增的反应体系为：SYBR GREEN 2XPCR混合反应缓冲液10ul，每条引物各1ul，ddH2O 7ul，逆转录产物1ul或标准品1ul，而PCR反应条件为：94℃/5分钟变性酶激活，94℃/30秒变性，60℃ /30秒退火，72℃/30秒延伸，共40个循环，使用仪器为实时定量PCR仪器，最后进行结果分析，PCR下机数据采用直接读取ct值的方法，首先通过内参基因进行校正，校正后的数据跟标准品比较，当LINC00504，RFX5及VEGFA基因的ct值同时小于标准品ct值时，预警乳腺癌为高风险。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 广东省人民医院
<120> 一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒
<141> 2021-05-12
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggggtgtgga aagaggccat gaagaagaaa gaggatttga aagaagagag aggaatgaag 60
aaagacttct aataaatatg cttgctacga tcaattctgt gtcctccctt ttctataaaa 120
tatgatcctt ggcccctata atttcttgac tctaaatgtt tgaaagagtg aatcagcatt 180
atcatggaac aatatgtgct gatgggtata gtctccccct ttgattggta ctttgcaagt 240
ttcacaaata actaaccacc tgagaacttg tctcccttga actgaattcc attttaattt 300
tgttcacctt cttgattctc ttctttttgt gtcaaaattg tacttttgca aagatgattt 360
caaaagtgtt ttctttctga tttagtgcgg ccagttttca acattcggtc tgaaattgag 420
gagttgctgt atgaaaagtg aatttatttg aatggtaaag tttcctgtga acagaaataa 480
agtattgttt cactctgaaa 500
<210> 2
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccaggacct tggggctggg ctggagtgaa ggtggctacg agttttccag atttaggaga 60
cttcagaaag gtggggcaga tagaatggag atggcaaaga tctctttggg catatatggg 120
cctggcgaag taatggaata atttctaatt ttcggagaag gcaagtgccc tcatgccggg 180
atggcagaag atgagcctga tgctaagagc cccaagactg ggggaagggc ccccccaggt 240
ggtgctgagg ctggggaacc taccaccctt cttcagaggc tccgaggtac catttccaag 300
gccgtgcaga acaaagtaga ggggatcctg caagatgtac agaaattttc tgacaatgac 360
aagctgtatc tctaccttca gctcccctca ggacccacca ctggagacaa aagctcagag 420
ccaagtacac tgagcaatga ggagtacatg tatgcctata ggtggatccg caaccacctg 480
gaagagcaca ctgacacctg 500
<210> 3
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gattccctcc acatgctgca cgcgcatctc gcccccaggg gcactgcctg gaagattcag 60
gagcctgggc ggccttcgct tactctcacc tgcttctgag ttgcccagga gaccactggc 120
agatgtcccg gcgaagagaa gagacacatt gttggaagaa gcagcccatg acagctcccc 180
ttcctgggac tcgccctcat cctcttcctg ctccccttcc tggggtgcag cctaaaagga 240
cctatgtcct cacaccattg aaaccactag ttctgtcccc ccaggagacc tggttgtgtg 300
tgtgtgagtg gttgaccttc ctccatcccc tggtccttcc cttcccttcc cgaggcacag 360
agagacaggg caggatccac gtgcccattg tggaggcaga gaaaagagaa agtgttttat 420
atacggtact tatttaatat ccctttttaa ttagaaatta aaacagttaa tttaattaaa 480
gagtagggtt ttttttcagt 500
<210> 4
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gttgctatcc aggctgtgct atccctgtac gcctctggcc gtaccactgg catcgtgatg 60
gactccggtg acggggtcac ccacactgtg cccatctacg aggggtatgc cctcccccat 120
gccatcctgc gtctggacct ggctggccgg gacctgactg actacctcat gaagatcctc 180
accgagcgcg gctacagctt caccaccacg gccgagcggg aaatcgtgcg tgacattaag 240
gagaagctgt gctacgtcgc cctggacttc gagcaagaga tggccacggc tgcttccagc 300
tcctccctgg agaagagcta cgagctgcct gacggccagg tcatcaccat tggcaatgag 360
cggttccgct gccctgaggc actcttccag ccttccttcc tgggcatgga gtcctgtggc 420
atccacgaaa ctaccttcaa ctccatcatg aagtgtgacg tggacatccg caaagacctg 480
tacgccaaca cagtgctgtc 500
Claims (6)
1.一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，其特征在于：包括一个标准品，一个长链非编码RNA，两个特异基因及内参基因的引物，针对的检测基因及内参基因分别为：LINC00504(GeneID：201853)，RFX5(GeneID：5993)，VEGFA(GeneID：7422)和β-actin(GeneID：60)，引物能特异的扩增出对应的基因。
2.根据权利要求1所述的一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，其特征在于：所述LINC00504基因部分序列：
3.根据权利要求1所述的一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，其特征在于：所述RFX5基因部分序列：
4.根据权利要求1所述的一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，其特征在于：所述VEGFA基因部分序列：
5.根据权利要求1所述的一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，其特征在于：所述β-actin基因部分序列：
6.根据权利要求1所述的一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒的每一人份包括：
1.逆转录翻译体系：5X逆转录缓冲液4ul，10nm的dNTP 1ul，oligo引物1ul，随机引物1ul，逆转录酶1ul，RNA酶抑制剂0.5ul，无酶水12ul；
2.PCR反应体系：SYBR GREEN 2XPCR混合反应缓冲液10ul，每条引物各1ul，ddH20 7ul；
3.标准品：4ul。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110519099.6A CN113481296A (zh) | 2021-05-12 | 2021-05-12 | 一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110519099.6A CN113481296A (zh) | 2021-05-12 | 2021-05-12 | 一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113481296A true CN113481296A (zh) | 2021-10-08 |
Family
ID=77933518
