CN108358996B - 一种模拟己烯雌酚的抗原表位肽、其制备方法及应用 - Google Patents

一种模拟己烯雌酚的抗原表位肽、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种模拟己烯雌酚的抗原表位肽、其制备方法及应用。该技术方案首先基于噬菌体展示肽库技术，以抗DES单克隆抗体为靶标，从噬菌体随机展示七肽库中淘选得序列为YVYPQQK、YVYPPGP或YVYPQSR的DES抗原模拟表位。本发明围绕该抗原模拟表位的免疫结合特性，基于酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法、荧光微球免疫层析法设计了具体的检测方法。该抗原模拟表位具有与天然DES分子相似的免疫反应特性，可以替代价格昂贵且具有致畸、致癌作用的DES标准品用于DES的免疫学检测，检测结果准确、灵敏度高。本发明有效降低了DES检测过程中对人体健康的危害，同时节约了成本。

Description

一种模拟己烯雌酚的抗原表位肽、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及噬菌体展示肽库技术领域，具体涉及一种模拟己烯雌酚的抗原表位肽、其制备方法及应用。
背景技术
己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)是人工合成的非甾体雌激素，由于具有促进蛋白沉积、提高动物日增重和减少脂肪合成等作用，曾经作为促生长剂广泛应用于畜牧养殖业。研究表明过量使用的同时也带来了DES在动物组织中高度残留的问题，高度残留的DES通过食物链会对人体产生致畸、致癌等危害。文献报道，在动物源性食品特别是水产品中DES检出率较高，对食品中DES残留进行及时检测是预防和控制其危害的有效手段。
目前，食品中DES的检测方法主要有高效液相色谱、气相色谱、高效液相色谱串联质谱、气相色谱串联质谱和免疫分析等方法，免疫分析方法以其简单方便、灵敏度高、成本较低等特性在DES的检测中得到了广泛的应用。但是，在实施免疫分析检测的过程中，必须使用己烯雌酚标准品为基础原材料来制备竞争抗原或者固相包被抗原，DES不仅致畸致癌性强且价格昂贵，对检测人员的身体健康和生态环境造成极大的危害。近年来科研人员采用抗原模拟表位成功替代小分子抗原进行了免疫学检测，在这种情况下，如果能获取一种与天然DES具有相似免疫反应特性的替代性物质，则有望在针对DES的免疫检测方法中避免使用DES标准品，以期降低检测成本同时提升安全性。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种模拟己烯雌酚的抗原表位肽，以解决现有技术中缺乏一种与DES具有相似免疫反应特性、能替代其作为免疫检测标品物质的技术问题。
本发明同时提供了上述模拟己烯雌酚的抗原表位肽的制备方法，以解决其制备方法不明确的技术问题。
本发明同时提供了上述模拟己烯雌酚的抗原表位肽在具体免疫检测方法中的应用，以解决现有技术中的常规检测方法未针对该抗原表位肽的免疫学性质进行适应性匹配，因而难以获得最佳检测效果的技术问题。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种模拟己烯雌酚的抗原表位肽，其氨基酸序列为：YVYPQQK。
一种编码上述抗原表位肽的基因，其核苷酸序列为：TATGTGTATCCTCAGCAGAAG。
本发明同时提供了上述抗原表位肽的一种制备方法，包括以下步骤：将具有DES抗原模拟表位的噬菌体加入至20ml接种有ER 2738大肠杆菌的培养液中，37℃150rpm振荡培养4.5h；将培养物转入另一离心管中，4℃12000g离心10min，将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃静置过夜；4℃12000g离心15min，沉淀重悬于1ml TBS中，4℃14000rpm离心5min；上清转入另一离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育1h，4℃14000rpm离心10min；弃上清，沉淀重悬于200μl TBS中。在该制备方法中，所述具有DES抗原模拟表位的噬菌体，可以是通过以下淘选方法获得的：
