CN116528894A

CN116528894A - 用于检测SARS-CoV-2的半胱氨酸样蛋白酶（Mpro）的测定

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Publication number: CN116528894A
Application number: CN202180056503.9A
Authority: CN
Inventors: 休·汤姆森·雷伯恩; 玛丽亚·德尔·马尔·韦尔斯·戈麦斯; 约瑟·米格尔·罗德里格斯·弗雷德; 约瑟·玛丽亚·卡萨斯诺娃·苏尔维斯
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2020-06-08
Filing date: 2021-06-08
Publication date: 2023-08-01
Also published as: EP4161569A1; EP3922262A1; WO2021250043A1; US20230358758A1

Abstract

在本发明中，我们在此总体上提供了一种检测至少一个生物样本中与SARS‑CoV‑2病毒的至少一个表位结合的抗体的体外方法，包括：使所述至少一个生物样本与至少一种分离的SARS‑CoV‑2M^pro蛋白或所述分离的SARS‑CoV‑2M^pro蛋白的包含SARS‑CoV‑2病毒的至少一个表位的至少一个片段接触，和检测所述病毒蛋白或所述片段与所述生物样本中存在的抗体之间抗原‑抗体复合物的形成。

Description

用于检测SARS-CoV-2的半胱氨酸样蛋白酶(Mpro)的测定

相关申请

本发明涉及SARS-CoV-2的重组表达蛋白、特别是SARS-CoV-2的主要蛋白酶(M^pro，又称3CLPro)及其片段，以及其在检测与SARS-CoV-2病毒的至少一个表位结合的抗体的生物样本中的用途。

背景技术

2019年12月，一种新型冠状病毒(CoV)出现，引起称为冠状病毒病19(COVID-19)的急性呼吸道疾病。该病毒被鉴定为与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)相关的β冠状病毒，因此被命名为SARS-CoV-2。这种病毒是在不到二十年的时间里继2003年的SARS-CoV和2012年的中东呼吸综合征之后第三种跨越物种屏障并在人类中引起严重呼吸道感染的已知冠状病毒，但与前两种病毒相比，传播速度前所未有。由于病例数量迅速增加以及不受控制的全球广泛传播，WHO已宣布SARS-CoV-2为大流行病。截至2020年3月14日，该病毒已感染122个国家/地区的超过130,000人，其中3.7％的人死亡。病原学的快速鉴定和病毒基因序列的共享以及随后的因SARS-CoV-2的出现而发起的国际合作努力，使得支持病例确定和疫情追踪的实时PCR诊断测定快速可用。这些工具的可用性有助于发现患者并努力遏制病毒。然而，目前仍缺乏特定且经过验证的血清学测定，迫切需要这样的血清学测定来了解SARS-CoV-2的流行病学。

经过验证的血清学测定对于追踪患者接触者、识别病毒宿主和流行病学研究至关重要。迫切需要流行病学研究来帮助揭示疾病负担，特别是无症状感染率，并更好地估计发病率和死亡率。此外，这些流行病学研究可帮助揭示病毒在家庭、社区和特定环境中的传播程度；这有助于指导控制措施。还需要血清学测定来评估疫苗试验的结果和治疗性抗体的开发。在四种冠状病毒结构蛋白中，刺突(S)和核衣壳(N)是主要的免疫原(Meyer B,Drosten C,Muller MA.Serological assays for emerging coronaviruses:challengesand pitfalls.Virus research.2014Dec 19；194:175-83)。对以ELISA形式检测SARS-CoV-2的病毒中和抗体以及针对核衣壳(NP)蛋白和各种刺突(S)结构域(包括S1亚基和受体结合结构域(RBD))的抗体的血清学测定的开发已有描述。

在本发明中，我们提供了可用于此类测定的其他病毒蛋白免疫原，这些病毒蛋白免疫原不是结构性的，也没有掺入感染性病毒颗粒中。

附图说明

图1.SARS-CoV-2蛋白纯化。(A)由质粒构建体表达的蛋白质的示意图。半胱氨酸样蛋白酶(3CLpro、Mpro)、核衣壳(NP)和哺乳动物(mRBD)。(B)SDS-PAGE。在不同系统中表达后，纯化蛋白质并将凝胶过滤层析的级分在SDS-PAGE中跑样。

图2.通过ELISA检测SARS-CoV-2Mpro特异性抗体。(A)Mpro上的血清滴定。板用SARS-CoV-2Mpro包被，并测试了血清稀释液(1/50至1/1600)。使用抗人F(ab)2’抗体进行检测。(B)同种型识别。以针对三种不同亚类的人Ig(IgG、IgA、IgM)的抗体检测包被有SARS-CoV-2Mpro、核蛋白(NP)或RBD的板。黑色符号对应covid-19患者，灰色符号对应covid-19之前收集的供者样本。

图3：比较ELISA测试。使用包被有0.5ug/ml SARS-CoV-2Mpro和核蛋白(NP)的板对36名COVID-19阳性患者(紫色)和33名阴性对照进行ELISA测试。使用针对三种不同亚类的人Ig(IgG、IgA、IgM)的抗体进行检测。A)血清样本的ELISA数据。B)A)部分的蛋白酶和NP测定的ROC曲线。

图4.通过ELISA检测SARS-CoV-2特异性抗体的包被滴定。板用SARS-CoV-2Mpro和核蛋白(NP)包被，并测试了血清稀释液(1/50至1/1600)。使用针对三种不同亚类的人Ig(IgG、IgA、IgM)的抗体进行检测。黑色符号对应covid-19患者，灰色符号对应covid-19之前的供者。

图5：Mpro和其他病毒抗原血清反应性的比较。板用0.5ug/m SARS-CoV-2Mpro或核蛋白(NP)或1μg/ml mRBD包被。1/100稀释的血清样本在ELISA测定中进行测试，并使用抗人IgG抗体进行显影。显示了两个COVID19⁺血清、阴性血清和对照孔。

图6.为了探索不同冠状病毒的半胱氨酸样蛋白酶之间的相似性，对来自SARS-CoV-2、HCovNL63和HCov229E的3CLpro(Mpro)进行了比对。相似度约为40％。

图7.背景水平和阴性对照。A.没有包被病毒蛋白的板中的背景。如所示的，板用1μg/ml的SARS-CoV-2Mpro或iRBD以及不同稀释度的患者血清包被，并用抗人F(ab)2’抗体检测(左图和中图)。酪蛋白对照对应于包被有含酪蛋白的封闭溶液的孔(右图)。这些孔与相同的血清一起孵育，并用抗人F(ab)2’抗体显色以检查与个体血清相对应的背景。B.SARS-CoV-2阴性对照。在包被有1μg/ml SARS-CoV-2Mpro或NP的板中，对2020年之前(COVID-19之前)收集的24份血清进行了测试。以1/50至1/900的稀释度添加血清。使用针对人IgG或IgM的抗体进行检测。IgM显示1/50稀释度的数据，IgG显示1/200稀释度的数据。血清编号0850对应阳性对照血清。

图8.33名COVID-19之前与36名COVID-19患者的血清比较。使用包被有0.5或1μg/ml(如所示的)SARS-CoV-2Mpro、NP或RBD的板对36份COVID-19阳性和33份阴性对照血清(在大流行病爆发前获得，即COVID-19之前)进行ELISA测试。使用针对三种不同亚类的人免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的抗体进行检测。血清稀释以1/50至1/3200进行。使用针对阳性血清库获得的信号对每种抗原的数据进行标准化。所有血清的箱线图，在1/200稀释度下测试这些血清的IgG，在1/50稀释度下测试这些血清的IgA和IgM。在Mann-Whitney检验中分析了统计学显著性。****表示p<0.0001。

图9.通过接受者操作特征(ROC)分析评估针对三种SARS-CoV-2蛋白的不同同种型反应作为COVID-19分类器。对69名供者的分析得出的灵敏度和特异性之间关系的图形表示。显示了针对每个抗原和免疫球蛋白配对而计算的曲线下面积(AUC)(参见材料和方法的统计部分)。

图10.RBD、Mpro和NP的不同血清稀释度之间的比较。使用包被有SARS-CoV-2Mpro、NP或RBD的板对36份COVID-19阳性对照血清和33份阴性对照血清进行ELISA测试。使用针对三个不同亚类的人免疫球蛋白的抗体进行检测：稀释度1/50至1/3200用于IgG；稀释度1/50至1/1350用于IgA和IgM。图中表示在针对阳性血清库对信号进行标准化后，针对每个抗原和每个供者获得的OD数据。A.Mpro。B.RBD。C.NP。

图11.A.同种型对不同SARS-CoV-2抗原的体液反应的相关性。图8中的数据显示为点图及其拟合的分数多项式预测，具有95％置信区间(透明灰色阴影)，使用具有fpfitci选项的Stata的双向命令进行估计。B.轻症、重症和危重症患者血清的比较。根据COVID-19症状的严重程度(参见参考文献13)，患者被分为三组(轻症n＝13、重症n＝17和危重症n＝6)。使用针对图2中所得的阳性血清库获得的信号对每种抗原的数据进行标准化，在箱线图中描绘数据，其中IgG稀释度为1/200，IgA和IgM稀释度为1/50。通过Cuzick检验分析统计显著性。

图12.COVID-19症状出现后第1个月和第4个月免疫球蛋白水平的比较。板用SARS-CoV-2NP、MPro或RBD包被。在不同时间点(如所示的，在COVID-19发病后的第一个月和四个月内)收集的14名患者的血清以1/200稀释度测试IgG，以1/50稀释度测试IgA和IgM。使用从阳性血清库获得的信号对每种抗原的所有数据进行标准化。A.每个供者的OD变化。该图将每个供者的样本与每种蛋白质的同种型相关联。使用配对样本的Wilcoxon检验来检验统计学显著性。B.变化的百分比。绘制了与A中相同的数据，使对第一个样本进行标准化的变化百分比可视化。

图13.比较11名健康供者和12名COVID-19血清阳性个体的唾液。板用0.5μg/mlSARS-CoV-2Mpro和NP或1μg/ml RBD包被，对1/2至1/10稀释的唾液样本进行ELISA测试。使用针对人IgG、IgM或IgA的抗体进行检测。使用针对阳性对照组氨酸标签获得的信号对每种抗原的数据进行标准化。进行Mann-Whitney检验以比较健康供者和患者中每个稀释度所获得的值。**p<0.01，****p<0.0001。

图14.用于检测COVID-19人血清样本中抗体的基本的珠辅助多抗原测定。A.该方法的示意图。四种不同的SARSCoV-2His标签化抗原(Mpro、NP、S和RBD)与用在APC和PerCP通道中显示不同荧光强度的染料标记的磁珠共价偶联。如所示的，将等量的不同珠群混合在同一管中，并与来自患者或健康供者的血浆稀释液一起孵育。用与荧光团缀合的抗人Ig开发与抗原结合的抗体，并通过流式细胞术分析样本。B.门控和抗体检测策略。与单个SARS-CoV-2抗原偶联的磁珠在单个孔中混合，并与来自健康供者和COVID-19患者的指定稀释度的血浆一起孵育。随后，在两个单独的管中进行检测，其中一个管含有PE缀合的抗人IgG，第二个管含有PE缀合的抗人IgM+FITC缀合的抗人IgA。选择了对应于6μm珠的FSC/SSC区域，并在APC/PerCP点图中使单个珠群形象化(左)。在每个珠门内的直方图中独立分析与每种珠类型结合的抗体。这些图表示与阴性对照(COVID-19之前)相比，分析针对一名患者的单个珠区域所获得的IgG而得到的平均荧光强度(MFI)值。C.多抗原测定中的血清滴定。在包括一系列血清稀释度的多抗原测定中获得的6名健康供者(实心符号)和6名COVID-19患者(空心符号)的抗体MFI值，如B所述。

