CN111518170A - 基于fret的psa荧光探针、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于FRET的PSA荧光探针、制备方法及应用，属于法医检验技术领域。首先基于荧光共振能量转移机理设计，合成了靶向识别检测前列腺特异性抗原的有机小分子荧光探针，通过质谱、高效液相色谱法等对探针进行结构及纯度表征分析，采用荧光光谱法测试探针对前列腺特异性抗原的荧光响应，通过对不同附着物的精液样品检材，利用倒置荧光显微镜观察记录荧光成像。荧光光谱实验表明其对前列腺特异性抗原有较好响应，最低检测限为0.8μg/mL，不同附着物精液检材荧光成像实验进一步验证了荧光探针在精液斑确证试验上的应用，有望用于法医学领域精液斑的确证试验。

Description

基于FRET的PSA荧光探针、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及基于FRET的PSA荧光探针、制备方法及其应用，属于法医检验技术领域。
背景技术
前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)是由前列腺腺泡和导管的上皮细胞分泌的一种单链糖蛋白，参与精液的液化过程。前列腺特异性抗原具有极高器官特异性和种属特异性，被用于法医物证学精斑确证试验，是可以替代精子显微镜检查的最常用的确证方法，特别适用于无精症精液斑鉴定。临床常规用于前列腺良性与恶性疾病鉴别诊断，以及前列腺癌患者术后随访的重要指标。
前列腺特异性抗原的检测方法通常包括酶联免疫吸附法、表面等离子共振、电化学发光、电化学免疫分析、胶体金法和荧光法等，但部分检测方法存在成本高、检测条件苛刻等局限性而限制了其实际应用。
利用靶向肽序列识别检测特定蛋白质具有低成本、易合成、稳定性好、安全可靠和适应性好等优点逐渐地被开发和应用。有机小分子荧光探针能够特异性检测某些标志物，在检测方面正在发挥着重要作用。已有数篇文献报道利用PSA对特定肽序列(HSSKLQ)具有识别水解特性，设计基于靶向肽序列的不同荧光探针对PSA进行特异性检测。
James Gooch等先后基于该肽序列HSSKLQ分别与荧光基团香豆素、罗丹明连接，制备出有机小分子荧光探针，验证了探针对PSA的特异性识别作用，且不影响PSA性质，可回收检材用于DNA分析，降低假阴性出现概率。
党福全课题组基于该序列制备的金纳米荧光探针，选择性实验表明，Mb,THF,LYZ,GOD,β-LAG,BSA等容易造成实验假阳性的蛋白不能使肽序列HSSKLQ裂解。
发明内容
本发明基于荧光共振能量转移机理(FRET)，将荧光基团与淬灭基团通过特定肽序列连接，制备一种前列腺特异性抗原荧光探针(DabcylGGHSSKLQLAAAK-FAM)，实现对前列腺特异性抗原的识别检测。
本发明第一个目的，提供一种新型荧光探针，所述荧光探针具体结构如下：
Figure BDA0002483358790000021
本发明第二个目的，提供上述荧光探针的制备方法，包括如下步骤：第一步为直线肽固相合成：{Dabcyl}-GGHSSKLQLAAAK(5-FAM)，第二步为多肽树脂的裂解，第三步为分离纯化，第四步为分析检测。
进一步地，在上述技术方案中，所述第一步直线肽固相合成操作为，用Fmoc-Lys(5-FAM)-Wang Resin S＝0.3mmol/g，采用Fmoc/Tbu合成策略工艺，从C端向N端(从右到左)依次缩合氨基酸链接，待直线肽缩合完成多肽树脂。
依次偶联下列氨基酸及原料：A-02Fmoc-Ala-OH,A-03Fmoc-Ala-OH,A-04Fmoc-Ala-OH A-05Fmoc-Leu-OH,A-06Fmoc-Gln(Trt)-OH,A-07Fmoc-Leu-OH,A-08Fmoc-Lys(Boc)-OH,A-09Fmoc-Ser(tbu)-OH,A-10Fmoc-Ser(tbu)-OH,A-11Fmoc-His(Trt)-OH,A-12Fmoc-Gly-OH,A-13Fmoc-Gly-OH,A-14Dabcyl acid将肽树脂洗涤转移出干燥至恒重，待裂解。
进一步地，在上述技术方案中，所述第二步多肽树脂的裂解操作为，按照TFA:H2O:EDT:TIS＝95:1:2:2比例，依次将所需裂解试剂H2O、TFA、EDT和TIS加入裂解反应瓶，裂解试剂温度控制在0～10℃；裂解试剂在搅拌下加入肽树脂中，待体系温度稳定后，再温控在25～30℃搅拌反应2.5小时。将裂解液滤出，采用5倍浓缩液体积量的冷冻乙醚将其沉淀，滤出沉淀物并于室温减压干燥，得多肽粗品。