DES抗原模拟表位的亲和淘选：具体方法为：用0.1M NaHCO3(pH 8.6)稀释抗DES单克隆抗体，并以终浓度80μg/mL加入96孔酶标单孔中，4℃包被过夜。次日用TBST[50mMTris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，0.1％Tween-20(v/v)]快速洗涤6次后，加入350μl 1％OVA封闭液，4℃封闭2h。弃封闭液，用TBST洗涤6次，加入120μl噬菌体肽库(噬菌体展示七肽库，购自NEB公司，用TBST稀释噬菌体，加入量为2.0×1011pfu)，25℃反应50min。弃孔中的噬菌体，用TBST快速洗涤10次，拍干，用0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)洗脱8min，然后用15μl 1MTris-HCl(pH 9.1)中和洗脱液。取5μl洗脱噬菌体测滴度，剩余的用于E.coli ER2738菌株进行扩增。次日用PEG/NaCl纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。在第二、第三轮的淘选过程中，包被的抗DES单克隆抗体浓度分别为40μg/mL和20μg/mL，封闭液依次为1％BSA和1％OVA，所用的TBST浓度为0.3％和0.5％，洗脱时间依次为7min和6min，其余步骤同上。
本发明同时提供了上述抗原表位肽的另一种制备方法，包括以下步骤：
1)PCR扩增序列为TATGTGTATCCTCAGCAGAAG的DNA片段，分别采用ACC65I和Eag I酶对该DNA片段和pMAl-pIII表达载体进行双酶切；将质粒pMal-PIII和该DNA片段以1∶10的摩尔比混匀，于16℃水浴连接12h，取10μl连接产物加至100μl感受态细胞TB1中，充分混匀；冰浴30min后，42℃水浴热激90s，立即冰浴5min后补加600μl LB液体培养液，37℃，200rpm培养1h，10000rpm离心1min，吸去上清留取约200μl，涂布于LB-A固体培养基中，37℃过夜培养，得到阳性克隆；
2)将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5mL LB-A，0.2％蔗糖中，37℃220rpm振荡培养过夜，将过夜培养物按1％(v/v)的接种量接种于50mL的LB-A，0.2％蔗糖培养基中，37℃220rpm振荡培养，当培养物细菌浓度达到OD600值为0.6时，向培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，220rpm振荡培养，将PEG溶液于4℃4000g离心20min收集菌体沉淀，弃上清；重悬细胞于400ml含有30mM Tris-HCl、20％蔗糖且pH为8.0的溶液中，加入EDTA至1mM，室温下震荡10min，8000g 4℃离心20min，弃上清，沉淀重悬于400ml预冷的5mM MgSO4，冰上震荡10min，8000g 4℃离心20min，保留上清，向上清液中加入8ml pH为7.4、浓度为1M的Tris-HCl，获得DES抗原模拟表位-MBP融合蛋白。
此外，上述抗原表位肽还可以是基于其氨基酸序列通过多肽化学合成的方法获得的。
本发明还提供了上述抗原表位肽作为酶联免疫法的竞争抗原用于检测食品中己烯雌酚的应用。
本发明还提供了上述抗原表位肽作为酶联免疫法的固相抗原用于检测食品中己烯雌酚的应用。
本发明还提供了上述抗原表位肽作为胶体金试纸的检测线用于检测食品中己烯雌酚的应用。
作为优选，该应用包括以下步骤：
用10mM PBS缓冲液稀释具有DES抗原模拟表位的噬菌体至2.0×1011pfu，取0.5mg/ml的羊抗鼠IgG二抗，用XYZ三维点喷仪分别喷点于硝酸纤维素膜上，作为试纸条的检测线和质控线，两线间隔约为7mm，37℃干燥12h，备用；用K2CO3调1ml胶体金溶液至pH值为8.2，用蒸馏水稀释抗DES单克隆抗体至0.04mg/ml，然后缓慢加入胶体金溶液中，边滴边搅拌，搅拌反应1h后，加入100μl 1％PEG至溶液中，继续搅拌30min；加入100μl 10％BSA溶液，搅拌30min，8000rpm 4℃离心30min，弃上清，100μl重悬液重悬沉淀，4℃保存备用；将胶体金标记抗体复合物稀释一定浓度，用XYZ三维点喷仪将稀释后的复合物喷涂于结合垫上，30℃干燥2h，备用；将硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫和吸水纸依次组装在PVC底板上，用切刀切割成4mm宽的试纸条装入检测卡中，备用；将80μl样品提取液加入试纸条加样孔中，10min后观察检测结果。
本发明还提供了上述抗原表位肽作为荧光微球试纸的检测线用于检测食品中己烯雌酚的应用。
作为优选，该应用包括以下步骤：用10mM PBS稀释具有DES抗原模拟表位的噬菌体至2.0×1011pfu，取0.5mg/ml的羊抗鼠IgG二抗，用XYZ三维点喷仪分别喷点于硝酸纤维素膜上，作为试纸条的检测线和质控线，两线间隔约为7mm，37℃干燥12h，备用；将25μl的荧光微球加入4.5ml PB溶液中，加入EDC活化15min，取1μg的抗DES单抗缓慢加入PB溶液中，搅拌反应2h；加入500μl 10％BSA溶液，搅拌反应30min，8000rpm 4℃离心10min，弃上清，500μl重悬液重悬沉淀，4℃保存备用；将荧光微球标记抗体复合物稀释，用XYZ三维点喷仪将稀释后的复合物喷涂于结合垫上，30℃干燥2h，备用。将硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫和吸水纸依次组装在PVC底板上，用切刀切割成4mm宽的试纸条装入检测卡中，备用；将80μl样品提取液加入试纸条加样孔中，15min后在荧光照射灯下观察检测结果。
