JPH10306100A - 新規泡蛋白質及びその利用 - Google Patents
新規泡蛋白質及びその利用Info
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- JPH10306100A JPH10306100A JP9334229A JP33422997A JPH10306100A JP H10306100 A JPH10306100 A JP H10306100A JP 9334229 A JP9334229 A JP 9334229A JP 33422997 A JP33422997 A JP 33422997A JP H10306100 A JPH10306100 A JP H10306100A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/16—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from plants
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ビールの泡持ちを規定する主成分の一つである
新規な泡蛋白質を、免疫学的測定法を応用して特異的に
定量し、迅速かつ正確にビールの泡持ち及び泡持ち安定
性を測定する方法を提供する。 【解決手段】新規泡蛋白質ならびに該蛋白質を特異的に
認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を
用いて免疫学的測定法によってビール試料中の泡蛋白質
含量を測定する方法、ビールの泡持ち及び泡持ち安定性
を測定する方法、ビール原料並びにビールの安定化剤を
評価する方法。
新規な泡蛋白質を、免疫学的測定法を応用して特異的に
定量し、迅速かつ正確にビールの泡持ち及び泡持ち安定
性を測定する方法を提供する。 【解決手段】新規泡蛋白質ならびに該蛋白質を特異的に
認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を
用いて免疫学的測定法によってビール試料中の泡蛋白質
含量を測定する方法、ビールの泡持ち及び泡持ち安定性
を測定する方法、ビール原料並びにビールの安定化剤を
評価する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビールの泡持ちを規定
する主成分の一つである新規な蛋白質、該蛋白質に対す
るモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を用いる
ビールの最終製品並びに製造工程におけるビール試料中
の泡蛋白質含有量を測定する方法に関する。本発明はま
たこのような測定方法によるビールの泡持ち及び泡持ち
安定性を測定する方法、ビール原料並びにビールの安定
化剤を評価する方法にも関する。
する主成分の一つである新規な蛋白質、該蛋白質に対す
るモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を用いる
ビールの最終製品並びに製造工程におけるビール試料中
の泡蛋白質含有量を測定する方法に関する。本発明はま
たこのような測定方法によるビールの泡持ち及び泡持ち
安定性を測定する方法、ビール原料並びにビールの安定
化剤を評価する方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】ビールは麦芽を主原料として糖化によっ
て麦汁を得、この麦汁に酵母を加えて主発酵を行い、次
いで主発酵で得られる若ビールを後発酵（貯酒）工程に
付し、濾過、ビン詰め工程を経て製造されている。
て麦汁を得、この麦汁に酵母を加えて主発酵を行い、次
いで主発酵で得られる若ビールを後発酵（貯酒）工程に
付し、濾過、ビン詰め工程を経て製造されている。
【０００３】このようにして製造されているビールの外
観品質の内、最も重視される性質の一つに泡がある。こ
の性質を規定する際には、大別して泡立ちと泡持ちの２
種に分類できる。
観品質の内、最も重視される性質の一つに泡がある。こ
の性質を規定する際には、大別して泡立ちと泡持ちの２
種に分類できる。
【０００４】この泡持ちを評価する方法として、泡の物
理化学的な特性を利用した方法、即ち泡の消失速度に基
づく方法や、ガラス面への付着性に基づく方法等が用い
られている。しかし、泡は複雑な性質をもっているた
め、これらの物理化学的方法では十分な再現性や精度が
得られなかった。また、従来はビール原料である大麦や
麦芽等を評価する場合や、長期間保管したビールの泡持
ちに対する安定性を評価するには、実際にビールを醸造
した後でなければ評価を行うことができなかったため、
再現性があり、かつ短期間で評価できる方法の確立が望
まれていた。
理化学的な特性を利用した方法、即ち泡の消失速度に基
づく方法や、ガラス面への付着性に基づく方法等が用い
られている。しかし、泡は複雑な性質をもっているた
め、これらの物理化学的方法では十分な再現性や精度が
得られなかった。また、従来はビール原料である大麦や
麦芽等を評価する場合や、長期間保管したビールの泡持
ちに対する安定性を評価するには、実際にビールを醸造
した後でなければ評価を行うことができなかったため、
再現性があり、かつ短期間で評価できる方法の確立が望
まれていた。
【０００５】そこで、ビールから抽出した粗泡蛋白に対
するポリクローナル抗体を用いた、泡持ち及び泡持ち安
定性を測定する方法が開発された（特開平７−３３３２
２３）。しかし、この方法では数種の泡蛋白質を包括的
に測定するため、微量且つ成分特異的な泡蛋白質は検出
できなかった。従って、微量且つ成分特異的な泡蛋白質
でも検出できるような十分な感度を有するさらに優れた
方法の開発が望まれていた。
するポリクローナル抗体を用いた、泡持ち及び泡持ち安
定性を測定する方法が開発された（特開平７−３３３２
２３）。しかし、この方法では数種の泡蛋白質を包括的
に測定するため、微量且つ成分特異的な泡蛋白質は検出
できなかった。従って、微量且つ成分特異的な泡蛋白質
でも検出できるような十分な感度を有するさらに優れた
方法の開発が望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ビール
から抽出した粗泡蛋白からビールの泡持ちを規定する主
成分の一つである新規な成分（泡蛋白質）を単離、精製
すること、このような新規蛋白質を抗原として前記泡蛋
白質を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製する
こと、さらにこのモノクローナル抗体を用いた免疫学的
手法を応用して、迅速かつ正確に泡蛋白質含有量を測定
する方法を提供することを目的とし、本発明を完成し
た。
から抽出した粗泡蛋白からビールの泡持ちを規定する主
成分の一つである新規な成分（泡蛋白質）を単離、精製
すること、このような新規蛋白質を抗原として前記泡蛋
白質を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製する
こと、さらにこのモノクローナル抗体を用いた免疫学的
手法を応用して、迅速かつ正確に泡蛋白質含有量を測定
する方法を提供することを目的とし、本発明を完成し
た。
【０００７】さらに、本発明の別の目的は、前記方法を
用いたビールの泡持ち又は泡持ち安定性の測定方法を提
供することにある。
用いたビールの泡持ち又は泡持ち安定性の測定方法を提
供することにある。
【０００８】また、本発明のさらに別の目的は、前記方
法を用いたビールの原料である大麦、麦芽等の評価方
法、さらにビールの混濁安定性改善のために添加する安
定化剤の選択方法を提供することにある。
法を用いたビールの原料である大麦、麦芽等の評価方
法、さらにビールの混濁安定性改善のために添加する安
定化剤の選択方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために、粗泡蛋白画分から６種類の泡蛋白質
画分をそれぞれ単離、精製し、得られた泡蛋白質に対す
るモノクローナル抗体を作製し、該モノクローナル抗体
を用いることにより、本発明を完成した。
を達成するために、粗泡蛋白画分から６種類の泡蛋白質
画分をそれぞれ単離、精製し、得られた泡蛋白質に対す
るモノクローナル抗体を作製し、該モノクローナル抗体
を用いることにより、本発明を完成した。
【００１０】発明の新規な泡蛋白質の単離、精製は、As
ano らの方法を若干変更して行った(Rept. Res. Lab. K