进一步地，在上述技术方案中，所述第三步纯化冻干操作为，将多肽粗品研细，准备纯化水，在搅拌下缓慢加入研细多肽粗品，同时滴加乙腈水溶液，待粗品加完并溶解完全后，用0.45μm的微孔滤膜过滤；粗品纯化采用岛津半制备并用5cm，10μm，C-18柱填料，在常温下用合适梯度进行分离纯化，收集目标产物，分析检测，归类；杂质纯度要求≥95％，将不合格目标物收集，用2cm，5μm，C-18柱用合适梯度再次进行分离纯化，将合格主峰减压冷冻干燥，得到粉末状精品。
进一步地，在上述技术方案中，所述第四步分析检测操作为，将合成的探针通过基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱和高效液相色谱法表征。MALDI-TOF-MS:470.3,[M+4H]4+；626.7,[M+3H]3+；939.3,[M+2H]2+；HPLC保留时间为13.690min。
本发明第三个目的，提供了上述荧光探针在前列腺特异性抗检测中的应用。
进一步地，在上述技术方案中，所述前列腺特异性抗原为含有前列腺特异性抗原的精液。
进一步地，在上述技术方案中，所述前列腺特异性抗原为含有前列腺特异性抗原的精液采用荧光探针检测时，在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光。
进一步地，在上述技术方案中，所述前列腺特异性抗原为含有前列腺特异性抗原的精液为附在玻璃、纸或乳胶上。
在本发明中，检测原理如附图1所示。基于荧光共振能量转移机理，以寡肽链HSSKLQ为桥接基团，连接淬灭基团4-(4'-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(Dabcyl)和荧光基团5-羧基荧光素(5-FAM)，制备出荧光极弱的前列腺特异性抗原靶向检测荧光探针Dabcyl-GGHSSKLQLAAAKFAM，当探针遇到PSA被水解释放出荧光基团，通过监测荧光信号由关至开的过程识别检测PSA。
发明有益效果
1、本发明通过改变肽序列长度，得到检测性能更优化的前列腺特异性抗原荧光探针。该探针为有机化合物，相对于现在法医物证广泛应用的免疫法的酶，其性质更加稳定且容易制备。通过荧光光谱测试，探针荧光强度与前列腺特异性抗原浓度(0～12.5μg/mL)成正相关和线性关系，且5min内均有较好的响应，可实现对PSA的快速定性定量分析。检测限为0.8μg/mL，远低于精液中PSA浓度，因而对检材需求量极少。
2、主流免疫学精液斑确证试验多局限于实验室，而本研究不同附着物上的精液样品检材荧光成像实验进一步证实了该荧光探针对PSA的实际检测效果，有望实现类似鲁米诺实验用于犯罪现场精液斑的识别确证，以期更加便捷辅助侦破案件。
说明书附图
图1为前列腺特异性抗原荧光探针检测机理图；
图2为在525nm下，不同浓度前列腺特异性抗原存在下荧光探针(10μM)荧光强度随时间(30min)变化的函数图；
图3为探针荧光强度与前列腺特异性抗原浓度Benesi-Hildebrand线性拟合图，S＝0.0621，δ＝0.01662，K＝3，LOD＝K×δ/S＝0.8μg/mL；
图4为荧光探针对不同附着物上的精液样品中的前列腺特异性抗原检测的荧光成像图，精液样品组a)玻璃b)纸c)乳胶，对照组d)玻璃e)纸f)乳胶。
具体实施例
实施例1
荧光探针的制备
1、肽序列：{Dabcyl}-GGHSSKLQLAAAK(5-FAM)
2、荧光探针制备为四步：第一步为直线肽固相合成：{Dabcyl}-GGHSSKLQLAAAK(5-FAM)，第二步为多肽树脂的裂解，第三步分离提纯，第四步为分析检测。
3、制备工艺过程采用固相有机合成法，利用Fmoc-保护氨基酸策略，SPPS固相合成技术，完成肽链组装，裂解，纯化得到荧光探针。
4、详细制备工艺过程：
第一步，直链肽固相合成：
用Fmoc-Lys(5-FAM)-Wang Resin S＝0.3mmol/g，采用Fmoc/Tbu合成策略工艺，以表1方法从C端向N端(从右到左)依次缩合氨基酸链接，待直线肽缩合完成多肽树脂：
表1 AA2-AA13
Figure BDA0002483358790000061
{Dabcyl}-GGHSSKLQLAAAK(5-FAM)