在本发明技术方案中，所述模拟己烯雌酚的抗原表位肽，亦可称之为DES抗原模拟表位或己烯雌酚抗原模拟表位。
上述抗原表位的氨基酸序列中，大写英文字母分别代表已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，其中K代表赖氨酸残基，P代表脯氨酸残基，Q代表谷氨酰胺残基，V代表缬氨酸残基，Y代表酪氨酸。
本发明DES抗原模拟表位在应用时，可以把合成的模拟表位本身用于免疫学检测分析，也可将通过噬菌体扩增获得的展示有DES抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将DES抗原模拟表位从噬菌体上分离下来代替DES标准品来进行免疫学检测分析。
本发明提供了一种模拟己烯雌酚的抗原表位肽、其制备方法及应用。该技术方案首先基于噬菌体展示肽库技术，以抗DES单克隆抗体为靶标，将靶标低温包被于酶标孔中，加入噬菌体随机展示七肽库进行亲和淘选，获得了一种序列为YVYPQQK的DES抗原模拟表位。
在此基础上，本发明分别给出了通过噬菌体扩增手段、通过基因重组手段制备该抗原模拟表位的方法。与此同时，本发明基于该抗原模拟表位的免疫结合特性，基于酶联免疫法、胶体金法、荧光微球法设计了具体的检测方法。
该抗原模拟表位具有与天然DES分子相似的免疫反应特性，可以替代价格昂贵且具有致畸、致癌作用的DES标准品用于DES的免疫学检测，检测结果准确、灵敏。本发明有效降低了DES检测过程中对人体健康的危害，同时节约了成本，具有突出的应用价值。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中以DES抗原模拟表位建立的间接竞争ELISA标准曲线；DES抗原模拟表位(YVYPQQK)与抗DES抗体的IC50值为185pg/ml。
图2是本发明具体实施方式中，由含不同浓度甲醇的DES标准品所建立的标准曲线。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
1、DES抗原模拟表位的淘选及其鉴定
(1)DES抗原模拟表位的亲和淘选：具体方法为：用0.1M NaHCO3(pH 8.6)稀释抗DES单克隆抗体，并以终浓度80μg/mL加入96孔酶标单孔中，4℃包被过夜。次日用TBST[50mMTris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，0.1％Tween-20(v/v)]快速洗涤6次后，加入350μl 1％OVA封闭液，4℃封闭2h。弃封闭液，用TBST洗涤6次，加入120μl噬菌体肽库(噬菌体展示七肽库，购自NEB公司，用TBST稀释噬菌体，加入量为2.0×1011pfu)，25℃反应50min。弃孔中的噬菌体，用TBST快速洗涤10次，拍干，用0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)洗脱8min，然后用15μl 1MTris-HCl(pH 9.1)中和洗脱液。取5μl洗脱噬菌体测滴度，剩余的用于E.coli ER2738菌株进行扩增。次日用PEG/NaCl纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。
在第二、第三轮的淘选过程中，包被的抗DES单克隆抗体浓度分别为40μg/mL和20μg/mL，封闭液依次为1％BSA和1％OVA，所用的TBST浓度为0.3％和0.5％，洗脱时间依次为7min和6min，其余步骤同上。
(2)阳性噬菌体克隆的鉴定：从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取24个噬菌体斑进行噬菌体的扩增并进行纯化，采用间接酶联免疫吸附法对纯化产物进行阳性鉴定，具体操作如下：用0.1M NaHCO3(pH 8.6)稀释抗DES单克隆抗体，1μg/mL包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。次日用PBST[10mM PBS，pH7.4，0.05％Tween-20(v/v)]洗涤3次后，用1％BSA进行封闭，4℃封闭2h；弃封闭液，PBST洗涤3次；加入100μl噬菌斑纯化液(约为1.0×1010pfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育45min，PBST洗涤6次；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100μl，37℃孵育45min，PBST洗涤6次；加入100μl TMB底物液，避光显色10min，酶标仪读取450nm处的吸收值。选取OD450大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。