irin Brewery Co.,Ltd、No.23, p1-13(1980)) 。即ち、
製造直後のビール最終製品にエタノールを用いて塩析を
行い、沈澱物を得、各種カラムクロマトグラフ法（イオ
ン交換及び逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過等）によ
って単離、精製することにより泡蛋白質画分を得ること
ができる。本発明ではこのようにして６種類の泡蛋白質
画分を単離、精製した。
ano らの方法を若干変更して行った(Rept. Res. Lab. K
irin Brewery Co.,Ltd、No.23, p1-13(1980)) 。即ち、
製造直後のビール最終製品にエタノールを用いて塩析を
行い、沈澱物を得、各種カラムクロマトグラフ法（イオ
ン交換及び逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過等）によ
って単離、精製することにより泡蛋白質画分を得ること
ができる。本発明ではこのようにして６種類の泡蛋白質
画分を単離、精製した。
【００１１】得られた泡蛋白質画分は、ウエスタンブロ
ットにより、分子量を測定し、また、同時にアミノ酸シ
ークエンサー・質量分析機を用いて該泡蛋白質の部分一
次構造を決定した。
ットにより、分子量を測定し、また、同時にアミノ酸シ
ークエンサー・質量分析機を用いて該泡蛋白質の部分一
次構造を決定した。
【００１２】さらに泡蛋白質１については、メタンスル
ホン酸を用いた酸加水分解によってアミノ酸組成を測定
した。
ホン酸を用いた酸加水分解によってアミノ酸組成を測定
した。
【００１３】得られた泡蛋白質はそれぞれ以下の性質を
有する： （Ａ）泡蛋白質１ １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４８
０００である、 ２）配列番号１記載のアミノ酸配列を有する、 ３）アミノ酸組成が表１に示す通りである、
有する： （Ａ）泡蛋白質１ １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４８
０００である、 ２）配列番号１記載のアミノ酸配列を有する、 ３）アミノ酸組成が表１に示す通りである、
【表２】 （Ｂ）泡蛋白質２ １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４８
０００である、 ２）配列番号２記載のアミノ酸配列を有する、 （Ｃ）泡蛋白質３ １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４０
０００である、 ２）配列番号３記載のアミノ酸配列を有する、 （Ｄ）泡蛋白質４ １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４０
０００である、 ２）配列番号４記載のアミノ酸配列を有する、 （Ｅ）泡蛋白質５ １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４０
０００である、 ２）配列番号５記載のアミノ酸配列を有する、 （Ｆ）泡蛋白質６ １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４７
０００である、 ２）配列番号６記載のアミノ酸配列を有する。
０００である、 ２）配列番号２記載のアミノ酸配列を有する、 （Ｃ）泡蛋白質３ １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４０
０００である、 ２）配列番号３記載のアミノ酸配列を有する、 （Ｄ）泡蛋白質４ １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４０
０００である、 ２）配列番号４記載のアミノ酸配列を有する、 （Ｅ）泡蛋白質５ １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４０
０００である、 ２）配列番号５記載のアミノ酸配列を有する、 （Ｆ）泡蛋白質６ １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４７
０００である、 ２）配列番号６記載のアミノ酸配列を有する。
【００１４】これらのアミノ酸配列をデータバンク「Ｓ
ＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ」で検索したところ、いずれも新規
な蛋白質であることが判明した。
ＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ」で検索したところ、いずれも新規
な蛋白質であることが判明した。
【００１５】本発明の泡蛋白質に特異的なモノクローナ
ル抗体の作製にあたっては、常法（免疫実験操作法II、
p945-957、南江堂参照）に従い、抗原（上述した各泡蛋
白質）を動物に免疫し、抗体産生細胞を回収し、これと
ミエローマ細胞を融合し、スクリーニングを行い標的抗
原と強く反応するハイブリドーマ株を採取することによ
り、得ることができる。
ル抗体の作製にあたっては、常法（免疫実験操作法II、
p945-957、南江堂参照）に従い、抗原（上述した各泡蛋
白質）を動物に免疫し、抗体産生細胞を回収し、これと
ミエローマ細胞を融合し、スクリーニングを行い標的抗
原と強く反応するハイブリドーマ株を採取することによ
り、得ることができる。
【００１６】ビール最終製品及びビール製造工程におけ
るビール試料中に含まれる泡蛋白質含有量をこのように
して得られたモノクローナル抗体を用いて免疫学的測定
法によって測定することができる。免疫学的測定法とし
ては、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセ
イ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫比
濁法などを含むが、エンザイムイムノアッセイ、特にＥ
ＬＩＳＡ（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）が泡
蛋白質を高感度で検出でき、かつ多数の検体を自動的に
測定できるので好適である。
るビール試料中に含まれる泡蛋白質含有量をこのように
して得られたモノクローナル抗体を用いて免疫学的測定
法によって測定することができる。免疫学的測定法とし
ては、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセ
イ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫比
濁法などを含むが、エンザイムイムノアッセイ、特にＥ
ＬＩＳＡ（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）が泡
蛋白質を高感度で検出でき、かつ多数の検体を自動的に
測定できるので好適である。
【００１７】ＥＬＩＳＡ法においては、まず本発明のモ
ノクローナル抗体を第一抗体として担体に固定化する。
担体としては固体担体が好ましく、例えばスチレンやポ
リスチレンなどの高分子担体を用いて成型されたＥＬＩ
ＳＡプレートなどの容器を使用できる。モノクローナル
抗体の担体への固定化は、例えばモノクローナル抗体を
炭酸緩衝液やホウ酸緩衝液などの緩衝液に溶解して担体
に吸着させることにより実施できる。他方、第二抗体と
しては、ポリクローナル抗体（例えば特開平７−３３３
２２３に記載のポリクローナル抗体）を用いてサンドイ
ッチＥＬＩＳＡとすることができる。あるいは、後述す
る実施例で記載するように、本発明のモノクローナル抗
体の１つを第一抗体とし、別のモノクローナル抗体を第
二抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡを用いる
と、泡蛋白質をより確実に精度よく検出できる。
ノクローナル抗体を第一抗体として担体に固定化する。
担体としては固体担体が好ましく、例えばスチレンやポ
リスチレンなどの高分子担体を用いて成型されたＥＬＩ
ＳＡプレートなどの容器を使用できる。モノクローナル
抗体の担体への固定化は、例えばモノクローナル抗体を
炭酸緩衝液やホウ酸緩衝液などの緩衝液に溶解して担体
に吸着させることにより実施できる。他方、第二抗体と
しては、ポリクローナル抗体（例えば特開平７−３３３
２２３に記載のポリクローナル抗体）を用いてサンドイ
ッチＥＬＩＳＡとすることができる。あるいは、後述す
る実施例で記載するように、本発明のモノクローナル抗