图15.表示来自多抗原COVID-19测定的抗体滴度的热图。来自15名健康对照者和29名COVID-19患者的血清与四种不同的SARS-CoV-2抗原包被的珠一起孵育：S、RBD、NP和Mpro(在底部指示)，这些血清用抗体检测以识别IgG、IgA和IgM，并使用如图14中描述的多抗原测定通过流式细胞术进行分析。为了总结所有数据，构建了热图，显示了在供者血清中检测到的IgG/IgM/IgA抗体的强度。每列对应一种抗原，行包括每个个体的五种不同稀释度(1/100、1/200、1/600、1/1800、1/5400)。颜色的强度描述了抗体的量。

图16.多抗原血清学测定以近100％的置信度识别COVID-19患者。A.单抗原ELISA和多抗原FACS测定的接受者操作特征(ROC)曲线。使用一个健康的和2个COVID对照IgG值训练随机森林分类器，随机森林分类器用于预测其余样本。显示每个条件的15倍交叉验证后的平均ROC曲线。B.针对一种病毒抗原具有偏好性IgG反应(biased IgG response)的患者的热图。尽管大多数COVID-19患者通过产生针对四种测试抗原的抗体而做出反应，但29名供者中有5名优先对S/RBD或NP/Mpro做出反应。显示来自6名患者和1名健康供者的数据以供比较。C.主成分分析(PCA)。使用来自IgG抗体(稀释度1/100、1/200、1/600、1/1800)的数据运行主成分分析，两个第一主成分用于代表每个患者。三角形和圆圈分别表示大流行之前的对照以及COVID-19患者。D.PCA载荷。PCA的两个第一主成分的载荷的直观表示。针对RBD、刺突、NP和MPro(如所示的)的IgG滴度的每个稀释度都表示为一个单独的变量。

图17.ROC曲线将COVID-19患者分类为重症或轻症。单独使用igG数据或包括来自其他同种型的数据，训练随机森林以区分患有重症或轻症的COVID-19患者，然后使用随机森林来预测未见的患者(占总样本的1/7)。显示每个条件下300次随机重复后的平均ROC曲线。

图18.与单个病毒抗原包被珠结合的抗His抗体的滴定。A.MPro珠的抗体结合能力的估计。将包被有SARS-CoV-2Mpro的磁珠与指定量的抗his标签抗体一起孵育，然后与抗兔-PE孵育，并通过流式细胞术进行分析。直方图显示了对于每个抗His浓度的荧光强度。B.SARS-CoV-2抗原包被珠的抗体结合能力的估计。对不同的磁珠平行进行了同样的操作，每种磁珠都用一种SARS-CoV-2抗原进行包被：刺突、S的受体结合结构域(RBD)、核衣壳蛋白(NP)和3CL主要蛋白酶(Mpro)。使用抗His抗体的三种稀释度：16ng/ml、80ng/ml和400ng/ml。这些图表示为针对每个测试条件获得的MFI值。

图19.图1，SARS-CoV-2抗原。在大肠杆菌中表达并从细菌沉淀的可溶性级分中提取核衣壳(NP)(A)和半胱氨酸样蛋白酶(3CLpro，Mpro)(B)蛋白。在HiTrap Ni2+螯合柱中选择后，洗脱的级分在SDS-PAGE(顶部凝胶)中跑样。使用Superdex75柱通过凝胶过滤进一步纯化蛋白质，并在SDS-PAGE(底部凝胶)中跑样。FPLC谱如右图所示。mRBD(C)。刺突蛋白的334至528片段在哺乳动物细胞中产生，该片段在N末端与HA标签融合，在C末端与TIM-1粘蛋白结构域以及随后的人IgG的Fc部分融合，其中的两个凝血酶识别位点(星号)允许在用凝血酶处理后释放mRBDm-Fc片段[(+T)SDS-PAGE右图]。在蛋白A和尺寸排阻层析(Superdex75)纯化后，在还原条件下跑SDS-PAGE。显示了与蛋白A柱结合(B)和未结合(U)的蛋白。(D)在非还原条件下纯化蛋白质的SDS-PAGE。E.RBD特异性抗体的比较。板用SARS-CoV-2RBD蛋白包被，该SARS-CoV-2RBD蛋白使用昆虫或哺乳动物细胞在真核系统中产生，并测试了血清稀释液(1/100至1/1600)。使用抗人IgG抗体进行检测。黑色符号对应COVID-19患者，灰色符号对应COVID-19之前的供者样本。

发明内容

一种名为严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的新型β冠状病毒株与已被WHO正式确认为大流行病的致命性呼吸道疾病COVID-19之间的联系已被确定，导致世界各地的卫生系统急于开发和实施病毒感染检测。病毒基因组的快速克隆和测序允许开发基于PCR的检测病毒核酸的测定，这已成为临床诊断和流行病学监测研究的关键策略。然而，PCR检测并非100％有效，事实上，据报道，COVID-19患者的RNA检测总体阳性率可低至30至50％(Liu等人.Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2infection in4880cases from one hospital in Wuhan,China,from Jan to Feb 2020.Clin ChimActa.2020；505:172-5；Yu等人.Quantitative Detection and Viral Load Analysis ofSARS-CoV-2in Infected Patients.Clin Infect Dis.2020；Wang等人.The geneticsequence,origin,and diagnosis of SARS-CoV-2.Eur J Clin Microbiol InfectDis.2020)。此外，病毒RNA检测需要专门的基础设施和训练有素的操作员，而且重要的是，无法检测既往感染的证据，而既往感染的证据对于评估有多少人已被感染的流行病学工作是至关重要的。测量抗体反应和确定血清转化的测定虽然不适用于检测急性感染，但却是补充信息的宝贵来源。血清学检测允许定量研究对SARS-CoV-2的免疫反应，对于确定任何给定地区的感染流行率也至关重要；定义感染致死率的必要变量，对于指导流行病管理具有相当大的实用性。最后，抗体反应的定量和定性分析可有助于确定与对SARS-CoV-2的有效免疫相关的因素、这些免疫反应的持续时间，还可有助于选择可用于产生恢复期血清/血浆制品以用于治疗用途的供者。

用于检测SARS-CoV-2暴露的多抗体测试正在变得可用，但是这些测定中大多数已经过优化以检测针对病毒的刺突(S)蛋白或核蛋白的免疫球蛋白G(IgG)抗体。这些蛋白质是病毒颗粒的关键元件，与其他冠状病毒类似，预计它们具有高度免疫原性。然而，病毒基因组中编码的28种其他病毒蛋白的免疫原性鲜为人知。

在这里，我们研究了病毒感染后引起的对主要病毒蛋白酶(Mpro或3CLPro)的抗体反应。与其他β冠状病毒一样，SARS-CoV-2是一种将其所有蛋白质表达为单条多肽链的正义RNA病毒。Mpro在病毒复制中发挥关键作用，即切割1ab多聚蛋白以产生成熟蛋白。由于这种活性对于病毒生命周期至关重要，因此对MPro的结构和功能进行了深入研究，因为这种酶的特异性抑制剂可能充当有效的抗病毒剂。我们现在首次报告，感染SARS-CoV-2的个体对Mpro产生了高滴度抗体反应，并且对该蛋白的血清反应性测定灵敏且特异性地区分感染者和未感染者。

因此，一般而言，本发明提供了分离的重组表达的SARS-CoV-2M^pro蛋白及其片段，用于检测受感染人类中的SARS-CoV-2特异性抗体。

定义

在本发明的上下文中，SARS-CoV-2的3C样蛋白酶(3CLpro，也称为主要蛋白酶，M^pro)的特征在于具有GenBank登录号MN908947.3的ORF1ab多聚蛋白的残基3264至3569。该氨基酸序列在本文中也被表征为SEQ ID NO 1(下文中称为“SARS-CoV-2M^pro蛋白”)。

根据本发明的SARS-CoV-2M^pro蛋白的“片段”是SARS-CoV-2M^pro蛋白的部分氨基酸序列或这样的片段的功能等价物。片段比完整的SARS-CoV-2M^pro蛋白短，优选长约15、20或65个至约305个氨基酸，更优选长约15、20或65个至约250个氨基酸，甚至更优选长约65个至约200个氨基酸。SARS-CoV-2M^pro蛋白的片段还包括具有至少15、20或65个连续氨基酸残基的肽，所述肽与SEQ ID No.1的至少约15、20或65个连续氨基酸残基具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、优选至少约95％、更优选至少98％的序列同一性，SEQ ID No.1的长度与所述肽大约相同。根据所选择的表达系统，蛋白质片段可能会也可能不会以天然糖基化形式表达。

“基本对应于”SARS-CoV-2M^pro蛋白片段的片段是具有与SARS-CoV-2M^pro蛋白的特定片段基本相同的氨基酸序列和基本相同的功能的片段。

具有与SARS-CoV-2M^pro蛋白的片段“基本相同的氨基酸序列”的片段与该片段具有大于90％的氨基酸同一性。该定义中包括保守氨基酸取代。

如本文所用，“表位”是指多肽的抗原决定簇。表位可包含呈现该表位特有的空间构象的三个氨基酸。通常，表位由至少五个这样的氨基酸组成，更通常由至少8至10个这样的氨基酸组成。确定此类氨基酸的空间构象的方法是本领域已知的。

本文使用的“抗体”是多克隆和/或单克隆抗体或其片段(包括重组抗体片段)及其免疫结合等价物，它们能够特异性结合SARS-CoV-2M^pro蛋白和/或其片段。术语“抗体”用于指同种类分子实体或混合物，例如由多种不同分子实体组成的血清产物。重组抗体片段可以例如源自单克隆抗体或可以分离自由经免疫的非人动物构建的文库。

本文在测试生物样本的上下文中所用的“灵敏度”是SARS-CoV-2样本的M^pro真阳性数量除以SARS-CoV-2样本的M^pro真阳性数量加上SARS-CoV-2样本的M^pro假阴性数量的总和所得的百分位数。

本文在测试生物样本的上下文中所用的“特异性”是SARS-CoV-2样本的M^pro真阴性数量除以SARS-CoV-2样本的M^pro真阴性数量加上假阳性样本数量的总和所得的百分位数。

本文在SARS-CoV-2病毒特异性抗体的上下文中使用的“检出率”是检出抗体的SARS-CoV-2M^pro阳性样本数除以所测试的SARS-CoV-2M^pro阳性样本的总数所得的百分位数。本文所用的“总体检出率”是指同时检测IgM和IgG得到的病毒检出率。

“临床样本”包括来自一名患者或来自随机混合的患者的生物样本，其中包括患有SARS-CoV-2和未患有SARS-CoV-2的患者。

如本文所用，“症状发作”是发热和咳嗽的发作。

在两个或更多个多肽或蛋白质的上下文中，术语“序列同一性”或“百分比同一性”是指，当与第二种分子进行比较和比对以获得最大对应性时，如使用序列比较算法(例如，通过BLAST比对或技术人员已知的任何其他算法)或者可替代地通过目视检查所测得的，两个或更多个序列或子序列相同(“一致”)或具有特定百分比的一致的氨基酸残基(“同一性百分比”)。

如果在最佳对齐的情况下，与天然存在的蛋白质或由其衍生的肽的氨基酸序列同一性为至少约60％的同一性、通常至少约70％的同一性、更通常至少约80％的同一性、优选至少约90％的同一性、更优选至少约95％的同一性，最优选至少约98％的同一性，那么本发明的蛋白质或肽与另一蛋白质或肽是基本上一致的。同一性是指两个多肽或两个多核苷酸序列之间的序列相关性程度，如通过两串这样的序列(例如完全和完整的序列)之间的匹配的同一性所确定的。同一性可以很容易地计算出来。存在许多测量多肽序列之间同一性的方法，同时术语“同一性”是技术人员所熟知的。

