CN113087779B

CN113087779B - 一种马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白、抗体、检测试剂及试剂盒

Info

Publication number: CN113087779B
Application number: CN202110382535.XA
Authority: CN
Inventors: 刘春龙; 张舟; 张玉静; 柏华松
Original assignee: Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd
Current assignee: Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2041-04-09
Also published as: CN113087779A

Abstract

本发明创造提供了一种马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白、抗体、检测试剂及试剂盒，所述抗原为马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白，其氨基酸序列如SEQ.ID.No.1所示。本发明所述的抗原标志物为高特异性分泌抗原，与曲霉蛋白无明显交叉序列，经后续交叉验证曲霉感染样本未出现假阳性现象；而且该抗原为基因表达产物，产品稳定性强、批间差小，产量大。

Description

一种马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白、抗体、检测试剂及试剂盒

技术领域

本发明创造属于马尔尼菲篮状菌检测领域，尤其是涉及一种马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白及应用该蛋白制备而得的试剂盒。

背景技术

现有文献报道的马尔尼菲篮状菌抗体检测技术中多使用甘露糖蛋白MP1作为马尔尼菲篮状菌标志物，但研究表明曲霉感染样本与MP1存在交叉现象，说明曲霉含有类似MP1的蛋白。

在现有文献报道的ELISA法检测马尔尼菲篮状菌抗体检测技术，以MP1为标志物，采用间接法检测待测血清中的抗体。需要样品中血清稀释后加入酶标板中，孵育洗涤，加入酶标试剂，孵育洗涤，再加入显色底物，孵育，终止反应并读数。读数数值与样品中待测物浓度呈正相关。该方法总时间大于1h。

在现有马尔尼菲篮状菌抗原检测试剂盒(ELISA法)中也是以MP1为待测物，应用生物素-亲和素体系，采用夹心法检测待测血清中的抗原。需要样品中血清处理后加入酶标板中，再加入生物素标记抗体及酶标抗体，经孵育后洗涤，再加入显色底物，孵育，终止反应并读数。读数数值与样品中待测物浓度呈正相关。该方法总时间大于1h。

综上，现有技术中的马尔尼菲篮状菌抗体检测技术中，不仅与曲霉感染样本存在交叉现象，且检测时间较长。

发明内容

有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白及应用该蛋白制备而得的试剂盒。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一种马尔尼菲篮状菌抗原，所述抗原为马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白，所述甘露糖蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.No.1所示。

本发明还提供一种马尔尼菲篮状菌的特异性抗体，所述特异性抗体由上述抗原制备而得的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明还提供一种马尔尼菲篮状菌化学发光检测试剂，所述检测试剂中包含上述马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白或上述的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明还提供一种应用上述马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白或上述的单克隆抗体或多克隆抗体的检测试剂盒。

优选的，所述检测试剂盒为磁微粒化学发光检测试剂盒。

更优选的，所述试剂盒为马尔尼菲篮状菌IgG抗体检测试剂盒，所述试剂盒中使用的化学发光标记物为吖啶磺酰胺，所述吖啶磺酰胺标记抗人IgG抗体，所述磁微粒与马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白偶联，所述磁微粒为羧基磁微粒。

更优选的，所述抗人IgG抗体为鼠抗人IgG抗体。

更优选的，所述试剂盒为马尔尼菲篮状菌抗原检测试剂盒，所述试剂盒中使用的化学发光标记物为吖啶磺酰胺，所述吖啶磺酰胺标记检测抗体，所述捕获抗原与磁微粒偶联，所述磁微粒为羧基磁微粒。

相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：

(1)本发明使用的抗原标志物为高特异性分泌抗原，与曲霉蛋白无明显交叉序列，经后续交叉验证曲霉感染样本未出现假阳性现象；而且该抗原为基因表达产物，产品稳定性强、批间差小，产量大。

(2)现有技术中的应用亲和素磁珠的化学发光法试剂大多都受样品中生物素干扰，而本发明将高特异性分泌抗原藕联羧基磁珠，从而消除样品中生物素干扰。

附图说明

图1为目标蛋白的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明创造。

本发明通过NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心)序列比对，获得与曲霉交叉远小于MP1的高特异性分泌抗原蛋白序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过原核基因表达得到高纯度蛋白，基因表达过程如下：

