CN102149827B - MiR-26家族作为肝细胞癌和对治疗的应答性的预测性标志物的用途 - Google Patents

Abstract

本文中公开，微RNA-26的表达在肝细胞(HCC)肿瘤组织中相对于非癌性组织降低，并且低水平的微RNA-26与不良临床结果相关联。本文中还公开，微RNA-26的低表达水平与HCC患者对干扰素(IFN)-α治疗的有利应答相关。因此，本文中提供了预测经诊断患有HCC的患者的临床结果的方法，其包括检测获自患者的样品中微RNA-26的表达水平。还提供了选择经诊断患有HCC的患者作为IFN-α治疗的候选者的方法，其包括检测获自患者的样品中微RNA-26的表达水平。还提供了鉴定用于治疗HCC的治疗剂的方法，其包括体外筛选候选试剂以选择增加微RNA-26在HCC细胞中的表达的试剂。还提供了治疗经诊断患有HCC且表达低水平的miR-26的患者的方法，其中治疗包括IFN-α治疗。

Description

MiR-26家族作为肝细胞癌和对治疗的应答性的预测性标志物的用途

交叉引用相关申请 

本申请要求2009年6月11日提交的PCT申请PCT/US09/046999(其要求2008年6月11日提交的美国临时申请案61/131,800的优先权)的权益，其全部公开内容明确地通过引用合并入本文。 

关于联邦政府支助的研究的声明 

本发明是在National Cancer Institute Grant Nos.Z01 BC010313和Z01 BC 010876下由政府支助进行的。政府在本发明中具有某些权利。 

本发明的技术领域和工业适用性 

本公开内容描述了作为HCC患者预后和对干扰素(IFN)-α辅助治疗的应答的预测性标志物的miR-26的鉴定。 

背景 

肝细胞癌(HCC)是世界范围内最普遍的人恶性肿瘤之一，并且在美国发病率日益上升(Parkin等人，CA Cancer J.Clin.55(2)：74-108，2005)。HCC最常见地发生于具有炎性肝(其由通过乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎或由代谢障碍或毒性刺激导致)的患者中。病毒性肝炎促成了世界上80％以上的HCC病例(Thorgeirsson和Grisham，Nat.Genet.31(4)：339-3465，2002；Budhu和Wang，J.Leukoc.Biol.80(6)：1197-1213，2006)。HCC的关键特征之一是其显著的男性患病倾向的性别差异(即男性中的发病率是女性中的2-6倍)(E1 Serag和Rudolph，Gastroenterology132(7)：2557-2576，2007)。经典的体内致癌作用实验也显示在雄性啮 

最近的研究表明，在HCC中观察到的性别差异可能归因于枯否细胞产生的白细胞介素-6(IL-6)的诱导，该诱导可被雌激素抑制(Naugler等人，Science 317(5834)：121-124，2007)。与该想法相符，其他研究已显示，血清IL-6在几种侵袭性恶性肿瘤包括HCC中高度升高，并且其表达(其可由肿瘤细胞产生)与转移性疾病和不良预后相关(Ashizawa等人，Gastric Cancer 8(2)：124-131，2005；Porta等人，Ann.Oncol.19(2)：353-358，2008)。这些研究表明，IL-6的促癌活性(procarcinogeneic activity)可受性激素调控并且具有活化的IL-6的肿瘤在生物学上可以不同并且更具侵袭性。 

迄今为止，手术仍然是有可能治愈HCC的唯一有效的治疗方式。然而，目前只有大约10-20％的HCC患者适合进行手术干预。此外，接受治愈切除术的患者通常具有高复发频率。因此，仍然需要开发在帮助分类患者以进行预后和治疗中提供足够的分辨力的诊断工具。 

公开内容的概述 

微RNA(miR)是调控基因表达的小的单链RNA分子。本文中公开，microR-26(miR-26)在HCC肿瘤组织中的表达相对于非癌性组织下降并且低水平的miR-26与不良临床结果相关联。本文中还公开，在HCC患者中miR-26的低表达水平与对干扰素(IFN)-α治疗的有利应答相关。因此，本文中提供了预测经诊断患有HCC的患者的临床结果的方 法，其包括检测获自患者的HCC肿瘤样品中miR-26的表达水平，其中相对于对照，肿瘤样品中miR-26的表达水平的下降预示着存活的降低、对IFN-α治疗的有利应答或两者。 

还提供了选择经诊断患有HCC的患者作为IFN-α治疗的候选者的方法，所述方法包括检测获自患者的HCC肿瘤样品中miR-26的表达水平，其中相对于对照，肿瘤样品中miR-26的表达水平的降低表明患者是IFN-α治疗的候选者。 

还提供了治疗经诊断患有HCC的患者的方法，所述方法包括(i)检测获自患者的肿瘤样品中miR-26的表达水平；(ii)将肿瘤样品中miR-26的表达水平与对照相比较；和(iii)选择治疗患者的方法，其中只有当患者在肿瘤样品中的miR-26表达水平与对照相比低1.5倍或过多时，治疗才包括IFN-α治疗。 

在本文中公开的方法的一些实施方案中，对照是获自患者的非癌性组织样品。在其他实施方案中，对照是来自健康受试者的肝样品或标准值。 

本文中还提供了鉴定用于治疗HCC的治疗剂的方法，所述方法包括体外筛选候选试剂以选择增加miR-26在HCC细胞中的表达的试剂，从而鉴定用于治疗HCC的试剂。在一些实施方案中，筛选包括将候选试剂与HCC细胞接触。候选试剂可以是任何类型的分子，包括但不限于细胞因子或小分子。 

根据参考附图进行的几个实施方案的下列详述，本公开内容的上述及其他特征和有利方面将变得更显然。 

附图概述 

本专利或申请文件可包括一个或多个以彩色制成的图和/或一个或多个照片。具有彩色附图和/或照片的本专利或专利申请公开案的拷贝将应请求且支付必要的费用后由专利局(Patent Office)提供。 

图1A-1D：miR-26在男性和女性肝组织和肿瘤中的表达。 

图1A：通过微阵列分析测定的女性(n＝30)和男性非癌性肝组织 (n＝194)中的miR-26a-1的表达水平。使用非配对t检验。 

图1B：通过qRT-PCR测定女性病例(n＝26)和年龄匹配的男性G1和G2病例(n＝56)的miR-26a的相对表达水平。使用非配对t检验。 

图1C：当通过肿瘤中miR-26的状态进行二分时，224个配对的NT和T组织之间miR-26a-1的相对水平的比较。使用配对t-检验：p＜0.001，对于低miR-26-1组；p＝0.23，对于高miR-26-1组。图1A-1C中的数据表示为针对无疾病正常肝混合物(n＝8)标准化的log 2相对表达。 

图1D：通过微阵列分析测定的肿瘤中miR-26a-1的表达水平，和存活结果。使用时序检验(log rank test)并且将中值表达水平(medianexpression level)用作截断值。低miR-26表达(n＝106)被分类为低于第50百分位数(与NT相比较T中平均2.69倍的降低)。高miR-26表达(n＝111)被分类为高于第50百分位数(与NT相比较T中平均0.98倍的降低)。 

图2A-2C：低miR-26HCC中截然不同的转录活性。 

图2A：基于11,580个基因的表达的224个HCC病例的多维标度图(multidimensional scaling plot)。基于中值二分(分为低miR-26表达(蓝色或浅色)或高miR-26表达(红色或深色))给样品着色。 

图2B：在低miR-26 HCC中共表达的mRNA的维恩图。 

图2C：低miR-26 HCC中NFkB/IL-6信号转导的基因网络。在低miR-26HCC中被上调的基因以橙色或浅灰色突显。以灰色显示的基因不在重要基因的列表中但据报导与网络相关。实线和虚线分别表示直接和间接的相互作用，而箭头表示正调控(即，作用于)基因表达。由线连接的基因只表示结合。详细的网络关系和网络形状描述于图15中。 

图3A-3F：两个使用I FN治疗的前瞻性随机对照试验(IFN测试组群，n＝118；IFN验证组群(validation cohort)，n＝79)中，肿瘤中miR-26a的表达与存活预后的关联。 

图3A-3B：来自对照组(组群2，图3A；组群3，图3B)的HCC患者中miR-26a的表达与总体存活的关联。组群2：高miR-26a病例，n＝24；低miR-26a病例，n＝35。组群3：高miR-26a病例，n＝21；低miR-26a病例，n＝19。

图3C-3D：具有低miR-26a表达的HCC患者中IFN辅助治疗与总体存活的关联。组群2：IFN病例，n＝24；对照病例，n＝35。组群3：IFN病例，n＝20；对照病例，n＝19。 

图3E-3F：具有高miR-26a表达的HCC患者中IFN辅助治疗与总体存活的关联。组群2：IFN病例，n＝35；对照病例，n＝24.组群3：IFN病例，n＝19；对照病例，n＝21。 

图4A：表1-组群1和组群2的受试者的临床特征。 

图4B：补充的表1-INF测试(组群2和组群3)的受试者的临床特征。 

图4C：补充的表2-用于搜索性别相关微RNA的病例的临床特征。 

图5A：表2-患有HCC的受试者中miR-26的表达水平和总体存活的单变量和多变量Cox回归分分析。 

图5B：表3-具有低miR-26表达的受试者中干扰素治疗和总体癌症存活的单变量和多变量Cox回归分析。 

图6A：补充的表3-八个性别相关微RNA。 

图6B：表4-根据INGENUITY^TM Pathway Analysis的基因网络的前20个的列表。 

图7A-7F：来自测试组群的男性和女性肝组织以及肿瘤中miR-26的表达丰度。 

图7A：女性(n＝30)和男性非肿瘤肝组织(n＝194)中miR-26a-2的表达水平。 

图7A：当通过miR-26状态进行二分时，配对的T和NT之间miR-26a-2的相对水平的比较。中值表达水平用作截断值。低miR-26表达被分类为低于第50百分位数(与NT相比较T中平均2.69倍的降低)。高miR-26表达被分类为高于第50百分位数(与NT相比较T中平均0.98倍的降低)。通过微阵列分析测定图7A和图7B中的数据并且将其表示为针对无疾病正常肝混合物(n＝8)标准化的log 2相对表达。 

图7C：肿瘤中miR-26a-2的表达水平和存活结果。 

图7D-7F：与图7A-7C中相似的关于miR-26b的表达状态的结果。 

图8：基于miR-26表达状态的样品分类。基于其平均微RNA表达(即miR-26a-1、26a-2和26b)对HCC样品进行分类。中值表达用于将病例分成低miR-26(蓝色或浅色)和高miR-26(红色或深色)。各点(病例)的位置由3个微RNA的表达水平(miR-26a-1、miR-26a-2和miR-26b)决定。分类结果用于产生MDS图。 