描述

在本发明的第一方面，我们在此提供了一种检测至少一个生物样本中与SARS-CoV-2病毒的至少一个表位结合的抗体的体外方法，包括：

a.使所述至少一个生物样本与至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或所述分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白的包含SARS-CoV-2病毒的至少一个表位的至少一个片段接触，和

b.检测所述病毒蛋白或所述片段与所述生物样本中存在的抗体之间抗原-抗体复合物的形成。

在此指出，为了生产大量的至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或至少一种包含SARS-CoV-2病毒的至少一个表位的所述分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白的其片段，可以通过RT-PCR产生来自基因组RNA的DNA片段。适当的PCR引物可包括限制酶切割位点。纯化后，PCR产物可以用合适的限制酶消化并克隆到合适的表达载体中，优选地，该表达载体受强启动子控制。然后可以将载体转化到合适的宿主细胞中。阳性克隆可通过PCR筛选鉴定，并通过酶切和序列分析进一步确认。然后可以测试如此产生的蛋白质/片段作为抗原用于第一方面的方法的适用性。

在第一方面的优选实施方式中，所述至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白是SEQID NO 1的蛋白或SEQ ID NO 1的变体，该变体与SEQ ID NO 1具有至少80％、85％、90％或95％的序列同一性，例如与SEQ ID NO 1具有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在第一方面的另一优选实施方式中，所述分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白的包含SARS-CoV-2病毒的至少一个表位的至少一个片段包括至少15、20或65个连续氨基酸残基，该至少15、20或65个连续氨基酸残基与SEQ ID No.1的至少约15、20或65个连续氨基酸残基具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、优选至少约95％、更优选至少98％的序列同一性。优选地，所述至少一种所述分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白的片段的灵敏度大于约70％、至少约80％、至少约90％、优选至少约95％、更优选至少98％或99％。优选地，所述至少一种所述分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白的片段的特异性大于约70％、至少约80％、至少约90％、优选至少约95％、更优选至少98％或99％。更优选地，所述至少一种所述分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白的片段的检出率或总体检出率大于约65％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、优选至少约95％、更优选至少98％或99％。

在第一方面或其任何优选实施方式的又一优选实施方式中，所述方法适于检测IgG、IgM和/或IgA。优选地，所述方法适于检测IgG。在另一个优选的实施方式中，所述方法适于在液体生物样本(优选血清)稀释度为约1:100、约1:800、约1:900、约1:1000、约1:1100直至约1:1200、1:800或1:3200下检测IgG。在另一个优选的实施方式中，根据本发明的方法能够在液体生物样本(优选血清)稀释度为约1:50、约1:100、约1:200直至约1:400或1:1000下检测IgM。

在第一方面或其任何优选实施方式的另一优选实施方式中，所述至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或其片段是重组表达产物。

在第一方面或其任何优选实施方式的又一优选实施方式中，实施该方法的适当生物样本包括但不限于漱口液、任何生物流体、病毒分离物、组织切片、野生和实验室动物样本。优选地，所述生物样本是分离自对象、优选哺乳动物、更优选人类的血液、血浆或血清样本。优选地，所述生物样本是血清或血清样本。在优选的实施方式中，生物样本是漱口液，优选唾液。

在第一方面或其任何优选实施方式的又一优选实施方式中，所述方法是检测具有针对SARS-CoV-2病毒的抗体的对象的体外诊断方法，其中所述对象优选是哺乳动物，更优选是人类，并且其中如果检测到所述病毒蛋白或所述片段与所述生物样本中存在的抗体之间的抗原-抗体复合物，则所述对象被诊断为具有针对SARS-CoV-2病毒的抗体。在一些实施方式中，哺乳动物选自人类、鼬科动物或猫科动物。在进一步优选的实施方式中，哺乳动物选自猫、狗、大鼠、牛、山羊、绵羊、马、猪、雪貂、人类、兔、豚鼠、牛和/或小鼠。更优选地，哺乳动物是猫、人类和/或雪貂。

在优选的实施方式中，根据本发明的所述体外诊断方法将能够另外检测SARS-CoV-2感染的广泛阶段。在又一个优选的实施方式中，所述诊断方法将能够检测SARS-CoV-2感染的早期阶段。在另一个优选的实施方式中，所述诊断方法将通过能够检测IgM而能够检测感染的早期阶段。在另一个优选的实施方式中，所述诊断方法将通过能够检测IgG而能够检测感染的后期阶段或既往感染。在另一个优选的实施方式中，所述诊断方法将通过能够检测非常低浓度的抗体而能够检测感染的早期阶段。因此，在优选的实施方式中，该诊断方法适用于在症状出现后少于约50天检测针对SARS-CoV-2病毒的抗体，优选在症状出现后少于约40天、少于约30天、少于约25天、少于约20天、少于约15天、少于约12天、少于约10天、少于约9天、少于约8天、少于约7天、少于约6天、少于约5天或少于约4天进行检测。

在第一方面或其任何优选实施方式的又一优选实施方式中，所述方法是用于将不具有抗SARS-CoV-2病毒抗体的个体与具有抗SARS-CoV-2病毒抗体的个体筛选开来的体外方法。

在第一方面或其任何优选实施方式的又一优选实施方式中，抗原-抗体结合的存在可通过本领域熟知的方法检测。在根据本发明的一种优选方法蛋白质印迹中，将蛋白质片段从凝胶转移到稳定的支持物如硝酸纤维素膜上。这些蛋白质片段可以与疑似感染SARS-CoV-2病毒的个体的血清发生反应。此步骤之后是洗涤步骤，该步骤将去除未结合的抗体但保留抗原-抗体复合物。然后可以通过例如用放射性同位素标记的抗免疫球蛋白抗体检测抗原-抗体复合物。因此，使用蛋白质印迹可以检测SARS-CoV-2阳性人血清与SARS-CoV-2蛋白的M^pro或其片段的结合。

其他优选的检测方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)和斑点印迹。这两种方法都相对容易使用并且是高通量方法。尤其是ELISA，已获得临床人员的高度认可。ELISA，优选基于化学发光或比色法的ELISA，也是高度敏感的。然而，也可以使用任何其他合适的方法来检测抗原-抗体复合物，例如但不限于标准化放射免疫测定(RIA)、侧流测试(也称为侧流免疫层析测定)或免疫荧光测定(IFA)。优选地，特别优选的方法是ELISA测定，更优选化学发光酶联免疫吸附测定(ELISA)。

在第一方面或其任何优选实施方式的又一优选实施方式中，检测方法是通过使用本说明书稍后描述的ELISA系统进行的ELISA测定。

在第一方面或其任何优选实施方式的又一优选实施方式中，使所述生物样本与至少一种或多种另外的SARS-CoV-2免疫原或其片段接触，其中优选地，所述免疫原选自由以下组成的组：SARS-CoV-2的核衣壳(N)蛋白、包括S1亚基的刺突(S)结构域、和/或SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)。

在第一方面或其任何优选实施方式的又一优选实施方式中，使所述生物样本与至少一种或多种衍生自至少一种不同的分离的SARS蛋白的另外的免疫原接触。

本发明的第二方面涉及一种用于检测生物样本中与SARS-CoV-2病毒的至少一个表位结合的抗体的体外试剂盒，包括：

a.至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或所述分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白的包含SARS-CoV-2病毒的至少一个表位的至少一个片段，和

b.用于检测所述至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或其片段与生物样本中存在的至少一种抗体之间抗原-抗体复合物的形成的试剂，

其中所述至少一种分离的蛋白质或其片段和所述试剂的存在量足以检测所述抗原-抗体复合物的形成。

在本发明的第二方面的优选实施方式中，所述至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白是SEQ ID NO 1的蛋白或SEQ ID NO 1的变体，该变体与SEQ ID NO 1具有至少80％、85％、90％或95％的序列同一性，例如与SEQ ID NO 1具有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在本发明的第二方面的另一优选实施方式中，所述分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白的包含SARS-CoV-2病毒的至少一个表位的至少一个片段包括至少15、20或65个连续氨基酸残基，该至少15、20或65个连续氨基酸残基与SEQ ID No.1的至少约15、20或65个连续氨基酸残基具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、优选至少约95％、更优选至少98％的序列同一性。

在本发明第二方面的另一优选实施方式中，所述试剂能够检测IgG、IgM和/或IgA。优选地，所述试剂能够检测IgG。在另一优选的实施方式中，所述试剂能够在约1:100、约1:800、约1:900、约1:1000、约1:1100直至约1:1200的稀释度下检测IgG。在另一优选的实施方式中，所述试剂能够在约1:50、约1:100、约1:500直至约1:1000的稀释度下检测IgM。

在一个特别优选的实施方式中，该试剂盒适用于进行放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)(优选化学发光或比色酶联免疫吸附测定(ELISA))、免疫荧光测定(IFA)、斑点印迹、侧流测试(也称为侧流免疫层析测定)或蛋白质印迹。优选地，试剂盒是ELISA系统。

在本发明的上下文中，ELISA(酶联免疫吸附测定)系统优选被理解为设计用于检测和定量至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或其片段的基于板的测定技术。在此ELISA中，必须将至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或其片段固定到固体表面，然后暴露于生物样本以形成复合物。检测是通过本领域熟知的任何技术完成的。

根据本发明的ELISA通常在96孔(或384孔)聚苯乙烯板中进行，该板将被动结合至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或其片段。试剂的结合和固定使ELISA的设计和执行变得简单。将ELISA的反应物固定到微孔板表面能够在测定过程中使结合物质和非结合物质轻松分离。这种洗去非特异性结合物质的能力使ELISA成为测量粗制品中特定分析物的强大工具。

在本发明第二方面的优选实施方式中，ELISA系统包含：至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或其片段以包被固体表面(优选微量滴定板孔)，以及可选的以下试剂中的一种或多种：用于未结合位点以防止假阳性结果的封闭试剂；与标记(优选酶)缀合的抗-(物种)的IgG、IgM和/或IgA；和与标记(优选酶)反应以指示阳性反应的底物。除了程序试剂外，诸如洗涤缓冲液、终止液和稳定剂的其他试剂也可以提高ELISA检测的质量。在选择单独的试剂或完整的试剂盒时，了解所需的灵敏度以及它们是否试图检测分析物或对其的抗体反应是有帮助的。

在本发明第二方面的又一优选实施方式中，所述至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或其片段是重组表达产物。

在本发明第二方面的又一优选实施方式中，所述至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白是SEQ ID NO 1的蛋白。

本发明的第三方面涉及本发明的第二方面或其任何优选实施方式的试剂盒用于实施本发明的第一方面中公开的任何方法的用途。

根据本发明如上所述的至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或所述分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白的包含SARS-CoV-2病毒的至少一个表位的至少一个片段的用途是目前看来最有吸引力的。然而，本发明的实施方式及其用途的前述公开仅出于说明的目的而不是限制本发明。因此，本发明应当被认为包括落在实施例部分之后的权利要求及其任何等同物的范围内的所有实施方式。

以下实施例仅是说明性的，不应被解释为以任何方式限制所附权利要求中阐述的本发明。

实施例

以下序列用于执行本说明书和附图中所示的实施例和图片：

序列表

SARS-CoV-2Mpro的肽序列(SEQ ID NO 1)：

SAVLQSGFRKMAFPSGKVEGCMVQVTCGTTTLNGLWLDDVVYCPRHVICTSEDMLNPNYEDLLIRKSNHNFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCVLKLKVDTANPKTPKYKFVRIQPGQTFSVLACYNGSPSGVYQCAMRPNFTIKGSFLNGSCGSVGFNIDYDCVSFCYMHHMELPTGVHAGTDLEGNFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITVNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTTLNDFNLVAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCASLKELLQNGMNGRTILGSALLEDEFTPFDVVRQCSGVTFQLEHHHHHH