依次偶联下列氨基酸及原料：A-02Fmoc-Ala-OH,A-03Fmoc-Ala-OH,A-04Fmoc-Ala-OH A-05Fmoc-Leu-OH,A-06Fmoc-Gln(Trt)-OH,A-07Fmoc-Leu-OH,A-08Fmoc-Lys(Boc)-OH,A-09Fmoc-Ser(tbu)-OH,A-10Fmoc-Ser(tbu)-OH,A-11Fmoc-His(Trt)-OH,A-12Fmoc-Gly-OH,A-13Fmoc-Gly-OH,A-14Dabcyl acid
从C端向N端开始合成详细过程如下：
Fmoc-Lys(5-Fam)-Wang Resin(loading：0.3mmol/g)加入20％Pip/DMF持续搅拌反应10min，然后再次加入20％Pip/DMF持续搅拌反应5min，然后加入DMF搅拌反应1min，重复上述加入DMF 4次，1min一次(每次都要进行搅拌)，然后取样做显色(Kaiser Test)检测。
显色检测成功后加入氨基酸Fmoc-Ala-OH和DIC以及HOBt持续搅拌反应60min，然后加入DMF持续搅拌反应1min，重复上述加入DMF操作3次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(KaiserTest)检测。加入20％Pip/DMF持续搅拌反应10min，然后再次加入20％Pip/DMF持续搅拌反应5min，接着加入DMF搅拌反应1min，重复上述加入DMF 4次，1min一次(每次都要进行搅拌)，然后取样做显色(Kaiser Test)检测。(Wang Resin-Lys(5-Fam)-Ala)
显色检测成功后加入氨基酸Fmoc-Ala-OH和DIC以及HOBt持续搅拌反应60min，然后加入DMF持续搅拌反应1min，重复上述加入DMF操作3次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(KaiserTest)检测。接着加入20％Pip/DMF持续搅拌反应10min，随后再次加入20％Pip/DMF持续搅拌反应5min，再加入DMF搅拌反应1min，重复上述加入DMF 4次，1min一次(每次都要进行搅拌)，然后取样做显色(Kaiser Test)检测。(Wang Resin-Lys(5-Fam)-Ala-Ala)
显色检测成功后加入氨基酸Fmoc-Ala-OH和DIC以及HOBt持续搅拌反应60min，然后加入DMF持续搅拌反应1min，重复上述加入DMF操作3次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(KaiserTest)检测。接着加入20％Pip/DMF持续搅拌反应10min，随后再次加入20％Pip/DMF持续搅拌反应5min，继续加入DMF搅拌反应1min，重复上述加入DMF 4次，1min一次(每次都要进行搅拌)，然后取样做显色(Kaiser Test)检测。(Wang Resin-Lys(5-Fam)-Ala-Ala-Ala)
显色检测成功后加入氨基酸Fmoc-Leu-OH和DIC以及HOBt持续搅拌反应60min，然后加入DMF持续搅拌反应1min，重复上述加入DMF操作3次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(KaiserTest)检测。接着加入20％Pip/DMF持续搅拌反应10min，随后再次加入20％Pip/DMF持续搅拌反应5min，然后加入DMF搅拌反应1min，重复上述加入DMF 4次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。(Wang Resin-Lys(5-Fam)-Ala-Ala-Ala-Leu)
显色检测成功后加入氨基酸Fmoc-Gln(Trt)-OH和DIC以及HOBt持续搅拌反应60min，然后加入DMF持续搅拌反应1min，重复上述加入DMF操作3次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。然后加入20％Pip/DMF持续搅拌反应10min，接着再次加入20％Pip/DMF持续搅拌反应5min，然后加入DMF搅拌反应1min，重复上述加入DMF 4次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。(Wang Resin-Lys(5-Fam)-Ala-Ala-Ala-Leu-Gln)