图9A-9B：HCC中S100P和SLC2A6的表达以及它们的微阵列与qRT-PCR之间的关系。通过qRT-PCR测定的具有低miR-26水平的10个HCC和具有高miR-26水平的10个HCC病例中S100P(图9A)和SLC2A6(图9B)的表达水平(左图)。显示来自qRT-PCR与微阵列的数据之间的线性回归和关系，并标明r(斯皮尔曼系数(spearman))和p值(右图)。表达状态显示为肿瘤(T)/非肿瘤(NT)的比率。 

图10A-10C：HCC中miR-26和IL-6的表达。 

图10A：通过qRT-PCR测定的82个配对的肿瘤(T)和非肿瘤组织(NT)中IL-6的表达水平。进行学生氏t检验以检查T与NT之间IL-6的差异表达。 

图10B-10C：通过qRT-PCR测定的82个配对的肿瘤与非肿瘤组织中IL-6与miR-26a(B图10B)或miR-26b(图10C)之间的表达水平的关系。数据显示为在log2标度上显示的T/NT比率。 

图11：来自验证组群的男性和女性肝组织以及肿瘤中miR-26的表达丰度。在来自回顾性随机临床试验的独立验证组群中验证肿瘤中miR-26a和miR-26b的降低的表达(右图)，并且与男性非肿瘤组织相比较它们在女性中具有更丰富的表达(左图)。miR-26a和miR-26b的表达水平通过qRT-PCR来测量。P值来自非配对t检验。 

图12A-12F：IFN辅助治疗的两个前瞻性随机对照试验中，肿瘤中miR-26b的表达与存活预后的关联。 

图12A-12B：来自组群2(图6A)或组群3(图12B)的对照病例中 miR-26b的表达与总体存活的关联。组群2：高miR-26b病例，n＝23；低miR-26b病例，n＝36。组群3：高miR-26b病例，n＝21；低miR-26b病例，n＝19。 

图12C-12D：具有低miR-26b表达的HCC患者中IFN辅助治疗与总体存活的关联。组群2：IFN病例，n＝22；对照病例，n＝36。组群3：IFN病例，n＝20；对照病例，n＝19。 

图12E-12F：具有高miR-26a表达的HCC患者中IFN辅助治疗与总体存活的关联。组群2：IFN病例，n＝37；对照病例，n＝23。组群3：IFN病例，n＝19；对照病例，n＝21。 

图13：通过qRT-PCR测定的各种细胞类型(包括原代新分离的肝细胞、hTERT永生化的正常肝细胞细胞系HHT4、两个HCC细胞系和来自健康供者的PBMC)中miR-26的表达。 

图14：HCC中HGF的表达以及与miR-26的关联。通过qRT-PCR测定的10个具有低miR-26水平的HCC和10个具有高miR-26水平的HCC病例中HGF的表达水平(左图)。显示来自qRT-PCR的HGF水平与来自微阵列的miR-26水平之间的线性回归和相关性，并标明r(斯皮尔曼系数)和p值(右图)。表达状态显示为肿瘤(T)/非肿瘤(NT)的比率。 

图15：用于途径分析的网络关系和网络形状的详述。 

序列表 

如37C.F.R.1.822中规定的，使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的3字母代码显示所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列。只显示每一个核酸序列的一条链，但当提及展示的链时，互补链理解为包括在其中。在所附序列表中： 

[SEQ ID NO：1]是人miR-26a-1的前体形式的核苷酸序列＝guggccucgu ucaaguaauc caggauaggc ugugcagguc ccaaugggcc uauucuuggu 

[SEQ ID NO：2]是人miR-26a-2的前体形式的核苷酸序列＝ ggcuguggcu ggauucaagu aauccaggau aggcuguuuc caucugugag gccuauucuugauuacuugu uucuggaggc agcu 

[SEQ ID NO：3]是人miR-26b的前体形式的核苷酸序列＝ccgggaccca guucaaguaa uucaggauag guugugugcu guccagccug uucuccauua cuuggcucggggaccgg 

[SEQ ID NO：4]是人miR-26a-1和miR-26a-2的成熟形式的核苷酸序列＝uucaaguaau ccaggauagg cu 

[SEQ ID NO：5]是人miR-26b的成熟形式的核苷酸序列＝uucaaguaau ucaggauagg u. 

发明详述 

缩写 

1NN    1-最近的相邻者 

3NN    3-最近的相邻者 

AFP    甲胎蛋白 

ALT    丙氨酸氨基转移酶 

CCP    混合协变量分类器(Compound covariate predictor) 

DLD    对角线线性判别(Diagonal linear discriminant) 

DNA    脱氧核糖核酸 

HBV    乙型肝炎病毒 

HCC    肝细胞癌 

HCV    丙型肝炎病毒 

IFN    干扰素 

IL     白细胞介素 

ISH    原位杂交 

miR    微RNA 

miRNA  微RNA 

mRNA   信使RNA 

NC    最近邻质心分类器(Nearest centroid) 

PCR          聚合酶链式反应 

pre-miRNA    前体微RNA 

qRT-PCR      定量逆转录酶聚合酶链式反应 

RNA          核糖核酸 

siRNA        小干扰RNA 

snRNA        小核RNA 

SVM          支持向量机(Support vector machine) 

TACE         经导管动脉化疗栓塞 

TNM          肿瘤结节转移(Tumor-node-metastasis) 

术语 

应理解，上述一般性描述和下文中的详述仅仅是示例性和说明性的，并且无意限定本教导的范围。在本申请中，除非明确地另外指出，否则单数的使用包括复数。 

当与权利要求书和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，单词″a″或″an″的使用可表示“一个”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”的意义相一致。 

此外，“包含”、“含有”和“包括”或此类根词的修饰形式例如但不限于“包含”、“含有”和“包括”无意是限定性的。术语“和/或”意指可一起或分开地采用之前和之后的项。例如，但不作为限制，“X和/或Y”可表示“X”或“Y”或“X和Y”。 

应理解，miRNA来源于基因组序列或基因。在这点上，为简单起见，将术语“基因”用于指编码给定的miRNA的前体miRNA的基因组序列。然而，本发明的实施方案可包括参与其表达的miRNA的基因组序列，例如启动子或其他调控序列。 

术语″miRNA″通常是指单链分子，但在特定的实施方案中，本发明中涉及的分子还可包括与相同单链分子的另一个区域或与另一个核酸部分(在整个链长度上10至50％互补)、大体上(在整个链长度上大于50％但小于100％互补)或完全互补的区域或另外的链。因此，核酸可包 括分子，所述分子包含含有分子的特定序列的一个或多个互补或自身互补的链或“互补序列”。例如，前体miRNA可具有达到100％互补的自身互补区域。本发明的miRNA探针可以与其靶互补或至少60、65、70、75、80、85、90、95或100％互补。 

本文中使用的术语“其组合”意指该术语之前所列项的全部排列和组合。例如，″A、B、C或其组合″意欲包括：A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一个，并且如果在特定背景中顺序是重要的，那么还包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。 

本文中使用的段落标题只用于组织目的并且不被解释为以任何方式限定所述主题。本申请中引用的所有文献和相似材料，包括专利、专利申请、论文、书籍、专题论文和互联网页为了任何目的以其全文通过引用明确地合并入本文。如果一个或多个合并的文献和相似材料以与本申请中的术语定义矛盾的方式定义或使用术语，那么以本申请为准。 

除非另外指出，否则按照常规用法使用技术术语。分子生物学中的一般术语的定义可见于Benjamin Lewin，Genes V，由OxfordUniversity Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(eds.)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由BlackwellScience Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology：aComprehensive Desk Reference，由VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。 

为了帮助概述本公开内容的各种实施方案，提供特定术语的下列解释： 

辅助治疗：与主治疗(primary treatment)组合使用以改善主治疗的效果的治疗。例如，经诊断患有HCC的患者可经历作为主治疗的肝切除术和作为辅助治疗的干扰素(IFN)-α治疗。 

候选者：如本文中所使用的，IFN-α治疗的“候选者”是经预测对治疗HCC的IFN-α治疗有利地应答的患者。 

临床结果：是指在治疗疾病或障碍例如HCC后，或在治疗不存在的情况下，患者的健康状态。临床结果包括但不限于死亡之前的时间长度的增加、死亡之前的时间长度的减少、存活概率的增加、死亡的风险的增加、存活、无疾病存活、慢性疾病、转移、晚期或侵袭性疾病、疾病复发、死亡和对治疗的有利或不良反应。 

对照：“对照”是指用于与实验样品例如获自HCC患者的肿瘤样品相比较的样品或标准。在一些实施方案中，对照是获自健康患者的肝样品或获自经诊断患有HCC的患者的非癌性组织样品。在一些实施方案中，对照是历史对照或标准值(即，代表基线或正常值的之前测试的对照样品或样品组，例如非癌性组织中miR-26的表达水平)。 

细胞因子：由众多造血和非造血细胞产生的影响其他细胞的行为的蛋白质。细胞因子对于先天免疫应答和适应性免疫应答都是非常重要的。 

存活的减少：如本文中使用的，“存活的减少”是指患者死亡之前时间长度的减少或患者死亡的风险的增加。 

检测表达的水平：如本文中使用的，“检测miR-26表达的水平”是指定量存在于样品中的miR-26的量。可使用本领域内已知的或本文中描述的任何方法，例如通过qRT-PCR检测miR-26或任何微RNA的表达。检测miR-26的表达包括检测miR-26的成熟形式或与miR-26表达相关的前体形式的表达。通常，miRNA检测方法包括序列特异性检测(例如通过RT-PCR进行的)。可使用前体和成熟miR-26的核酸序列(所述序列在本领域中是已知的并且在本文中提供为SEQ ID NO：1-5)来设计miR-26特异性引物和探针。 

肝细胞癌(HCC)：HCC是通常在患有由病毒性肝炎、肝脏毒素或肝硬化(通常由酒精中毒引起的)导致的炎性肝的患者中发生的肝的原发性恶性肿瘤。 

干扰素(IFN)-α：干扰素是由多种不同细胞类型包括白细胞(例如T细胞、B细胞和天然杀伤细胞)和成纤维细胞产生的一种细胞因子。干扰素响应对外源因子例如病毒、寄生虫和肿瘤的暴露而被诱导。双 链RNA，通常预示着病毒感染，是干扰素的常见诱导剂。干扰素对于抑制病毒复制、活化天然杀伤细胞和巨噬细胞以及增加抗原至淋巴细胞的呈递是非常重要的。干扰素包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ。如本文中所使用的，用于HCC的″IFN治疗″或″IFN-α治疗″是指使用IFN-α的治疗。如本文中所使用的，“对IFN治疗的有利应答”或“对IFN-α治疗的有利应答”意指用I FN-α治疗的患者具有存活的增加(死亡之前的时间长度的增加，或增加的存活概率)、HCC的症状的改善、HCC的扩散或转移的减少、疾病的严重度或侵袭性的降低或用于测量对治疗的阳性应答的任何其他适当的临床参数。 