(3)DES抗原模拟表位的鉴定：采用间接竞争酶联免疫吸附法对所有阳性噬菌体克隆进行表位确定，具体操作如下：用0.1M NaHCO3(pH 8.6)稀释抗DES单克隆抗体，包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。次日用PBST[10mM PBS，pH7.4，0.05％Tween-20(v/v)]洗涤3次后，用1％BSA进行封闭，4℃封闭2h；弃封闭液，PBST洗涤3次，加入50μl阳性的噬菌体克隆(约为1.0×1010pfu)和50μl DES标准品(10ng/ml)，37℃孵育45min，PBST洗涤6次；加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100μl，37℃孵育45min，PBST洗涤6次；加入100μl TMB底物液，避光显色10min，酶标仪读取450nm处的吸收值，能被DES标准品抑制的噬菌体，鉴定为DES的抗原模拟表位。
2、DES抗原模拟表位编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
将经过间接竞争酶联免疫吸附法鉴定为DES抗原模拟表位的噬菌体进行扩增，提取噬菌体的DNA。操作过程如下：对目的噬菌体进行扩增，扩增产物离心后，取500μl噬菌体上清转入一新离心管；加入200μl PEG/NaCl沉淀噬菌体，静置20min，14000rpm离心10min。弃上清，沉淀重悬于100μl碘化物缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA,4M NaI)，加入250μl无水乙醇沉淀，静置15min，14000rpm离心10min。弃上清后再用70％乙醇洗涤沉淀(DNA测序模板)，14000rpm离心10min，弃上清，短暂真空干燥。沉淀重悬于30μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA)，取4μl进行琼脂糖凝胶电泳分析；取10μL噬菌体模板进行DNA测序，其-96gIII测序引物为：5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。依据DNA测序结果及密码子表可获得DES抗原模拟表位的氨基酸序列。其中部分噬菌斑的氨基酸序列为YVYPQQK。
3、DES抗原模拟表位对有机溶剂甲醇的耐受性
将展示有DES抗原模拟表位的噬菌体粒子进行甲醇耐受性验证，具体过程如下：用0.1M NaHCO3(pH 8.6)稀释抗DES单克隆抗体，包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。次日用PBST[10mM PBS，pH7.4，0.05％Tween-20(v/v)]洗涤3次后，用1％BSA进行封闭，4℃封闭2h；弃封闭液，PBST洗涤3次，加入50μl阳性的噬菌体克隆(约为2.0×1010pfu)和50μl(0％、5％、10％、15％、20％、30％、40％)甲醇的PBS缓冲液配制的一系列浓度DES标准品，37℃孵育45min，PBST洗涤6次；加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100μl，37℃孵育45min，PBST洗涤6次；加入100μl TMB底物液，避光显色10min，酶标仪读取450nm处的吸收值。根据建立的各自标准曲线(图2)，结果显示展示有DES抗原模拟表位的噬菌体粒子在40％甲醇的PBS中仍然有反应活性；甲醇在PBS中最适浓度为10％。
4、DES抗原模拟表位作为竞争抗原在酶联免疫分析方法中的应用
(1)样品提取
将猪肉的脂肪和结缔组织去除，用搅拌机将其打碎，称取2g于50ml的离心管中，加入6ml 10％的甲醇-PBS溶液，在振荡器上振荡3分钟；加入6ml 0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)，再加入10ml乙酸乙酯，150rpm振摇30min，4000rpm离心10min。移取上层有机层于另一试管中，向其中加入1.25ml 0.1M NaOH溶液和0.625ml 1.0M MgCl2溶液，60℃水浴30min。取出试管稍作冷却后加入1g的无水Na2SO4，振器上摇振5min后离心5min。移取上层有机层于一新的试管中，在约55℃的氮吹仪中吹干。加入100μl甲醇溶液溶解后，再加入900μL PBS重悬，重悬液经膜过滤。取50μl过滤液直接加样于微孔中进行酶联免疫分析测定。
(2)抗体包被