显色检测成功后加入氨基酸Fmoc-leu-OH和DIC以及HOBt持续搅拌反应60min，然后加入DMF持续搅拌反应1min，重复上述加入DMF操作3次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(KaiserTest)检测。接着加入20％Pip/DMF持续搅拌反应10min，随后再次加入20％Pip/DMF持续搅拌反应5min，然后加入DMF搅拌反应1min，重复上述加入DMF 4次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。(Wang Resin-Lys(5-Fam)-Ala-Ala-Ala-Leu-Gln-leu)
显色检测成功后加入氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH和DIC以及HOBt持续搅拌反应60min，然后加入DMF持续搅拌反应1min，重复上述加入DMF操作3次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。接着加入20％Pip/DMF持续搅拌反应10min，然后再次加入20％Pip/DMF持续搅拌反应5min，接着加入DMF搅拌反应1min，重复上述加入DMF 4次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。(Wang Resin-Lys(5-Fam)-Ala-Ala-Ala-Leu-Gln-leu-Lys)
显色检测成功后加入氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH和DIC以及HOBt持续搅拌反应60min，然后加入DMF持续搅拌反应1min，重复上述加入DMF操作3次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。接着加入20％Pip/DMF持续搅拌反应10min，然后再次加入20％Pip/DMF持续搅拌反应5min，随后加入DMF搅拌反应1min，重复上述加入DMF 4次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。(Wang Resin-Lys(5-Fam)-Ala-Ala-Ala-Leu-Gln-leu-Lys-Ser)
显色检测成功后加入氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH和DIC以及HOBt持续搅拌反应60min，然后加入DMF持续搅拌反应1min，重复上述加入DMF操作3次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。接着加入20％Pip/DMF持续搅拌反应10min，然后再次加入20％Pip/DMF持续搅拌反应5min，随后加入DMF搅拌反应1min，重复上述加入DMF 4次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。(Wang Resin-Lys(5-Fam)-Ala-Ala-Ala-Leu-Gln-leu-Lys-Ser-Ser)
显色检测成功后加入氨基酸Fmoc-His(Trt)-OH和DIC以及HOBt持续搅拌反应60min，然后加入DMF持续搅拌反应1min，重复上述加入DMF操作3次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。接着加入20％Pip/DMF持续搅拌反应10min，随后再次加入20％Pip/DMF持续搅拌反应5min，然后加入DMF搅拌反应1min，重复上述加入DMF 4次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。(Wang Resin-Lys(5-Fam)-Ala-Ala-Ala-Leu-Gln-leu-Lys-Ser-Ser-His)