微RNA(miRNA，miR)：调控基因表达的单链RNA分子。微RNA在长度上通常为21-23个核苷酸。微RNA被从称为pri-miRNA的初级转录物加工为称为前体(pre)-miRNA的短茎环结构，并且最终加工为功能性成熟微RNA。成熟微RNA分子与一个或多个信使RNA分子部分互补，并且其主要功能是下调基因表达。微RNA通过RNAi途径调控基因表达。 

微RNA-26：是指目前包括miR-26a-1、miR-26a-2和miR-26b的微RNA(也称为miR)家族。术语″微RNA-26″也包括任何迄今未鉴定的在HCC肿瘤中相对于健康组织差异表达的微RNA-26家族的成员。 

miR-26表达：如本文中所使用的，″低miR-26表达″和″高miR-26表达″是指样品例如健康或HCC肝样品中发现的miR-26的水平的相对术语。在一些实施方案中，通过比较一组非癌性肝样品和HCC肝样品中miR-26的水平来确定低和高miR-26表达。然后可基于样品中miR-26的表达在平均或中值miR-26表达水平以上(高)还是以下(低)来将低和高表达分配给各样品。对于单独的样品，可通过将样品与已知具有高或低表达的对照或参照样品相比较，或通过与标准值相比较来确定高或低miR-26表达。低和高miR-26表达可包括miR-26的前体或成熟形式或两者的表达。 

患者：如本文中所使用的，术语“患者”包括人和非人动物。进行治疗的优选患者是人。“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。 

药学上可接受的载体：可用于本公开内容的药学上可接受的载体(媒介物)是常规的。Remington′s Pharmaceutical Sciences，by E.W.Martin，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第15版(1975)，描述了适合用于一种或多种治疗化合物、分子或试剂的药物递送的组合物和制剂。 

一般而言，载体的性质将取决于待使用的特定施用模式。例如，胃肠外制剂通常包括可注射液，其包含药学上和生理上可接受的液体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性葡萄糖、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规无毒固体载体可包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体外，待施用的药物组合物可包含少量的无毒的辅助物质例如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸钠或山梨聚糖单月桂酸酯。 

预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病(例如HCC)是指抑制疾病的完全发展。“治疗”是指在疾病或病理状况已开始发展后缓解其体征或症状的治疗性干预。“改善”是指疾病的体征或症状的数目或严重度的降低。 

筛选：如本文中所使用的，“筛选”是指用于评估和鉴定增加miR-26的表达的候选试剂的方法。在一些情况下，筛选包括将候选试剂(例如抗体、小分子或细胞因子)与HCC细胞接触并且测试试剂对miR-26的表达的影响。可使用本领域内已知的和本文中描述的许多技术中的任一种例如通过微阵列分析或通过qRT-PCR来定量微RNA的表达。 

小分子：通常具有低于大约1000道尔顿或在一些实施方案中，低于大约500道尔顿的分子量的分子，其中所述分子能够以可测量的程度调控靶分子的活性。 

治疗：包括诊断和治疗的一般术语。 

治疗剂：当适当地给受试者施用时，能够诱导期望的治疗或预防效果的化合物、小分子或其他组合物例如反义化合物、抗体、蛋白酶 抑制剂、激素、趋化因子或细胞因子。例如，HCC的治疗剂包括预防或抑制HCC的发展或转移的试剂。如本文中使用的，“候选试剂”是选择用于筛选以确定其是否可用作HCC的治疗剂的化合物。在一些实施方案中，如果候选试剂增加miR-26在HCC细胞中的表达，那么其被鉴定为治疗剂。″温育″包括用于试剂与细胞或组织相互作用的足够量的时间。“接触”包括将固体或液体形式的试剂与细胞或组织一起温育。用试剂″治疗″细胞或组织包括将所述试剂与细胞或组织接触或一起温育。 

治疗有效量：足以在将用试剂治疗的受试者或细胞中获得期望的效果的特定药物或治疗剂的量。例如，这可以是增加miR-26的表达的治疗剂的量和/或预防、治疗或改善患者的HCC的治疗剂的量。试剂的有效量将取决于几个因素，包括但不限于将要治疗的受试者或细胞以及治疗性组合物的施用方式。 

肿瘤、瘤(neoplasia)、恶性肿瘤或癌症：细胞的异常和不受控制的生长的结果。瘤、恶性肿瘤、癌症和肿瘤通常可互换使用并且是指由过度细胞分裂引起的组织或细胞的异常生长。个体中肿瘤的量是可测量为肿瘤的数目、体积或重量的“肿瘤负荷”。不转移的肿瘤称为“良性的”。侵入周围组织和/或可转移的肿瘤称为“恶性的”。 

肿瘤结节转移(TNM)：恶性肿瘤的TNM分类是用于描述患者身体中癌症的程度的癌症分期系统。T描述原发性肿瘤的大小和其是否侵袭附近组织；N描述牵涉的任何淋巴结；和M描述转移。TNM由International Union Against Cancer发展和维持以在用于分类癌症的扩散程度的一个全球公认的标准上获得共识。TNM分类也由American Joint Committee on Cancer和International Federationof Gynecology and Obstetrics使用。 

除非另外解释，否则本文中使用的全部技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的技术人员通常理解的意义相同的意义。除非上下文另外清楚地指出，否则单数术语“a”、“an”和“the”包括复数指示物。类似地，除非上下文另外清楚地指出，否则单词“或”旨在 包括“和”。因此“包含A或B”意指包括A或B或A和B。还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似值，并且其被提供用于说明。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于实施或测试本公开内容，但适当的方法和材料描述于下文中。本文中提及的全部公开案、专利申请、专利和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。在矛盾的情况下，以本说明书(包括术语的解释)为准。此外，材料、方法和实例仅是举例说明性的并且无意是限定性的。 

几个实施方案的概述 

本文中公开，miR-26的表达在HCC肿瘤组织中相对于非癌性组织降低，以及低水平的miR-26与不良临床结果关联。本文中还公开，在HCC患者中，低表达水平的miR-26与对IFN-α治疗的有利应答相关。 

因此，本文中提供了预测经诊断患有HCC的患者的临床结果的方法，其包括检测获自患者的HCC肿瘤样品中miR-26的表达水平，其中相对于对照，肿瘤样品中miR-26的表达水平的降低预示着存活的减少、对IFN-α治疗的有利应答或两者。还提供了选择经诊断患有HCC的患者作为IFN-α治疗的候选者的方法，其包括检测获自患者的HCC肿瘤样品中miR-26的表达水平，其中相对于对照，肿瘤样品中miR-26的表达水平的降低表示患者是进行IFN-α治疗的候选者。 

在本方法的一个实施方案中，miR-26是miR-26a-1。在另一个实施方案中，miR-26是miR-26a-2。在另一个实施方案中，miR-26是miR-26b。在其他实施方案中，miR-26是miR-26a-1、miR-26a-2和miR26b中的两个或更多个的组合。 

在一些实施方案中，对照是获自相同患者的非癌性组织样品。在其他实施方案中，对照是获自健康受试者例如健康肝供者的肝样品。在另一个实例中，对照是根据历史值计算的标准。可按照本领域内已知的任何方法获得肿瘤样品和非癌性组织样品。例如，可从已经历肝切除术的HCC患者获得肿瘤和非癌性样品，或可使用皮下注射针通过 抽取，通过显微解剖，或通过激光捕获来获得它们。可以例如从尸体器官提供者或从健康肝供者获得对照(非癌性)样品。 

肿瘤样品中miR-26的表达降低(相对于对照)这样的量，所述量足以赋予表型效应(例如使肿瘤对使用IFN-α的治疗更易感，改变肿瘤的生长速率，使肿瘤能够转移)。然而不期望受理论束缚，表型效应据认为由受miR-26调控的差异基因表达介导。表型效应还可以是一个或多个受miR-26调控的基因的表达的增加或减少。在一些实施方案中，肿瘤样品中miR-26的表达减少至少1.1倍，至少1.2倍，至少1.3倍或至少1.4倍。在一个实施方案中，肿瘤样品中miR-26的表达相对于对照减少至少1.5倍。在另一个实施方案中，肿瘤样品中miR-26的表达相对于对照减少至少2倍。在另一个实施方案中，肿瘤样品中miR-26的表达相对于对照减少至少2.5倍。在另一个实施方案中，肿瘤样品中miR-26的表达相对于对照减少至少3倍。在另一个实施方案中，肿瘤样品中miR-26的表达相对于对照减少至少3.5倍。在另一个实施方案中，肿瘤样品中miR-26的表达相对于对照减少至少4倍。在其他实施方案中，肿瘤样品中miR-26的表达降低至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍或至少10倍。miR-26的表达可使用本领域内已知的任何方法例如但不限于微阵列和qRT-PCR来检测和定量。 

还提供了鉴定用于治疗HCC的治疗剂的方法，其包括体外筛选候选试剂以选择增加miR-26在HCC细胞中的表达的试剂，从而鉴定用于治疗HCC的试剂。 

在一些实施方案中，筛选包括将候选试剂与HCC细胞接触。HCC细胞可以是获自HCC患者的原代细胞，或HCC细胞可以是永生化或转化的细胞。在一个实施方案中，HCC细胞中miR-26的表达相对于未处理的细胞增加至少2倍。在另一个实施方案中，HCC细胞中miR-26的表达相对于未处理的细胞增加至少3倍。在另一个实施方案中，HCC细胞中miR-26的表达相对于未处理的细胞增加至少4倍。 

候选试剂可以是任何类型的试剂例如蛋白质、肽、小分子、抗体 或核酸。在一些实施方案中，候选试剂是细胞因子。在一些实施方案中，候选试剂是小分子。筛选包括高通量筛选和筛选单独的候选试剂或小组候选试剂。 

还提供了治疗经诊断患有HCC的患者的方法，其包括(i)检测获自患者的肿瘤样品中miR-26的表达水平；(ii)将肿瘤样品中miR-26的表达水平与对照相比较；和(iii)选择治疗患者的方法，其中仅当患者的miR-26表达水平在肿瘤样品中相对于对照具有1.5倍或更多倍的降低时，治疗才包括IFN-α治疗。在一些实施方案中，miR-26是miR-26a-1、miR-26a-2、miR-26b或其组合。 

在一些实施方案中，治疗方法还包括肝切除术。在一些实施方案中，IFN-α治疗包括IFN-α的施用。 

在一个实施方案中，对照是获自患者的非癌性组织样品。在另一个实施方案中，对照是来自健康受试者的肝样品。在另一个实施方案中，对照是标准值。 

在本方法的一些实施方案中，miR-26在肿瘤样品中的表达减少至少2倍、至少2.5倍、至少3倍或至少4倍。 

肿瘤组织样品 

本文中提供的方法包括检测肿瘤和非肿瘤组织样品中miR-26的表达水平。在一些实施方案中，组织样品获自经诊断患有HCC的受试者，和在一些情况下，获自健康受试者或尸体器官供者。″样品″是指组织的一部分(其为整个组织或组织的患病或健康部分)。如本文中所描述的，将肿瘤组织样品与对照相比较。在一些实施方案中，对照是获自相同受试者的非癌性组织样品，例如围绕HCC肿瘤的非癌性肝组织。在其他实施方案中，对照是获自健康患者的肝样品或来自尸体的非癌性组织样品。在其他实施方案中，参照样品是基于历史值的标准。 