(1)引物设计

根据目标序列的碱基组成，分别设计引物扩增目标基因，上下游分别含有EcoR I和Xho I酶切位点。引物序列如下：

上游引物：5’ttgaattcatgaagttcttac3’(EcoR I)

下游引物：5’tctcgagtcaatgatcattgagcaccga3’(Xho I)

(2)基因扩增

常规SDS碱裂解法破碎马尔尼菲篮状菌细胞壁，采用市售DNA提取试剂盒，按照说明操作，获得总DNA，并以其为模板扩增目标基因。PCR反应体系：

PCR运行条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，56℃退火40s，72℃延伸20s，共30个循环；72℃再延伸5min。

(3)采用分子生物学领域中的常规酶切及连接技术，构建表达质粒pET-28a(+)-PM，采用CaCl₂热激法将从组载体转化到大肠杆菌DH5a感受态中。利用含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆。常规培养大肠杆菌，提取质粒进行PCR鉴定，确定目标基因存在。

(4)表达及纯化

将提取的表达质粒pET-28a(+)-PMAA转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，在选择培养基上涂布培养，筛选抗100μg/mL氨苄青霉素的单菌落，再液体培养过夜。取1mL过夜培养物接种到200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，震荡培养至对数期(OD600在0.5-0.6)，加入IPTG(1mmol/L),16℃诱导培养3h，发酵液过镍柱纯化，纯化产物经SDS-PAGE检测，片段大小合适，为目标蛋白，SDS-PAGE电泳图如图1所示(图中M1为Marker，泳道1为BSA，泳道2为目标蛋白)。

实施例1

以为抗原标志物，采用化学发光间接法检测血清样本中抗的特异性抗体，并基于磁微粒化学发光间接法建立了马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白IgG抗体检测试剂盒。

该马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白IgG抗体检测试剂盒包括如下组分：

羧基磁珠藕联的特异抗原：羧基磁珠浓度0.4mg/mL，抗原浓度10μg/mg羧基磁珠；

吖啶磺酰胺标记的鼠抗人IgG抗体：抗体浓度0.2μg/mL；

QC1阴性质控：稀释液(不含患者血清)；

QC2阳性质控；含患者血清的稀释液；

稀释液：0.01M PBS(pH7.4)，0.5％BSA，0.05％ProClin300；

具体检测过程为：在反应杯中加入样品10μL、稀释液90μL和羧基磁珠藕联的特异抗原30μL，37℃孵育4min后洗涤，再加入吖啶磺酰胺标记的鼠抗人IgG抗体100μL，37℃孵育4min，洗液去除未与磁珠结合的物质。将反应杯放入测量点中，加入100μL激发液发光，并通过光电倍增器测量发光强度。

发光数值与样品中待测物浓度呈正相关。该方法总时间约10min，检测限低，与曲霉感染样品无交叉，具体实验结果见下表。

由以上表结果可知，本发明所述IgG抗体检测试剂盒特异性100％，所用的特异性蛋白与曲霉阳性样本无交叉反应。

实施例2

本实施例应用马尔尼菲篮状菌的特异性分泌抗原免疫小鼠，获得检测的配对单克隆抗体，具体操作过程为：使用抗原免疫小鼠，对选定小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，采用ELISA法筛选能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增，对克隆产生的抗体进行抗体配对验证，得到所需的捕获抗体和检测抗体。

基于磁微粒化学发光法，建立了马尔尼菲篮状菌抗原检测试剂盒。该马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白IgG抗体检测试剂盒包括如下组分：

羧基磁珠藕联的捕获抗体：羧基磁珠浓度0.4mg/mL，捕获抗体浓度10μg/mg羧基磁珠；

吖啶酯标记的检测抗体：抗体浓度1.0μg/mL；

CAL 1低值校准品：含抗原浓度为50pg/mL的稀释液；

CAL 2高值校准品；含抗原浓度为500pg/mL的稀释液；

稀释液：0.01M PBS(pH7.4)，0.5％BSA，0.05％ProClin300；

具体检测过程为：在反应杯中加入待测样品10μL、稀释液40μL、羧基磁珠藕联的捕获抗体50μL和吖啶酯标记的检测抗体50μL，37℃孵育5min后洗涤，去除未与磁珠结合的物质。将反应杯放入测量点中，加入100μL激发液发光，并通过光电倍增器测量发光强度。

