CN114292919A - 一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其为一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒，包括一个标准品，一个长链非编码RNA，两个特异基因及内参基因的引物，针对的检测基因及内参基因分别为：lncRNA KB‑1562D12.1(Ensembl Gene ID：ENSG00000254024)，和GAPDH(GeneID:ENSG00000111640)，引物能特异的扩增出对应的基因；本发通过发现一种与乳腺癌发展发生相关的lncRNA，即SE‑lncRNA KB‑1562D12.1，通过荧光定量PCR检测该SE‑lncRNA KB‑1562D12.1的表达发现其在Luminal乳腺癌细胞中的表达量明显高于乳腺上皮细胞及其他亚型细胞，且该针对试剂盒对Luminal乳腺癌的研究具有重大的理论价值，从而能够提早发现患者发病机制，对于治疗乳腺癌疾病具有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒。
背景技术
乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，在全球的发病率和死亡率分别位居第1位和第2位。我国女性乳腺癌发病人数占全球的11.19％，仅次于美国，且近20年来发病率与死亡率增长迅速。在我国，Luminal型乳腺癌在所有分子亚型乳腺癌中占比最高，虽然已有手术、内分泌治疗、化疗手段治疗该类乳腺癌，但由于其发病机制仍不清楚，仍有大量患者出现耐药、远期复发转移等问题，从而造成患者预后差、医疗负担高。因此，急需研究Luminal型乳腺癌发病过程中重要的调控因子和网络，为进一步研发新型生物标志物及靶向药物提供科学基础，对病人早发现、早治疗、预后以及减轻社会医疗负担有十分重要的意义。
长链非编码RNA(Longnon-codingRNA，lncRNA)是一类本身不具备编码能力的且转录本长度超过200nt的RNA分子。lncRNA可广泛参与基因组调节，是细胞增殖、分化和凋亡以及细胞粘附和迁移等生物学行为的重要调控因子。超级增强子(Superenhancer，SEs)是近年来发现的另一重要调控分子。其是由多个增强子组成的一个大簇，可富集高密度的转录因子、辅因子和增强子表观修饰，对基因表达有更强的促进作用，能够驱动控制细胞身份基因的表达，可以用来解释细胞类型特异的表达模式。大部分超级增强子在细胞内处于抑制状态，一般只有少量决定细胞身份的超级增强子被打开，一旦细胞内超级增强子打开错误，或靶向的基因错误，就导致肿瘤的发生。近来发现，超级增强子可转录成lncRNA发挥功能，称为超级增强子lncRNA(SE-lncRNA)。
目前针对SE-lncRNA在乳腺癌疾病领域中的研究仍处于起步阶段，因此，筛选能够有效用于预防和治疗肿瘤的SE-lncRNA具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒，解决了目前Luminal型乳腺癌在所有分子亚型乳腺癌中占比最高，虽然已有手术、内分泌治疗、化疗手段治疗该类乳腺癌，但其发病机制仍不清楚的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒，包括一个标准品，一个长链非编码RNA，两个特异基因及内参基因的引物，针对的检测基因及内参基因分别为：lncRNAKB-1562D12.1(EnsemblGeneID：ENSG00000254024)，和GAPDH(GeneID:ENSG00000111640)，引物能特异的扩增出对应的基因。
优选的，所述lncRNAKB-1562D12.1基因部分序列：
GAGGAGAGATGCAAGATTGAAATATCATGGAATGGACTATGGTTTATCCTCTCTTCTGGTCGTAAAACACCATCAGGTTGTAATTGTTCAGATCAGAAATTCCCAAGCTTTTAATAAAGCCTTCAGGGAGCCTCATCCAGGGGCAACTGCCCTGTCATTGGGAATAAGTAGAGTGTGTGGGAAATATGTTGTCCTTGGTAAAACCTCCCCTTAGGAAAGAAGGCAAGAGAATTGAGTAAGAGAATGATGGGCCAAAAGGAGAAAATAGAGAAAGAGGCTGCATGCTACAGAGAACAAGAGCAAAATTCAAAAGCCTGGCACAGTTGGGCTTGAAACCATCTGTGTAAAGGGGACTAATAATGCTGACCT。
优选的，所述GAPDH基因部分序列：
GGAAATGAATGGGCAGCCGTTAGGAAAGCCTGCCGGTGACTAACCCTGCGCTCCTGCCTCGATGGGTGGAGTCGCGTGTGGCGGGGAAGTCAGGTGGAGCGAGGCTAGCTGGCCCGATTTCTCCTCCGGGTGATGCTTTTCCTAGATTATTCTCTGGTAAATCAAAGAAGTGGGTTTATGGAGGTCCTCTTGTGTCCCCTCCCCGCAGAGGTGTGGTGGCTGTGGCATGGTGCCAAGCCGGGAGAAGCTGAGTCATGGGTAGTTGGAAAAGGACATTTCCACCGCAAAATGGCCCCTCTGGTGGTGGCCCCTTCCTGCAGCGCCGGCTCACCTCACGGCCCCGCCCTTCCCCTGCCAGCCTAGCGTTGACCCGACCCCAAAGGCCAGGCTGTAAATGTCACCGGGAGGATTGGGTGTCTGGGCGCCTCGGGGAACCTGCCCTTCTCCCCATTCCGTCTTCCGGAAACCAGATCTCCCACCGCACCCTGGTCTGAGGTTAAATATAGCTGCTGACCTTTCTGTAGCTGGGGGCCTGGGCTGGGGCTCTCTCCCATCCCTTCTCCCCACACACATGCA。