可使用本领域内已知的任何方法从受试者获得组织样品。例如，可从已经历肝切除术(作为HCC治疗)的HCC患者获得组织样品。可 从这些患者获得肿瘤组织和周围非癌性肝组织。在一些实施方案中，用作对照的非癌性组织样品获自尸体。在其他实施方案中，非癌性组织样品获自健康肝供者(参见Kim等人.，Hepatology 39(2)：518-527，2004)。 

在一些实施方案中，通过活组织检查获得组织样品。活组织检查样品可以是新鲜的、冷冻的或固定的，例如福尔马林固定的和石蜡包埋的。可通过抽取(例如利用皮下注射针或其他类型的针)，通过显微解剖，通过激光捕获或通过本领域内已知的任何其他方法通过手术从患者取出样品。 

检测miR-26表达的方法 

前体微RNA(pre-miRNA)和成熟miRNA的序列可以公共获得，例如通过miRBase数据库(可通过Sanger Institute在线获得)(参见Griffiths-Jones等人，Nucleic Acids Res.36：D154-D158，2008；Griffiths-Jones等人，Nucleic Acids Res.34：D140-D144，2006；和Griffiths-Jones，Nucleic Acids Res.32：D109-D111，2004)。miR-26家族成员的前体和成熟形式的序列在本文中提供为SEQ ID NO：1-5。虽然miR-26a-1和miR-16a-2的前体形式不同，但这些miR的成熟形式的序列是相同的(SEQ ID NO：4)。 

微RNA表达的检测和定量可通过本领域内熟知的(参见，例如，美国专利申请公开案2006/0211000和2007/0299030，其通过引用合并入本文)和下文中描述的许多方法中的任一方法来实现。通过使用miR-26家族成员的已知序列，适当时可设计特异性探针和引物以用于下文中描述的检测方法。 

在一些情况下，miRNA检测方法需要从样品例如细胞或组织样品分离核酸。核酸，包括RNA和特别地miRNA，可使用本领域内已知的任何适当技术来分离。例如，基于苯酚的提取是用于分离RNA的常用方法。基于苯酚的试剂包含用于细胞和组织破裂和随后将RNA与污染物分离的变性剂和RNA酶抑制剂的组合。基于苯酚的分离方法可回收 10-200个核苷酸范围内的RNA类别(例如，前体和成熟miRNA、5S和5.8S核糖体RNA(rRNA)以及U1小核RNA(snRNA))。此外，提取方法例如使用TRIZOL^TM或TRI REAGENT^TM的方法将纯化全部RNA(大的和小的)，并且为从包含miRNA和小干扰RNA(siRNA)的生物样品分离总RNA的有效方法。 

微阵列 

微阵列是使得能够进行复杂生物化学样品的平行分析的核酸、蛋白质、小分子、细胞或其他物质的微观有序的阵列。DNA微阵列由称为捕获探针的化学连接至固体基质(其可以是微型芯片、载玻片或微球体大小的珠粒)的不同核酸探针组成。可使用微阵列例如同时测量大量信使RNA(mRNA)和/或miRNA的表达水平。 

可使用多种技术，包括使用精细的针印制至载玻片、使用预制的掩蔽物进行的光刻(photolithography)、使用动态微镜器件(dynamicmicromirror device)进行的光刻、喷墨打印或微电极阵列上的电化学来制作微阵列。 

可按照本领域内已知的任何方法来完成mi RNA的微阵列分析(参见，例如，PCT公开案WO 2008/054828；Ye等人，Nat.Med.9(4)：416-423，2003；Calin等人，N.Engl.J.Med.353(17)：1793-1801，2005，其各自通过引用合并入本文)。在一个实例中，从细胞或组织样品提取RNA，使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从总RNA按大小选择小RNA(18-26个核苷酸的RNA)。将寡核苷酸接头连接至小RNA的5′和3′末端，且所得的连接产物用作使用10个扩增循环的RT-PCR反应的模板。有义链PCR引物具有连接至其5′末端的荧光团，从而荧光标记PCR产物的有义链。使PCR产物变性，然后与微阵列杂交。与微阵列上的相应miRNA捕获探针序列互补的称为靶核酸的PCR产物将通过碱基配对与其上附着有捕获探针的点杂交。然后当使用微阵列激光扫描仪激发时，点将发射荧光。然后使用许多阳性和阴性对照以及阵列数据标准化方法就特定miRNA的拷贝数评估各点的荧光强度，这将产生对特定 miRNA的表达水平的估量。 

在可选择的方法中，直接使用从细胞或组织样品提取的包含小RNA级分(包括mi RNA)的总RNA而无需进行小RNA的大小选择，并且使用T4RNA连接酶和荧光标记的短RNA接头标记3′末端。通过在30℃下温育2小时，然后在80℃下热灭活T4RNA连接酶5分钟来标记RNA样品。与阵列上相应miRNA捕获探针序列互补的荧光团标记的mi RNA将通过碱基配对与其上附着有捕获探针的点杂交。如上所述进行微阵列扫描和数据处理。 

存在几种类型的可使用的微阵列，包括点样(spotted)寡核苷酸微阵列、预制的寡核苷酸微阵列和点样长寡核苷酸阵列。在点样寡核苷酸微阵列中，捕获探针是与miRNA序列互补的寡核苷酸。通常将该类型的阵列与来自两个待比较的样品(例如非癌性组织和HCC肝组织)的经大小选择的小RNA的扩增PCR产物(其用两种不同的荧光团标记)杂交。可选择地，从两个样品提取包含小RNA级分(包括miRNA)的总RNA，然后直接使用而无需进行小RNA的大小选择，并且使用T4RNA连接酶和用两个不同荧光团标记的短RNA接头标记3′末端。可将样品混合并且与一个单一微阵列杂交，然后扫描所述阵列，从而允许在一个测定中显现上调的和下调的miRNA基因。 

在预制的寡核苷酸微阵列或单通道微阵列中，探针经设计以匹配已知的或预测的miRNA的序列。存在可商购获得的覆盖整个基因组的设计(例如，来自Affymetrix或Agilent)。此类微阵列提供基因表达的绝对值的评估，从而两个条件的比较需要使用两个分开的微阵列。 

点样长寡核苷酸阵列由50至70聚体寡核苷酸捕获探针组成，并且通过喷墨或机器打印产生。短寡核苷酸阵列由20至25聚体寡核苷酸探针组成，并且通过光刻合成(Affymetrix)或通过机器打印产生。 

定量RT-PCR 

定量RT-PCR(qRT-PCR)是用于快速测量聚合酶链式反应的产物的量的聚合酶链式反应的改进。qRT-PCR通常用于确定基因序列例如miR 是否存在于样品中，并且如果其存在，测定其在样品中的拷贝数。可测定核酸分子包括miRNA的表达的任何PCR方法落在本公开内容的范围内。存在本领域内已知的qRT-PCR法的几种变型，其中的三个描述于下文中。 

用于定量聚合酶链式反应的方法包括但不限于通过琼脂糖凝胶电泳、SYBR Green(双链DNA染料)的使用以及荧光报告探针的使用。后两者可进行实时分析。 

对于琼脂糖凝胶电泳，用已知浓度的相似大小部分的靶DNA进行扩增以制备未知样品和已知样品。在相同条件(优选使用相同引物，或至少具有相似退火温度的引物)下进行两个反应，进行相同的时间长度。琼脂糖凝胶电泳用于将反应的产物与其原始DNA和多余引物分离。测量已知和未知样品的相对量以测定未知样品的量。 

SYBR Green染料的使用比琼脂糖凝胶法更精确，并且可实时提供结果。DNA结合染料结合所有新合成的双链DNA并且测量荧光强度的增加，从而允许测定初始浓度。然而，SYBR Green将标记所有双链DNA，包括任何非预期的PCR产物以及引物二聚体，从而导致潜在的复杂性和假像。常规地制备反应物，并加入荧光双链DNA染料。进行反应，并且监控荧光的水平(当与双链DNA结合时，染料才发荧光)。参考标准样品或标准曲线，可测定PCR中的双链DNA浓度。 

荧光报告探针法使用基于序列特异性核酸的探针从而只定量探针序列而并非所有双链DNA。通常使用在相邻位置具有荧光报告分子和猝灭剂的基于DNA的探针(所谓的双标记探针)进行该方法。报告分子与猝灭剂的紧密相邻阻止了其荧光；只有在探针断裂时才可检测到荧光。该方法依赖于使用的聚合酶的5′至3′外切核酸酶活性。 

通过加入双标记探针制备实时定量PCR反应物。在双链DNA模板变性时，探针能够结合模板DNA的目的区域中的其互补序列。当加热PCR反应混合物以激活聚合酶时，聚合酶开始合成引发的单链模板DNA的互补链。随着聚合的继续进行，其到达结合至互补序列的探针，然后由于聚合酶的5′至3′外切核酸酶活性，探针被水解，从而将荧光报 告分子与猝灭剂分子分离。这导致检测到荧光增加。在实时PCR反应的热循环过程中，监控荧光的增加(其在各PCR循环中从水解的双标记探针释放)，这允许精确地测定最终的DNA的量，从而测定初始DNA的量。 

原位杂交 

原位杂交(ISH)将核酸杂交技术应用和推广至单细胞水平，并且与细胞化学、免疫细胞化学和免疫组织化学的技术组合，允许形态学的维持和待维持和鉴定的细胞标志物的鉴定，并且使得能够将序列定位至群体例如组织和血液样品内的特定细胞。ISH是一种类型的杂交，其使用互补核酸将一个或多个特定核酸序列定位在组织的一部分或切片中(原位)，或如果组织足够小，定位在整个组织中(整体原位杂交(whole mount ISH))。RNA ISH可用于测定组织中的表达模式，例如miRNA的表达模式。 

处理样品细胞或组织以增加它们的通透性，从而允许探针例如miRNA特异性探针进入细胞。将探针加入至经处理的细胞，让其在恰当的温度下杂交，然后洗去过量的探针。用放射性、荧光或抗原性标签标记互补探针，以便可使用放射自显影、荧光显微术或免疫测定来测定组织中探针的位置和量。样品可以是本文中描述的任何样品，例如非癌性或HCC肝样品。因为miR-26家族成员的序列是已知的，因此可相应地设计miR-26探针以便所述探针特异性结合miR-26。 

原位PCR 

原位PCR是在ISH之前基于PCR的靶核酸序列的扩增。为了检测RNA，引入细胞内逆转录步骤以在原位PCR之前从RNA模板产生互补DNA。这使得能够检测低拷贝的RNA序列。 