用0.1M NaHCO3(pH 8.6)稀释抗DES单克隆抗体，1μg/mL包被酶标板，4℃孵育过夜。次日用PBST[10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v)]洗涤3次后，用1％BSA进行封闭，4℃封闭育2h后，PBST洗板3次拍干，放置4℃备用。
(3)标准曲线的建立
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别加入50μl DES抗原模拟表位的噬菌体(约1.0×1010pfu)和一系列不同浓度的50μl DES标准品，37℃孵育45min，PBST洗涤6次；加入100μl 1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37℃孵育45min，PBST洗涤6次。加入100μlTMB底物显色，酶标仪读取OD450吸光值。以DES浓度对数为横坐标，结合率(加入DES的孔的OD450/未加入DES的孔的OD450×100％)为纵坐标，建立DES间接竞争标准曲线。结果显示线性相关性较好(图1)。如图1，以DES抗原模拟表位建立的间接竞争酶联免疫分析方法标准曲线。DES抗原模拟表位(YVYPQQK)与抗DES抗体的IC50值为185pg/ml。
(4)样品的检测
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别加入50μl DES抗原模拟表位的噬菌体(约1.0×1010pfu)和待测样品提取液，37℃孵育45min。弃反应液，PBST洗涤6次；加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37℃孵育45min，弃反应液，PBST洗涤6次；然后用TMB底物显色，读取OD450，计算结合率，并根据标准曲线，计算出样品中DES的含量。
5、DES抗原模拟表位作为固相抗原在酶联免疫分析方法中的应用
(1)样品提取
将猪肉的脂肪和结缔组织去除，用搅拌机将其打碎，称取2g于50ml的离心管中，加入6ml 10％的甲醇-PBS溶液，在振荡器上振荡3分钟；加入6ml 0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)，再加入10ml乙酸乙酯，150rpm振摇30min，4000rpm离心10min。移取上层有机层于另一试管中，向其中加入1.25ml 0.1M NaOH溶液和0.625ml 1.0M MgCl2溶液，60℃水浴30min。取出试管稍作冷却后加入1g的无水Na2SO4，振器上摇振5min后离心5min。移取上层有机层于一新的试管中，在约55℃的氮吹仪中吹干。加入100μl甲醇溶液溶解后，再加入900μl PBS重悬，重悬液经膜过滤。取50μl过滤液直接加样于微孔中进行酶联免疫分析测定。
(2)包被及封闭
用10mM PBS(pH 7.4)稀释DES抗原模拟表位的噬菌体(约2.0×1011pfu)，100μl包被于酶标板，4℃孵育过夜。次日用PBST[10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v)]洗涤3次后，用1％BSA进行封闭，4℃封闭2h后，用PBST洗板3次待用。
(3)标准曲线的建立
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50μl抗DES单克隆抗体(0.35ng/ml)和一系列不同浓度的50μl DES标准品，37℃孵育45min，弃反应液，PBST洗涤6次；加入1:5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育45min，弃反应液，PBST洗涤6次；然后用TMB底物显色，读取OD450。以DES浓度对数为横坐标，结合率(加入DES的孔的OD450/未加入DES的孔的OD450×100％)为纵坐标，建立DES间接竞争标准曲线。
(4)样品的检测
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50μl抗DES单克隆抗体(0.35ng/ml)和待测样品提取液，37℃孵育45min，弃反应液，PBST洗涤6次；加入1:5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育45min，弃反应液，PBST洗涤6次；然后用TMB底物显色，读取OD450。以DES浓度对数为横坐标，结合率(加入DES的孔的OD450/未加入DES的孔的OD450×100％)为纵坐标，建立DES间接竞争标准曲线。
6、DES抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析方法中的应用
(1)样品提取