SARS-CoV-2Mpro的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)：

tcagctgttttgcagagtggttttagaaaaatggcattcccatctggtaaagttgagggttgtatggtacaagtaacttgtggtacaactacacttaacggtctttggcttgatgacgtagtttactgtccaagacatgtgatctgcacctctgaagacatgcttaaccctaattatgaagatttactcattcgtaagtctaatcataatttcttggtacaggctggtaatgttcaactcagggttattggacattctatgcaaaattgtgtacttaagcttaaggttgatacagccaatcctaagacacctaagtataagtttgttcgcattcaaccaggacagactttttcagtgttagcttgttacaatggttcaccatctggtgtttaccaatgtgctatgaggcccaatttcactattaagggttcattccttaatggttcatgtggtagtgttggttttaacatagattatgactgtgtctctttttgttacatgcaccatatggaattaccaactggagttcatgctggcacagacttagaaggtaacttttatggaccttttgttgacaggcaaacagcacaagcagctggtacggacacaactattacagttaatgttttagcttggttgtacgctgctgttataaatggagacaggtggtttctcaatcgatttaccacaactcttaatgactttaaccttgtggctatgaagtacaattatgaacctctaacacaagaccatgttgacatactaggacctctttctgctcaaactggaattgccgttttagatatgtgtgcttcattaaaagaattactgcaaaatggtatgaatggacgtaccatattgggtagtgctttattagaagatgaatttacaccttttgatgttgttagacaatgctcaggtgttactttccaactcgagcaccaccaccaccaccactga

SARS-CoV-2核衣壳蛋白的肽序列(SEQ ID NO 3)：

MASDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPVEHHHHHH

SARS-CoV-2核衣壳蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO 4)：

atggcttctgataatggtccgcaaaatcagcgtaatgcaccccgcattacgtttggtggaccctcagattcaactggcagtaaccagaatggagaacgcagtggggcgcgatcaaaacaacgtcggccccaaggtttacccaataatactgcgtcttggttcaccgctctcactcaacatggcaaggaagaccttaaattccctcgaggacaaggcgttccaattaacaccaatagcagtccagatgaccaaattggctactaccgaagagctaccagacgaattcgtggtggtgacggtaaaatgaaagatctcagtccaagatggtatttctactacctaggaactgggccagaagctggacttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagggagccttgaatacaccaaaagatcacattggcacccgcaatcctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagaagggagcagaggcggcagtcaagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagagcaaaatgtctggtaaaggccaacaacaacaaggccaaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcttctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccactaaagcatacaatgtaacacaagctttcggcagacgtggtccagaacaaacccaaggaaattttggggaccaggaactaatcagacaaggaactgattacaaacattggccgcaaattgcacaatttgcccccagcgcttcagcgttcttcggaatgtcgcgcattggcatggaagtcacaccttcgggaacgtggttgacctacacaggtgccatcaaattggatgacaaagatccaaatttcaaagatcaagtcattttgctgaataagcatattgacgcatacaaaacattcccaccaacagagcctgtcgagcaccaccaccaccaccactga

SARS-CoV-2RBD(受体结合结构域)的肽序列(SEQ ID NO 5)：

gsrNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKlvpr

SARS-CoV-2RBD的核苷酸序列(SEQ ID NO 6)：

ggatcccgcaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaacttgtccctcgc

实施例1

材料和方法

SARS-CoV-2半胱氨酸样蛋白酶(3CLpro，Mpro)和核衣壳蛋白(NP)的分子克隆

编码SARS-CoV-2Mpro的基因(ORF1ab多蛋白残基3264-3569，GenBank代码：MN908947.3)通过PCR使用寡核苷酸5'-gacccatggcttcagctgtttttcagagtggttt-3'和5'-gacctcgagttggaaagtaacacctgagcatt-3'进行扩增，用NcoI和XhoI消化，并连接到用相同限制酶消化的载体pET22b(Novagen)中。该构建体的完整性通过MWG Eurofins测序验证。

使用寡核苷酸5'-gatccatggcttctgataatggtccgcaaaatcagcgtaatgca-3'和5'-caggtcgacaggctctgttggtgggaatg-3'扩增SARS-CoV-2的核衣壳蛋白(NP)。然后将扩增产物用NcoI和SalI消化，并连接到用NcoI和XhoI消化的pET26b载体(Novagen)中。

所有构建体的完整性通过MWG Eurofins测序验证。

SARS-CoV-2半胱氨酸样蛋白酶(3CLpro，Mpro)和核衣壳蛋白的表达

通过将该质粒转化到大肠杆菌菌株BL21 Star(DE3)pLysS(ThermoFisher)中来表达SARS-CoV-2Mpro蛋白。转化的克隆在含有氨苄青霉素(150μg/mL)和氯霉素(34ug/ml)的50mL 1xLB培养基中在室温下预培养过夜。然后将过夜培养物接种到1L的1xLB培养基(150μg/mL氨苄青霉素和34ug/ml氯霉素)中，培养物在37℃下搅拌生长，直到OD₆₀₀达到0.6，此时将异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入1mM以诱导Mpro基因的过表达。除了使用卡那霉素(150ug/ml)代替氨苄青霉素进行抗生素介导的选择外，遵循相同的方案来生产核衣壳蛋白。

在22℃下过夜培养后，通过4℃下以9500xg离心15分钟收集细菌，通过在150mLTES缓冲液(20mM Tris pH8、2mM EDTA、150mM NaCl)中重悬来洗涤沉淀物，并再次离心。洗涤后的沉淀物立即处理或冷冻储存以备后用。

将新鲜或解冻的细胞沉淀重悬于冰冷的50mM NaH₂PO₄缓冲液pH8、500mM NaCl、10mM咪唑(I2399，Sigma Aldrich)、0.1％肌氨酰和5％甘油(pH8.0)中。然后添加溶菌酶(至0.25mg/ml)以及苯甲基磺酰氟、亮肽素和胃酶抑素A(均至终浓度为1mM)和DNaseI(2μg/ml)。通过超声处理(3个循环，每次30秒，脉冲之间在冰上静置30秒)裂解细菌，并通过在4℃下以14,000g离心裂解的细胞45分钟来分离可溶性蛋白质。

使用5ml HiTrap Ni2+螯合柱(琼脂糖珠技术)从裂解物中纯化6-组氨酸标签化蛋白。将细菌上清液以1ml/min的流速加样到柱上，然后用5个柱体积的50mM NaH₂PO₄缓冲液、500mM NaCl、10mM咪唑洗涤，然后用5个柱体积的50mM NaH₂PO₄缓冲液、500mM NaCl、25mM咪唑洗涤。使用25mM至250mM的咪唑线性梯度，以超过5个柱体积洗脱重组蛋白(洗脱级分的代表性SDS-PAGE分析显示在图19A中)。然后使用在10mM Tris、2mM EDTA、300mM NaCl，pH7.5中预平衡的10/30Superdex 75Increase柱(Cytiva)，通过凝胶过滤进一步纯化蛋白质。凝胶过滤分析表明，SARS CoV 2Mpro蛋白被纯化为二聚体。

哺乳动物细胞中SARS-CoV-2受体结合结构域蛋白(mRBD)的分子克隆和生产

扩增编码S蛋白(PDB ID 6VSB)结构中定义的受体结合结构域(RBD)的cDNA区域(残基334至528)，以在哺乳动物细胞中表达。该片段在其5'端与IgK前导序列、HA标签(YPYDVPDYA)和凝血酶识别位点(LVPRGS)同框克隆，随后在3'端克隆第二个凝血酶位点、TIM-1粘蛋白结构域和人IgG1 Fc区。将重组cDNA克隆到衍生自pEF-BOS(9)的载体中以便在HEK293细胞中瞬时表达，并克隆到pBJ5-GS载体中以便在基于谷氨酰胺合成酶系统在CHO细胞中稳定生产蛋白(Casasnovas JM,and Springer TA.Kinetics and thermodynamics ofvirus binding to receptor.Studies with rhinovirus,intercellular adhesionmolecule-1(ICAM-1),and surface plasmon resonance.The Journal of biologicalchemistry.1995；270(22):13216-24)。包含TIM-1粘蛋白结构域增强了蛋白质表达。

与粘蛋白结构域和Fc区融合的哺乳动物RBD(mRBD)(mRBD-粘蛋白-Fc)最初使用IgSelect柱(GE Healthcare)通过亲和层析从细胞上清液中纯化。通过在室温下用凝血酶处理过夜，粘蛋白-Fc部分和HA-标签被释放而与mRBD蛋白分离。将混合物通过蛋白A柱以去除粘蛋白-Fc蛋白，并使用Superdex 75柱在HBS缓冲液(25mM HEPES和150mM NaCl，pH7.5)中通过尺寸排阻层析进一步纯化mRBD。通过280nm处的吸光度来确定纯化的mRBD的浓度。

用于检测针对SARS-CoV-2的抗体的ELISA

用以下来包被96孔Maxisorp Nunc-Immuno板：100μL/孔的在硼酸盐缓冲盐水(BBS，10mM硼酸盐，150mM NaCl，pH8.2)中稀释重组蛋白；0.5μg/ml的NP和蛋白酶，1μg/ml的RBD，并在4℃下孵育过夜。然后吸出包被溶液，将ELISA板用200μl PBS 0.05％ Tween 20(PBS-T)洗涤3次然后干燥，然后在室温下用含有1％酪蛋白的PBS(Biorad)封闭2小时。再次用PBS-T洗涤板，并如所示，添加100μl在PBS-酪蛋白、0.02％Tween-20中稀释的患者血清/血浆样本并在37℃下孵育2小时。再次洗涤板，添加100μL/孔所示的检测抗体，这些检测抗体均来自Jackson Labs(AffiniPure兔抗人IgM，Fcμ片段特异性.HRPO；AffiniPure兔抗人血清IgA，α链特异性.HRPO；或AffiniPure兔抗人IgG，Fcγ片段特异性.HRPO)，并在室温下孵育1小时。板用PBS-T洗涤四次，并与100μL/孔的底物溶液(OPD，Sigma，根据制造商的说明制备)一起在室温下避光孵育(通常持续3分钟)。然后将50μL终止溶液(3M H₂SO₄)添加到每个孔中，并使用酶标仪测定每个孔的光密度(492nm处)。

阴性对照包括仅包被有封闭缓冲液和2019年之前收集自供者的血清样本的孔。

统计学分析

使用Graph Pad Prism 8软件(GraphPad Software，美国，www.graphpad.com)和Windows版Stata 14.0(Stata Corp LP，College Station，TX，美国)进行图形和统计学分析。遵循非正态分布的定量变量表示为中位数和四分位数范围(IQR)，并使用Mann Whitney检验来检验统计学上的显著差异。具有正态分布的变量通过均值±标准偏差(SD)描述，组间差异通过学生t检验进行评估。定性变量被描述为计数和比例，并使用χ2或Fisher精确检验进行比较。使用皮尔逊相关检验分析定量变量之间的相关性。

如前所述确定了COVID-19的严重程度(Ibarrondo等人.2020.Rapid decay ofanti-SARS-CoV-1antibodies in persons with mild covid-19.N Engl J Med)。在这种情况下，为了确定严重程度的组之间抗体滴度的差异，采用了评估有序组间趋势的Cuzick检验。

由于几个变量可能导致ELISA滴度的差异，因此使用广义线性模型(Stata的glm命令)进行多变量线性分析，在广义线性模型中，因变量是每种同种型针对每种蛋白质的ELISA滴度。第一模型包括年龄、性别和症状出现的时间，然后采用向后逐步方法去除所有p值>0.15的变量以获得每种蛋白质和同种型的最佳模型。然后，将感兴趣的变量(严重性、嗅觉丧失或IL-6血清水平)强制纳入模型。

为了确定不同的ELISA区分COVID-19之前血清和从SARS-CoV-2患者获得的血清的能力，正如鼻咽渗出液的阳性PCR所确定的那样，使用Stata(College Station，Texas)的roctab命令进行了ROC分析。每个截止点都是根据灵敏度、特异性之间的最佳权衡值和正确分类的患者百分比选择的。还获得了ROC曲线和曲线下面积(AUC)。

