CN107988370B - 一种circRNA基因在制备诊断慢性粒细胞性白血病试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及一种circRNA基因在制备诊断慢性粒细胞性白血病中的应用。本发明提供了检测circDOPEY2表达水平的试剂在制备诊断慢性粒细胞性白血病产品中的用途，其中试剂盒产品检测简单、准确、快速，特异性强，对于慢性粒细胞性白血病患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。

Description

一种circRNA基因在制备诊断慢性粒细胞性白血病试剂中的 应用

技术领域

本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及一种circRNA基因在制备诊断慢性粒细胞性白血病试剂中的应用。

背景技术

慢性粒细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其它造血组织中大量增殖累积，并浸润其它非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。90％以上的病例均具有CML的标记染色体-ph染色体，其是由于9号染色体长臂上C-ABL原癌基因易位至22号染色体长臂的断裂点簇集区(BCR)形成BCR-ABL融合基因。因而BCR-ABL1融合基因是经典的CML分子标志物。

酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitor，TKI)能选择性抑制BCR/ABL蛋白的酪氨酸激酶活性，可显著改善CML患者的预后。然而，随着临床上的广泛应用和时间的推移，TKI的耐药现象日益明显，复发率逐渐升高严重影响了CML的治疗效果。治疗上，羟基脲、阿糖胞苷等曾被广泛应用，但是，以上疗法均不能取得分子生物学缓解。因而寻找新的CML靶点以便可以尽早诊断，是目前所亟需的。

环状RNA(CircularRNA,circRNA)是一类广泛存在于生物体内的单链非编码RNA，最早发现于20世纪70年代的植物类病毒中，随后陆续在酵母菌线粒体内被发现。在早期的研究中，circRNA被认为形成于外显子转录本的错误剪接，作为随机产物并不具备生物学功能，因而相关报道较为少见。近年来，随着生物信息学及高通量测序技术的迅速发展，大量circRNA被发现并引起关注。越来越多的证据表明，circRNA并非偶然产生，其丰度高、结构稳定并存在时空表达特异性，很可能在调控生物体基因表达过程中发挥重要作用。

前期本申请人经过深入而广泛的研究，发现一类特殊的非编码RNA—环状RNA(circRNA)在肿瘤和正常组织中表达存在显著差异。因而申请人通过基因芯片和定量PCR技术，对大量候选circRNA基因进行了测定和分析，首次发现DOPEY2的circRNA(circDOPEY2)和慢性粒细胞性白血病患者临床诊断密切相关。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于诊断慢性粒细胞性白血病产品，可以尽早诊断，以方便患者尽早治疗，增加治愈或延长患者生命期限。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明第一个方面，提供了检测circDOPEY2表达水平的试剂在制备诊断慢性粒细胞性白血病产品中的用途。

本发明第二个方面，提供一种诊断慢性粒细胞性白血病的产品，所述产品包括试剂盒，所述试剂盒包括可以检测circDOPEY2表达水平的PCR反应试剂。

本发明第三个方面，提供一种非诊断目的的是否存在circDOPEY2基因及其定量检测方法，步骤如下：

(1)用权利要求1或2所述的引物扩增待检样品，得到扩增产物；

(2)对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在circDOPEY2；

(3)与内参基因GAPDH相比，利用2^-ΔCt方法，计算circDOPEY2的表达量。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：

本发明首次发现circDOPEY2基因表达量与慢性粒细胞性白血病临床诊断密切相关。本发明诊断慢性粒细胞性白血病的试剂盒检测简单、准确、快速，特异性强，对于慢性粒细胞性白血病患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。对于探讨白血病发生发展的生物学机制，寻找白血病患者分子分型的分子标记，对白血病患者实施有效的个体化防治具有重要意义。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是引物设计原理图。

图2是circDOPEY2基因表达量与白血病患者临床诊断的相关性：ND：初诊，Normal：正常对照。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了解决如上的技术问题，本发明第一个方面，提供了检测circDOPEY2表达水平的试剂在制备诊断慢性粒细胞性白血病产品中的用途。

进一步，所述circDOPEY2在慢性粒细胞性白血病患者中表达下调。

进一步，所述circDOPEY2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述试剂包括RT-PCR、实时定量PCR或高通量测序平台检测用试剂。

本发明第二个方面，提供一种诊断慢性粒细胞性白血病的产品，所述产品包括试剂盒，所述试剂盒包括可以检测circDOPEY2表达水平的PCR反应试剂。

进一步，所述PCR反应试剂包括扩增circDOPEY2的引物；所述引物序列如SEQIDNO.2～3所示。其它PCR反应试剂为dNTP、DEPC水和SYBR Green。PCR反应试剂中各组分的用量关系为常规的。

进一步，扩增circDOPEY2的PCR条件为：95℃5min；95℃10s，62℃1min，72℃10s，40个循环。

本发明第三个方面，提供一种非诊断目的的circDOPEY2基因及其定量检测方法，步骤如下：

(1)用SEQ ID NO.2～3所示的引物扩增待检样品，得到扩增产物；

(2)对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在circDOPEY2；

(3)与内参基因GAPDH相比，利用2^-ΔCt方法，计算circDOPEY2的表达量。

在本发明优选的实施方案中，还提供一种对慢性粒细胞性白血病患者临床诊断进行定量检测的方法，步骤如下：

定量检测该个体的circDOPEY2基因，并与正常个体进行比较，存在差异就表明该患者临床诊断为白血病的可能性高于正常个体。所述差异是指circDOPEY2基因表达量的高低：其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1DOPEY2基因来源的circRNA检测及与慢性粒细胞性白血病患者临床诊断的关联分析