体の１つを第一抗体とし、別のモノクローナル抗体を第
二抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡを用いる
と、泡蛋白質をより確実に精度よく検出できる。
【００１８】本発明によるビールの泡蛋白質含有量の測
定方法の一例を以下に説明する。
定方法の一例を以下に説明する。
【００１９】まず抗体吸着用緩衝液を用いて第一抗体を
マイクロプレートに分注してインキュベートし、上清を
除去した後、洗浄液を用いて洗浄する。同様に、ブロッ
キング溶液、目的とする抗原（ビール溶液）溶液、第二
抗体、標識酵素の順に分注、インキュベート、洗浄を繰
り返す。最後に基質溶液を分注し、室温又は37℃で保持
した後、405nm における吸光度を測定し、別途泡蛋白質
の標準希釈系列から作成した検量線グラフを用いること
により、ビール試料に含まれる泡蛋白質の濃度を算定す
ることができる。
マイクロプレートに分注してインキュベートし、上清を
除去した後、洗浄液を用いて洗浄する。同様に、ブロッ
キング溶液、目的とする抗原（ビール溶液）溶液、第二
抗体、標識酵素の順に分注、インキュベート、洗浄を繰
り返す。最後に基質溶液を分注し、室温又は37℃で保持
した後、405nm における吸光度を測定し、別途泡蛋白質
の標準希釈系列から作成した検量線グラフを用いること
により、ビール試料に含まれる泡蛋白質の濃度を算定す
ることができる。
【００２０】抗体吸着用緩衝液としては例えばPBS(-)緩
衝液を、希釈液としては例えば、ウシ血清アルブミン(B
SA)、ゼラチンあるいはオボアルブミンを含むPBS(-)緩
衝液等を使用できる。洗浄液としては、例えば、NaN3及
びTween20 を含むPBS(-)緩衝液、NaCl及びTween20 を含
むトリス緩衝化生理食塩水(TBS) 等を使用できる。又、
ブロッキング溶液としては、例えば、1 〜3%BSA を含む
PBS(-)緩衝液、1-5 ％スキムミルクを含むPBS(-)緩衝液
等を使用できる。標識酵素としては、例えば、ペルオキ
シダーゼ、酸性フォスファターゼ、アルカリフォスファ
ターゼ、β- ガラクトシダーゼ等を用いる。また、基質
溶液としては、例えば、標識酵素がアルカリフォスファ
ターゼの場合、p-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩
(PNPP)、β- ガラクトシダーゼの場合、o-ニトロフェニ
ルβ-Dガラクトシダーゼ等、標識酵素に合わせて適宜選
択する事が出来る。
衝液を、希釈液としては例えば、ウシ血清アルブミン(B
SA)、ゼラチンあるいはオボアルブミンを含むPBS(-)緩
衝液等を使用できる。洗浄液としては、例えば、NaN3及
びTween20 を含むPBS(-)緩衝液、NaCl及びTween20 を含
むトリス緩衝化生理食塩水(TBS) 等を使用できる。又、
ブロッキング溶液としては、例えば、1 〜3%BSA を含む
PBS(-)緩衝液、1-5 ％スキムミルクを含むPBS(-)緩衝液
等を使用できる。標識酵素としては、例えば、ペルオキ
シダーゼ、酸性フォスファターゼ、アルカリフォスファ
ターゼ、β- ガラクトシダーゼ等を用いる。また、基質
溶液としては、例えば、標識酵素がアルカリフォスファ
ターゼの場合、p-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩
(PNPP)、β- ガラクトシダーゼの場合、o-ニトロフェニ
ルβ-Dガラクトシダーゼ等、標識酵素に合わせて適宜選
択する事が出来る。
【００２１】このようにしてビール最終製品及びビール
の製造工程におけるビール試料中の泡蛋白含有量を測定
することにより、ビールの泡持ち及び泡持ち安定性を評
価することができる。
の製造工程におけるビール試料中の泡蛋白含有量を測定
することにより、ビールの泡持ち及び泡持ち安定性を評
価することができる。
【００２２】また、ビール製造において、混濁安定性を
改善するなどの目的のためにシリカゲルやタンニン酸等
の各種安定化剤を加えるが、このような安定化剤が泡持
ちに悪影響を与えないことが重要である。本発明の測定
法はこのような安定化剤の効力判定にも利用することが
できる。例えば、後述する実施例では、ビール製造工程
で得られるもろみに各種安定化剤を添加して本発明のＥ
ＬＩＳＡ法によって泡蛋白質の量を測定したところ、安
定化剤の種類によって残存蛋白質量が異なることが明ら
かとなり、本発明の方法を安定化剤の評価に使用可能な
ことが判明した。
改善するなどの目的のためにシリカゲルやタンニン酸等
の各種安定化剤を加えるが、このような安定化剤が泡持
ちに悪影響を与えないことが重要である。本発明の測定
法はこのような安定化剤の効力判定にも利用することが
できる。例えば、後述する実施例では、ビール製造工程
で得られるもろみに各種安定化剤を添加して本発明のＥ
ＬＩＳＡ法によって泡蛋白質の量を測定したところ、安
定化剤の種類によって残存蛋白質量が異なることが明ら
かとなり、本発明の方法を安定化剤の評価に使用可能な
ことが判明した。
【００２３】さらに、本発明の方法を用いて、ビール原
料（大麦及びそれを製麦した麦芽等）に含まれている泡
蛋白質含量を測定することができる。従って、従来はビ
ール製造後でなければ原料の評価を行うことができなか
ったが、本発明の方法を用いることにより、ビール製造
前にビール原料の品質評価を容易に実施することが可能
となった。
料（大麦及びそれを製麦した麦芽等）に含まれている泡
蛋白質含量を測定することができる。従って、従来はビ
ール製造後でなければ原料の評価を行うことができなか
ったが、本発明の方法を用いることにより、ビール製造
前にビール原料の品質評価を容易に実施することが可能
となった。
【００２４】本発明の方法においては、ビール試料中の
泡蛋白を１種又は２種のモノクローナル抗体を用いて測
定するため、測定によるバラツキが少なく、かつ感度が
非常に高いので微量の泡蛋白質でも検出することが可能
である。又、本発明の方法は、以下の参考例１に記載す
る従来の泡持ち測定法（ＳＨＶ法）による測定結果と良
好な相関関係を示し、従来法に代えて迅速かつ正確にビ
ールの泡持ち及び泡持ち安定性試験に有効に使用できる
ことが明らかとなった。
泡蛋白を１種又は２種のモノクローナル抗体を用いて測
定するため、測定によるバラツキが少なく、かつ感度が
非常に高いので微量の泡蛋白質でも検出することが可能
である。又、本発明の方法は、以下の参考例１に記載す
る従来の泡持ち測定法（ＳＨＶ法）による測定結果と良
好な相関関係を示し、従来法に代えて迅速かつ正確にビ
ールの泡持ち及び泡持ち安定性試験に有効に使用できる
ことが明らかとなった。
【００２５】さらに、本発明は上述した本発明の方法に
使用するキットを提供する。本発明のキットには、本発
明の泡蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体を
含む。抗体は上記の希釈液中に希釈された抗体希釈液、
あるいは抗体凍結乾燥品の形でありうる。本発明のキッ
トには、該抗体の他に、９６ウエルプレート、試料吸着
用緩衝液、洗浄液、ブロッキング溶液、基質溶液、第二
抗体希釈液ならびに検量線グラフなどを含むことができ
る。
使用するキットを提供する。本発明のキットには、本発
明の泡蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体を
含む。抗体は上記の希釈液中に希釈された抗体希釈液、
あるいは抗体凍結乾燥品の形でありうる。本発明のキッ
トには、該抗体の他に、９６ウエルプレート、試料吸着
用緩衝液、洗浄液、ブロッキング溶液、基質溶液、第二
抗体希釈液ならびに検量線グラフなどを含むことができ
る。
【００２６】
【発明の実施の形態】次に本発明を実施例によりさらに
詳細に説明する。
詳細に説明する。
【００２７】実施例１：泡蛋白質の調製泡蛋白質１の単離、精製 ビール最終製品（ サントリー(株)製）にエタノールを
加え、粗泡蛋白画分を沈殿させる。これを透析後、ゲル
濾過（Toyopearl HW-55F）、イオン交換(Toyopearl G65
0M）クロマトの順で活性画分の精製を進め、さらにゲル
濾過HPLC（Toyopearl G2000SW）、逆相HPLC（Toyopearl
C8）を繰り返し、最終精製を行った。最終精製分の純
度は、HPLCのクロマトグラムで単一ピークを与え、且つ
SDS-PAGEにより単一バンドとなったことにより確認し
た。なお、カラムクロマト後の活性画分の評価方法とし
ては、Asano らの方法(Rept.Res.Lab.Kirin Brewery C