优选的，所述的试剂盒的每一人份包括：
1.逆转录翻译体系：5X逆转录缓冲液4ul，10nm的dNTP1ul，oligo引物1ul，随机引物1ul，逆转录酶1ul，RNA酶抑制剂0.5ul，无酶水12ul；
2.PCR反应体系：SYBRGREEN2XPCR混合反应缓冲液10ul，每条引物各1ul，ddH2O7ul；
3.标准品：4ul。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发通过发现一种与乳腺癌发展发生相关的lncRNA，即SE-lncRNAKB-1562D12.1，通过荧光定量PCR检测该SE-lncRNAKB-1562D12.1的表达发现其在Luminal乳腺癌细胞中的表达量明显高于乳腺上皮细胞及其他亚型细胞，且该针对试剂盒对Luminal乳腺癌的研究具有重大的理论价值，从而能够提早发现患者发病机制，对于治疗乳腺癌疾病具有很高的应用价值。
附图说明
图1为本发明分析对比示意图一；
图2为本发明分析对比示意图二；
图3为本发明分析对比示意图三。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒，包括一个标准品，一个长链非编码RNA，两个特异基因及内参基因的引物，针对的检测基因及内参基因分别为：lncRNAKB-1562D12.1(EnsemblGeneID：ENSG00000254024)，和GAPDH(GeneID:ENSG00000111640)，引物能特异的扩增出对应的基因。
本实施例中，lncRNAKB-1562D12.1基因部分序列：
GAGGAGAGATGCAAGATTGAAATATCATGGAATGGACTATGGTTTATCCTCTCTTCTGGTCGTAAAACACCATCAGGTTGTAATTGTTCAGATCAGAAATTCCCAAGCTTTTAATAAAGCCTTCAGGGAGCCTCATCCAGGGGCAACTGCCCTGTCATTGGGAATAAGTAGAGTGTGTGGGAAATATGTTGTCCTTGGTAAAACCTCCCCTTAGGAAAGAAGGCAAGAGAATTGAGTAAGAGAATGATGGGCCAAAAGGAGAAAATAGAGAAAGAGGCTGCATGCTACAGAGAACAAGAGCAAAATTCAAAAGCCTGGCACAGTTGGGCTTGAAACCATCTGTGTAAAGGGGACTAATAATGCTGACCT。
本实施例中，GAPDH基因部分序列：
GGAAATGAATGGGCAGCCGTTAGGAAAGCCTGCCGGTGACTAACCCTGCGCTCCTGCCTCGATGGGTGGAGTCGCGTGTGGCGGGGAAGTCAGGTGGAGCGAGGCTAGCTGGCCCGATTTCTCCTCCGGGTGATGCTTTTCCTAGATTATTCTCTGGTAAATCAAAGAAGTGGGTTTATGGAGGTCCTCTTGTGTCCCCTCCCCGCAGAGGTGTGGTGGCTGTGGCATGGTGCCAAGCCGGGAGAAGCTGAGTCATGGGTAGTTGGAAAAGGACATTTCCACCGCAAAATGGCCCCTCTGGTGGTGGCCCCTTCCTGCAGCGCCGGCTCACCTCACGGCCCCGCCCTTCCCCTGCCAGCCTAGCGTTGACCCGACCCCAAAGGCCAGGCTGTAAATGTCACCGGGAGGATTGGGTGTCTGGGCGCCTCGGGGAACCTGCCCTTCTCCCCATTCCGTCTTCCGGAAACCAGATCTCCCACCGCACCCTGGTCTGAGGTTAAATATAGCTGCTGACCTTTCTGTAGCTGGGGGCCTGGGCTGGGGCTCTCTCCCATCCCTTCTCCCCACACACATGCA。
本实施例中，试剂盒的每一人份包括：
1.逆转录翻译体系：5X逆转录缓冲液4ul，10nm的dNTP1ul，oligo引物1ul，随机引物1ul，逆转录酶1ul，RNA酶抑制剂0.5ul，无酶水12ul；
2.PCR反应体系：SYBRGREEN2XPCR混合反应缓冲液10ul，每条引物各1ul，ddH2O7ul；
3.标准品：4ul。