1.1研究对象

选取慢性粒细胞性白血病患者49例，2015年9月～2017年8月于山东大学齐鲁医院确诊治疗，临床资料从病历获得。大部分受试者均为山东省内汉族居民。取受试人员骨髓5ml，裂解红细胞，分离有核细胞。所有受试人员均按照山东大学齐鲁医院伦理委员会要求征得同意。

1.2RNA提取

(1)在细胞中加入1ml TRIzol，混匀。样品体积不应超过TRIzol体积10％。

(2)每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，冰上静置10分钟。

(3)4℃15000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在上水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60％。

(4)把上层水相转移到新管中，用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.6ml异丙醇，冰上静置10分钟。

(5)4℃15000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清。

(6)用80％乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 80％乙醇。4℃15000×g离心5分钟，弃上清。

(7)室温放置干燥RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可。加入10μl DEPC水，用枪头吸打几次，静置10分钟使RNA溶解。

(8)测定RNA浓度和纯度。

1.3引物、PCR扩增、测序和定量

从circBase下载基因组序列：

(1)序列位置变换。circDOPEY2为环状RNA，由于已获取的序列为环序列从剪接位点(backsplice)处打开后的线性序列，因此，为复原序列成环时的位置关系，应先进行序列位置变换后再进行引物设计(设计原理如图1)；

(2)截取3’端150bp长度序列置于5’端头部，形成一个新的序列，新序列为:AGAAATGCCATTTTGGAAGAGCTGCCTCGAACTGTTAACACCATGGCCCTTCTCTGGAATGTTCTCAGAAAGGAGGAGACTCAAAAGAGACCTGTCGATCTCCTAGGGGCCACGAAGGGATCCTCTTCCGTTTACTTTAAAACCACCAAACACAACCTCCAAGAGGGAAAACATTTCTCCAGATTATCCACTCACCCTTCTAGAAGGTCTAACGACCATTAGTCATTTTTGTCTTTTGGAACAAGCCAACCAAAACAAAAAGACCATGGCTGCAGGTGATCCTGCCAACTTGAGGAATGC，如SEQ IDNO：4所示。

(3)新的序列中碱基相连处即为circ DOPEY2剪接位点处，引物设计按照常规PCR引物设计原理，跨剪接位点上下游进行设计，最终扩增产物必须包含剪接位点，用Primerpremier5.0设计引物。具体引物详细信息见表1。

表1引物序列表

PCR扩增条件：

a.反应条件：95℃5min；95℃10s，62℃1min，72℃10s，40个循环；

b.扩增反应结束后，从60℃缓慢加热到99℃，建立PCR产物的熔解曲线，分析引物特异性。

(4)PCR扩增产物送交上海铂尚生物技术公司测序，测序结果应用软件Meglign7.0和Chromas 2.33进行检验和分析，本实施例采用了正向和反向测序，经分析，发现存在circDOPEY2目的基因。

(5)circDOPEY2定量：与内参基因GAPDH相比，利用2^-ΔCt方法，计算circDOPEY2的表达量。

1.4circRNA关联分析

在GraphPad Prism应用T检验对受试人员PCR结果进行统计分析。所有P值均为双侧概率，当P<0.05时认为有显著统计学意义。白血病患者新诊断和正常人circDOPEY2表达量进行配对检验，P<0.0001。结果发现SEQ ID NO：1中的circDOPEY2表达量与白血病患者的临床诊断显著相关，白血病初诊患者circDOPEY2表达量(中位值0.0029)比正常对照(中位值0.0119)明显降低。可作为白血病患者临床辅助诊断的分子标记。详细结果见图2。

实施例2白血病患者临床诊断检测试剂盒

由于circDOPEY2与白血病患者的临床诊断相关，因此可基于这个设计circDOPEY2基因特异性引物，再以患者的cDNA为模板进行扩增检测。

制备一试剂盒(100人次)，它含有如表2所示的物质：

表2试剂盒组成

抽取受试者骨髓5ml，裂解红细胞，分离有核细胞，常规方法提取RNA。利用白血病患者诊断检测试剂盒进行PCR反应，将反应产物进行测序，将测序结果利用BLAST软件进行检验和分析，同时进行定量检测。

circDOPEY2检测结果显著降低的患者临床诊断为白血病的可能性高于正常受试者。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学齐鲁医院

<120> 一种circRNA基因在制备诊断慢性粒细胞性白血病试剂中的应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 241

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacaacctcc aagagggaaa acatttctcc agattatcca ctcacccttc tagaaggtct 60

gtcttttgga acaagccaac caaaacaaaa agaccatggc tgcaggtgat cctgccaact 120

attttggaag agctgcctcg aactgttaac accatggccc ttctctggaa tgttctcaga 180

acctgtcgat ctcctagggg ccacgaaggg atcctcttcc gtttacttta aaaccaccaa 240

a 241

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cactgccgcg atacttttc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agagccttgt tgagtttgcc 20

<210> 4

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agaaatgcca ttttggaaga gctgcctcga actgttaaca ccatggccct tctctggaat 60

gttctcagaa aggaggagac tcaaaagaga cctgtcgatc tcctaggggc cacgaaggga 120

tcctcttccg tttactttaa aaccaccaaa cacaacctcc aagagggaaa acatttctcc 180

agattatcca ctcacccttc tagaaggtct aacgaccatt agtcattttt gtcttttgga 240

acaagccaac caaaacaaaa agaccatggc tgcaggtgat cctgccaact tgaggaatgc 300

Claims (3)

1.检测circDOPEY2表达水平的试剂在制备诊断慢性粒细胞性白血病产品中的用途，其特征在于，所述circDOPEY2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述circDOPEY2在慢性粒细胞性白血病患者中表达下调。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述试剂包括RT-PCR、实时定量PCR或高通量测序平台检测用试剂。

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