o.,Ltd. , No23,p1-13,(1980)) を適用した。即ち、100
から300mg の試料を3.6%エタノール水溶液(pH4.2)1L
に溶解し、この溶液20mlを目盛付チューブに入れ、２０
℃で５秒間振り動かす(400回／分) 。振り動かした後の
泡の体積を測定し、活性の高いフラクションのみを分取
する。
加え、粗泡蛋白画分を沈殿させる。これを透析後、ゲル
濾過（Toyopearl HW-55F）、イオン交換(Toyopearl G65
0M）クロマトの順で活性画分の精製を進め、さらにゲル
濾過HPLC（Toyopearl G2000SW）、逆相HPLC（Toyopearl
C8）を繰り返し、最終精製を行った。最終精製分の純
度は、HPLCのクロマトグラムで単一ピークを与え、且つ
SDS-PAGEにより単一バンドとなったことにより確認し
た。なお、カラムクロマト後の活性画分の評価方法とし
ては、Asano らの方法(Rept.Res.Lab.Kirin Brewery C
o.,Ltd. , No23,p1-13,(1980)) を適用した。即ち、100
から300mg の試料を3.6%エタノール水溶液(pH4.2)1L
に溶解し、この溶液20mlを目盛付チューブに入れ、２０
℃で５秒間振り動かす(400回／分) 。振り動かした後の
泡の体積を測定し、活性の高いフラクションのみを分取
する。
【００２８】この泡蛋白質をウエスタンブロット分析に
付して分子量を測定したところ、約４８０００であっ
た。
付して分子量を測定したところ、約４８０００であっ
た。
【００２９】次に泡蛋白質をアミノ酸シークエンサーに
供し、Ala-Val-Glu-Asn-Ala-Asn-Arg-Val-Asn-Lys-Phe-
Leu-Phe-Leu-Ile-Arg-Glu-Ala-Ile （配列番号１）とい
う部分一次構造を決定した。この配列をデータバンク
「ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ」で検索したところ、新規な蛋
白質であることが判明した。
供し、Ala-Val-Glu-Asn-Ala-Asn-Arg-Val-Asn-Lys-Phe-
Leu-Phe-Leu-Ile-Arg-Glu-Ala-Ile （配列番号１）とい
う部分一次構造を決定した。この配列をデータバンク
「ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ」で検索したところ、新規な蛋
白質であることが判明した。
【００３０】さらに、メタンスルホン酸を用いた酸加水
分解によってこの泡蛋白質のアミノ酸組成を分析した結
果は上記表１に示す通りである。
分解によってこの泡蛋白質のアミノ酸組成を分析した結
果は上記表１に示す通りである。
【００３１】泡蛋白質２〜６の単離、精製 ビール最終製品（サントリー(株)製）にエタノールを加
え、粗泡蛋白画分を沈殿させる。これを透析後、この画
分を濃縮し、イオン交換カラム（Toyopearl G650M）、ゲル
濾過HPLC（ToyopearlG2000SW）、逆相HPLC（ToyopearlO
DS）によって順次精製を進め、数種の活性画分を単離し
た。ゲル濾過、イオン交換クロマトの順で活性画分の精
製を行った。最終精製分の純度は、SDS-PAGEにより単一
バンドとなったことにより評価した。なお、カラムクロ
マト後の活性画分の評価方法は、前記泡蛋白質１の場合
と同様にして行った。
え、粗泡蛋白画分を沈殿させる。これを透析後、この画
分を濃縮し、イオン交換カラム（Toyopearl G650M）、ゲル
濾過HPLC（ToyopearlG2000SW）、逆相HPLC（ToyopearlO
DS）によって順次精製を進め、数種の活性画分を単離し
た。ゲル濾過、イオン交換クロマトの順で活性画分の精
製を行った。最終精製分の純度は、SDS-PAGEにより単一
バンドとなったことにより評価した。なお、カラムクロ
マト後の活性画分の評価方法は、前記泡蛋白質１の場合
と同様にして行った。
【００３２】得られた５種類の泡蛋白（それぞれ泡蛋白
質２、泡蛋白質３、泡蛋白質４、泡蛋白質５及び泡蛋白
質６とする）をウエスタンブロット分析に付して分子量
を測定したところ、それぞれ、約４８０００（泡蛋白質
２）、約４００００（泡蛋白質３）、約４００００（泡
蛋白質４）、約４００００（泡蛋白質５）及び約４７０
００（泡蛋白質６）であった。
質２、泡蛋白質３、泡蛋白質４、泡蛋白質５及び泡蛋白
質６とする）をウエスタンブロット分析に付して分子量
を測定したところ、それぞれ、約４８０００（泡蛋白質
２）、約４００００（泡蛋白質３）、約４００００（泡
蛋白質４）、約４００００（泡蛋白質５）及び約４７０
００（泡蛋白質６）であった。
【００３３】なお、これらの泡蛋白質は以下の条件の逆
相HPLCを行うとき、以下の保持時間で溶出する。
相HPLCを行うとき、以下の保持時間で溶出する。
【００３４】 ＜クロマトグラフィ条件＞ カラム：TSK-Gel 80Ts (6mm I.D. x 150mm) 溶出条件： ０分〜１０分 H20 １０分〜４０分 H20→100% MeCN リニアグラジエント ４０分〜５０分 100% MeCN 流速：1.0ml/min. 検出条件：280nm(UV) ＜保持時間＞ 泡蛋白質２：３０〜３２分 泡蛋白質３：２６〜２８分 泡蛋白質４：２１〜２３分 泡蛋白質５：２３〜２５分 泡蛋白質６：３３〜３５分
【００３５】なお、同じ条件のクロマトグラフィを行う
ときの泡蛋白質１の保持時間は２２〜２４分であった。
ときの泡蛋白質１の保持時間は２２〜２４分であった。
【００３６】泡蛋白質２〜６をアミノ酸シークエンサー
に供し、それぞれ、Phe-Asn-Pro-Gly-Gln-Val-Asp-Gly-
Lys-Met-Leu-Pro-Tyr-Leu-Thr（泡蛋白質２、配列番
号：２）、Val-Tyr-Pro-Val-Gln-Tyr-Ala-Gly-Gln-Gly-
Leu-Pro-Leu-Asn-Gly（泡蛋白質３、配列番号：３）、P
he-Asn-Pro-Val-Gln-Val-Asp-Ala-Lys-Met-Pro-Pro-Leu
-Phe-Leu（泡蛋白質４、配列番号：４）、Val-Tyr-Pro-
Pro-Gln-Tyr-Pro-Gly-Met-Gly-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu
（泡蛋白質５、配列番号：５）及びAsp-Val-Val-Ala-As
n-Met-Leu-Pro-Leu-Phe-Leu-Ile（泡蛋白質６、配列番
号：６）という部分一次構造を決定した。
に供し、それぞれ、Phe-Asn-Pro-Gly-Gln-Val-Asp-Gly-
Lys-Met-Leu-Pro-Tyr-Leu-Thr（泡蛋白質２、配列番
号：２）、Val-Tyr-Pro-Val-Gln-Tyr-Ala-Gly-Gln-Gly-
Leu-Pro-Leu-Asn-Gly（泡蛋白質３、配列番号：３）、P
he-Asn-Pro-Val-Gln-Val-Asp-Ala-Lys-Met-Pro-Pro-Leu
-Phe-Leu（泡蛋白質４、配列番号：４）、Val-Tyr-Pro-
Pro-Gln-Tyr-Pro-Gly-Met-Gly-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu
（泡蛋白質５、配列番号：５）及びAsp-Val-Val-Ala-As
n-Met-Leu-Pro-Leu-Phe-Leu-Ile（泡蛋白質６、配列番
号：６）という部分一次構造を決定した。
【００３７】これらの配列をデータバンク「ＳＷＩＳＳ
−ＰＲＯＴ」で検索したところ、いずれも新規な蛋白質
であることが判明した。
−ＰＲＯＴ」で検索したところ、いずれも新規な蛋白質
であることが判明した。
【００３８】実施例２：モノクローナル抗泡蛋白質抗体
の作製泡蛋白質１を抗原とするモノクローナル抗体 実施例１で得られた泡蛋白質１を抗原としてモノクロー
ナル抗体を作製した。まず、泡蛋白質１を蒸留水で懸濁
し、生理食塩水(0.9w/w% NaCl 水溶液) を用いて適当な
蛋白質濃度(1mg/ml)に調製する。これを完全フロイント
アジュバントと容量３：５の比率で混合して油中水型乳
剤を作製する。BALB/cマウス( ４週齢）３匹に初回免疫
として抗原0.18mg/mouse相当量を腹腔及び皮下にそれぞ
れ注射する。追加免疫は、不完全フロイントアジュバン
トを用いて同様に乳剤を作製して、抗原0.09mg/mouse相