患者样本和机构审查委员会

本研究使用的样本来自La Princesa健康研究所(IIS-IP)研究伦理委员会批准的研究项目“免疫反应动力学作为COVID-19疾病演变的预测因子.对治疗决策的影响”[PREDINMUN-COVID](注册号4070)。一些实验包括来自La Paz医院委员会批准的“在不同的宿主健康和COVID-19严重程度情况下，针对SARS-COV-2的淋巴细胞反应的研究(InmunoCOVID)”(HULP:PI-4101)的患者。所有实验均按照赫尔辛基宣言中确立的伦理原则进行。所有纳入的患者(或其代表)都被告知该研究并签署了书面知情同意书。

患者选择

该研究招募了36名经PCR诊断的COVID-19患者。其中9人在研究期间表现出SARS-CoV2的活动性感染，而其余人则没有可检测到的病毒水平。10名患者需要住院治疗，其中6名被送入ICU(表1)。2019年6月之前(PRE-COVID-19)收集自表现出单克隆丙种球蛋白病、过敏性疾病或类风湿性关节炎的患者的33份血清样本被用作阴性对照。所有样本在使用前都冷冻保存。

唾液样本中的抗体检测

选择了12名血清中具有高抗体滴度的供者来测量唾液中的针对SARS-CoV2的特异性IgG和IgA。为此，从这些患者以及11名健康供者中采集了新的唾液样本，将其等分并立即冷冻。使用前，将唾液样本解冻，以400g离心，并在含有1％酪蛋白(Bio-Rad)和0.02％Tween-20并补充有Complete^TM蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的1xPBS中以1/2、1/4和1/10稀释。

结果

来自SARS-CoV-2的可溶性半胱氨酸样蛋白酶(3CLpro，Mpro)

为了探索不同冠状病毒的半胱氨酸样蛋白酶之间的相似性，对来自SARS-CoV-2、HCovNL63和HCov229E的3CLpro(Mpro)进行了比对(图6)。相似度约为40％。

扩增来自Wuhan-Hu-1毒株(GenBank登录号MN908947.3)的SARS-CoV-2半胱氨酸样蛋白酶(也称为3CLpro，MPro)的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)，并将其亚克隆到原核表达载体pET22b中，在大肠杆菌BL21 Star(DE3)pLysS菌株中表达可溶性蛋白。从细菌裂解物中提取可溶性蛋白质并在Ni-NTA柱中选择His标签化的蛋白质后，通过尺寸排阻纯化Mpro，产生表观Mw约为70kDa的蛋白质，其对应于二聚体。图1显示了重组蛋白的示意图和SDS-PAGE数据。

由于目的是首次评估冠状病毒感染的个体是否可以产生针对半胱氨酸样蛋白酶的抗体反应，因此还产生了其他SARS-CoV-2蛋白：NP(SEQ ID NO 4)在大肠杆菌中表达，RBD通过在哺乳动物细胞中转染来表达(SEQ ID NO 5的mRBD)。NP和蛋白酶具有组氨酸标签，它们在Ni²⁺-NTA柱上纯化，然后进行尺寸排阻。

高滴度的SARS-CoV-2 3CLpro特异性抗体可在Covid-19阳性患者血清中检测到，但在阴性供者中检测不到。

使用covid-19患者血清进行的首次实验表明，存在高滴度的MPro抗体。抗体对蛋白酶的反应性在低浓度下达到饱和，有效区分了感染SARS-CoV-2的个体和未感染该病的个体(图2A)。此外，可以检测三种同种型的抗体，IgG、IgM和IgA。不同血清针对蛋白酶MPro的反应性与对其他病毒蛋白的反应性相当，或者在某些情况下更强(图2B)。

关于不同血清针对Mpro相比于RBD的反应性之间的比较，发现针对蛋白酶MPro的IgG反应性与针对RBD的反应性相当，有时甚至更强，但是，在哺乳动物细胞或杆状病毒中表达的RBD重组蛋白之间没有发现差异(图19E)。为了进一步验证该测定，进行了额外的对照，例如监测没有包被病毒抗原的板中的背景和测试在COVID-19大流行之前收集的血清(图7)。

识别的特异性在包被滴定实验和血清滴定中是明显的(图4)。

以上数据的特异性和灵敏度/ROC分析

基于两种抗原(NP和蛋白酶-His)的ELISA检测具有高灵敏度和特异性的IgG抗体，基于蛋白酶作为抗原的测定至少与NP一样地灵敏和特异(图3)。

如图5所示，使用血清样本，基于核蛋白、蛋白酶和mRBD抗原的ELISA的比较表明，使用N和P抗原的测定可能比使用mRBD的测定更灵敏。

通过ELISA在COVID-19患者血清中可检测到Mpro特异性抗体

由于这项研究首次评估了冠状病毒感染的个体是否可以产生针对半胱氨酸样蛋白酶MPro的抗体反应，因此产生了血清学测试中常用的其他SARS-CoV-2蛋白以供比较。在大肠杆菌中表达Mpro和NP，并使用两种不同的刺突蛋白受体结合结构域(RBD)构建体：一种通过在哺乳动物细胞中转染(mRBD)来表达，另一种通过昆虫细胞的杆状病毒感染来产生(iRBD-His)。除了mRBD之外，所有蛋白质都具有组氨酸标签，并且它们在Ni²⁺-NTA柱上纯化，然后进行尺寸排阻层析(图19A至图19D)。

SARS-CoV-2Mpro特异性抗体的检测以高特异性和灵敏度识别COVID-19血清阳性个体

La Princesa大学医院招募了36名COVID-19患者(PCR+)和33名健康供者的队列(表1)，并进行了ELISA检测以检测血清中IgG、IgA和IgM亚类的Mpro特异性抗体以及RBD特异性抗体和NP特异性抗体(图8)。

表1.患者人口统计学数据和临床数据

血清样本的滴定是在1/50到1/3200的稀释范围内进行的，这些实验显示，对所有三种抗原进行的血清阳性测定区分了COVID-19阳性和阴性供者，如比较不同稀释度的点图所示(图10)。图8总结了所有血清样本的吸光度数据。为了估计每个抗原/Ig同种型配对的截止值、灵敏度和特异性参数，进行了接受者操作特征(ROC)分析(表2，图9)。最佳曲线下面积(AUC)值是通过测量对Mpro和NP具有特异性的IgG抗体获得的(AUC分别等于0.9945和0.9927)。检测三种所测试的蛋白的IgG抗体的灵敏度和特异性均在90％以上，对Mpro的灵敏度和特异性值分别为97％和100％。其他同种型(IgA、IgM)的AUC值高于0.85。抗IgA抗体的测量似乎无法准确地区分COVID-19之前的血清和COVID-19血清，但这并不是因为对该同种型缺乏灵敏度。相反，由于IgA的背景水平非常低并且某些患者的信号明显呈阳性，因此检测的缺乏表明某些COVID-19阳性患者具有循环IgA，而其他COVID-19阳性患者的外周血中缺乏IgA。外周IgA的存在是否与临床方面有任何关系需要在更大的患者队列中进一步探索。

表2.AUC、截止值、灵敏度和特异性

AUC,曲线下面积；RBD,受体结合结构域；Mpro,半胱氨酸样蛋白酶；NP,核蛋白

蛋白质之间的比较显示，不同供者产生抗体(特别是IgM和IgA亚类)的能力存在一些异质性。非线性多项式回归显示，与NP和RBD或MPro和RBD相比，针对NP和Mpro的抗体检测之间具有更好的相关性(图11A)。只有一名COVID-19供者未能发生完全的抗体反应。

进行了进一步的分析以探索血清中不同抗体的滴度与临床参数之间的相关性。有趣的是，在患有更重症的患者中发现了更高滴度抗体反应的趋势(图11B)，这对于针对Mpro的IgM和针对RBD的IgG来说更为明显。然而，其他几个变量也导致了抗体反应的异质性，主要是年龄和症状出现后的时间(表3)。在调整了这些可能的混杂因素后，观察到抗RBD的IgA在危重症患者中显著高于轻症患者。此外，危重症患者表现出抗Mpro的IgM和IgA滴度比轻症COVID-19患者更高的趋势。此外，针对这三种蛋白质的强烈的IgM和IgA反应与较高的血清IL-6水平显著相关(数据未显示)。

表3.解释针对SARS-CoV-2病毒三种蛋白质的Ab反应异质性的变量

Co_eff.：系数；NRM：与该模型不相关

因此，将SARS-CoV-2Mpro与已经描述的用于血清学测试的其他抗原结合使用，为患者识别提供了出色的特异性和灵敏度。IgG比IgA或IgM滴度更高，这表明，正如预期的那样，IgG亚类在血清中更丰富。IgM抗体的测定具有较低的信噪比，在许多SARS-CoV-2阴性血清中，可以观察到IgM的显著背景。相比之下，在健康供者中未检测到SARS-CoV-2特异性IgA抗体，但在测试的来自COVID-19患者的36份血清中，有27份明显存在SARS-CoV-2特异性IgA抗体。

SARS-CoV-2抗体反应的动力学

为了比较MPro抗体反应与其他SARS-CoV-2蛋白的动力学，对14名患者进行了随访，选择了7名在症状出现后第一个月具有高滴度的患者和7名在同一时间点具有中低滴度的患者。比较每个供者的抗体水平(图12A)，并计算变化百分比(图12B)。大多数患者的IgG浓度略有下降，但在症状出现4个月后仍可检测到针对这三种蛋白的抗体。相反，IgA和IgM水平明显下降，在某些患者中达到背景水平。

一名患者显示出在症状出现四个月后获得的样本中IgG显著增加。在这种情况下，第一个样本是在症状出现的第一周获得的，可能当时免疫反应尚未完全激活。患者当时患有严重的疾病，这解释了后来抗体水平的升高。

在COVID-19患者唾液中检测到Mpro特异性IgG抗体

唾液样本收集自La Princesa大学医院(马德里)的11名健康供者和12名COVID-19患者，并在一系列稀释度(1/2至1/10)下在ELISA测定中进行测试。在COVID-19患者中可以观察到识别三种所测试的病毒抗原的IgG，其中反应最强的是对病毒蛋白酶Mpro的特异性反应(图13)。仅在一名COVID-19感染个体中检测到IgA和IgM反应。该唾液样本是在SARS-CoV-2阳性PCR检测确认后59天收集的，该患者病情非常轻微。

实施例3

材料和方法

患者选择、样本和机构审查委员会许可

实验按照1964年赫尔辛基宣言及其后来的修正案确立的伦理原则或类似的伦理标准进行。患者(或其代表)都被告知该研究并签署了书面知情同意书。这项研究使用了来自几家医院的样本。对于优化实验，使用了来自La Princesa健康研究所(IIS-IP)研究伦理委员会批准的研究项目“免疫反应动力学作为COVID-19疾病演变的预测因子.对治疗决策的影响”(注册号4070)的样本；来自重症和轻症患者的样本和数据由Biobank HospitalUniversitario Puerta de Hierro Majadahonda(HUPHM)/Instituto de InvestigaciónSanitaria Puerta de Hierro-Segovia de Arana(IDIPHISA)提供(西班牙国家生物银行网络中的PT17/0015/0020)，它们按照标准操作程序进行处理，并获得伦理和科学委员会的适当批准。为了比较疾病的严重程度，招募了29名通过PCR诊断的COVID-19患者。14名患者被归类为轻症或无症状，诊断后无需治疗。15名被归类为重症的患者需要ICU住院治疗(表4)。在诊断性PCR后33至40天获得血浆样本，在EDTA管中收集后通过血液离心分离，使用Puerta de Hierro医院生物库中的在2019年6月之前(COVID-19之前)收集自健康献血者的15份血浆样本作为阴性对照。

表4：严重程度研究的患者人口统计学数据和临床数据

ICU(重症监护室)，HTN(高血压)，DM(糖尿病)，COPD(慢性肺阻塞病)。

在Centro de Hemoterapia y Hemodonación de Castilla y León(ChemCyL)招募了15名已接种疫苗(Pfizer BioNTech)的个体与SARS-CoV-2感染患者进行比较(表5)。