在进行原位PCR之前，固定和透化细胞或组织样品以保持形态学并且允许PCR试剂接近待扩增的细胞内序列。然后在保持在悬浮液中的完整细胞中或直接在离心涂片制剂(cytocentrifuge preparation) 中或载玻片上的组织切片中进行靶序列的PCR扩增。在前一种方法中，使用常规热循环仪对悬浮于PCR反应混合物中的已固定的细胞进行热循环。在PCR后，将细胞离心涂片至载玻片上，通过ISH或免疫组织化学显现细胞内PCR产物。通过在盖玻片下用PCR混合物覆盖样品(然后密封以防止反应混合物蒸发)来进行载玻片上的原位PCR。通过将载玻片直接置于常规或特殊设计的热循环仪的加热块的顶部或通过使用热循环炉(thermal cycling oven)来进行热循环。 

通常通过两个不同技术中的一个技术来实现细胞内PCR产物的检测，所述两个技术是使用PCR产物特异性探针通过ISH进行的间接原位PCR或通过直接检测在热循环过程中掺入PCR产物的标记核苷酸(例如地高辛-11-dUTP、荧光素-dUTP、3H-CTP或生物素-16-dUTP)而无需进行ISH的直接原位PCR。 

miR-26作为HCC预后的预测性标志物和用于鉴定治疗HCC的治疗剂的用途 

本文中公开，miR-26是HCC患者的存活预后的独立预测物(predictor)。与来自相同受试者或来自健康受试者的非癌性组织相比较具有低miR-26表达的HCC肿瘤样品预示着存活的减少。此外，当对HCC患者的IFN-α治疗的治疗结果分类时，只有在肿瘤中具有低miR-26表达的患者有利地响应IFN-α治疗。因此，肿瘤中miR-26的状态可用作HCC患者的预后的临床工具和用于选择可从IFN-α辅助治疗受益(以防止复发)的适当的HCC患者。在一些情况下，在根治性肝切除术后使用IFN-α治疗。 

在一些实施方案中，将HCC肿瘤样品中miR-26的表达水平直接与来自相同患者的周围非癌性组织中miR-26的表达水平相比较。在其他实施方案中，将肿瘤样品中miR-26的表达与获自健康受试者例如肝供者的肝样品中miR-26的表达水平相比较。在一些情况下，用作对照样品的非癌性组织获自尸体。在其他实施方案中，将肿瘤样品中miR-26的表达与基于历史值的标准水平相比较。例如，可基于获自受试者组 群的非癌性肝组织样品中miR-26的平均表达水平来设置标准。例如，受试者的组群可以是一组参与临床试验的HCC患者。受试者的组群还可以是一组尸体器官供者。 

相对于对照，HCC肿瘤样品中一个或多个miR-26家族成员的低表达表示患者的不良预后并且将患者鉴定为IFN-α辅助治疗的良好候选者。如本文中所使用的，“不良的预后”通常指存活的减少，或换句话说，死亡风险的增加或死亡之前时间的减少。不良预后还可指疾病的严重度的增加，例如癌症至其他器官的扩散(转移)的增加。在一个实施方案中，miR-26的低表达表示为相对于对照表达降低至少1.5倍。在其他实施方案，miR-26的低表达表示为相对于对照miR-26表达降低至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍或至少4倍。 

患有具有更高水平的miR-26表达的HCC肿瘤的患者具有更好的存活概率的发现表明，增加miR-26的表达的化合物可用作治疗HCC的治疗剂。因此，本文中提供了鉴定治疗HCC的治疗剂的方法，其包括体外筛选候选试剂以选择增加miR-26在HCC细胞中的表达的试剂。在一些实施方案中，筛选包括将候选试剂与HCC细胞接触，然后检测细胞中miR-26的表达水平的任何变化。HCC细胞可以是获自HCC患者的原代细胞，获自患者的永生化或转化的细胞，或细胞可以是可商购获得的永生化细胞系，例如，但不限于MHCC97、HepG2、Hep3B或SNU-423细胞。 

在用候选试剂处理后miR-26的表达的增加将该试剂鉴定为治疗HCC的治疗剂。筛选候选试剂以鉴定用于治疗疾病的治疗剂的方法在本领域内是熟知的。检测miR-26的表达水平的方法在本领域内是已知的并且描述于本文中，例如但不限于微阵列分析、RT-PCR(包括qRT-PCR)、原位杂交、原位PCR和Northern印迹分析。在一个实施方案中，筛选包括高通量筛选。在另一个实施方案中，单独地筛选候选试剂。 

候选试剂可以是任何类型的分子，例如但不限于可直接或间接改变miR-26表达的核酸分子、蛋白质、肽、抗体、脂质、小分子、化学药品、细胞因子、趋化因子、激素或任何其他类型的分子。在一些实 施方案中，候选试剂是在NFκB/IL-6信号转导途径中起作用的分子。在其他实施方案中，候选试剂是在IL-10、STAT3或干扰素可诱导的因子信号转导网络中起作用的分子。在一个实施方案中，候选试剂是细胞因子。在另一个实施方案中，候选试剂是小分子。 

本文中还公开了用于表征肝细胞癌(HCC)的方法，其中HCC的至少一个特征选自下列中的一个或多个：HCC的存在或不存在；HCC的诊断；HCC的预后；治疗结果的预测；治疗结果的监测；HCC对治疗的适合性，例如HCC对化学疗法治疗和/或放射疗法治疗的适合性；HCC对激素治疗的适合性；HCC对通过侵入性手术去除的适合性；HCC对组合辅助疗法的适合性。 

本文中还公开了用于检测HCC的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种含有miR-26家族的一个或多个成员的检测探针。试剂盒可以以寡核苷酸阵列的形式存在或可包括寡核苷酸阵列。 

本文中还描述了用于确定HCC患者对治疗的适合性的方法，其包括：i)从患有HCC的患者分离至少一个组织样品；ii)表征至少一个组织样品和/或利用检测探针以鉴定HCC的至少一个特征；iii)基于步骤ii)中鉴定的至少一个特征，诊断患者的生理状态；iv)基于步骤iii)中获得的诊断，确定患者是否从HCC的治疗中获益。 

在某些实施方案中，癌症的至少一个特征选自下列中的一个或多个：癌症的存在或不存在；癌症的类型；癌症的来源；癌症的诊断；癌症的预后；治疗结果的预测；治疗结果的监测；癌症对治疗的适合性，例如癌症对化学疗法治疗和/或放射疗法治疗的适合性；癌症对激素治疗的适合性；癌症对通过侵入性手术去除的适合性；癌症对组合辅助治疗的适合性。 

本文中还公开了用于测定癌症对治疗的适合性的方法，其中癌症的至少一个特征是癌症对治疗的适合性，例如，癌症对化学疗法治疗和/或放射疗法治疗的适合性；癌症对激素治疗的适合性；癌症对通过侵入性手术去除的适合性；癌症对组合辅助疗法的适合性。 

本文中还公开了用于确定HCC患者的可能预后的方法，其包括： i)从患有HCC的患者分离至少一个组织样品；和，ii)表征至少一个组织样品以鉴定HCC的至少一个特征；其中所述特征允许确定HCC患者的可能预后。 

提供下列实施例以举例说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应当解释为将本公开内容限定于所述的具体特征或实施方案。 

实施例 

下文中的实施例描述了HCC的性别依赖性微RNA特征谱和其在存活预后和治疗结果中的预测价值的分析。为了进行此类研究，分析两个独立的总共379个HCC患者的组群。第一组群是鉴定潜在的与HCC关联的微RNA的测试组群。第二组群(验证组群)用于确认获自测试组群的结果。通过使用该策略，将miR-26的成员鉴定为性别相关微RNA，因为它们在女性肝组织中更丰富地表达。此外，无论性别如何，与它们的配对的非癌性组织相比较，miR-26家族成员的表达水平在HCC肿瘤样品组中被显著下调。具有减少的miR-26表达的肿瘤具有独特的基因表达特征谱，并且具有低miR-26表达的病例与不良存活预后关联。下文中描述的数据表明，miR-26可用作肿瘤抑制剂并且具有miR-26沉默的肿瘤在生物学上可能是独特的。 

实施例I：材料、方法和患者特征 

临床样本 

在知情同意的情况下，从在Liver Cancer Institute of FudanUniversity，Shanghai(376个病例)和在University of Hong KongMedical Centre，Hong Kong(79个病例)，China(4)经历根治性切除术的455个HCC患者获得获得肿瘤(T)和周围非肿瘤肝组织(NT)的快速冷冻或石蜡包埋的样品。研究由相应研究所的伦理审查委员会批准。从8个无疾病肝供者(24)获得正常肝组织样品混合物。将之前描述的241个HCC病例的组群(组群1：测试组群)和可获得的微RNA微阵列数据(22)用于搜索与性别和存活关联的微RNA。其中，17个丢失了miR-26 表达的数据，9个丢失了存活的数据，剩下224个病例用于miR-26表达分析以及217个病例用于存活分析。通过定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)，将用于评估辅助IFN治疗的来自前瞻性随机对照试验(RCT)(组群2：验证组群和IFN测试组群)(3)的HCC病例(n＝135)用作独立验证组群。在组群2当中，6个丢失了miR-26表达的数据以及12个丢失了存活的数据，剩下129个病例(60个对照，69个IFN病例)用于miR-26表达分析以及118个病例(59个对照，59个IFN病例)用于存活分析。来自另一个前瞻性RCT(组群3：IFN验证组群)的剩下的79个HCC病例(40个对照，39个IFN病例)用于验证miR-26与干扰素治疗之间的关联(4)。另外的方法详细地描述于补充的附录中。 

患者的特征 

研究包括由来自Liver Cancer Institute in Shanghai(表1)的376个患者组成的两个独立组群和来自University of Hong Kong的另外的IFN验证组群(图4-补充的表1)，其全都具有组织学上确认的HCC并且大部分(90.5％)是乙型肝炎病毒(HBV)慢性携带者。组群1由241个患者组成，而组群2由135个参与干扰素治疗的前瞻性RCT的患者组成(3)。组群3由来自另一个干扰素治疗的前瞻性RCT的79个HCC患者组成(4)。所有患者接受治愈目的的肝切除术。大部分患者是男性(85.1％)，具有肝硬化(88.1％)，升高的血清AFP(62.2％)和孤立性呈现(solitary presentation)(84.4％)。除了血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平、TNM分期和辅助治疗外，临床变量在测试组群与验证组群之间是相似的。这些HBV相关HCC患者中的肝炎活性，如通过ALT水平显示的，在组群2的病例中比在组群1或组群3中显著更低，并且在组群2中发现更多早期HCC病例。此外，组群1中的39个患者接受预防性辅助治疗，但应答显示为最低(p＝0.9；时序检验)。相反地，组群2中53.3％的患者和组群3中49.4％的患者接受“旨在治愈”的IFN辅助治疗，所述治疗提高了总体存活(3；4)。 