当量を同じく腹腔及び皮下にそれぞれ注射する。追加免
疫は、１週間から１０日間の間隔で３回実施する。
の作製泡蛋白質１を抗原とするモノクローナル抗体 実施例１で得られた泡蛋白質１を抗原としてモノクロー
ナル抗体を作製した。まず、泡蛋白質１を蒸留水で懸濁
し、生理食塩水(0.9w/w% NaCl 水溶液) を用いて適当な
蛋白質濃度(1mg/ml)に調製する。これを完全フロイント
アジュバントと容量３：５の比率で混合して油中水型乳
剤を作製する。BALB/cマウス( ４週齢）３匹に初回免疫
として抗原0.18mg/mouse相当量を腹腔及び皮下にそれぞ
れ注射する。追加免疫は、不完全フロイントアジュバン
トを用いて同様に乳剤を作製して、抗原0.09mg/mouse相
当量を同じく腹腔及び皮下にそれぞれ注射する。追加免
疫は、１週間から１０日間の間隔で３回実施する。
【００３９】最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、RPMI-1
640 培地でよく洗浄する。当該脾細胞1x108個と親細胞
( ミエローマ、P3X63Ag-U1)2x107個とを混合し、ポリエ
チレングリコール1500をRPMI-1640 に50% に溶解した液
1.5ml を加えて1000rpm で約40秒間遠心する。更にRPMI
-1640 培地5ml を徐々に加えて希釈した後、1000rpmで
３分遠心し上澄みを捨て、次にＨＴ（ヒポキサンチン−
チミジン）培地6ml を加え再度900rpmで５分遠心する。
次にＨＴ培地20mlに細胞を分散させ、９６穴の培養プレ
ートの内側６０ウエルに100 μl ずつ注入し、翌日40μ
l のＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジ
ン）培地を継ぎ足した。その後３日置きに半量の培地を
新しいＨＡＴ培地に変えていき、１４日後における培養
上清について抗体価を測定したところ、１２ウエルに陽
性を認めた。次にこれら陽性ハイブリドーマをBALB/cマ
ウス胸腺細胞をフィーダー(feeder)として加えたＨＴ培
地で希釈していく限界希釈法を数回繰り返して行うこと
により、最終的にモノクローナル抗泡蛋白質抗体を産生
するハイブリドーマが数種得られた。
640 培地でよく洗浄する。当該脾細胞1x108個と親細胞
( ミエローマ、P3X63Ag-U1)2x107個とを混合し、ポリエ
チレングリコール1500をRPMI-1640 に50% に溶解した液
1.5ml を加えて1000rpm で約40秒間遠心する。更にRPMI
-1640 培地5ml を徐々に加えて希釈した後、1000rpmで
３分遠心し上澄みを捨て、次にＨＴ（ヒポキサンチン−
チミジン）培地6ml を加え再度900rpmで５分遠心する。
次にＨＴ培地20mlに細胞を分散させ、９６穴の培養プレ
ートの内側６０ウエルに100 μl ずつ注入し、翌日40μ
l のＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジ
ン）培地を継ぎ足した。その後３日置きに半量の培地を
新しいＨＡＴ培地に変えていき、１４日後における培養
上清について抗体価を測定したところ、１２ウエルに陽
性を認めた。次にこれら陽性ハイブリドーマをBALB/cマ
ウス胸腺細胞をフィーダー(feeder)として加えたＨＴ培
地で希釈していく限界希釈法を数回繰り返して行うこと
により、最終的にモノクローナル抗泡蛋白質抗体を産生
するハイブリドーマが数種得られた。
【００４０】上記で得られたハイブリドーマをそれぞれ
pristane(2,6,10,14-tetramethylpentadecane)で予め処
理をしておいたBALB/cマウスの腹腔内に注入し、２〜３
週間後に腹水を採取することにより、モノクローナル抗
泡蛋白質抗体粗画分を得た。これらのモノクローナル抗
体を硫酸アンモニウム法で塩析し、プロテインＡを担体
とするアフィニティクロマトグラフィにより精製した。
pristane(2,6,10,14-tetramethylpentadecane)で予め処
理をしておいたBALB/cマウスの腹腔内に注入し、２〜３
週間後に腹水を採取することにより、モノクローナル抗
泡蛋白質抗体粗画分を得た。これらのモノクローナル抗
体を硫酸アンモニウム法で塩析し、プロテインＡを担体
とするアフィニティクロマトグラフィにより精製した。
【００４１】得られたモノクローナル抗体の実施例１で
得た泡蛋白質１に対する反応性を評価することによって
スクリーニングを行い、モノクローナル抗体を選択し
た。このようにして抗体Ａ及び抗体Ｂを含む数種のモノ
クローナル抗体を得た。
得た泡蛋白質１に対する反応性を評価することによって
スクリーニングを行い、モノクローナル抗体を選択し
た。このようにして抗体Ａ及び抗体Ｂを含む数種のモノ
クローナル抗体を得た。
【００４２】泡蛋白質２〜６を抗原とするモノクローナ
ル抗体 泡蛋白質２〜６の各々について上記と同様の方法を用い
て、各々の抗原に対して２種類のハイブリドーマを得
た。得られたハイブリドーマをそれぞれpristaneで予め
処理をしておいたBALB/cマウスの腹腔内に注入し、２〜
３週間後に腹水を採取することにより、モノクローナル
抗泡蛋白質抗体粗画分を得た。これらのモノクローナル
抗体を硫酸アンモニウム法で塩析し、プロテインＧを担
体とするアフィニティクロマトグラフィにより精製し
た。
ル抗体 泡蛋白質２〜６の各々について上記と同様の方法を用い
て、各々の抗原に対して２種類のハイブリドーマを得
た。得られたハイブリドーマをそれぞれpristaneで予め
処理をしておいたBALB/cマウスの腹腔内に注入し、２〜
３週間後に腹水を採取することにより、モノクローナル
抗泡蛋白質抗体粗画分を得た。これらのモノクローナル
抗体を硫酸アンモニウム法で塩析し、プロテインＧを担
体とするアフィニティクロマトグラフィにより精製し
た。
【００４３】泡蛋白質２を抗原としてモノクローナル抗
体Ｃ、Ｄが、泡蛋白質３を抗原としてモノクローナル抗
体Ｅ、Ｆが、泡蛋白質４を抗原としてモノクローナル抗
体Ｇ、Ｈが、泡蛋白質５を抗原としてモノクローナル抗
体Ｉ、Ｊが、泡蛋白質６を抗原としてモノクローナル抗
体Ｋ、Ｌが、それぞれ得られた。
体Ｃ、Ｄが、泡蛋白質３を抗原としてモノクローナル抗
体Ｅ、Ｆが、泡蛋白質４を抗原としてモノクローナル抗
体Ｇ、Ｈが、泡蛋白質５を抗原としてモノクローナル抗
体Ｉ、Ｊが、泡蛋白質６を抗原としてモノクローナル抗
体Ｋ、Ｌが、それぞれ得られた。
【００４４】実施例３：サンドイッチ法によるビール試
料中の泡蛋白質の定量 実施例２で得られた泡蛋白質１を抗原として得られたモ
ノクローナル抗体Ａ及びビオチン化したモノクローナル
抗体Ｂを用いるサンドイッチ法により、ビール中の泡蛋
白質の定量を以下のようにして行った。
料中の泡蛋白質の定量 実施例２で得られた泡蛋白質１を抗原として得られたモ
ノクローナル抗体Ａ及びビオチン化したモノクローナル
抗体Ｂを用いるサンドイッチ法により、ビール中の泡蛋
白質の定量を以下のようにして行った。
【００４５】１）まず、抗体吸着用緩衝液(0.05-0.1% N
aN3 を含む0.01M PBS(-)、pH7.5-8.5)を用いて第一抗体
として抗体Ａを希釈し、９６穴プレートに100 μl ずつ
分注し4 ℃、一晩、抗体を吸着させる。
aN3 を含む0.01M PBS(-)、pH7.5-8.5)を用いて第一抗体
として抗体Ａを希釈し、９６穴プレートに100 μl ずつ
分注し4 ℃、一晩、抗体を吸着させる。
【００４６】２）次に上清を除去し、洗浄液(NaN3 及び
Tween-20を含む0.01M PBS(-)、pH7.5-8.5)を用いて２回
洗浄した後、ブロッキング溶液(1-3% BSA 及びNaN3を含
む0.01M PBS(-)、pH7.5-8.5)を200 μl/wellずつ分注
し、３７℃で１時間インキュベートする。
Tween-20を含む0.01M PBS(-)、pH7.5-8.5)を用いて２回
洗浄した後、ブロッキング溶液(1-3% BSA 及びNaN3を含
む0.01M PBS(-)、pH7.5-8.5)を200 μl/wellずつ分注
し、３７℃で１時間インキュベートする。
【００４７】３）一方、希釈液(0.1% BSA 及び0.05-0.1
% NaN3を含む0.01M PBS(-)、pH7.5-8.5)を用いてビール
試料の希釈系列を作製しておく。別途、泡蛋白質の検量
線を作成する目的で、泡蛋白質の標準希釈系列及び第二
抗体として使用するビオチン化抗体Ｂの希釈溶液を作製
する。