表5.疫苗接种研究的患者人口统计学

这些样本是作为项目“用于检测病毒抗原(SARS-COV2)的血清学测定的开发”的一部分而获得的。该协议得到了生物伦理委员会：CEImde Salud Valladolid Este,Hospital Clínico Universitario de Valladolid的批准，其编号/BIO 2020-98-COVID。

CPD呼吸面板人血浆样本(CPD respiratory panel human plasma samples)获自商业来源(BioIVT-West Sussex，英国)。

SARS-CoV-2半胱氨酸样蛋白酶(Mpro)、核衣壳(NP)、刺突(S)和RBD蛋白的表达

重组SARS-CoV-2蛋白与组氨酸标签一起表达。在大肠杆菌菌株BL21 Star(DE3)pLysS(ThermoFisher)中表达半胱氨酸样蛋白酶(Mpro)和核衣壳(NP)蛋白构建体并如上所述进行纯化。

将编码可溶性S(残基1至1208)和RBD(332至534)蛋白的重组cDNA克隆到pcDNA3.1载体中，以使用标准转染方法在HEK-293F细胞中表达。这两个构建体在N端包含S信号序列，在C端包含T4纤维蛋白三聚化序列、Flag表位和8xHis标签。在S蛋白中，弗林蛋白酶识别基序(RRAR)被GSAS序列取代，它在S2部分包含A942P、K986P和V987P取代。通过Ni-NTA亲和层析从转染的细胞的上清液中纯化蛋白质，并在浓缩过程中将它们转移至25mM Hepes缓冲液和150mM NaCl，pH7.5。

SARS-CoV-2抗体的基于珠的流式细胞术测定

10⁶个平均直径为5.5μm且表面具有高密度羧基官能团的磁性荧光珠(QuantumPlex^TMM COOH–Bangs Laboratories,Inc.)，通过其伯胺与30μg病毒蛋白通过两步EDC/NHS方案共价偶联。将珠重悬于含有1％酪蛋白和稳定剂(Biorad 1xPBS封堵剂)的PBS溶液中。为了区分包被有不同抗原的珠，在APC和PerCP通道中使用了不同的荧光强度组合(图14)。

使用每个实验中的指定稀释度，在96孔板(Nunc^TMMicroWell^TM96孔，ThermoFisher Scientific)中，将珠与兔抗His标签抗体(Proteintech Group)或来自患者或健康供者的终体积50μl的血浆一起孵育。患者血浆样本在PBS-酪蛋白(Biorad，1xPBS阻断剂)中稀释，并在室温下与珠一起搅拌孵育40分钟。通过添加PBS洗涤珠3次，将试管或板放在磁铁上(Mag.Sep.Stand 12-hole,12x75mm,Promega；用于96孔板的手持式磁力分离块，Merck，Millipore)，并倾析上清液。

为了可视化与抗原包被珠结合的抗体，添加PE缀合的抗兔抗体(0.25μg/ml，Southern Biotech)、PE缀合的抗人IgG和IgM、或FITC缀合的抗人IgA抗体(ImmunstepS.L.)(30μL/孔)，并在室温下搅拌孵育20分钟。洗涤三次后，使用CytoFLEX或Cytomics FC500(Beckman Coulter)通过流式细胞仪获取数据。

对于在不同日期进行的大型筛查，将数据标准化到每个测定中包含的阳性对照血清的值。

用于检测针对SARS-CoV-2的抗体的ELISA

如上所述进行了用于检测针对四种SARS-CoV-2抗原的抗体的ELISA测定。

统计学分析

为了评估新方法的预测能力，使用Scikit-learn python包构建了一种算法(F P,G V,A G,V M,B T,O G等人.Scikit-learn:Machine Learning in Python.Journal ofMachine Learning Research.2011；12:2825-30)。样本被分层并随机拼接成训练集和测试集。训练样本用于拟合随机森林分类器，然后随机森林分类器预测未见的测试样本(占总样本的1/7)的健康与疾病类别。对此重复n＝10,000次。对于每名患者，准确度计算为正确预测除以所做预测的数量所得的比例。作为一种补充方法，通过分层15折交叉验证对随机森林分类器构建平均接受者操作特征(ROC)曲线，其中使用较小集合(2至3个样本)训练模型，然后对其余的进行预测。

使用Scikit-learn的MixMaxScaler命令将每个变量缩放到范围(0,1)，并使用seaborn python包中的热图命令进行对其可视化。对于主成分分析，将每个变量按照描述进行缩放，并使用Scikit-learn中的PCA命令来拟合和转换数据。保存了高达95％的累积解释方差的主成分。

每个变量在重症和轻症患者之间的比较通过多个t检验进行，然后通过Graph PadPrism 8软件(GraphPad Software，美国，www.graphpad.com)中的两阶段上升法(two-stage step-up method)进行错误发现率(1％)校正。

结果

使用流式细胞术进行基本的珠辅助多抗原血清学测定

冠状病毒的NP、S和RBD蛋白已广泛用于SARS和MERS引起的疾病的单抗原血清学测定。然而，将这些抗原与免疫原性Mpro结合使用，可以更全面地描述SARS-CoV-2感染患者免疫反应的强度和持续时间。为了促进采用高通量方法对COVID-19患者进行全面表征，开发了多抗原测定，其中将几种病毒抗原固定在荧光珠上，以允许流式细胞术检测SARS-CoV-2感染期间产生的多种抗体。

如图14A所示，该测定使用包被有SARS-CoV-2抗原的荧光磁珠。每种蛋白质都固定在珠群上，该珠群在红色通道中具有特定的荧光强度(例如APC/PerCP)。这允许在单个试管或孔中同时检测针对不同抗原的抗体。在与患者血浆孵育后，使用一种或几种与不同荧光团(如FITC或PE)缀合的二抗来鉴定与病毒抗原结合的IgG、IgA和IgM免疫球蛋白。在大多数实验中，使用了抗IgM-PE和IgA-FITC的组合。IgG与IgA结合使用也具有良好的结果。因此，每个抗原特异性Ig的数据可以通过使用三种不同的荧光团在单个反应中确定。具体来说，在几个实验中，分别测试了FITC、PE和PE-Cyanine7荧光染料组合以检测IgG、IgA和IgM。

最初，为了确定检测限和抗体结合量，进行了不同珠量(未显示)和抗His标签抗体浓度的滴定实验(图18)。这些试验性实验允许估计已知抗体浓度的信号，数据表明新方法可以提供良好的灵敏度。事实上，由于所有抗原构建体都只有单个His标签，因此可以预期，使用含有结合多个表位的抗体的多克隆混合物的血浆将提供更多信号并进一步提高灵敏度。

与其他病毒抗原相比，S蛋白获得的抗His信号较低，但不影响在患者血浆中进行检测。His标签抗体对S的较低检测可能是由于S的摩尔量低于与珠结合的NP、MPro或RBD。这是意料之中的，因为S的分子量(180KDa)至少是其他抗原(25至40KDa)的四倍。血清分析允许在广泛的稀释范围内很好地分离对照和恢复期样本(图14B，C)。因此，使用磁珠和流式细胞仪是适合于血清学分析的技术。～

多抗原珠辅助流式细胞术以100％的置信度识别COVID-19患者

通过测试44个血浆样本中是否存在针对四种SARS-CoV-2抗原(S、RBD、NP、Mpro)的抗体，评估了新方法的灵敏度和特异性。这44个血浆样本中包括29名COVID-19患者，其中14名患轻症，15名患重症。每个血浆样本在一系列稀释度(1:100至1:5400)内测试三种Ig同种型(IgA、IgG、IgM)。使用数据的热图表示进行的初步分析(图15)显示，针对四种抗原的IgG抗体所获得的信号在健康对照和COVID-19患者之间存在明显差异。正如预期的那样，尽管在多名患者中检测到了SARS-CoV-2特异性IgA和IgM抗体，但它们并未出现在所有测试的血清中。IgM具有更高的背景，而IgA提供了非常清晰和具体的数据。

机器学习技术被用来评估这种新方法的特异性和灵敏度。当通过ELISA和FACS生成数据时，开发了一种随机森林分类算法，以评估对血清阴性与COVID血清阳性个体的预测能力，同时比较单抗原技术和多抗原技术。当仅分析通过FACS针对IgG生成的数据时，除了有两名被正确分类的次数为99.93％和98.24％之外，所有患者在100％的多抗原重复中均被正确分类(表6)。结合IgG的四种抗原和4种稀释度的数据，提供了99.94％真阳性率和100％真阴性率的总体预测能力。当仅分析三种抗原(RBD、S和Mpro)和一种稀释度时，也获得了接近100％的真阳性率，突出强调了该技术的预测能力[IgG 1/100 99.87；IgG 1/20099.98；IgG 1/600 98.94；IgG 1/1800x＝99.98]。在所有情况下，真阴性率始终为100％。ELISA法中单个抗原具有略低的预测值。因此，使用包括三种抗原、一种同种型检测(IgG)和一种稀释度的单一测试对患者进行了准确分类，从而促进大规模筛查。

表6.健康样本与COVID样本的预测准确性*

*样本被分层并随机拼接成训练集和测试集。训练样本用于拟合随机森林分类器，然后随机森林分类器预测未见的测试样本(占总样本的1/7)的健康与疾病类别。对此重复n＝10,000次。对于每名患者，准确度计算为正确预测除以所做预测的数量所得的的比例。

COVID-19患者对四种病毒抗原的反应不同

使用小型训练集，生成ROC曲线以比较每个单抗原ELISA测试和多抗原FACS技术的灵敏度和特异性(图16A)，后者再次表现出最佳性能，突出强调了在必须使用有限数量的已知对照来对大量未知样本进行分类的临床环境中，多抗原方法可能更有用。

多抗原测试效率的提高可能与观察到一些患者明显优先对病毒颗粒中存在的抗原(S、RBD)作出反应有关，而其他患者主要对通常仅在细胞被感染后暴露的抗原(NP、Mpro)作出反应(图16B)。当对每种抗体同种型的数据进行主成分分析(PCA)时，独立确认了这种偏差的存在。该分析揭示了血清阳性和血清阴性患者的明显分离(图16C)。检验PCA载荷(图16D)显示，对于IgG，第二个主成分区分了针对NP+MPro或S+RBD的抗体的产生。当分析IgA和IgM反应(未显示)时，注意到类似的模式。在仅分析有限数量的患者时检测到这种偏差，这表明优先的抗原特异性反应是常见的，并且为使用多抗原血清学测定来避免假阴性结果提供了强有力的理由。随着大流行的发展，已经确定并非所有患者都以相同的方式对SARS-CoV-2感染作出反应。事实上，已经描述了大量的临床表现，并且已经表明不同类型的免疫反应可能导致这些不同的表现。因此，在探索SARS CoV 2感染与不同临床表现之间的关联时，这可能与表征潜在的偏好性抗体反应有关。

总的来说，多抗原测定所产生的数据轻松有效地区分血清阴性和COVID血清阳性个体。

COVID-19患者抗体反应的多抗原、多同种型分析改进了与疾病严重程度相关的分类，并允许区分疫苗诱导和自然感染的抗体反应

一般而言，抗体滴度较高的患者更可能遭受重症感染，表明感染严重程度与抗体滴度升高相关[13]。然而，仅对IgG反应的分析并没有明确地区分患有重症或轻症的患者(图15)。在针对NP(稀释度1:100至1:600)、MPro(稀释度1:100至1:600)和RBD(稀释度1:100至1:200)的IgA抗体的情况下，与轻度受影响的患者相比，观察到重症患者的抗体反应在统计学上显著增加。当同时分析IgG数据(稀释度1:600至1800)和IgA(稀释度1:100)反应时，使用这些变量构建随机森林允许以92％的准确度分类为轻症和重症(图17)，相比之下，当仅考虑IgG数据时，准确度为90％(图17)。尽管需要分析更多的数据，但我们的结果表明了分析针对多种SARS-CoV-2抗原的IgG/IgA免疫反应对于建立明确的严重程度区分标准的重要性。