显色检测成功后加入氨基酸Fmoc-Gly-OH和DIC以及HOBt持续搅拌反应60min，然后加入DMF持续搅拌反应1min，重复上述加入DMF操作3次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(KaiserTest)检测。然后加入20％Pip/DMF持续搅拌反应10min，接着再次加入20％Pip/DMF持续搅拌反应5min，随后加入DMF搅拌反应1min，重复上述加入DMF 4次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。(Wang Resin-Lys(5-Fam)-Ala-Ala-Ala-Leu-Gln-leu-Lys-Ser-Ser-His-Gly)
显色检测成功后加入氨基酸Fmoc-Gly-OH和DIC以及HOBt持续搅拌反应60min，然后加入DMF持续搅拌反应1min，重复上述加入DMF操作3次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(KaiserTest)检测。随后加入20％Pip/DMF持续搅拌反应10min，接着再次加入20％Pip/DMF持续搅拌反应5min，然后加入DMF搅拌反应1min，重复上述加入DMF 4次，1min一次(每次都要进行搅拌)，取样做显色(Kaiser Test)检测。(Wang Resin-Lys(5-Fam)-Ala-Ala-Ala-Leu-Gln-leu-Lys-Ser-Ser-His-Gly-Gly)
显色检测成功后加入Dabcyl acid和DIC以及HOBt持续搅拌反应60min，然后加入DMF持续搅拌反应1min，重复上述加入DMF操作3次，1min一次(每次都要进行搅拌)，然后取样做显色(KaiserTest)检测。(Wang Resin-Lys(5-Fam)-Ala-Ala-Ala-Leu-Gln-leu-Lys-Ser-Ser-His-Gly-Gly-Dabcyl)
以上氨基酸序列全部合成完成后，将肽树脂洗涤(使用甲醇)转移出干燥至恒重，等待裂解。
第二步，多肽树脂裂解：
裂解试剂的配制：按体积为1g肽树脂比10mL±2mL计算裂解试剂用量：
按照体积比TFA:H2O:EDT:Tis＝95:1:2:2比例，依次将所需裂解试剂H2O、TFA、EDT和TIS加入裂解反应瓶，裂解试剂温度控制在0～10℃。裂解试剂在搅拌下加入肽树脂中，待体系温度稳定后；再温控在25～30℃搅拌反应2.5小时。
将裂解液滤出，采用5倍浓缩液体积量的冷冻乙醚将其沉淀，滤出沉淀物并于室温减压干燥，得多肽粗品。
第三步，纯化冻干：
将多肽粗品研细，准备纯化水，在搅拌下缓慢加入研细多肽粗品，同时滴加乙腈水溶液，待粗品加完并溶解完全后，用0.45μm的微孔滤膜过滤；粗品纯化采用岛津半制备并用5cm，10μm，C-18柱填料，在常温下用合适梯度进行分离纯化，收集目标产物，分析检测，归类。杂质纯度要求≥95％，将不合格目标物收集，用2cm，5μm，C-18柱合适梯度下再次进行分离纯化，将合格主峰减压冷冻干燥，得到粉末状精品。
第四步，分析检测
将合成的精品探针通过基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱和高效液相色谱法表征。MALDI-TOF-MS:470.3,[M+4H]4+；626.7,[M+3H]3+；939.3,[M+2H]2+。HPLC保留时间为13.690min，详细技术参数见表2。
表2高效液相色谱(HPLC)技术参数
Figure BDA0002483358790000121
Figure BDA0002483358790000131
应用实验前准备工作：
溶液配制方法
前列腺特异性抗原荧光探针用PBS缓冲液溶解，制备成浓度为1mM的探针储备液，用前稀释成10μM测试溶液。前列腺特异性抗原用PBS溶液。配制成浓度为1mg/mL储备液，用前稀释。
光谱测试方法
每次用微量注射器将前列腺特异性抗原加入含有3mL探针测试溶液的1厘米宽的比色皿中，激发波长为488nm，激发和发射光谱狭缝宽均为0.8nm，进行荧光光谱测试。
荧光成像实验样品制备方法
样品组：取0.4μL精液分别滴于玻璃、纸、乳胶，再分别混合10μM的荧光探针0.6μL。
对照组：取0.4μL PBS溶液分别滴于玻璃、纸、乳胶，再分别混合10μM的荧光探针0.6μL，静置1分钟后进行观察拍照。
实施例3
荧光光谱实验
采用荧光光谱实验对不同浓度PSA进行了测定。结果表明，荧光探针在识别检测PSA过程中，荧光增强速率和强度与PSA浓度呈正相关(图2)，且荧光强度与PSA浓度之间呈现良好的线性关系(图3，R2＝0.993)。最低检测限为0.8μg/mL，远低于正常人精液中前列腺特异性抗原浓度0.5～3.0mg/mL。