% NaN3を含む0.01M PBS(-)、pH7.5-8.5)を用いてビール
試料の希釈系列を作製しておく。別途、泡蛋白質の検量
線を作成する目的で、泡蛋白質の標準希釈系列及び第二
抗体として使用するビオチン化抗体Ｂの希釈溶液を作製
する。
【００４８】４）ブロッキングした９６穴プレートを洗
浄液で２回洗浄後、上記のビール試料及び泡蛋白質の希
釈溶液を100 μl/wellずつ分注し、３７℃で１．５時間
インキュベートする。
浄液で２回洗浄後、上記のビール試料及び泡蛋白質の希
釈溶液を100 μl/wellずつ分注し、３７℃で１．５時間
インキュベートする。
【００４９】これを洗浄液で２回洗浄して、第二抗体と
してビオチン化抗体Ｂ希釈液を100μl/wellずつ分注
し、３７℃で１．５時間インキュベートする。
してビオチン化抗体Ｂ希釈液を100μl/wellずつ分注
し、３７℃で１．５時間インキュベートする。
【００５０】５）更に、これを同様に２回洗浄して、ス
トレプトアビジン結合アルカリフォスファターゼ(1000
倍希釈、Dakopatts 社製) を100 μl/wellずつ分注し、
３７℃で３０分間インキュベートする。
トレプトアビジン結合アルカリフォスファターゼ(1000
倍希釈、Dakopatts 社製) を100 μl/wellずつ分注し、
３７℃で３０分間インキュベートする。
【００５１】６）続いて、さらに洗浄液で２回洗浄し
て、基質溶液(p- ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩
(PNPP)をMgCl2 を含むジエタノールアミン溶液(pH9.0-
9.5)で希釈したもの) を100 μl/wellずつ分注し、３７
℃で１０〜１５分間保持した後、1-3N NaOH 50μl を分
注して反応を停止し、自動吸光度測定機を用いて405nm
における吸光度を測定する。
て、基質溶液(p- ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩
(PNPP)をMgCl2 を含むジエタノールアミン溶液(pH9.0-
9.5)で希釈したもの) を100 μl/wellずつ分注し、３７
℃で１０〜１５分間保持した後、1-3N NaOH 50μl を分
注して反応を停止し、自動吸光度測定機を用いて405nm
における吸光度を測定する。
【００５２】７）標準希釈系列の吸光度測定値をプロッ
トし、泡蛋白質１の検量線を作成する。この検量線を用
いることにより、各々のビール試料に含まれる泡蛋白質
１の濃度を算定することができる。
トし、泡蛋白質１の検量線を作成する。この検量線を用
いることにより、各々のビール試料に含まれる泡蛋白質
１の濃度を算定することができる。
【００５３】実施例４：サンドイッチ法と従来法の泡蛋
白質分析法であるポリクローナル抗体を用いるELISA 法
との比較 市場より購入した各種ビール最終製品について、実施例
３に記載の泡蛋白質１を抗原とする本発明のモノクロー
ナル抗体を用いるサンドイッチ法と、泡蛋白粗画分に対
するポリクローナル抗体を用いた従来法（特開平７−３
３３２２３）による泡蛋白測定を行い比較を行った（図
１）。なお、従来法では、泡蛋白粗画分に対するポリク
ローナル抗体を第一抗体とし、ビオチン化ヤギ抗ウサギ
免疫グロブリンを第二抗体として用いている。さらに、
参考例１に示す現行ビールの泡持ち測定法（ＳＨＶ法）
も行った。
白質分析法であるポリクローナル抗体を用いるELISA 法
との比較 市場より購入した各種ビール最終製品について、実施例
３に記載の泡蛋白質１を抗原とする本発明のモノクロー
ナル抗体を用いるサンドイッチ法と、泡蛋白粗画分に対
するポリクローナル抗体を用いた従来法（特開平７−３
３３２２３）による泡蛋白測定を行い比較を行った（図
１）。なお、従来法では、泡蛋白粗画分に対するポリク
ローナル抗体を第一抗体とし、ビオチン化ヤギ抗ウサギ
免疫グロブリンを第二抗体として用いている。さらに、
参考例１に示す現行ビールの泡持ち測定法（ＳＨＶ法）
も行った。
【００５４】得られた結果を表２に示す。なお、表２に
おいて、ＳＨＶ法による泡持ちの単位はｃｍ2であり、
粗泡蛋白画分に対するポリクローナル抗体を用いる従来
法、及び本発明の方法の欄に記載するのは、各検量線か
ら算出した泡蛋白質濃度（ｍｇ／Ｌ）である。 表２ ビール ＳＨＶ 従来法 本発明の方法 Ａ １３７ ４２ ５．２５ Ｂ １４７ ５１ ６．５０ Ｃ ７８ ３４ ３．６７ Ｄ １２２ ３９ ４．９９ Ｅ ９４ ３２ ４．６４
おいて、ＳＨＶ法による泡持ちの単位はｃｍ2であり、
粗泡蛋白画分に対するポリクローナル抗体を用いる従来
法、及び本発明の方法の欄に記載するのは、各検量線か
ら算出した泡蛋白質濃度（ｍｇ／Ｌ）である。 表２ ビール ＳＨＶ 従来法 本発明の方法 Ａ １３７ ４２ ５．２５ Ｂ １４７ ５１ ６．５０ Ｃ ７８ ３４ ３．６７ Ｄ １２２ ３９ ４．９９ Ｅ ９４ ３２ ４．６４
【００５５】この結果から本発明によるサンドイッチ法
とＳＨＶ法（参考例１) との相関係数を求めたところ、
両者に非常に良好な相関を確認した( 相関係数0.926：
図１、Ｂ) 。この相関係数は従来法とＳＨＶ法との相関
係数（0.896：図１、Ａ）よりも高い値を示した。ま
た、本発明の方法と従来法との間にも高い相関係数（0.
965）が得られた。
とＳＨＶ法（参考例１) との相関係数を求めたところ、
両者に非常に良好な相関を確認した( 相関係数0.926：
図１、Ｂ) 。この相関係数は従来法とＳＨＶ法との相関
係数（0.896：図１、Ａ）よりも高い値を示した。ま
た、本発明の方法と従来法との間にも高い相関係数（0.
965）が得られた。
【００５６】従ってこのサンドイッチ法を適用すること
によって、ビールの泡持ちを精確に予測できることが明
らかになった。
によって、ビールの泡持ちを精確に予測できることが明
らかになった。
【００５７】次に泡蛋白質の標準希釈系列を作製し、サ
ンドイッチ法と従来法の感度を比較した（表３）。サン
ドイッチ法は従来法に比べ60-100倍感度が高く、非常に
微量な泡蛋白質量でも測定できることを示した。
ンドイッチ法と従来法の感度を比較した（表３）。サン
ドイッチ法は従来法に比べ60-100倍感度が高く、非常に
微量な泡蛋白質量でも測定できることを示した。
【表３】
【００５８】次に、実施例２において、泡蛋白質２を抗
原として得られたモノクローナル抗体Ｃ／Ｄ（以下この
組み合わせをペア１とする)、泡蛋白質３を抗原として
得られたモノクローナル抗体Ｅ／Ｆ（以下この組み合わ
せをペア２とする）、泡蛋白質４を抗原として得られた
モノクローナル抗体Ｇ／Ｈ（以下この組み合わせをペア
３とする）、泡蛋白質５を抗原として得られたモノクロ
ーナル抗体Ｉ／Ｊ（以下この組み合わせをペア４とす
る）、泡蛋白質６を抗原として得られたモノクローナル
抗体Ｋ／Ｌ（以下この組み合わせをペア５とする）を用
いて、上記と同様のサンドイッチ法により、ビール中の
各々の泡蛋白質の定量を行った。各々のモノクローナル
抗体のペアにおいて、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ及びＫを第一抗
体、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ及びＬを第二抗体として使用した。
原として得られたモノクローナル抗体Ｃ／Ｄ（以下この
組み合わせをペア１とする)、泡蛋白質３を抗原として
得られたモノクローナル抗体Ｅ／Ｆ（以下この組み合わ
せをペア２とする）、泡蛋白質４を抗原として得られた
モノクローナル抗体Ｇ／Ｈ（以下この組み合わせをペア
３とする）、泡蛋白質５を抗原として得られたモノクロ
ーナル抗体Ｉ／Ｊ（以下この組み合わせをペア４とす
る）、泡蛋白質６を抗原として得られたモノクローナル
抗体Ｋ／Ｌ（以下この組み合わせをペア５とする）を用
いて、上記と同様のサンドイッチ法により、ビール中の
各々の泡蛋白質の定量を行った。各々のモノクローナル
抗体のペアにおいて、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ及びＫを第一抗
体、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ及びＬを第二抗体として使用した。
【００５９】サンドイッチ法による測定結果と、現行ビ
ールの泡持ち測定法（ＳＨＶ法；参考例１）との相関を
評価した。その結果、両者に非常に良好な相関を確認し
た（相関係数は、ペア１から５の順に0.973、0.967、0.