将猪肉的脂肪和结缔组织去除，用搅拌机将其打碎，称取2g于50ml的离心管中，加入6ml 10％的甲醇-PBS溶液，在振荡器上振荡3分钟；加入6ml 0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)，再加入10ml乙酸乙酯，150rpm振摇30min，4000rpm离心10min。移取上层有机层于另一试管中，向其中加入1.25ml 0.1M NaOH溶液和0.625ml 1.0M MgCl2溶液，60℃水浴30min。取出试管稍作冷却后加入1g的无水Na2SO4，振器上摇振5min后离心5min。移取上层有机层于一新的试管中，在约55℃的氮吹仪中吹干。加入100μl甲醇溶液溶解后，再加入900μl PBS重悬，重悬液经膜过滤。过滤液即为样品提取液，待用。
(2)检测线和控制线的点喷
用10mM PBS(pH 7.4)稀释DES抗原模拟表位的噬菌体(2.0×1011pfu)、0.5mg/ml的羊抗鼠IgG二抗，用XYZ三维点喷仪分别喷点于硝酸纤维素膜上，作为试纸条的检测线和质控线，两线间隔约为7mm，37℃干燥12h，备用。
(3)胶体金标记抗DES单克隆抗体
用K2CO3调1ml胶体金溶液(40nm)至pH值为8.2，用蒸馏水稀释抗DES单克隆抗体至0.04mg/ml，然后缓慢加入胶体金溶液中，边滴边搅拌，搅拌反应1h后，加入100μl 1％PEG至溶液中，继续搅拌30min；加入100μl 10％BSA溶液，搅拌30min，8000rpm 4℃离心30min，弃上清，100μl重悬液重悬沉淀，4℃保存备用。
(4)胶体金标记抗体复合物喷涂结合垫
将胶体金标记抗体复合物稀释一定浓度，用XYZ三维点喷仪将稀释后的复合物喷涂于结合垫上，30℃干燥2h，备用。
(5)胶体金试纸条的组装
将硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫和吸水纸依次组装在PVC底板上，用切刀切割成4mm宽的试纸条装入检测卡中，备用。
(5)样品的检测
将80μl样品提取液加入试纸条加样孔中，10min后观察检测结果，若样品中含有DES且超过胶体金试纸条的检测阈值，则检测线不显红色，而控制线显色；若样品中不含有DES且低于胶体金试纸条的检测阈值，则检测线显红色，控制线显红色。若控制线不显红色，表明试纸条失效。
另外，通过便携式胶体金读取仪读取试纸条上检测线和质控线的吸光值，以DES浓度对数为横坐标，以检测线/质控线的比值作为纵坐标，建立标准曲线内置于读取仪中，通过对加入提取液试纸条的检测线和质控线扫描，快速计算出样本中DES的含量。
7、DES抗原模拟表位作为固相抗原在荧光免疫层析方法中的应用
(1)样品提取
将猪肉的脂肪和结缔组织去除，用搅拌机将其打碎，称取2g于50ml的离心管中，加入6ml 10％的甲醇-PBS溶液，在振荡器上振荡3分钟；加入6ml 0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)，再加入10ml乙酸乙酯，150rpm振摇30min，4000rpm离心10min。移取上层有机层于另一试管中，向其中加入1.25ml 0.1M NaOH溶液和0.625ml 1.0M MgCl2溶液，60℃水浴30min。取出试管稍作冷却后加入1g的无水Na2SO4，振器上摇振5min后离心5min。移取上层有机层于一新的试管中，在约55℃的氮吹仪中吹干。加入100μl甲醇溶液溶解后，再加入900μl PBS重悬，重悬液经膜过滤。过滤液即为样品提取液，待用。
(2)检测线和控制线的点喷
用10mM PBS(pH 7.4)稀释DES抗原模拟表位的噬菌体(2.0×1011pfu)、0.5mg/ml的羊抗鼠IgG二抗，用XYZ三维点喷仪分别喷点于硝酸纤维素膜上，作为试纸条的检测线和质控线，两线间隔约为7mm，37℃干燥12h，备用。
(3)荧光微球标记抗DES单克隆抗体
将25μl的荧光微球加入4.5ml PB溶液中(pH6.0)，加入EDC活化15min，取1μg的抗DES单抗缓慢加入PB溶液中，搅拌反应2h；加入500μl 10％BSA溶液，搅拌反应30min，8000rpm 4℃离心10min，弃上清，500μl重悬液重悬沉淀，4℃保存备用。
(4)荧光微球标记抗体复合物喷涂结合垫
将荧光微球标记抗体复合物稀释一定浓度，用XYZ三维点喷仪将稀释后的复合物喷涂于结合垫上，30℃干燥2h，备用。
(5)荧光微球试纸条的组装
将硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫和吸水纸依次组装在PVC底板上，用切刀切割成4mm宽的试纸条装入检测卡中，备用。
(5)样品的检测
将80μl样品提取液加入试纸条加样孔中，15min后在荧光照射灯下观察检测结果，若样品中含有DES且超过试纸条的检测阈值，则检测线不显荧光，而控制线显荧光；若样品中不含有DES且低于试纸条的检测阈值，则检测线显荧光，控制线显荧光。若控制线不显荧光，表明试纸条失效。