工作原理：当早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒在活检组织中使用时，先进行活检取出的组织样品使用氯仿法抽提总RNA，对RNA进行定量分析，使用2ug总RNA作为起始量进行下一步操作，让母后使用试剂盒提供的逆转录试剂进行逆转录反应，体系为20ul，反应条件如下：42℃/60分钟，75℃/5分钟，然后再使用试剂盒提供的PCR试剂进行PCR反应，取上述逆转录反应产物1ul作为模板，分别单独扩增SE-lncRNAKB-1562D12.1及GAPDH，所使用的引物分别如下：(1)SE-lncRNAKB-1562D12.1正向引物：5`-TGGACTATGGTTTATCCTCTCTTCT-3`，反向引物：5`-TCCCAATGACAGGGCAGTT-3`；(2)GAPDH正向引物：5`-GAACGGGAAGCTCACTGG-3`，反向引物：5`-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3`，同时进行标准品的PCR反应，取试剂盒内提供的标准品1ul作为模板，分别单独扩增SE-lncRNAKB-1562D12.1及GAPDH，所使用的引物分别如下：(1)SE-lncRNAKB-1562D12.1正向引物：5`-TGGACTATGGTTTATCCTCTCTTCT-3`，反向引物：5`-TCCCAATGACAGGGCAGTT-3`；(2)GAPDH正向引物：5`-GAACGGGAAGCTCACTGG-3`，反向引物：5`-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3`，PCR扩增的反应体系为：SYBRGREEN2XPCR混合反应缓冲液10ul，每条引物各1ul，ddH2O7ul，逆转录产物1ul或标准品1ul，而PCR反应条件为：95℃/5分钟变性酶激活，95℃/30秒变性，60℃/30秒退火，72℃/30秒延伸，共40个循环，使用仪器为实时定量PCR仪器，最后进行结果分析，PCR下机数据采用直接读取ct值的方法，首先通过内参基因进行校正，校正后的数据跟标准品比较，当SE-lncRNAKB-1562D12.1基因的ct值同时小于标准品ct值时，预警乳腺癌为高风险。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒，其特征在于：包括一个标准品，一个长链非编码RNA，两个特异基因及内参基因的引物，针对的检测基因及内参基因分别为：lncRNAKB-1562D12.1(EnsemblGeneID：ENSG00000254024)，和GAPDH(GeneID:ENSG00000111640)，引物能特异的扩增出对应的基因。
2.根据权利要求1所述的一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒，其特征在于：所述lncRNAKB-1562D12.1基因部分序列：
GAGGAGAGATGCAAGATTGAAATATCATGGAATGGACTATGGTTTATCCTCTCTTCTGGTCGTAAAACACCATCAGGTTGTAATTGTTCAGATCAGAAATTCCCAAGCTTTTAATAAAGCCTTCAGGGAGCCTCATCCAGGGGCAACTGCCCTGTCATTGGGAATAAGTAGAGTGTGTGGGAAATATGTTGTCCTTGGTAAAACCTCCCCTTAGGAAAGAAGGCAAGAGAATTGAGTAAGAGAATGATGGGCCAAAAGGAGAAAATAGAGAAAGAGGCTGCATGCTACAGAGAACAAGAGCAAAATTCAAAAGCCTGGCACAGTTGGGCTTGAAACCATCTGTGTAAAGGGGACTAATAATGCTGACCT。
3.根据权利要求1所述的一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒，其特征在于：所述GAPDH基因部分序列：
GGAAATGAATGGGCAGCCGTTAGGAAAGCCTGCCGGTGACTAACCCTGCGCTCCTGCCTCGATGGGTGGAGTCGCGTGTGGCGGGGAAGTCAGGTGGAGCGAGGCTAGCTGGCCCGATTTCTCCTCCGGGTGATGCTTTTCCTAGATTATTCTCTGGTAAATCAAAGAAGTGGGTTTATGGAGGTCCTCTTGTGTCCCCTCCCCGCAGAGGTGTGGTGGCTGTGGCATGGTGCCAAGCCGGGAGAAGCTGAGTCATGGGTAGTTGGAAAAGGACATTTCCACCGCAAAATGGCCCCTCTGGTGGTGGCCCCTTCCTGCAGCGCCGGCTCACCTCACGGCCCCGCCCTTCCCCTGCCAGCCTAGCGTTGACCCGACCCCAAAGGCCAGGCTGTAAATGTCACCGGGAGGATTGGGTGTCTGGGCGCCTCGGGGAACCTGCCCTTCTCCCCATTCCGTCTTCCGGAAACCAGATCTCCCACCGCACCCTGGTCTGAGGTTAAATATAGCTGCTGACCTTTCTGTAGCTGGGGGCCTGGGCTGGGGCTCTCTCCCATCCCTTCTCCCCACACACATGCA。
4.根据权利要求1所述的一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒的每一人份包括：
1.逆转录翻译体系：5X逆转录缓冲液4ul，10nm的dNTP1ul，oligo引物1ul，随机引物1ul，逆转录酶1ul，RNA酶抑制剂0.5ul，无酶水12ul；
2.PCR反应体系：SYBRGREEN2XPCR混合反应缓冲液10ul，每条引物各1ul，ddH2O7ul；
3.标准品：4ul。
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