序列表

<110> 高等科学研究委员会(CSIC)

<120> 用于检测SARS-CoV-2的半胱氨酸样蛋白酶（Mpro）的测定

<130> 906 312

<150> EP20382495.8

<151> 2020-06-08

<160> 14

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 319

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> 1..319

<220>

<223> 肽序列SARS-CoV-2 Mpro

<400> 1

Ser Ala Val Leu Gln Ser Gly Phe Arg Lys Met Ala Phe Pro Ser Gly

1 5 10 15

Lys Val Glu Gly Cys Met Val Gln Val Thr Cys Gly Thr Thr Thr Leu

20 25 30

Asn Gly Leu Trp Leu Asp Asp Val Val Tyr Cys Pro Arg His Val Ile

35 40 45

Cys Thr Ser Glu Asp Met Leu Asn Pro Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Ile

50 55 60

Arg Lys Ser Asn His Asn Phe Leu Val Gln Ala Gly Asn Val Gln Leu

65 70 75 80

Arg Val Ile Gly His Ser Met Gln Asn Cys Val Leu Lys Leu Lys Val

85 90 95

Asp Thr Ala Asn Pro Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Phe Val Arg Ile Gln

100 105 110

Pro Gly Gln Thr Phe Ser Val Leu Ala Cys Tyr Asn Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Gly Val Tyr Gln Cys Ala Met Arg Pro Asn Phe Thr Ile Lys Gly Ser

130 135 140

Phe Leu Asn Gly Ser Cys Gly Ser Val Gly Phe Asn Ile Asp Tyr Asp

145 150 155 160

Cys Val Ser Phe Cys Tyr Met His His Met Glu Leu Pro Thr Gly Val

165 170 175

His Ala Gly Thr Asp Leu Glu Gly Asn Phe Tyr Gly Pro Phe Val Asp

180 185 190

Arg Gln Thr Ala Gln Ala Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ile Thr Val Asn

195 200 205

Val Leu Ala Trp Leu Tyr Ala Ala Val Ile Asn Gly Asp Arg Trp Phe

210 215 220

Leu Asn Arg Phe Thr Thr Thr Leu Asn Asp Phe Asn Leu Val Ala Met

225 230 235 240

Lys Tyr Asn Tyr Glu Pro Leu Thr Gln Asp His Val Asp Ile Leu Gly

245 250 255

Pro Leu Ser Ala Gln Thr Gly Ile Ala Val Leu Asp Met Cys Ala Ser

260 265 270

Leu Lys Glu Leu Leu Gln Asn Gly Met Asn Gly Arg Thr Ile Leu Gly

275 280 285

Ser Ala Leu Leu Glu Asp Glu Phe Thr Pro Phe Asp Val Val Arg Gln

290 295 300

Cys Ser Gly Val Thr Phe Gln Leu Glu His His His His His His

305 310 315

<210> 2

<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SARS-CoV-2 Mpro的核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> 1..960

<400> 2

tcagctgttt tgcagagtgg ttttagaaaa atggcattcc catctggtaa agttgagggt 60

tgtatggtac aagtaacttg tggtacaact acacttaacg gtctttggct tgatgacgta 120

gtttactgtc caagacatgt gatctgcacc tctgaagaca tgcttaaccc taattatgaa 180

gatttactca ttcgtaagtc taatcataat ttcttggtac aggctggtaa tgttcaactc 240

agggttattg gacattctat gcaaaattgt gtacttaagc ttaaggttga tacagccaat 300

cctaagacac ctaagtataa gtttgttcgc attcaaccag gacagacttt ttcagtgtta 360

gcttgttaca atggttcacc atctggtgtt taccaatgtg ctatgaggcc caatttcact 420

attaagggtt cattccttaa tggttcatgt ggtagtgttg gttttaacat agattatgac 480

tgtgtctctt tttgttacat gcaccatatg gaattaccaa ctggagttca tgctggcaca 540

gacttagaag gtaactttta tggacctttt gttgacaggc aaacagcaca agcagctggt 600

acggacacaa ctattacagt taatgtttta gcttggttgt acgctgctgt tataaatgga 660

gacaggtggt ttctcaatcg atttaccaca actcttaatg actttaacct tgtggctatg 720

aagtacaatt atgaacctct aacacaagac catgttgaca tactaggacc tctttctgct 780

caaactggaa ttgccgtttt agatatgtgt gcttcattaa aagaattact gcaaaatggt 840

atgaatggac gtaccatatt gggtagtgct ttattagaag atgaatttac accttttgat 900

gttgttagac aatgctcagg tgttactttc caactcgagc accaccacca ccaccactga 960

<210> 3

<211> 377

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> 1..377

<220>

<223> 肽序列SARS-CoV-2核衣壳蛋白

<400> 3

Met Ala Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile

1 5 10 15

Thr Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu

20 25 30

Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn

35 40 45

Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp

50 55 60

Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser

65 70 75 80

Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg

85 90 95

Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr

100 105 110

Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys

115 120 125

Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys

130 135 140

Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu

145 150 155 160

Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly

165 170 175

Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg

180 185 190

Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro

195 200 205

Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu

210 215 220

Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser

245 250 255

Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr

260 265 270

Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly

275 280 285

Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln

290 295 300

Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg

305 310 315 320

Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly

325 330 335

Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile

340 345 350

Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu

355 360 365

Pro Val Glu His His His His His His

370 375

<210> 4

<211> 1134

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SARS-CoV-2核衣壳蛋白的肽序列

<220>

<221> misc_feature

<222> 1..1134

<400> 4

atggcttctg ataatggtcc gcaaaatcag cgtaatgcac cccgcattac gtttggtgga 60

ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg atcaaaacaa 120

cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct cactcaacat 180

ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac caatagcagt 240

ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg tggtgacggt 300

aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat ttctactacc taggaactgg gccagaagct 360

ggacttccct atggtgctaa caaagacggc atcatatggg ttgcaactga gggagccttg 420

aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc aatcgtgcta 480

caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag cagaggcggc 540

agtcaagcct cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa ttcaactcca 600

ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga tgctgctctt 660

gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg taaaggccaa 720

caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcttctaa gaagcctcgg 780

caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag acgtggtcca 840

gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca gacaaggaac tgattacaaa 900

cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg aatgtcgcgc 960

attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc catcaaattg 1020

gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca tattgacgca 1080

tacaaaacat tcccaccaac agagcctgtc gagcaccacc accaccacca ctga 1134

<210> 5

<211> 202

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> 1..202

<220>

<223> 肽序列SARS-CoV-2 RBD

<400> 5

Gly Ser Arg Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg

1 5 10 15

Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val

20 25 30

Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys

35 40 45

Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn

50 55 60

Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile

65 70 75 80

Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro

85 90 95

Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp

100 105 110

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

115 120 125

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

130 135 140

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln

165 170 175

Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

180 185 190

Thr Val Cys Gly Pro Lys Leu Val Pro Arg

195 200

<210> 6

<211> 606

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SARS-CoV-2 RBD的核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> 1..606

<400> 6

ggatcccgca acttgtgccc ttttggtgaa gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt 60

tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac tgtgttgctg attattctgt cctatataat 120

tccgcatcat tttccacttt taagtgttat ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc 180

tgctttacta atgtctatgc agattcattt gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc 240

gctccagggc aaactggaaa gattgctgat tataattata aattaccaga tgattttaca 300

ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat cttgattcta aggttggtgg taattataat 360

tacctgtata gattgtttag gaagtctaat ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact 420

gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt 480

cctttacaat catatggttt ccaacccact aatggtgttg gttaccaacc atacagagta 540

gtagtacttt cttttgaact tctacatgca ccagcaactg tttgtggacc taaacttgtc 600

cctcgc 606

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> 1..34

<400> 7

gacccatggc ttcagctgtt tttcagagtg gttt 34

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> 1..32

<400> 8

gacctcgagt tggaaagtaa cacctgagca tt 32

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> 1..44

<400> 9

gatccatggc ttctgataat ggtccgcaaa atcagcgtaa tgca 44

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> 1..29

<400> 10

caggtcgaca ggctctgttg gtgggaatg 29

<210> 11

<211> 303

<212> PRT

<213> 冠状病毒科(Coronaviridae)

<220>

<223> HCoVNL63

<400> 11

Ser Gly Leu Lys Lys Met Ala Gln Pro Ser Gly Cys Val Glu Arg Cys

1 5 10 15

Val Val Arg Val Cys Tyr Gly Ser Thr Val Leu Asn Gly Val Trp Leu

20 25 30

Gly Asp Thr Val Thr Cys Pro Arg His Val Ile Ala Pro Ser Thr Thr

35 40 45

Val Leu Ile Asp Tyr Asp His Ala Tyr Ser Thr Met Arg Leu His Asn

50 55 60

Phe Ser Val Ser His Asn Gly Val Phe Leu Gly Val Val Gly Val Thr

65 70 75 80

Met His Gly Ser Val Leu Arg Ile Lys Val Ser Gln Ser Asn Val His

85 90 95

Thr Pro Lys His Val Phe Lys Thr Leu Lys Pro Gly Asp Ser Phe Asn

100 105 110

Ile Leu Ala Cys Tyr Glu Gly Ile Ala Ser Gly Val Phe Gly Val Asn

115 120 125

Leu Arg Thr Asn Phe Thr Ile Lys Gly Ser Phe Ile Asn Gly Ala Cys

130 135 140

Gly Ser Pro Gly Tyr Asn Val Arg Asn Asp Gly Thr Val Glu Phe Cys

145 150 155 160

Tyr Leu His Gln Ile Glu Leu Gly Ser Gly Ala His Val Gly Ser Asp

165 170 175

Phe Thr Gly Ser Val Tyr Gly Asn Phe Asp Asp Gln Pro Ser Leu Gln

180 185 190

Val Glu Ser Ala Asn Leu Met Leu Ser Asp Asn Val Val Ala Phe Leu

195 200 205

Tyr Ala Ala Leu Leu Asn Gly Cys Arg Trp Trp Leu Cys Ser Thr Arg

210 215 220

Val Asn Val Asp Gly Phe Asn Glu Trp Ala Met Ala Asn Gly Tyr Thr

225 230 235 240

Ser Val Ser Ser Val Glu Cys Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Lys Thr Gly

245 250 255

Val Ser Val Glu Gln Leu Leu Ala Ser Ile Gln His Leu His Glu Gly

260 265 270

Phe Gly Gly Lys Asn Ile Leu Gly Tyr Ser Ser Leu Cys Asp Glu Phe

275 280 285

Thr Leu Ala Glu Val Val Lys Gln Met Tyr Gly Val Asn Leu Gln

290 295 300

<210> 12

<211> 302

<212> PRT

<213> 冠状病毒科(Coronaviridae)