性别相关微RNA和临床结果 

为了搜索在男性与女性肝样品之间差异表达的微RNA，我们全局性分析了来自组群1的241个病例的微RNA表达特征谱，其中肿瘤(T)和非肿瘤(NT)微RNA阵列数据是可获得的(GEO登录号，GSE6857)(22)。为了避免潜在的混淆因素，将年龄匹配和平衡的病例组用于鉴定性别依赖性微RNA，所述病例组包括所有女性病例(n＝30)和两个年龄匹配的男性组(即G1(n＝31)和G2(n＝31))。女性病例和男性G1或G2病例的临床特征是相似的(图4C-补充的表2)。 

种类比较分析显示，15个(女性对男性G1)或45个(女性对男性G2)微RNA在NT组织中差异表达，其中7个重叠。相反地，在肿瘤中只发现一个重叠的微RNA，miR-129-2(图6A-补充的表3)。因此，与肿瘤相比较，微RNA的表达在肝微环境中具有更一致的差异。 

在重叠的微RNA中，选择miR-26a-1用于进一步分析，因为其水平在两个性别之间最显著不同，并且是最丰富的。对组群1的病例的分析显示，miR-26a-1水平在女性肝中比在男性中显著更高(图1A)。 

使用qRT-PCR，根据成熟miR-26在女性病例(n＝26)和年龄匹配的男性病例(n＝56)中的表达来对其进行验证(图1B)。 

然后本发明者在本文中详尽论述，miR-26可用作性别依赖性肿瘤抑制基因，并且假如这样的话，miR-26的沉默将是肿瘤中的频繁事件。分析显示，当二分224个HCC病例(基于肿瘤中miR-26a-1的中值水平，二分为低或高miR-26)时，只在低miR-26病例(p＜0.001)中但未在高miR-26病例(p＝0.23)中观察到miR-26a-1在T样品中的显著减少(与NT样品相比较)(图1C)。 

平均倍数变化(T/NT的比率)在低miR-26a-1病例中为0.37，而在高miR-26a-1病例中为0.98，这表明miR-26的沉默只与低miR-26病例相关。此外，低miR-26病例与不良存活相关联(图1D)。 

在人中，存在3个miR-26成员，即miR-26a-1、miR-26a-2和miR-26b。此类微RNA在进化上高度保守，26a-1和26a-2共有相同的成熟序列，这表明它们的功能冗余。所有3个miR-26成员的表达模式 以及它们与存活的关联相似(图7)。 

本发明者现于本文中显示，miR-26成员在女性肝中更丰富地表达，并且其沉默在具有不良结果的HCC亚组的发展中可能是非常重要的。 

独特的基因表达模式与低miR-26HCC相关联 

为了测试低miR-26HCC是否是生物学上不同的，本发明者在本文中分析了224个匹配的HCC病例(具有可获得的微RNA和mRNA微阵列数据)。mRNA微阵列数据基于大约21,000个mRNA基因的表达(GEO登录号，GSE5975)(27)。基于所有基因的前3个主要组分的多维标度分析显示，根据3个miR-26的二分表达状态(图8)，大多数低miR-26病例与高miR-26病例分开聚簇(图2A)。 

种类比较分析显示，大量基因的表达在低与高miR-26组之间的肿瘤中不同，并且915个基因是共同的(图2B)。 

SLC2A6和S100P选自差异表达的基因，用于通过qRT-PCR进行验证(图9)。 

此外，多变量分类预测分析产生具有80.3％的总准确度的低miR-26病例的有效分类预测。因此，低miR-26HCC病例与高miR-26 HCC病例相比较在其基因表达模式上是不同的。 

在915个重叠的基因中，770个在低miR-26HCC中过表达。使用这770个基因的基因网络分析显示一系列具有高评分(＞10)的假定的肿瘤发生网络(图6B-表4)。 

检查不同分类中的富集的基因显示几个重要的信号转导网络，其中最令人吃惊的信号转导网络显示，NFκB/IL-6信号转导途径在低miR-26病例中显著激活(图2C)。 

我们利用qRT-PCR测量NFκB靶基因IL-6的水平，因为其与HCC和HCC性别差异相关。大多数具有降低的miR-26水平的HCC病例具有相伴的IL-6表达的提高(图10)。综合起来，这些数据显示，低miR-26HCC具有独特的基因特征谱。 

使用独立的组群进行的验证 

为了验证性别依赖性miR-26与存活的关联，我们利用qRT-PCR检测来自组群2的T和NT组织中的成熟miR-26。当IFN辅助治疗改变存活结果时，我们分析对照组。与组群1相符，miR-26表达在女性NT组织中更丰富但无论性别如何，在肿瘤中都观察到显著的降低(图11)。 

此外，肿瘤中低miR-26表达与不良患者存活显著相关(图3A，图12A)。 

另一个独立组群(组群3)显示一致的结果(图3B，图12B)。 

将Cox比例危险回归分析用于进一步评估miR-26的表达与组群2中对照的预后的关联(表2)。 

在单变量分析中，低miR-26a肿瘤表达和TNM分期与预后显著相关。最终的多变量模型显示，肿瘤中低miR-26a表达是不良存活的独立预测物。对于miR-26b发现类似的趋势。因此，二分的miR-26表达值是预后的独立预测物。 

miR-26表达和治疗结果 

低miR-26HCC显示在生物学上在基因富集方面不同，所述基因在功能上与免疫生物学关联，包括NFκB/IL-6途径中的基因。然而不希望受理论束缚，本发明者现于本文中相信，这样的肿瘤可能在其对细胞因子介导的活性的应答中是“成瘾的”。因为组群2由用IFN治疗的病例组成，所以本发明者分析miR-26表达与治疗结果之间的关联。 

当与对照组的总体存活相比较时，在肿瘤中具有低miR-26a表达的患者在接受IFN辅助治疗后具有显著改善的总体存活(p＝0.003)(图3C)，这在组群3中得到验证(图3D)。 

相反地，来自两个组群的具有高miR-26a表达的患者对IFN不应答(图3E-3F)。 

对于miR-26b表达获得相似的结果(图12C-12F)。Cox比例危险回 归分析用于评估治疗对组群2的低miR-26组的存活的影响(图5B-表3)。 

在单变量和多变量分析中，IFN治疗与低miR-26组中显著改善的存活相关联。miR-26表达、IFN治疗与存活之间的相互作用的分析也显示，miR-26的表达显著影响这两个组群中IFN相关的存活结果(miR-26a，p＝0.004；miR-26b，p＝0.02)。因此，miR-26是IFN应答的独立预测物。 

讨论 

这是迄今为止使用3个独立组群分析HBV相关HCC中的性别依赖性微RNA特征谱和它们在存活预后和治疗结果中的预测价值的最大研究。 

本发明者在本文中未显示，miR-26在女性肝组织中更丰富地表达，但无论性别如何，其表达在HCC亚组中显著下调(与它们配对的非癌性组织相比)。这些结果表明miR-26是性别和肿瘤相关性微RNA。 

此外，具有减少的miR-26表达的肿瘤具有独特的基因表达特征谱，并且具有低miR-26表达的病例具有不良预后，但对IFN治疗有利地作出响应。 

这些结果显示miR-26可以是肿瘤抑制剂。肝细胞中miR-26的沉默可促成男性在侵袭性HCC的发展中占主体。下列发现与本发明者的上述假说相符：(1)miR-26在女性肝中以更高的水平表达，其中推测存在更抗癌的活性；(2)miR-26表达在具有不良存活的HCC亚组中被沉默；(3)低miR-26HCC中被激活的基因选择性地富集在NFκB/IL-6信号转导途径中。(4)miR-26在肝细胞和永生化/非转化的肝细胞中比在HCC细胞和PBMC中更丰富地表达(图13)。 

最近发现肝癌的性别差异归因于小鼠中NF-κB对MyD8依赖性IL-6诱导的性别差异(13)。吸引人地，雌激素抑制IL-6启动子活性，这可在女性中促成减少的对HCC的易感性。 

这些现象与此类发现相一致，因为IL-6表达与miR-26成负相关。 此外，在低miR-26 HCC中被激活的许多基因可用于诱导孕酮，但抑制雌激素信号转导(网络5和15，图6B-补充的表4)。有趣地，miR-26表达与肝生长因子(HGF)(HCC中另一个重要的因子)无关(图14)。 

本发明者在本文中的分析显示，miR-26是存活的独立预测物。然而，当对IFN治疗的治疗结果分类时，在两个独立的前瞻性RCT中，只有在肿瘤中具有低miR-26表达的患者有利地对IFN治疗作出响应。 

这些结果表明，肿瘤中miR-26的状态在HCC患者预后中和在帮助选择可从IFN辅助治疗受益以防止复发的适当的HCC患者中是有用的临床工具。 

目前，复发相关死亡率是接受手术的HCC患者的重大临床问题，并且在辅助治疗时不能获得单一试剂作为标准护理。令人鼓舞地，Clavien在7个RCT中在肝切除或肿瘤消除后评估IFN的辅助效果并且发现，所有这些试验都显示适度的有益效果，但明显地需要改善(5)。此外，在多种实验试剂当中，只对索拉非尼观察到适度的存活有益性(6)。目前的系统性治疗剂的较差的功效可能因不能选择可最有利地对特定HCC治疗作出响应的患者亚群而引起。 

这些结果首次为该问题提供了解决办法。本文中描述的结果现已导致“历史”试剂即I FN的再发现，其常规适度的治疗有益性现可变成具有巨大效能的试剂。 

由于miR-26预测物的稳健性(robustness)，IFN可用作接受切除术和患有具有减少的miR-26表达的肿瘤的HCC患者的一线疗法，其需要在前瞻性研究中进行评估。应注意，此处提供的研究主要来自HBV阳性(大约90％)中国HCC患者，从而将需要在非亚洲人HCC和源于其他基础肝疾病例如丙型肝炎和/或酒精性肝炎的HCC中进行评估。 

虽然低miR-26HCC病例对IFN治疗的敏感性背后的机制目前还不清楚，但本发明者在本文中相信，这些HCC代表了具有IFN应答信号转导途径的特异性激活的独特类型的肿瘤。相符合地，低miR-26 HCC与高miR-26 HCC截然不同并且具有不良存活预后。低miR-26 HCC中许多过表达的基因与细胞免疫相关，例如编码促炎和抗炎细胞因子的 基因(即，IL-1、IL-2、IL-10和IL-17)。 

此外，在低miR-26 HCC中被激活的许多信号转导网络是免疫相关的，例如NFκB/IL-6、IL-10、STAT3和IFN可诱导因子信号转导网络。 

再次地，不希望受理论束缚，本发明者在本文中相信，具有低miR-26表达的肿瘤可具有独特的IFN信号转导激活(潜在地通过NFκB/IL-6信号转导途径)，从而可对经由IL-6/STAT3信号转导的IFN介导的生长抑制敏感(29)。 