982、0.917及び0.971であった。）また、従来法（特開
平７−３３３２２３）とＳＨＶ法との相関係数は0.906
であった。（なお、サンプル数は全て８種で行った）。
ールの泡持ち測定法（ＳＨＶ法；参考例１）との相関を
評価した。その結果、両者に非常に良好な相関を確認し
た（相関係数は、ペア１から５の順に0.973、0.967、0.
982、0.917及び0.971であった。）また、従来法（特開
平７−３３３２２３）とＳＨＶ法との相関係数は0.906
であった。（なお、サンプル数は全て８種で行った）。
【００６０】実施例５：安定化剤の評価方法 異なるメーカーから購入した安定化剤（シリカゲルを５
サンプル、タンニン酸を１サンプルの計６サンプル）
を、もろみに400mg/L （但し、タンニン酸は50mg/Lの濃
度）の濃度にて添加し、氷冷中、5分撹袢反応させた。
但し、タンニン酸は０℃で一晩静置処理した。その後、
各もろみを冷却遠心処理(12000rpm ・3分)した後、泡蛋
白質１を抗原とするモノクローナル抗体を用いて実施例
３に示すELISA を実施した。得られた結果を表４に示す
（表中、安定化剤Ｂはタンニン酸であり、その他はシリ
カゲルである）。安定化剤の種類によって残存量が異な
ることが明らかになった。
サンプル、タンニン酸を１サンプルの計６サンプル）
を、もろみに400mg/L （但し、タンニン酸は50mg/Lの濃
度）の濃度にて添加し、氷冷中、5分撹袢反応させた。
但し、タンニン酸は０℃で一晩静置処理した。その後、
各もろみを冷却遠心処理(12000rpm ・3分)した後、泡蛋
白質１を抗原とするモノクローナル抗体を用いて実施例
３に示すELISA を実施した。得られた結果を表４に示す
（表中、安定化剤Ｂはタンニン酸であり、その他はシリ
カゲルである）。安定化剤の種類によって残存量が異な
ることが明らかになった。
【表４】
【００６１】実施例６：ビール原料( 大麦麦芽) の評価
方法 産地・ 品種の異なる大麦麦芽（褐色麦芽を１サンプル、
淡色麦芽を２サンプル、黒麦芽を１サンプルの計４サン
プル）について麦汁を作製し、この試料中に含まれる泡
蛋白質量を上記実施例３の方法に従い測定した。泡蛋白
質１を抗原として得られたモノクローナル抗体Ａ及びビ
オチン化したモノクローナル抗体Ｂを用いるサンドイッ
チ法により、得られた結果を表５に示す。各種麦芽によ
って泡蛋白質含量は大きく異なることが明らかになっ
た。
方法 産地・ 品種の異なる大麦麦芽（褐色麦芽を１サンプル、
淡色麦芽を２サンプル、黒麦芽を１サンプルの計４サン
プル）について麦汁を作製し、この試料中に含まれる泡
蛋白質量を上記実施例３の方法に従い測定した。泡蛋白
質１を抗原として得られたモノクローナル抗体Ａ及びビ
オチン化したモノクローナル抗体Ｂを用いるサンドイッ
チ法により、得られた結果を表５に示す。各種麦芽によ
って泡蛋白質含量は大きく異なることが明らかになっ
た。
【表５】
【００６２】同様に、産地・ 品種の異なる大麦麦芽４種
（品種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）について麦汁を作製し、この試
料中に含まれる泡蛋白質量を上記実施例３の方法に従い
測定した。泡蛋白質２〜６を抗原として得られたモノク
ローナル抗体ペア１、２、３、４、５を用いるサンドイ
ッチ法により、得られた結果を図２に示す。各種麦芽に
よって泡蛋白質含量は大きく異なることが明らかになっ
た。
（品種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）について麦汁を作製し、この試
料中に含まれる泡蛋白質量を上記実施例３の方法に従い
測定した。泡蛋白質２〜６を抗原として得られたモノク
ローナル抗体ペア１、２、３、４、５を用いるサンドイ
ッチ法により、得られた結果を図２に示す。各種麦芽に
よって泡蛋白質含量は大きく異なることが明らかになっ
た。
【００６３】実施例７：ビール原料( 大麦) の評価方法 産地・ 品種の異なる大麦麦芽４種について、この試料中
に含まれる泡蛋白質量を上記実施例３の方法に従い測定
した。泡蛋白質１を抗原として得られたモノクローナル
抗体Ａ及びビオチン化したモノクローナル抗体Ｂを用い
るサンドイッチ法により、得られた結果を表６に示す。
各種大麦によって泡蛋白質含量は大きく異なることが明
らかになった。
に含まれる泡蛋白質量を上記実施例３の方法に従い測定
した。泡蛋白質１を抗原として得られたモノクローナル
抗体Ａ及びビオチン化したモノクローナル抗体Ｂを用い
るサンドイッチ法により、得られた結果を表６に示す。
各種大麦によって泡蛋白質含量は大きく異なることが明
らかになった。
【表６】
【００６４】参考例１ 泡持ち測定法（ＳＨＶ-Schaumh
aftvermoegen- 法） ビールの泡持ちを泡の立ち具合とガラス面への泡の付着
性を測定し評価する方法である。即ち、ビール全量を一
度に２０秒間平均してメスシリンダーに注ぎ込み、注ぎ
込み終了３０分後のメスシリンダー壁に付着して残って
いる泡の量をプラニメーターを用いて測り、泡持ちを定
量的に評価する。この際、泡持ちの単位はｃｍ2で表す
（化学と生物、ｐ１３５４、(1975)参照）。
aftvermoegen- 法） ビールの泡持ちを泡の立ち具合とガラス面への泡の付着
性を測定し評価する方法である。即ち、ビール全量を一
度に２０秒間平均してメスシリンダーに注ぎ込み、注ぎ
込み終了３０分後のメスシリンダー壁に付着して残って
いる泡の量をプラニメーターを用いて測り、泡持ちを定
量的に評価する。この際、泡持ちの単位はｃｍ2で表す
（化学と生物、ｐ１３５４、(1975)参照）。
【００６５】
【発明の効果】ビールにおける、重要な外観品質のひと
つである、泡持ちの鍵となる新規蛋白質を単離・ 同定し
た。更にこの蛋白質に対するモノクローナル抗体を作製
し、この抗体を基にしたサンドイッチELISA の適用によ
り、泡品質に関して、最良のビール麦芽や安定化剤を選
択し、或は最適ビール醸造条件を極めて正確且つ迅速に
評価することが可能となった。
つである、泡持ちの鍵となる新規蛋白質を単離・ 同定し
た。更にこの蛋白質に対するモノクローナル抗体を作製
し、この抗体を基にしたサンドイッチELISA の適用によ
り、泡品質に関して、最良のビール麦芽や安定化剤を選
択し、或は最適ビール醸造条件を極めて正確且つ迅速に
評価することが可能となった。
【００６６】
【００６７】配列番号：１ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Val Glu Asn Ala Asn Arg Val Asn Lys Phe Leu Phe Leu Ile Arg Glu Ala Ile
【００６８】配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Asn Pro Gly Gln Val Asp Gly Lys Met Leu Pro Tyr Leu Thr
【００６９】配列番号：３ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Tyr Pro Val Gln Tyr Ala Gly Gln Gly Leu Pro Leu Asn Gly
【００７０】配列番号：４ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Asn Pro Val Gln Val Asp Ala Lys Met Pro Pro Leu Phe Leu
【００７１】配列番号：５ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Tyr Pro Pro Gln Tyr Pro Gly Met Gly Leu Ile Gln Asn Leu
【００７２】配列番号：６ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Val Val Ala Asn Met Leu Pro Leu Phe Leu Ile
【図面の簡単な説明】
【図１】サンドイッチ法と従来法で測定した泡蛋白量の
ＳＨＶ法との相関を示す（Ａは従来法とＳＨＶ法との相
関を、Ｂは本発明のサンドイッチ法とＳＨＶ法との相関
を示す）。
ＳＨＶ法との相関を示す（Ａは従来法とＳＨＶ法との相
関を、Ｂは本発明のサンドイッチ法とＳＨＶ法との相関
を示す）。
【図２】モノクローナル抗体ペア１〜５を用いて測定し
た大麦麦芽品種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ中の泡タンパク濃度を示
す。
た大麦麦芽品種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ中の泡タンパク濃度を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ (72)発明者 寺野 由剛 大阪府池田市旭丘３丁目４番17号
Claims (17)
- 【請求項１】ウエスタンブロット分析で測定した分子量
が約４００００〜約４８０００であるビールの泡持ちを
規定する新規泡蛋白質。 - 【請求項２】以下の性質： １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４８
０００である、 ２）配列番号１記載のアミノ酸配列を有する、 ３）アミノ酸組成が表１に示す通りである、 【表１】 を有する請求項１記載の蛋白質。 - 【請求項３】以下の性質： １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４８
０００である、 ２）配列番号２記載のアミノ酸配列を有する、を有する
請求項１記載の蛋白質。 - 【請求項４】以下の性質： １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４０
０００である、 ２）配列番号３記載のアミノ酸配列を有する、を有する
請求項１記載の蛋白質。 - 【請求項５】以下の性質： １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４０
０００である、 ２）配列番号４記載のアミノ酸配列を有する、を有する
請求項１記載の蛋白質。 - 【請求項６】以下の性質： １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４０