实施例4
荧光成像实验
为了进一步验证探针的实际应用价值，利用荧光探针对不同附着物上的精液样品进行了荧光成像实验(图4)。采用Leica DMi8倒置荧光显微镜，蓝光激发，10×5倍镜下观察并记录其荧光成像，可见含有前列腺特异性抗原的精液样品组呈现强烈的黄绿色荧光，对照组无荧光。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (10)

1.一种荧光探针，其特征在于，化学结构为：
Figure FDA0002483358780000011
2.如权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步为直线肽固相合成：{Dabcyl}-GGHSSKLQLAAAK(5-FAM)，第二步为多肽树脂的裂解，第三步分离纯化，第四步为分析检测。
3.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于：第一步直线肽固相合成操作为，用Fmoc-Lys(5-FAM)-Wang Resin S＝0.3mmol/g，采用Fmoc/Tbu合成策略工艺，从C端向N端依次缩合氨基酸链接，待直线肽缩合完成多肽树脂：依次偶联下列氨基酸及原料：A-02Fmoc-Ala-OH,A-03 Fmoc-Ala-OH,A-04 Fmoc-Ala-OH A-05 Fmoc-Leu-OH,A-06 Fmoc-Gln(Trt)-OH,A-07 Fmoc-Leu-OH,A-08 Fmoc-Lys(Boc)-OH,A-09 Fmoc-Ser(tbu)-OH,A-10Fmoc-Ser(tbu)-OH,A-11 Fmoc-His(Trt)-OH,A-12 Fmoc-Gly-OH,A-13 Fmoc-Gly-OH,A-14Dabcyl acid将肽树脂洗涤转移出干燥至恒重，待裂解。
4.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于：第二步多肽树脂的裂解操作为，按照TFA:H2O:EDT:TIS＝95:1:2:2比例，依次将所需裂解试剂H2O、TFA、EDT和TIS加入裂解反应瓶，裂解试剂温度控制在0～10℃；裂解试剂在搅拌下加入肽树脂中，待体系温度稳定后，再温控在25～30℃搅拌反应2.5小时；将裂解液滤出，采用5倍浓缩液体积量的冷冻乙醚将其沉淀，滤出沉淀物并于室温减压干燥，得多肽粗品。
5.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于：第三步纯化冻干操作为，将多肽粗品研细，准备纯化水，在搅拌下缓慢加入研细多肽粗品，同时滴加乙腈水溶液，待粗品加完并溶解完全后，用0.45μm的微孔滤膜过滤；粗品纯化采用岛津半制备并用5cm，10μm，C-18柱填料，在常温下用合适梯度进行分离纯化，收集目标产物，分析检测，归类；杂质纯度要求≥95％，将不合格目标物收集，用2cm，5μm，C-18柱用合适梯度再次进行分离纯化，将合格主峰减压冷冻干燥，得到粉末状精品。
6.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于：第四步分析检测操作为，将合成的探针通过基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱和高效液相色谱法表征：MALDI-TOF-MS:470.3,[M+4H]4+；626.7,[M+3H]3+；939.3,[M+2H]2+；HPLC保留时间为13.690min。
7.如权利要求1所述荧光探针在前列腺特异性抗检测中的应用。
8.根据权利要求7所述荧光探针在前列腺特异性抗原检测中的应用，其特征在于：所述前列腺特异性抗原为含有前列腺特异性抗原的精液。
9.根据权利要求8所述荧光探针在前列腺特异性抗原检测中的应用，其特征在于：所述前列腺特异性抗原为含有前列腺特异性抗原的精液采用荧光探针检测时，在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光。
10.根据权利要求8所述荧光探针在前列腺特异性抗原检测中的应用，其特征在于：所述前列腺特异性抗原为含有前列腺特异性抗原的精液为附在玻璃、纸或乳胶上。
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