现已在本文中描述了来源于HCC患者的男性与女性肝组织之间的微RNA表达模式的系统性差异的鉴定。具有减少的miR-26表达的肿瘤在生物学上是显著不同的，具有不良的存活结果，但有利地对辅助IFN治疗作出响应。这些数据表明，miR-26是HCC的有用的诊断和预后生物标志物并且可帮助选择可从辅助IFN治疗显著受益的患者。 

实施例II：RNA分离和实时qRT-PCR分析 

使用标准TRIZOL(Invitrogen，Carlsbad，CA)法从组群1的冷冻组织，以及使用Master Pure RNA Purification试剂盒(Epicenter，Madison，WI)从组群2和组群3的石蜡包埋的组织提取总RNA。在逆转录后使用特异于miR-26a和miR-26b的Taqman MicroRNA Assays(Applied biosystems，Foster City，CA)测量成熟微RNA的表达。在各组群内进行层间(性别，miR等)的所有比较。将用于U6 RNA的Taqman MicroRNA Assay用于标准化微RNA的相对丰度。在使用HighCapacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)逆转录后使用特异于IL基因的Taqman Gene Assay测量IL-6的表达。将用于18s的Taqman Gene Assay用于标准化mRNA的相对丰度。以一式三份进行实验。 

微阵列分析和统计学 

为了进行微RNA微阵列特征谱分析，使用之前描述的单通道阵列平台(22)分别分析肿瘤和配对的非肿瘤组织的特征谱。基本上如之 前所述(22)进行阵列质量控制、数据预处理和标准化。将BRB-ArrayTools软件3.6.0(http://linus.nci.nih.gov)用于微阵列分析，如之前所描述的(25；26)。从分析中排除在超过50％的阵列中丢失值的微RNA探针和低于20％的表达数据值在任一方向上与探针的中值相比较具有至少1.5倍的变化的微RNA探针，这导致剩下624个探针。将使用t-统计的种类比较分析用于鉴定在男性与女性之间在肿瘤或周围非癌性组织中差异表达的微RNA。 

为了进行该分析，将单变量检验的初始显著性阈值设置为p＜0.05，并且分析基于多变量检验的1000个排列以产生控制错误发现率的全局测试的排列p值。为了进行mRNA表达微阵列特征谱分析，本发明者使用他们之前可获得的基于双通道平台(即，T/NT的比率)(27)的寡核苷酸阵列(oligoarray)数据集，所述数据集包括与具有上述可获得的微RNA微阵列数据的病例匹配的224个病例。本发明者使用肿瘤中的中值表达来二分HCC病例，其中低miR-26表达分类为低于第50百分位数，高miR-26表达被分类为高于第50百分位数。将基于二分的miR-26表达水平的种类比较分析用于鉴定低miR-26与高miR-26HCC之间差异表达的mRNA。相同探针过滤标准按照上述的标准，剩下11,580个表达探针用于此类比较。 

还将6个种类预测算法(即支持向量机(SVM)、混合协变量分类器(CCP)、对角线线性判别(DLD)、1-最近的相邻者(1NN)、3-最近的相邻者(3NN)或最近邻质心分类器(NC))用于确定mRNA表达模式是否可准确地区分低miR-26HCC与高miR-26HCC。在此类分析中，随机选择90％的样品以建立随后用于预测剩余的10％的病例的分类器。在重复该随机分配过程1000次以控制错误发现的数目和比例后，计算预测的准确性。使用BRBarrayTool，利用中位数居中相关性(median-centeredcorrelation)和完全连锁(complete linkage)进行层次聚类分析(Hierarchical clustering)。通过使用无监督方法，我们还使用全部的组群1样品基于通过滤器的11,580个基因的前3个主要组分进行多维标度分析。将此类基因的表达水平进行对数转换，并且将欧几里 德距离(Euclidean distance)用于确定其位置。通过使用IngenuityPathways Analysis( www.ingenuity.com)，将基因网络分析用于鉴定信号转导途径，所述信号转导途径对于在低miR-26HCC与高miR-26 HCC之间在肿瘤中差异表达的基因是富集的。 

通过使用GraphPad Prism软件5.0(GraphPad Software，SanDiego，CA)，利用通过Cox-Mantel时序检验产生的统计P值，将Kaplan-Meier存活分析用于比较患者的存活(基于二分的miR-26表达)。使用STATA 9.2(College Station，TX)，将Cox比例危险回归分析用于分析临床变量对患者存活的影响。使用单变量检验检查各临床变量对存活的影响。通过考虑与存活显著相关的(显著性设置为p＜0.05)来自单变量分析的临床变量，进行多变量分析。估量协变量的多重共线性并且未发现存在多重共线性。在最终的模型中，性别，由于其在HCC结果中的生物学相关性和其与miR-26表达的关联，被包括为协变量。经确定最终的模型满足比例危险假设。对于RT-PCR数据，使用GraphPad Prism软件5.0计算学生氏t检验产生的统计学P值和斯皮尔曼相关常数。将统计显著性确定为p＜0.05。本文中所有p值都是双侧的。 

实施例III：治疗在HCC肿瘤样品中展示低miR-26表达的患者的HCC的方法 

本实施例描述了选择和治疗HCC患者的方法，所述患者可能具有对作为辅助疗法的IFN-α治疗的有利应答。 

对于一些HCC患者，辅助治疗例如IFN-α治疗可延长存活(Sun等人，J.Cancer Res.Clin.Oncol.132(7)：458-465，2006)。然而，在开始治疗之前鉴定最可能从IFN-α辅助治疗受益的患者是有益的。 

现已在本文中公开，与对照(例如获自相同患者的非癌性肝组织)相比，在HCC肿瘤样品中表达低水平的miR-26的HCC患者的预后在用IFN-α治疗后显著改善。相反地，在肿瘤样品中表达高水平的miR-26 的患者在IFN-α治疗后不展示存活的显著增加，从而不是此类辅助治疗的良好候选者。 

经诊断患有HCC的患者首先经历肝切除术以期治愈。从取自患者的肝组织的部分获得HCC肿瘤和非癌性组织样品。然后使用本领域内熟知的用于提取小RNA的任何适当的方法，例如通过使用TRIZOL^TM，从组织样品分离RNA。然后使用特异于miR-26的引物将纯化的RNA经历RT-PCR以测定肿瘤和非癌性组织中miR-26的表达水平。如果miR-26的表达在肿瘤组织中相对于非癌性组织低至少1.5倍，那么患者是IFN-α辅助治疗的候选者。 

因此，按照本领域内已知的方法(参见，例如，Sun等人，J.CancerRes.Clin.Oncol.132(7)：458-465，2006；Qian等人，Cancer 107(7)：1562-1569，2006，两者都通过引用合并入本文)使用治疗有效量的IFN-α治疗患者。IFN-α的剂量和给药方案将取决于许多因素，例如患者的健康状况和HCC的分期。通常，每周施用IFN-α1至3次，进行多至大约6个月。 

实施例IV：用于具有低miR-26表达的HCC患者的可选择的治疗方法 

本实施例描述了在肝切除术不存在的情况下用干扰素疗法治疗经诊断患有HCC并且展示低miR-26表达的患者的方法。为了确定经诊断患有HCC的患者是否是IFN-α治疗的良好候选者，从未曾经历肝切除术的患者获得HCC肿瘤样品以及非癌性肝组织样品。可按照本领域内已知的任何方法获得组织样品。例如，可通过进行活组织检查，使用皮下注射针取出期望的组织来获得组织样品。 

然后使用本领域内熟知的用于提取小RNA的任何适当的方法，例如通过使用TRIZOL^TM，从组织样品分离RNA。然后使用特异于miR-26的引物将纯化的RNA经历RT-PCR以测定肿瘤和非癌性组织中miR-26的表达水平。如果miR-26的表达在肿瘤组织中相对于非癌性组织低至少1.5倍，那么患者是IFN-α治疗的候选者。 

因此，按照本领域内已知的方法(参见，例如，Sun等人，J.CancerRes.Clin.Oncol.132(7)：458-465，2006；Qian等人，Cancer 107(7)：1562-1569，2006，两者都通过引用合并入本文)使用治疗有效量的IFN-α治疗患者。IFN-α的剂量和给药方案将取决于许多因素，例如患者的健康状况和HCC的分期。通常，每周施用IFN-α1至3次，进行多至大约6个月。 

实施例V：用于治疗在HCC肿瘤样品中展示高miR-26表达的患者的HCC的方法 

本实施例描述了治疗经诊断患有HCC的患者(患者在HCC肿瘤中展示高水平的miR-26表达)的方法。 

经诊断患有HCC的患者首先经历肝切除术以期治愈。HCC肿瘤和非癌性组织样品获自从患者取出的肝组织的部分。然后使用本领域内熟知的用于提取小RNA的任何适当的方法，例如通过使用TRIZOL^TM，从组织样品分离RNA。然后使用特异于miR-26的引物将纯化的RNA经历RT-PCR以测定肿瘤和非癌性组织中miR-26的表达水平。如果miR-26的表达在肿瘤组织中相对于非癌性组织没有低至少1.5倍，那么患者不太可能对IFN-α辅助治疗作出有利的响应。因此，患者不接受IFN-α治疗，而是就疾病复发的术后体征对其进行监控。 

实施例VI：诊断HCC患者的方法 

在一个特定的方面，本文中提供了诊断受试者是否患有肝细胞癌(HCC)或处于发展所述疾病的风险中的方法。该方法通常包括测量来自受试者的测试样品中至少一个miR基因产物的水平，以及确定相对于对照样品中相应miR基因产物的水平，测试样品中miR基因产物的水平的变化是否表示受试者患有HCC或处于发展HCC的风险中。在某些实施方案中，使用Northern印迹分析测量至少一个miR基因产物的水平。此外，在某些实施方案中，测试样品中至少一个miR基因产物的水平低于对照样品中相应miR基因产物的水平，和/或测试样品中至少 一个miR基因产物的水平高于对照样品中相应miR基因产物的水平。 

实施例VII：测量miR基因产物 

可这样测量至少一个miR基因产物的水平：逆转录来自从受试者获得的测试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；和将测试样品的杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较。至少一个miRNA的信号的变化表示受试者患有HCC或处于发展其的风险中。 

实施例VIII：诊断和治疗性应用 

在另一个方面，本文中提供了治疗受试者的HCC的方法，其中至少一个miRNA的信号相对于从对照样品产生的信号失调(例如，下调和/或上调)。 

本文中还提供了诊断受试者是否患有与受试者中的一个或多个不利预后标志物相关联的HCC或处于发展所述疾病的风险中的方法，所述方法包括逆转录来自从受试者获得的测试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；和将测试样品的杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较。信号的改变表示受试者患有癌症或处于发展所述癌症的风险中。 

本文中还提供了治疗患有HCC的受试者的HCC的方法，在所述HCC中至少一个miR基因产物在受试者的癌细胞中相对于对照细胞下调或上调。当一个或多个miR基因产物在癌细胞中被下调时，该方法包括给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，以便受试者中癌细胞的增殖被抑制。当一个或多个miR基因产物在癌细胞中被上调时，该方法包括给受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一个miR基因产物的表达的化合物，以便受试者中癌细胞的增殖被抑制。 