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110519099.6A Pending CN113481296A (zh) | 2021-05-12 | 2021-05-12 | 一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113481296A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114292919A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-04-08 | 广东省人民医院 | 一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050095607A1 (en) * | 2003-03-07 | 2005-05-05 | Arcturus Bioscience, Inc. University Of Louisville | Breast cancer signatures |
| CN101341259A (zh) * | 2005-08-01 | 2009-01-07 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物 |
| CN101921858A (zh) * | 2010-08-23 | 2010-12-22 | 广州益善生物技术有限公司 | 乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片 |
| CN103695548A (zh) * | 2013-12-12 | 2014-04-02 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种检测乳腺癌的存在和/或严重性的方法 |
| CN104152557A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-11-19 | 浙江省肿瘤医院 | 基因多态性变异位点早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒 |
| US20160160295A1 (en) * | 2014-12-08 | 2016-06-09 | The Regents Of The University Of Michigan | Non-coding rnas and uses thereof |
| WO2018104346A1 (en) * | 2016-12-05 | 2018-06-14 | Nuritas Limited | Compositions comprising peptide wkdeagkplvk |
| CN110923321A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-03-27 | 广东省人民医院(广东省医学科学院) | 一种环状rna检测试剂盒预测三阴性乳腺癌新辅助化疗反应性 |
| JP2020089313A (ja) * | 2018-12-06 | 2020-06-11 | 国立大学法人 琉球大学 | ヒト組織特異的幹／前駆細胞の人工作製方法 |
-
2021
- 2021-05-12 CN CN202110519099.6A patent/CN113481296A/zh active Pending
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050095607A1 (en) * | 2003-03-07 | 2005-05-05 | Arcturus Bioscience, Inc. University Of Louisville | Breast cancer signatures |
| CN101341259A (zh) * | 2005-08-01 | 2009-01-07 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物 |
| CN101921858A (zh) * | 2010-08-23 | 2010-12-22 | 广州益善生物技术有限公司 | 乳腺癌预后相关基因mRNA表达水平检测液相芯片 |
| CN103695548A (zh) * | 2013-12-12 | 2014-04-02 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种检测乳腺癌的存在和/或严重性的方法 |
| CN104152557A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-11-19 | 浙江省肿瘤医院 | 基因多态性变异位点早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒 |
| US20160160295A1 (en) * | 2014-12-08 | 2016-06-09 | The Regents Of The University Of Michigan | Non-coding rnas and uses thereof |
| WO2018104346A1 (en) * | 2016-12-05 | 2018-06-14 | Nuritas Limited | Compositions comprising peptide wkdeagkplvk |
| CN110381976A (zh) * | 2016-12-05 | 2019-10-25 | 努里塔斯有限公司 | 包括肽wkdeagkplvk的组合物 |
| JP2020089313A (ja) * | 2018-12-06 | 2020-06-11 | 国立大学法人 琉球大学 | ヒト組織特異的幹／前駆細胞の人工作製方法 |
| CN110923321A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-03-27 | 广东省人民医院(广东省医学科学院) | 一种环状rna检测试剂盒预测三阴性乳腺癌新辅助化疗反应性 |
Non-Patent Citations (7)
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114292919A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-04-08 | 广东省人民医院 | 一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108251522B (zh) | 人类mthfr和mtrr基因检测试剂盒及其用途 | |
| JP4308309B2 (ja) | グルタチオンＳトランスフェラーゼＰｉ発現に基づき化学療法を決定する方法 | |
| CN109112216B (zh) | 三重qPCR检测DNA甲基化的试剂盒和方法 | |
| CN111020031A (zh) | 序列特异性阻断剂结合特定pcr程序检测肿瘤基因突变的方法 | |
| WO2016165591A1 (zh) | 基于焦磷酸测序技术的mgmt基因启动子甲基化检测 | |
| CN110511984B (zh) | Egfr基因19号外显子缺失突变的快速荧光检测方法及应用 | |
| CN107513577A (zh) | 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒 | |
| CN113481296A (zh) | 一种早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒 | |
| EP4144859A1 (en) | Tumor detection reagent and kit | |
| CN113549694A (zh) | 一种新型宫颈癌甲基化基因检测方法 | |
| CN112609003A (zh) | 一种鉴别甲状腺结节良恶性的组合物、试剂盒及其用途 | |
| CN107326092B (zh) | 大肠癌相关的miRNA作为生物标志物的应用及大肠癌检测试剂盒 | |
| CN114250276B (zh) | 基于指数扩增反应和Argonaute核酸酶的microRNA检测体系及方法 | |
| CN114292919A (zh) | 一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒 | |
| CN113308543B (zh) | hsa_circ_0000284在制备神经母细胞瘤预后制剂中的应用 | |
| CN113652490A (zh) | 一种用于膀胱癌早期筛查和/或预后监测的引物探针组合及试剂盒 | |
| CN113462685A (zh) | 阻碍真菌保守区域逆转录的探针组合物及其应用 | |
| CN113122636A (zh) | 检测dna甲基化的试剂及用途 | |
| CN113215228A (zh) | 脆性x综合征fmr1基因检测引物、试剂盒及其应用 | |
| JP7297902B2 (ja) | 分析方法及びキット | |
| WO2017135850A1 (ru) | Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, и набор для его осуществления | |
| CN112226528B (zh) | 一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法 | |
| CN115948561B (zh) | 一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用 | |
| CN115261351B (zh) | 一种逆转录-聚合双功能酶及其制备方法、应用 | |
| WO2023104136A1 (zh) | 甲状腺癌良恶性结节诊断的甲基化标志物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |