JPH08502889A - 前立腺癌の微小転移を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明により、患者の血液からＲＮＡを単離し、前立腺特異抗原遺伝子の領域に相補的な一組のプライマーを用いて増幅することによる、前立腺転移の診断の方法を提供する。増幅されたＲＮＡの存否が検出され、増幅されたＲＮＡの存在は前立腺癌の微小転移を意味する。

Description

【発明の詳細な説明】 前立腺癌の微小転移を検出する方法発明の分野 本発明は前立腺癌を検出する方法に関する。発明の背景 前立腺癌は今年、３０，０００人以上のアメリカ人の命を奪うだろう。Ｂｏｒ ｉｎｇら，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １９９１，１９．しかし、転 移（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）の様式はまだほとんど分かっていない。転移 のほぼ教義的な観点から見ると、前立腺癌細胞はまず前立腺被膜を通り、次にリ ンパ管へと広がっていき、最後には血流により骨へと移動すると考えられている 。Ｂｙａｒら，Ｃａｎｃｅｒ １９７２，３０，５； Ｗｉｎｔｅｒ，Ｃ．Ｃ． ，Ｓｕｒｇ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．１９５７，１０５，１３６； Ｈ ｉｌａｒｉｓら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ．１９７４，１２１，８３２ ； ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１９７６，１１５，８９； Ｊａ ｃｏｂｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｕｒｏｌｏｇｙ １９８３，２１，３３７； Ｂａｔｓｏ ｎ，Ｏ．Ｖ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．１９４０，１１２，１３８； Ｓａｉｔｏｈ ら，Ｃａｎｃｅｒ １９８４，５４，３０７８−３０８４； Ｗｈｉｔｍｏｒｅ ，Ｗ．Ｆ．，Ｊｒ．，Ｃａｎｃｅｒ １９７３，３２，１１０４。しかし、この モデルはかなりの制限をもつ組織病理学的研究に基づいており、そして現状では 転移が起こる一連の順序は未知のままである。固形腫瘍動物実験は、循環してい る癌細胞の０．０１％のみが最終的にひとつの転移性沈着物を形成することを示 唆している。Ｆｉｄｌｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８２，２１７，９９８−１ ００１； Ｌｉｏｔｔａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９７４，３４，９９７； Ｓｃｉｒｒｍａｃｈｅｒ，Ｂ，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８５，４３ ，１−３２．建前上はヒト前立腺癌（ＰＡＣ）由来のひとつの骨転移は、１０， ０００の循環癌細胞（２細胞／１ｍｌの血液）によって造ら れ得る。過去には、このような低濃度の細胞の検出は困難であるかまたは不可能 であった。しかし近年、Ｗｕらは患者のリンパ節および骨髄への乳癌の微小転移 を検出するためにケラチン−１９（Ｋ−１９）ｍＲＮＡ ＰＣＲを用いた。Ｗｕ ら，Ｌａｂ．Ｉｎｖ．１９９０，６２、１０９Ａ．Ｍｉｙｏｍｕｒａらもフィラ デルフィア染色体を有する患者の急性リンパ芽球白血病のわずかな痕跡のＰＣＲ により検出を報告している。Ｍｉｙｏｍｕｒａら，Ｂｌｏｏｄ １９９２，７９ 、１３６６−１３７０． 前立腺癌んの微小転移を検出する方法は非常に切望されている。発明の概要 本発明により、患者の血液からＲＮＡ標本を得て、複製連鎖反応（ＰＣＲ）に より該ＲＮＡを増幅する工程からなる、患者の前立腺癌微小転移を検出する方法 を提供する。複製連鎖反応は前立腺癌特異抗原の離れた領域に相補的な一組のプ ライマーを使用して行われる。これらのプライマーは、ＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＣ ＡＣＴＧＡＡＧＴＴ（配列番号１）及びＣＣＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣＧＡＴＴ ＣＣＴ（配列番号２）という配列をもっていてもよい。その後、増幅されたＲＮ Ａの存否が検出され、ここにおいて、増幅されたＲＮＡの存在は前立腺癌の微小 転移を意味する。図面の簡単な説明 図１は、２１４塩基対（ｂｐ）のバンドの存在により微小転移が示されている アガロースゲルを示す。発明の詳細な説明 本発明の方法により、患者の血液からＲＮＡ標本を得る工程を含む、患者の前 立腺癌の微小転移を検出する方法を提供する。好ましくは、ＲＮＡは、抹消静脈 血標本のような血液標本から得る。有核細胞を単離するために全血勾配を行って もよく、例えば、ＲＮａｚｏｌｅ Ｂ法（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ Ｉｎｃ．，Ｆｒｉ ｅｎｄｓｗｏｏｄ，Ｔｅｘａｓ）や、または当該技術分野において知られてい る、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に 記載の方法の修飾により全ＲＮＡが抽出される。 その後、複製連鎖反応を全抽出ＲＮＡに対して行ってもよい。好ましくは増幅 されるｍＲＮＡの量を測定する為に逆転写ＰＣＲ増幅法が行われてもよい。複製 連鎖反応は当該技術分野においてよく理解されている。Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ ，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．，Ｉｎｃ．Ｓ ａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ，１９９０．複製連鎖反応のプライマーは前立腺癌特異 抗原（ＰＳＡ）遺伝子の離れた領域に相補するように設計されていてもよい。Ｈ ｅｎｔｔｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ ｍ ．１９８９，１６０，９０３−９１０．離れた領域とは第１のプライマーがＰ ＳＡ遺伝子の３’領域に相補的であり、第２のプライマーがＰＳＡ遺伝子の５’ 領域に相補的であることを意味する。好ましくはプライマーは別個の、離れた領 域に相補的であり、かつ互いに相補的でない。 ＰＳＡは前立腺の上皮細胞により特異的に発現される重要なマーカーであり、 前立腺癌によりほぼ恒常的に発現されている。Ｓｔａｍｅｙら．，Ｊ．Ｕｒｏｌ ．１９８９，１４１，１０７６−１０８３．従って、ＰＳＡ２（５−ＧＡＧＧＴ ＣＣＡＣＡＣＡＣＴＧＡＡＧＴＴ，配列番号１）及びＰＳＡ３（５−ＣＣＴＣＣ ＴＧＡＡＧＡＡＴＣＧＡＴＴＣＣＴ，配列番号２）オリゴヌクレオチドプライマ ーは、ＰＳＡ遺伝子に対して高い相同性を有するように設計した。Ｇｅｎｅ Ｂ ａｎｋ ｖｅｒｓｉｏｎ−７０（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の検索か ら、これらのプライマーはＰＳＡに対しては特異性を示すが、ＰＳＡ遺伝子に高 い相同性を示すヒト腺性カリクレイン（ＨＭＧＫ）遺伝子には特異的でないこと が確認された。Ｈｅｎｔｔｕら．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ ｏｍｍ ，１９８９，１６０，９０３−９１０．ＲＳＡ２およびＰＳＡ３はＰＳＡ 遺伝子のイントロンIII中、ＰＣＲ増幅により３６０ｂｐのＤＮＡ及び２１４ｂ ｐのＲＮＡ産物が生じるように存在する配列に結合し、それによってＤＮＡのコ ンタミネーションから生じる偽陽性を除外できる。オリゴヌクレオチドプライ マーは当該技術分野において知られている、標準的なホスホアミダイト化学のよ うな方法によって調製されてもよい。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上述参照）。増幅 の後、ｍＲＮＡ増幅産物の存在、不存在を検出することができる。好ましくはＰ ＣＲ産物をアガロースゲル中で電気泳動し、エチヂウムブロマイドなどによる染 色をして可視化してもよい。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上述参照）。 以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、制限するためのものでは ない。実施例 実施例１ 患者の試料 患者の選択は以下の基準に基づいて行われた。前立腺癌の患者は、彼らが：（ １）前もってホルモン治療を受けておらず、且つ高血清ＰＳＡ値を有する、臨床 的及び／または外科的ステージＤ０−Ｄ２の疾患（Ｄ０＝証明可能な転移の無い 、腫瘍マーカーの上昇、Ｄ１＝骨盤リンパ節の掛かり合い（ｉｎｖｏｌｖｅｍｅ ｎｔ）、Ｄ２＝通常、骨へ転移した疾患）、または（２）ステージＤ３の高ＰＳ Ａの疾患（ホルモン治療で治癒しにくいＤ２疾患）を有するか否かの分析によっ て選択された。陰性コントロールは、女性の献体者、及び生検によって証明され た良性前立腺肥大（ＢＰＨ）の患者、またはＢＰＨ研究の記録に載っている男性 から成る。前立腺の外科的処置を前年に受けた患者は研究から除外した。陽性コ ントロールは、病理学的に証明されたＢＰＨ由来の既知の転移ＰＡＣ組織を伴う 患者のリンパ節、及びｃＤＮＡ ＰＳＡプラスミドを含んだ。Ｈｅｎｔｔｕ ｅ ｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９８９，１ ６０，９０３−９１０．記録はＩＲＢに承認され、執筆認可を得た。ＬＮＣＡＰ 及びＰＣ３ヒト細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ ｌｅｃｔｉｏｎから入手した（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）。実施例２ ＲＮＡ抽出のための血液調製 約６ｍｌの静脈血を標準的静脈穿刺技術により、ヘパリン処理したチューブを 用いて得た。全血を等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と混合し、次に１５ ｍｌポリスチレンチューブ中の８ｍｌのフィコール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｕｐ ｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上に重層した。勾配を５℃において２００ｇで３０ 分間遠心した。リンパ球及び顆粒球層（約５ｍｌ）を注意深く吸引し、５０ｍｌ チューブ中でＰＢＳにより５０ｍｌまで再希釈し、つづいて５℃において１８０ ０ｇで２０分間遠心した。上清を捨て、有核細胞を含むペレットを企業（Ｔｅｌ −Ｔｅｓｔ Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，Ｔｅｘａｓ）に記載のＲＮａ ｚｏｌｅ Ｂ法による、ＲＮＡの抽出に用いた。実施例３ オリゴヌクレオチドプライマ一及びプローブ ＰＳＡ２（５−ＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＣＡＣＴＧＡＡＧＴＴ，配列番号１）及 び ＰＳＡ３（５−ＣＣＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣＧＡＴＴＣＣＴ，配列番号２ ）オリゴヌクレオチドプライマーはＰＳＡ遺伝子に対し、高い特異性を有するよ うに注文設計した；Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ ｖｅｒｓｉｏｎ−７０（Ｍｏｕｎｔａ ｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の検索から、これらのプライマーはＰＳＡに対しては特 異性を示すが、ＰＳＡ遺伝子に７５−８５％の相同性を示すヒト腺性カリクレイ ン（ＨＭＧＫ）遺伝子には特異的でない事が確認された。Ｈｅｎｔｔｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９８９，１６０ ，９０３−９１０．全てのプライマーはＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ ＤＮＡ Ｓ ｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｄｕａｒｔｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ ａ）により合成され、ゲル精製された。ＰＳＡ２及びＰＳＡ３はイントロンIII 中、ＰＣＲ増幅により３６０ｂｐのＤＮＡ及び２１４ｂｐのＲＮＡ産物が生じる ように存在する配列に結合する。既に発表されたアクチンＰＣＲプライマーの配 列を、分解した（ｄｅｇｒａｄｅｄ）ＲＮＡを排除するために用いた。アクチン オリゴヌクレオチドプライマーＡ１及びＡ２を用いた増幅により、１５４ｂｐの ＲＮＡ及び２５０ｂｐのＤＮＡ産物が生じた。Ｂｅｎ−Ｅｚｒａ ｅｔ ａ１． ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１９９１，３９，３５１−３５ ４．実施例４ 複製連鎖反応 逆転写酵素反応及びＰＣＲ増幅はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００ ＰＣ Ｒ ｍａｃｈｉｎｅ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）中で、中断無しに続けて行 った。２０μｌのＤＥＰＣ（ジエチルーピロカーボネート）処理水中の４００ ｎｇのＲＮＡをＰＣＲ試薬を加える直前に、６５℃の水槽中に５分間置き、次に すばやく氷上で冷やした。５０μｌの合計ＰＣＲ容量は２．５ユニットのＴａｑ ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ１ｍｅｒ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌ１ｅ，ＣＡ）、２ ユニットのＡＭＶ逆転写酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎ ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、各２００μＭのｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ 及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）、１ ８ｐＭの各プライマー、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ）５０ｍＭ ＫＣＩ）２ｍ Ｍ ＭｇＣｌ₂（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）か ら成る。ＰＣＲの条件は以下の通りであった。サイクル１は、４２℃で１５分間 、つづいて９７℃１５秒間（１サイクル）：サイクル２は、９５℃１分間、つづ いて６０℃１分間及び７２℃３０秒間（１５サイクル）：サイクル３は、９５℃ １分間、つづいて６０℃１分間及び７２℃１分間（１０サイクル）：サイクル４ は９５℃１分間、つづいて６０℃１分間及び７２℃２分間（８サイクル）：サイ クル５は７２℃１５分間（１サイクル）：そして最終サイクルはサンプルが機械 から取り出されるまでの４℃保存であった。５０μｌのＰＣＲ産物を真空遠心に より１０μｌに濃縮し、サンプル全量をエチヂウムブロマイドを含む薄い３％ト リス−ほう酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）中で泳動した。陽性か、陰性かの結果を確認 するため、全ての標本を少なくとも２回解析した。 クロスコンタミネーションから生じる偽陽性の可能性の危険はＲＴ ＰＣＲを 単一のチューブ中で、中断無しに行い、フィルター付きのチップを使用すること で除外した。多量のＴａｑポリメラーゼを使用し、伸長時間を大幅に延ばし、エ チヂウムブロマイドを含む薄いアガロースゲルで５０μｌのＰＣＲ産物全てを解 析することにより感度を増強した。これらの方法は技術的な簡便性を保持しなが ら、高い確実性を保証した。 前立腺ヒト組織標本、組織培養細胞株及びＨｅｎｔｔｕ及びＶｉｎｋｏにより クローニングされ、記載されたＰＳＡ ｃＤＮＡプラスミド（Ｈｅｎｔｔｕ ｅ ｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９８９，１ ６０，９０３−９１０）を陽性コントロールとして用い、その結果図１の上パネ ルに示すように、２１４ｂｐのバンドを示した。転移ＰＡＣをもつ骨盤リンパ節 、 初期段階の前立腺癌、及びＢＰＨ標本はすべて強いＰＳＡ ＰＣＲシグナルを生 じた。ＬＮＣＡＰ及びＰＣ−３ヒト前立腺細胞株は弱いシグナルを生じた。実施例５ 塩基配列決定 これらのプライマーのＰＳＡ遺伝子に対する特異性は増幅された２１４ｂｐの 断片（図１下パネル）のＤＮＡ塩基配列解析により確認した。断片のこの領域は ＨＭＧＫ遺伝子に低い相同性しか持たない。２１４ｂｐの産物はＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて製造業者が記載したようにして精製した 。１マイクログラムのＰＣＲ産物をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａ ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）記載の、Ｐｅｒｋ ｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００ ＰＣＲ Ｍａｃｈｉｎｅ中でＴａｑ ＤｙｅＤｅ ｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを 用いたＰＣＲ塩基配列決定反応に使用した。塩基配列決定産物を、ｃｅｎｔｒｉ −ｓｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｄｅｌｐｈ ｉａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて企業が記載したようにして精製した。次 にこの産物をＭａｃｉｎｔｏｓｈ ＩＩｃｉコンピューターに接続されたＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａ ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐ ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ，ＣＡ）により解析した。実施例６ 循環血行性微小転移の検出 １２の前立腺癌患者及び１７のコントロール患者が実施例１から４に記載の、 血液から抽出したＰＳＡ及びアクチンＲＮＡに対するＲＴ ＰＣＲ解析を受けた 。アクチンＰＣＲにより、全ての患者のＲＮＡの充分な質が示された（図１、下 段）。転移疾患をもつ１２のヒト前立腺腺癌（ＰＡＣ）患者のうち、４患者（３ ３％）は抹消静脈血中の前立腺上皮細胞の存在を意味する陽性ＰＳＡシグナルを 示した。これらの４患者はステージＤ１の患者が二人、ステージ２の患者は一人 、及びステージ３の患者が一人から成る（Ｎ＝１）（図１、上段）。１７の陰性 コントロールは８人の女性献体者及び９人のＢＰＨをもつ男性から成るが、全て がＲＴ ＰＣＲにより検出不可能なＰＳＡ ｍＲＮＡしかもたなかった。これら のデータはＰＳＡ遺伝子のＲＮＡに対するＲＴ ＰＣＲはステージＤ１−Ｄ３の 病理を持 つ患者の循環血行性微小転移の特異的な検出に利用できることを意味する。これ らの知見は流動細胞学及び免疫組織学により前立腺がんの患者中に循環ＰＳＡ陽 性細胞を検出した Ｈａｍｂｙらによる研究と一致する。Ｈａｍｂｙ ｅｔ ａ ｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．１９９２，６９，３９２−３９６。 微小転移は１２の前立腺癌患者のうち、ステージＤ３の患者が二人、ステージ Ｄ１の患者が二人、及びステージＤ０の患者が四人から成る８人には検出されな かった。微小転移の検出を増強するために、解析は軟膜細胞に集中してもよい。 結果は前立腺癌細胞は”軟膜”に集中していることを示唆する。ＰＳＡシグナル は同一の前立腺患者でも全フィコール層から単離されたもの（図１、レーン７） と比較すると、”軟膜”（図１、レーン８）のみから得られた細胞から抽出され たＲＮＡ中でより強かった。これらの知見は前立腺上皮細胞は”軟膜”中に移動 することを発見したＨａｒｔｙらの知見と一致する。Ｈａｒｔｙ ｅｔ ａｌ． ，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１９７９，２６，４１１−４１６。 配列表 （２）配列番号：１ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ： ２０ （Ｂ）配列の型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （iv）アンチセンス： Ｎｏ （xi）配列： 配列番号：１ ＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡ ＣＡＣＴＧＡＡＧＴＴ ２０ （２）配列番号：２ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ： ２１ （Ｂ）配列の型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 一本鎖 （Ｄ）トポロジー： 直鎖状 （iv）アンチセンス： Ｎｏ （xi）配列： 配列番号：２ ＣＣＴＣＣＴＧＡＡＧ ＡＡＴＣＧＡＴＴＣＣ Ｔ ２１

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マルホランド，エス・グラント アメリカ合衆国ペンシルバニア州19035, グラッドワイン，セントリー・レーン 1050 (72)発明者 モレノ，ジョゼ・ジー アメリカ合衆国ペンシルバニア州19087, ウェイン，レッド・コウト・ストリート 447 (72)発明者 フィッシャー，ライナー ドイツ連邦共和国デー―52074 アーヒェ ン―レニールス，フェンゼルブクヴェーク 218

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者の血液からＲＮＡ標本を得て； 該ＲＮＡを前立腺特異抗原遺伝子の離れた領域に相補的な一組のプライマ ーを用いる複製連鎖反応により増幅し；そして 増幅されたＲＮＡの存否を検出する、ここにおいて増幅されたＲＮＡが存 在する場合、前立腺癌の微小転移を意味する という工程から成る、患者の前立腺癌微小転移を検出する方法。 ２．該プライマーが配列 ＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＣＡＣＴＧＡＡＧＴＴ（配列 番号１）及びＣＣＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣＧＡＴＴＣＣＴ（配列番号２）を有 する、請求項１に記載の方法。 ３．該ＲＮＡが、調製された血液標本のフィコール層の軟膜中の細胞から得た ものである、請求項１に記載の方法。