发光数值与样品中待测物浓度呈正相关。该方法总时间约10min，检测限低，与曲霉感染样品无交叉。具体实验结果见下表。

由以上表结果可知，本发明所述抗原检测试剂盒特异性100％，与曲霉阳性样本无交叉反应。

实施例3

本实施例采用一步法测试生物素的影响，一步法的具体操作步骤为：将待检人样本100μL、0.4mg/mL羧基磁微粒标记的捕获抗体40μL、1μg/mL吖啶磺酰胺标记的检测抗体100μL混合，经37℃孵育，孵育5min后，洗涤1次，除去未结合的标记物等，加入激发液产生光信号，发光强度与样本中待测物浓度成正相关。具体实验结果见下表。

由以上表结果可知，本发明检测时间短，仅10min；在临界值(I值1.0)附近样品中添加生物素浓度至640ng/mL，均未改变参考品的阴阳性，可见本发明不受生物素干扰。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 丹娜（天津）生物科技股份有限公司

<120> 一种马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白、抗体、检测试剂及试剂盒

<130> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 200

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Lys Phe Leu Gln Phe Leu Leu Ser Leu Ile Ile Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Ala Arg Ala Leu Ala Ser Ser Cys Asn Asn Tyr His Val Thr Lys Ala

20 25 30

Leu Gly Asp Arg Arg Val Phe Ala Asn Val Thr Cys Lys Val Ile Glu

35 40 45

Ala Leu Val Gln Phe Thr Asn Asp Ile Glu Lys Gln Ser Phe Gln Val

50 55 60

Leu His Lys Asp Val Val Val Ile Leu Gln Arg Ile Glu Asn Gly Ile

65 70 75 80

Lys Arg Ile Ala Val Glu Ser Gln Leu Asp Ser Arg Asp Val Tyr Ser

85 90 95

Leu Glu Ala Gly Phe Lys Ala Phe Glu Lys Asp Ile Glu Glu Leu Leu

100 105 110

Lys Ala Leu Lys Asp Lys Lys Thr Asp Ile Val Gly Ser Asp Val Cys

115 120 125

Ala Glu Leu Val Lys Asp Leu Lys Asp Leu Lys Asp Ala Gly Arg Gln

130 135 140

Ile Ser Ile Leu Val Leu Gly Lys Met Pro Glu Glu Phe Phe Asp Ile

145 150 155 160

Gly Lys Arg Ala Ser Asn Lys Ala Leu Gln Glu Leu Gln Asp Thr Ile

165 170 175

Asn Asp Phe Ser Lys Val Gly Arg Gln Ala Gly Ala Arg Ser Pro Arg

180 185 190

Arg Ser Thr Thr Ile Gly Ala Gln

195 200

Claims

1.一种氨基酸序列如SEQ.ID.No.1所示的马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白或由氨基酸序列如SEQ.ID.No.1所示的马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白制备而得的单克隆抗体或多克隆抗体用于制备马尔尼菲篮状菌检测试剂盒的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述检测试剂盒为磁微粒化学发光检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述试剂盒为马尔尼菲篮状菌IgG抗体检测试剂盒，所述试剂盒中包括化学发光标记物和磁微粒，所述化学发光标记物为吖啶磺酰胺，所述吖啶磺酰胺标记抗人IgG抗体，所述磁微粒与马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白偶联，所述磁微粒为羧基磁微粒。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述抗人IgG抗体为鼠抗人IgG抗体。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述试剂盒为马尔尼菲篮状菌抗原检测试剂盒。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述试剂盒包括化学发光标记物、捕获抗原和磁微粒，所述化学发光标记物为吖啶磺酰胺，所述捕获抗原与磁微粒偶联，所述磁微粒为羧基磁微粒。