本文中还提供了治疗受试者的HCC的方法，其包括：测定HCC细 胞中相对于对照细胞至少一个miR基因产物的量；和，通过下列改变HCC细胞中表达的miR基因产物的量，以便受试者中癌细胞的增殖被抑制：给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物(如果癌细胞中表达的所述miR基因产物的量低于对照细胞中表达的所述miR基因产物的量)；或给受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一个miR基因产物的表达的化合物(如果癌细胞中表达的所述miR基因产物的量大于对照细胞中表达的所述miR基因产物的量)。 

实施例IX：组合物 

本文中还提供了用于治疗HCC的药物组合物，其包含至少一个分离的miR基因产物和药学上可接受的载体。在特定的实施方案中，药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物，其相应于相对于适当的对照细胞在HCC细胞中下调的miR基因产物。在某些实施方案中，所述miR基因产物包括SEQ ID NO：1-5中的一个或多个。 

在另一个特定的实施方案中，药物组合物包含至少一种miR表达调节剂(例如，抑制剂)化合物和药学上可接受的载体。 

本文中还提供了药物组合物，所述药物组合物包含至少一种miR表达调节剂化合物，其特异于相对于适当的对照细胞在HCC细胞中被上调或下调的miR基因产物。 

本文中还提供了鉴定抗HCC剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂并且测量至少一种与HCC细胞中减少的表达水平相关的miR基因产物的水平，其中相对于适当的对照细胞，细胞中所述miR基因产物的水平的增加表示测试试剂是抗HCC试剂。在某些实施方案中，所述miR基因产物包括SEQ ID NO：1-5中的一个或多个。 

本文中还提供了鉴定抗HCC试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂并且测量至少一种与HCC细胞中增加的表达水平相关的miR基因产物的水平，其中相对于适当的对照细胞，细胞中所述miR基因产物的水平的降低表示测试试剂是抗HCC试剂。 

实施例X：试剂盒 

可将本文中描述的任何组合物包括在试剂盒中。在非限定性实例中，将用于分离miRNA、标记miRNA和/或使用阵列评估miRNA群体的试剂包括在试剂盒中。试剂盒还可包括用于产生或合成miRNA探针的试剂。因此试剂盒将在适当的容器装置中包含用于通过掺入标记的核苷酸或未标记的核苷酸(其随后被标记)标记miRNA的酶。其还可包括一种或多种缓冲剂例如反应缓冲剂、标记缓冲剂、清洗缓冲剂或杂交缓冲剂、用于制备miRNA探针的化合物和用于分离miRNA的组分。其他试剂盒可包括制备包含与miRNA互补的寡核苷酸的核酸阵列的组分，从而可包括例如固体支持物。 

对于任何试剂盒实施方案，包括阵列，可存在包含与SEQ IN NO：1-5的任一个的全部或部分同一或互补的序列的核酸分子。 

可以在水性介质中或以冻干的形式包装试剂盒的组分。试剂盒的容器装置通常可包括至少一个可将组分置于(优选适当地等分入)其中的小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置。在试剂盒中存在1个以上的组分的情况下(可将标记试剂和标记物包装在一起)，试剂盒还通常包含可将另外的组分分开地置于其中的第二、第三或其他另外的容器。然而，可将组分的各种组合包含在小瓶中。本发明的试剂盒通常还包括用于包含核酸的装置和密封以用于商业销售的任何其他试剂容器。此类容器可包括注射或吹塑塑料容器，在所述容器中容纳期望的小瓶。 

当在一个和/或多个液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液是水溶液，且无菌水溶液是一个优选的溶液。可包括在试剂盒中的其他溶液是参与从混合样品分离和/或富集miRNA的溶液。 

然而，试剂盒的组分可以以干燥粉剂的形式提供。当试剂和/或组分以干燥粉剂提供时，可通过加入适当的溶剂来重构粉剂。预期还可在另一个容器装置中提供溶剂。试剂盒还可包括促进标记的miRNA的分离的组分。其还可包括保存或维持miRNA或保护其免受降解的组分。组分可以是不含RNA酶的或保护以抵抗RNA酶降解。 

此外，试剂盒通常还可在适当的装置中包括用于各单独的试剂或溶剂的不同容器。试剂盒还可包括使用试剂盒组分以及使用未包括在试剂盒中的任何其他试剂的说明书。说明书可包括可应用的变型。预期此类试剂是本发明的试剂盒的实施方案。此外，试剂盒不限于上文描述的特定项并且可包括用于操作或表征miRNA的任何试剂。 

还预期，在miRNA阵列的背景中论述的任何实施方案可更常见地用于筛选或表征本发明的方法或试剂盒。换句话说，描述什么可包括在特定阵列中的任何实施方案可更常见地在miRNA表征的背景中实施并且不必包括阵列本身。 

还预期，任何试剂盒、阵列或其他检测技术或工具或任何方法可包括表征任何此类miRNA。此外，预期可在本发明的方法中使用或不使用阵列形式来实施miRNA阵列的背景中论述的任何实施方案；换句话说，可根据对于本领域技术人员来说是已知的任何技术，在本发明的任何方法中筛选或评估miRNA阵列中的任何miRNA。阵列形式不是实施筛选和诊断方法所必需的。 

本发明者在本文中预期，使用miRNA阵列的试剂盒可用于治疗、预后或诊断应用和此类用途。试剂盒可包括miRNA阵列以及关于用于微阵列上的miRNA的标准或标准化的miRNA特征谱的信息。此外，在某些实施方案中，对照RNA或DNA可包括在试剂盒中。对照RNA可以是可用作阳性对照用于标记和/或阵列分析的miRNA。 

已在本文中广泛和一般性地描述了本教导的方法和试剂盒。落在一般公开内容中的每一个更窄的类别和亚属分组也形成了本教导的一部分。这包括从一般公开内容除去任何主题的本教导的一般描述，无论去除的材料是否明确地在本文中引用。 

实施例XI：阵列制备和筛选 

本文中还提供了miRNA阵列的制备和用途，所述阵列是核酸分子(探针)的有序宏阵列(macroarray)或微阵列，所述核酸分子与众多miRNA分子或前体miRNA分子完全或几乎完全互补或同一并且以空 间上分离的组织形式置于支持材料上。宏阵列通常是已将探针点样于其上的硝酸纤维素片或尼龙片。微阵列更密集地放置核酸探针，以便可将多至10,000个核酸分子置于通常1至4平方厘米的区域。 

可通过将核酸分子例如基因、寡核苷酸等点样至基质上或在基质上原位制备寡核苷酸序列来制作微阵列。可以以多至每平方厘米大约30个非同一的核酸分子或更高例如多至每平方厘米大约100或甚至1000个非同一的核酸分子的高密度矩阵模式应用点样的或制备的核酸分子。微阵列通常使用包被的玻璃作为固体支持物，与过滤阵列(filter arrays)的基于硝酸纤维素的材料不同。通过具有miRNA-互补核酸样品的有序阵列，可追踪各样品的位置并且将其与原始样品相联系。 

其中将多种不同的核酸探针与固体支持物的表面稳定地缔合的多种不同阵列装置对于本领域技术人员来说是已知的。用于阵列的有用的基质包括尼龙、玻璃和硅。阵列可以以许多不同方式变化，包括平均探针长度、探针的序列或类型、探针与阵列表面之间的键的性质，例如共价或非共价的等。本文中描述的标记和筛选方法以及阵列在其应用上在任何参数方面不受限制，除了探针检测miRNA外；因此，可将方法和组合物与多种不同类型的miRNA阵列一起使用。 

鉴于可将本发明的原理应用于许多可能的实施方案，应当承认举例说明的实施方案只是本发明的优选实施例并且不应当看作是对本发明的范围的限制。相反，本发明的范围由下列权利要求限定。因此，我们要求保护落在这些权利要求的范围和精神内的全部方案作为我们的发明。 

参考文献 

上述参考文献和下列参考文献明确地通过引用合并入本文，并达到这样的程度，它们提供示例性方法或补充本文中所示的内容的其他详细内容。 

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Claims (32)

1.用于检测miR-26的表达水平的试剂在制备用于预测经诊断患有肝细胞癌(HCC)的患者的临床结果的组合物中的用途，其中所述组合物用于检测获自所述患者的HCC肿瘤样品中miR-26的表达水平，其中相对于对照，肿瘤样品中miR-26的表达水平减少1.5倍或更多预示着对干扰素(IFN)-α治疗的有利应答，

其中所述对照选自，获自所述患者的非癌性组织样品或者来自健康受试者的肝样品，

其中所述临床结果是对干扰素治疗的有利应答。

2.权利要求1的用途，其中miR-26是miR-26a-1、miR-26a-2、miR-26b或其组合。

3.权利要求1的用途，其中所述对照是获自所述患者的非癌性组织样品。

4.权利要求1的用途，其中所述对照是来自健康受试者的肝样品。

5.权利要求1的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少2倍。

6.权利要求1的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少2.5倍。

7.权利要求1的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少3倍。

8.权利要求1的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少3.5倍。

9.权利要求1的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少4倍。

10.用于检测miR-26的表达水平的试剂在制备用于选择经诊断患有HCC的患者作为IFN-α治疗的候选者的组合物中的用途，其中所述组合物用于检测获自患者的HCC肿瘤样品中miR-26的表达水平，其中相对于对照，肿瘤样品中miR-26的表达水平减少1.5倍或更多表示所述患者是IFN-α治疗的候选者；其中所述对照选自，获自所述患者的非癌性组织样品或者来自健康受试者的肝样品。

11.权利要求10的用途，其中miR-26是miR-26a-1、miR-26a-2、miR-26b、miR-26a-1的前体、miR-26a-2的前体、miR-26b的前体或其组合。

12.权利要求10的用途，其中所述对照是获自所述患者的非癌性组织样品。

13.权利要求10的用途，其中所述对照是来自健康受试者的肝样品。

14.权利要求10的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少2倍。

15.权利要求10的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少2.5倍。

16.权利要求10的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少3倍。

17.权利要求10的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少3.5倍。

18.权利要求10的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少4倍。

19.权利要求2的用途，其中所述对照是获自所述患者的非癌性组织样品。

20.权利要求2的用途，其中所述对照是来自健康受试者的肝样品。

21.权利要求2的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少2倍。

22.权利要求2的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少2.5倍。

23.权利要求2的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少3倍。

24.权利要求2的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少3.5倍。

25.权利要求2的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少4倍。

26.权利要求11的用途，其中所述对照是获自所述患者的非癌性组织样品。

27.权利要求11的用途，其中所述对照是来自健康受试者的肝样品。

28.权利要求11的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少2倍。

29.权利要求11的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少2.5倍。

30.权利要求11的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少3倍。

31.权利要求11的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少3.5倍。

32.权利要求11的用途，其中肿瘤样品中miR-26的表达减少至少4倍。