另外，通过便携式荧光读取仪读取试纸条上检测线和质控线的荧光值，以DES浓度对数为横坐标，以检测线/质控线的比值作为纵坐标，建立标准曲线内置于读取仪中，通过对加入提取液试纸条的检测线和质控线扫描，快速计算出样本中DES的含量。
8、DES抗原模拟表位的制备
(1)以噬菌体扩增的方式
将DES抗原模拟表位的噬菌体加入至20ml接种有ER 2738的大肠杆菌中，37℃150rpm振荡培养4.5h。将培养物转入另一离心管中，4℃12000g离心10min，将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃静置过夜。4℃12000g离心15min，沉淀重悬1ml TBS中，4℃14000rpm离心5min；上清转入另一离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育1h，4℃14000rpm离心10min；弃上清，呈现重悬200μl TBS中，此即为噬菌体扩增液，4℃保存或加甘油冻存。
(2)以DES抗原模拟表位-融合蛋白的方式进行制备
A.PCR扩增DES抗原模拟表位的外源编码基因
PCR反应体系：(50μl)
10×Pyrobest Buffer(Mg2+plus)5μl
dNTP Mixture(each for 2.5mM)4μl
M13KE insert extension primer(10mM)1μl
-96gIII sequencing primer(10mM)1μl
噬菌体DNA模板1μl
Pyrobest DNA Polymerase 0.5μl
灭菌ddH2O 37.5μl
PCR反应条件：95℃5min，接着95℃30sec，55℃30sec，72℃40sec，72℃10min共30cycles
采用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物，微量核酸定量仪定量。本发明DES抗原模拟表位的编码基因序列分别对应为：TATGTGTATCCTCAGCAGAAG
B.外源编码基因及表达载体的双酶切
分别采用ACC65I和Eag I酶对外源编码基因和表达载体(pMAl-pIII,NEB公司，可表达MBP融合蛋白)进行双酶切。
C.酶切后产物的连接及转化
将质粒pMal-PIII和目的片段以1∶10(摩尔比)混匀，于16℃水浴连接12h,取10μl连接产物加至100μl感受态细胞TB1中，充分混匀。冰浴30min后，42℃水浴热激90s，立即冰浴5min后补加600μl LB液体培养液，37℃，200rpm培养1h，10000rpm离心1min，吸去上清留取约200μl，涂布于LB-A固体(Ampr)培养基中，37℃过夜培养，得到阳性克隆。
DES抗原模拟表位-MBP融合蛋白的表达
将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5mL LB-A，0.2％蔗糖中，37℃220rpm振荡培养过夜，将过夜培养物按1％接种量(v/v)接种于50mL的LB-A，0.2％蔗糖培养基中，37℃220rpm振荡培养，当培养物细菌浓度达到0.6(OD600)时，向培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，220rpm振荡培养，将PEG溶液于4℃4000g离心20min收集菌体沉淀，弃上清。重悬细胞于400ml[30mM Tris-HCl，20％蔗糖，pH 8.0(80ml/g细胞湿重)]，加入EDTA至1mM，室温下震荡10min，8000g 4℃离心20min，弃上清，沉淀重悬于400ml预冷的5mMMgSO4，冰上震荡10min，8000g 4℃离心20min，保留上清，向上清液中加入8ml 1M Tris-HCl(pH 7.4)，获得DES抗原模拟表位-MBP融合蛋白。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种模拟己烯雌酚的抗原表位肽，其氨基酸序列为：YVYPQQK、YVYPPGP或YVYPQSR。
2.一种编码权利要求1所述抗原表位肽的基因，其核苷酸序列分别对应为：TATGTGTATCCTCAGCAGAAG、TATGTTTATCCGCCTGGTCCG、TATGTTTATCCGCAGAGTCGT。
3.权利要求1所述抗原表位肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将具有DES抗原模拟表位的噬菌体加入至20ml接种有ER 2738大肠杆菌的培养液中，37℃150rpm振荡培养4.5h；将培养物转入另一离心管中，4℃12000g离心10min，将上清上部80％体积的部分转入另一离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃静置过夜；4℃12000g离心15min，沉淀重悬于1ml TBS中，4℃14000rpm离心5min；上清转入另一离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育1h，4℃14000rpm离心10min；弃上清，沉淀重悬于200μl TBS中。