<220>

<223> HCoV229E

<400> 12

Ala Gly Leu Arg Lys Met Ala Gln Pro Ser Gly Phe Val Glu Lys Cys

1 5 10 15

Val Val Arg Val Cys Tyr Gly Asn Thr Val Leu Asn Gly Leu Trp Leu

20 25 30

Gly Asp Ile Val Tyr Cys Pro Arg His Val Ile Ala Ser Asn Thr Thr

35 40 45

Ser Ala Ile Asp Tyr Asp His Glu Tyr Ser Ile Met Arg Leu His Asn

50 55 60

Phe Ser Ile Ile Ser Gly Thr Ala Phe Leu Gly Val Val Gly Ala Thr

65 70 75 80

Met His Gly Val Thr Leu Lys Ile Lys Val Ser Gln Thr Asn Met His

85 90 95

Thr Pro Arg His Ser Phe Arg Thr Leu Lys Ser Gly Glu Gly Phe Asn

100 105 110

Ile Leu Ala Cys Tyr Asp Gly Cys Ala Gln Gly Val Phe Gly Val Asn

115 120 125

Met Arg Thr Asn Trp Thr Ile Arg Gly Ser Phe Ile Asn Gly Ala Cys

130 135 140

Gly Ser Pro Gly Tyr Asn Leu Lys Asn Gly Glu Val Glu Phe Val Tyr

145 150 155 160

Met His Gln Ile Glu Leu Gly Ser Gly Ser His Val Gly Ser Ser Phe

165 170 175

Asp Gly Val Met Tyr Gly Gly Phe Glu Asp Gln Pro Asn Leu Gln Val

180 185 190

Glu Ser Ala Asn Gln Met Leu Thr Val Asn Val Val Ala Phe Leu Tyr

195 200 205

Ala Ala Ile Leu Asn Gly Cys Thr Trp Trp Leu Lys Gly Glu Lys Leu

210 215 220

Phe Val Glu His Tyr Asn Glu Trp Ala Gln Ala Asn Gly Phe Thr Ala

225 230 235 240

Met Asn Gly Glu Asp Ala Phe Ser Ile Leu Ala Ala Lys Thr Gly Val

245 250 255

Cys Val Glu Arg Leu Leu His Ala Ile Gln Val Leu Asn Asn Gly Phe

260 265 270

Gly Gly Lys Gln Ile Leu Gly Tyr Ser Ser Leu Asn Asp Glu Phe Ser

275 280 285

Ile Asn Glu Val Val Lys Gln Met Phe Gly Val Asn Leu Gln

290 295 300

<210> 13

<211> 305

<212> PRT

<213> 冠状病毒科(Coronaviridae)

<220>

<223> SARS-CoV-2

<400> 13

Gly Phe Arg Lys Met Ala Phe Pro Ser Gly Lys Val Glu Gly Cys Met

1 5 10 15

Val Gln Val Thr Cys Gly Thr Thr Thr Leu Asn Gly Leu Trp Leu Asp

20 25 30

Asp Val Val Tyr Cys Pro Arg His Val Ile Cys Thr Ser Glu Asp Met

35 40 45

Leu Asn Pro Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Ile Arg Lys Ser Asn His Asn

50 55 60

Phe Leu Val Gln Ala Gly Asn Val Gln Leu Arg Val Ile Gly His Ser

65 70 75 80

Met Gln Asn Cys Val Leu Lys Leu Lys Val Asp Thr Ala Asn Pro Lys

85 90 95

Thr Pro Lys Tyr Lys Phe Val Arg Ile Gln Pro Gly Gln Thr Phe Ser

100 105 110

Val Leu Ala Cys Tyr Asn Gly Ser Pro Ser Gly Val Tyr Gln Cys Ala

115 120 125

Met Arg Pro Asn Phe Thr Ile Lys Gly Ser Phe Leu Asn Gly Ser Cys

130 135 140

Gly Ser Val Gly Phe Asn Ile Asp Tyr Asp Cys Val Ser Phe Cys Tyr

145 150 155 160

Met His His Met Glu Leu Pro Thr Gly Val His Ala Gly Thr Asp Leu

165 170 175

Glu Gly Asn Phe Tyr Gly Pro Phe Val Asp Arg Gln Thr Ala Gln Ala

180 185 190

Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ile Thr Val Asn Val Leu Ala Trp Leu Tyr

195 200 205

Ala Ala Val Ile Asn Gly Asp Arg Trp Phe Leu Asn Arg Phe Thr Thr

210 215 220

Thr Leu Asn Asp Phe Asn Leu Val Ala Met Lys Tyr Asn Tyr Glu Pro

225 230 235 240

Leu Thr Gln Asp His Val Asp Ile Leu Gly Pro Leu Ser Ala Gln Thr

245 250 255

Gly Ile Ala Val Leu Asp Met Cys Ala Ser Leu Lys Glu Leu Leu Gln

260 265 270

Asn Gly Met Asn Gly Arg Thr Ile Leu Gly Ser Ala Leu Leu Glu Asp

275 280 285

Glu Phe Thr Pro Phe Asp Val Val Arg Gln Cys Ser Gly Val Thr Phe

290 295 300

Gln

305

<210> 14

<211> 303

<212> PRT

<213> 冠状病毒科(Coronaviridae)

<220>

<223> HCoVOC43

<400> 14

Ser Gly Ile Val Lys Met Val Asn Pro Thr Ser Lys Val Glu Pro Cys

1 5 10 15

Val Val Ser Val Thr Tyr Gly Asn Met Thr Leu Asn Gly Leu Trp Leu

20 25 30

Asp Asp Lys Val Tyr Cys Pro Arg His Val Ile Cys Ser Ala Ser Asp

35 40 45

Met Thr Asn Pro Asp Tyr Thr Asn Leu Leu Cys Arg Val Thr Ser Ser

50 55 60

Asp Phe Thr Val Leu Phe Asp Arg Leu Ser Leu Thr Val Met Ser Tyr

65 70 75 80

Gln Met Arg Gly Cys Met Leu Val Leu Thr Val Thr Leu Gln Asn Ser

85 90 95

Arg Thr Pro Lys Tyr Thr Phe Gly Val Val Lys Pro Gly Glu Thr Phe

100 105 110

Thr Val Leu Ala Ala Tyr Asn Gly Lys Pro Gln Gly Ala Phe His Val

115 120 125

Thr Met Arg Ser Ser Tyr Thr Ile Lys Gly Ser Phe Leu Cys Gly Ser

130 135 140

Cys Gly Ser Val Gly Tyr Val Ile Met Gly Asp Cys Val Lys Phe Val

145 150 155 160

Tyr Met His Gln Leu Glu Leu Ser Thr Gly Cys His Thr Gly Thr Asp

165 170 175

Phe Asn Gly Asp Phe Tyr Gly Pro Tyr Lys Asp Ala Gln Val Val Gln

180 185 190

Leu Pro Ile Gln Asp Tyr Ile Gln Ser Val Asn Phe Leu Ala Trp Leu

195 200 205

Tyr Ala Ala Ile Leu Asn Asn Cys Asn Trp Phe Ile Gln Ser Asp Lys

210 215 220

Cys Ser Val Glu Asp Phe Asn Val Trp Ala Leu Ser Asn Gly Phe Ser

225 230 235 240

Gln Val Lys Ser Asp Leu Val Ile Asp Ala Leu Ala Ser Met Thr Gly

245 250 255

Val Ser Leu Glu Thr Leu Leu Ala Ala Ile Lys Arg Leu Lys Asn Gly

260 265 270

Phe Gln Gly Arg Gln Ile Met Gly Ser Cys Ser Phe Glu Asp Glu Leu

275 280 285

Thr Pro Ser Asp Val Tyr Gln Gln Leu Ala Gly Ile Lys Leu Gln

290 295 300

Claims

1.一种检测至少一个生物样本中与SARS-CoV-2病毒的至少一个表位结合的抗体的体外方法，包括：

b.检测所述病毒蛋白或所述片段与所述生物样本中存在的抗体之间抗原-抗体复合物的形成，

其中，所述方法是检测具有针对SARS-CoV-2病毒的抗体的对象的体外诊断方法，其中如果检测到所述病毒蛋白或所述片段与所述生物样本中存在的抗体之间的抗原-抗体复合物，则所述对象被诊断为具有针对SARS-CoV-2病毒的抗体。

2.根据权利要求1所述的体外方法，其中，所述方法能够检测IgG、IgM和/或IgA。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的体外方法，其中，所述方法能够检测IgG。

4.根据权利要求1或2中任一项所述的体外方法，其中，所述方法能够检测IgM。

5.根据权利要求1或2中任一项所述的体外方法，其中，所述方法能够检测IgA。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的体外方法，其中，所述至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白是SEQ ID NO 1的蛋白或SEQ ID NO 1的变体，所述变体与SEQ ID NO 1具有至少80％的序列同一性。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的体外方法，其中，所述分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白的包含SARS-CoV-2病毒的至少一个表位的至少一个片段包括至少20个连续氨基酸残基，所述至少20个连续氨基酸残基与SEQ ID No.1的至少约20个连续氨基酸残基具有至少80％的序列同一性。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的体外方法，其中，所述至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白是SEQ ID NO 1的蛋白。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的体外方法，其中，所述至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或其片段是重组表达产物。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的体外方法，其中，所述生物样本是血液、血浆或血清样本。

11.根据权利要求10所述的体外方法，其中，所述生物样本是血清样本，所述SARS-CoV-2M^pro蛋白是SEQ ID NO 1的蛋白。

12.一种适合于检测生物样本中与SARS-CoV-2病毒的至少一个表位结合的抗体的体外试剂盒，包括：

其中，所述至少一种分离的蛋白质或其片段和所述试剂的存在量足以检测所述抗原-抗体复合物的形成。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，所述至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白是SEQ ID NO1的蛋白或SEQ ID NO 1的变体，所述变体与SEQ ID NO 1具有至少80％的序列同一性。

14.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，所述分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白的包含SARS-CoV-2病毒的至少一个表位的至少一个片段的特征在于包括至少20个连续氨基酸残基，所述至少20个连续氨基酸残基与SEQ ID No.1的至少20个连续氨基酸残基具有至少80％的序列同一性。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或其片段是重组表达产物。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白是SEQ ID NO 1的蛋白。

17.根据权利要求12至16中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒是ELISA系统，所述ELISA系统包含：SEQ ID NO 1的至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白，以包被固体表面、优选微量滴定板孔，以及以下试剂中的一种或多种：用于未结合位点以防止假阳性结果的封闭试剂；与标记、优选酶缀合的抗-(物种)的IgG、IgM和/或IgA；和与所述标记、优选所述酶反应以指示阳性反应的底物。

18.根据权利要求1至11中任一项所述的体外方法，其中，所述抗原-抗体复合物的形成通过放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光或比色酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定(IFA)、斑点印迹、侧流免疫层析测定或蛋白质印迹来检测。

19.根据权利要求1至11中任一项所述的体外方法，其中，所述抗原-抗体复合物的形成通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测。

20.根据权利要求1至11或18和19中任一项所述的体外方法，其中，所述抗原-抗体复合物的形成通过权利要求18所确定的任何方法来检测，所述至少一种病毒蛋白或所述片段适于在1:200至1:1800的稀释度下检测IgG、IgM和/或IgA。

21.根据权利要求1至11或18和19中任一项所述的体外方法，其中，所述抗原-抗体复合物的形成通过权利要求18所确定的任何方法来检测，所述能够在1:200至1:1800的稀释度下检测IgG、IgM和/或IgA。

22.根据权利要求1至11或18至21中任一项所述的体外方法，其中，使所述生物样本与至少一种或多种另外的SARS-CoV-2M^pro免疫原或其片段接触。

23.根据权利要求22所述的体外方法，其中，所述另外的免疫原选自由以下组成的组：SARS-CoV-2的核衣壳(N)蛋白、包括S1亚基的刺突(S)结构域、和/或SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)。

24.根据权利要求1至11或18至23中任一项的体外方法，其中，使所述生物样本与至少一种或多种衍生自至少一种不同的分离的SARS蛋白的另外的免疫原接触。

25.一种ELISA系统，包括：根据权利要求1至11中任一项定义的至少一种分离的SARS-CoV-2M^pro蛋白或其片段，以包被固体表面、优选微量滴定板孔，以及以下试剂中的一种或多种：用于未结合位点以防止假阳性结果的封闭试剂；与标记、优选酶缀合的抗-(物种)的IgG、IgM和/或IgA；和与所述标记、优选所述酶反应以指示阳性反应的底物。

26.根据权利要求25所述的ELISA系统，其中，所述ELISA系统还包含额外的试剂，例如洗涤缓冲液、终止液和稳定剂。

27.权利要求12至17中任一项所述的试剂盒或权利要求25或26中任一项所述的ELISA系统用于实施权利要求1至11或18至24中任一项所述的方法的体外用途。