4.权利要求1所述抗原表位肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)PCR扩增序列分别为TATGTGTATCCTCAGCAGAAG、TATGTTTATCCGCCTGGTCCG、TATGTTTATCCGCAGAGTCGT的DNA片段，分别采用ACC65I和Eag I酶对该DNA片段和pMAl-pIII表达载体进行双酶切；将质粒pMal-PIII和该DNA片段以1:10的摩尔比混匀，于16℃水浴连接12h，取10μl连接产物加至100μl感受态细胞TB1中，充分混匀；冰浴30min后，42℃水浴热激90s，立即冰浴5min后补加600μlLB液体培养液，37℃200rpm培养1h，10000rpm离心1min，吸去上清留取约200μl，涂布于LB-A固体培养基中，37℃过夜培养，得到阳性克隆；
2)将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5ml LB-A、0.2％蔗糖中，37℃220rpm振荡培养过夜，将过夜培养物按1％(v/v)的接种量接种于50ml的LB-A、0.2％蔗糖培养基中，37℃220rpm振荡培养，当培养物细菌浓度达到OD600nm值为0.6时，向培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mM，220rpm振荡培养，将PEG溶液于4℃4000g离心20min收集菌体沉淀，弃上清；重悬细胞于400ml含有30mM Tris-HCl、20％蔗糖且pH为8.0的溶液中，加入EDTA至1mM，室温下震荡10min，8000g 4℃离心20min，弃上清，沉淀重悬于400ml预冷的5mMMgSO4，冰上震荡10min，4℃8000g离心20min，保留上清，向上清液中加入8ml pH为7.4、浓度为1M的Tris-HCl，获得DES抗原模拟表位-MBP融合蛋白。
5.权利要求1所述抗原表位肽作为酶联免疫吸附法的竞争抗原用于检测食品中己烯雌酚的应用。
6.权利要求1所述抗原表位肽作为酶联免疫吸附法的固相抗原用于检测食品中己烯雌酚的应用。
7.权利要求1所述抗原表位肽作为胶体金试纸的检测线用于检测食品中己烯雌酚的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于包括以下步骤：
用10mM PBS缓冲液稀释具有DES抗原模拟表位的噬菌体至2.0×1011pfu，取0.5mg/ml的羊抗鼠IgG二抗，用XYZ三维点喷仪分别喷点于硝酸纤维素膜上，作为试纸条的检测线和质控线，两线间隔约为7mm，37℃干燥12h，备用，用K2CO3调1ml胶体金溶液至pH值为8.2，用蒸馏水稀释抗DES单克隆抗体至0.04mg/ml，然后缓慢加入胶体金溶液中，边滴边搅拌，搅拌反应1h后，加入100μl 1％PEG至溶液中，继续搅拌30min；加入100μl 10％BSA溶液，搅拌30min，4℃8000rpm离心30min，弃上清，100μl重悬液重悬沉淀，4℃保存备用，将胶体金标记抗体复合物稀释，用XYZ三维点喷仪将稀释后的复合物喷涂于结合垫上，30℃干燥2h，备用；将硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫和吸水纸依次组装在PVC底板上，用切刀切割成4mm宽的试纸条装入检测卡中，备用；将80μl样品提取液加入试纸条加样孔中，10min后观察检测结果。
9.权利要求1所述抗原表位肽作为荧光微球试纸的检测线用于检测食品中己烯雌酚的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于包括以下步骤：
用10mM PBS稀释具有DES抗原模拟表位的噬菌体至2.0×1011pfu，取0.5mg/ml的羊抗鼠IgG二抗，用XYZ三维点喷仪分别喷点于硝酸纤维素膜上，作为试纸条的检测线和质控线，两线间隔约为7mm，37℃干燥12h，备用；将25μl的荧光微球加入4.5ml PB溶液中，加入EDC活化15min，取1μg的抗DES单抗缓慢加入PB溶液中，搅拌反应2h；加入500μl 10％BSA溶液，搅拌反应30min，4℃8000rpm离心10min，弃上清，500μl重悬液重悬沉淀，4℃保存备用；将荧光微球标记抗体复合物稀释，用XYZ三维点喷仪将稀释后的复合物喷涂于结合垫上，30℃干燥2h，备用；将硝酸纤维素膜、荧光微球结合垫、样品垫和吸水纸依次组装在PVC底板上，用切刀切割成4mm宽的试纸条装入检测卡中，备用；将80μl样品提取液加入试纸条加样孔中，15min后在紫外照射灯下观察检测结果。
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