０００である、 ２）配列番号５記載のアミノ酸配列を有する、を有する
請求項１記載の蛋白質。 - 【請求項７】以下の性質： １）ウエスタンブロット分析で測定した分子量が約４７
０００である、 ２）配列番号６記載のアミノ酸配列を有する、を有する
請求項１記載の蛋白質。 - 【請求項８】請求項２〜７のいずれかに記載の蛋白質を
特異的に認識するモノクローナル抗体。 - 【請求項９】請求項８記載のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ。 - 【請求項１０】請求項９のハイブリドーマを生体外又は
生体内で培養する工程とその培養物又は体液からモノク
ローナル抗体を採取する工程を含んでなる請求項８記載
のモノクローナル抗体の製造方法。 - 【請求項１１】請求項８記載のモノクローナル抗体を用
いる免疫学的測定法によって、ビールの最終製品及びビ
ールの製造工程におけるビール試料中の泡蛋白質の含有
量を測定する方法。 - 【請求項１２】請求項８記載のモノクローナル抗体を用
いる免疫学的測定法によって、ビールの泡持ち又は泡持
ち安定性を測定する方法。 - 【請求項１３】請求項８記載のモノクローナル抗体を用
いる免疫学的測定法によって、ビール原料を評価する方
法。 - 【請求項１４】請求項８記載のモノクローナル抗体を用
いる免疫学的測定法によって、ビールの安定化剤を選択
する方法。 - 【請求項１５】前記安定化剤がシリカゲル又はタンニン
酸である請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】免疫学的測定法がＥＬＩＳＡ法である請
求項１１〜１５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１７】請求項８記載のモノクローナル抗体、な
らびに９６ウェルプレート、試料吸着用緩衝液、洗浄
液、ブロッキング溶液、基質溶液、第二抗体希釈液及び
検量線グラフから選択される１または２以上を含む請求
項１１〜１６のいずれかの方法に使用するキット。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33422997A JP4310389B2 (ja) | 1997-03-07 | 1997-12-04 | 新規泡蛋白質及びその利用 |
| DE69835047T DE69835047T2 (de) | 1997-03-07 | 1998-03-05 | Schaumproteine, monoklonale Antikörper dagegen, und deren Verwendungen |
| EP98103922A EP0863153B1 (en) | 1997-03-07 | 1998-03-05 | Foam proteins, monoclonal antibodies thereto, and their uses |
| AT98103922T ATE331732T1 (de) | 1997-03-07 | 1998-03-05 | Schaumproteine, monoklonale antikörper dagegen, und deren verwendungen |
| CA002225183A CA2225183C (en) | 1997-03-07 | 1998-03-05 | Novel foam proteins and use thereof |
| DK98103922T DK0863153T3 (da) | 1997-03-07 | 1998-03-05 | Skumproteiner, monoklonale anatistoffer derimid og deres anvendelse |
| US09/035,749 US6080405A (en) | 1997-03-07 | 1998-03-06 | Foam proteins and use thereof |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-53249 | 1997-03-07 | ||
| JP5324997 | 1997-03-07 | ||
| JP33422997A JP4310389B2 (ja) | 1997-03-07 | 1997-12-04 | 新規泡蛋白質及びその利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10306100A true JPH10306100A (ja) | 1998-11-17 |
| JP4310389B2 JP4310389B2 (ja) | 2009-08-05 |
Family
ID=26393969
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33422997A Expired - Lifetime JP4310389B2 (ja) | 1997-03-07 | 1997-12-04 | 新規泡蛋白質及びその利用 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6080405A (ja) |
| EP (1) | EP0863153B1 (ja) |
| JP (1) | JP4310389B2 (ja) |
| AT (1) | ATE331732T1 (ja) |
| CA (1) | CA2225183C (ja) |
| DE (1) | DE69835047T2 (ja) |
| DK (1) | DK0863153T3 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008108470A1 (ja) * | 2007-03-07 | 2008-09-12 | Sapporo Breweries Limited | 麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定方法及び泡持ち判定用マーカー |
| JP2008249704A (ja) * | 2007-03-07 | 2008-10-16 | Sapporo Breweries Ltd | 麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定方法及び泡持ち判定用マーカー |
| CN113355203A (zh) * | 2021-06-10 | 2021-09-07 | 佛山市海天（江苏）调味食品有限公司 | 一种降低食醋发酵过程中泡沫产生量的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030148400A1 (en) | 1998-04-17 | 2003-08-07 | Auli Haikara | Method for determining a gushing factor for a beverage |
| US6423546B1 (en) | 2000-11-02 | 2002-07-23 | Miller Brewing Company | Monoclonal antibodies for assaying lipid transfer proteins |
| CN105585996B (zh) | 2009-03-06 | 2019-04-05 | 爱福特立 | 含有蛋白的乳液和粘合剂以及它们的制造与用途 |
| WO2010102297A2 (en) | 2009-03-06 | 2010-09-10 | Parker Anthony A | Protein-containing foams, manufacture and use thereof |
| PL2576661T3 (pl) | 2010-06-07 | 2017-07-31 | Evertree | Substancje adhezyjne zawierające białka i ich wytwarzanie i zastosowanie |
| RU2621798C2 (ru) | 2011-09-09 | 2017-06-07 | Эвертри | Белоксодержащие адгезивы и их получение и применение |
| LT2753633T (lt) | 2011-09-09 | 2017-04-10 | Evertree | Baltymo turintys klijai, jų gamyba ir panaudojimas |
| EP3666845A1 (en) | 2012-07-30 | 2020-06-17 | Evertree | Protein adhesives containing an anhydride, carboxylic acid, and/or carboxylate salt compound and their use |
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|---|---|---|---|---|
| US3911089A (en) * | 1972-10-06 | 1975-10-07 | Sumitomo Chemical Co | Process for preparing hydrogen cyanide |
| US4511548A (en) * | 1981-12-18 | 1985-04-16 | The Standard Oil Company | Ammoxidation of methanol to produce hydrogen cyanide |
| JPS58145617A (ja) * | 1982-02-22 | 1983-08-30 | Nitto Chem Ind Co Ltd | シアン化水素の製造法 |
| US4457905A (en) * | 1982-12-27 | 1984-07-03 | Monsanto Company | Process for oxidation and ammoxidation |
| JPH0712434B2 (ja) * | 1987-11-27 | 1995-02-15 | 日東化学工業株式会社 | リン・アンチモン含有酸化物触媒の製法 |
| JPH0763629B2 (ja) * | 1987-12-25 | 1995-07-12 | 日東化学工業株式会社 | 流動層反応に適する鉄・アンチモン・リン含有触媒の製法 |
| JPH0764555B2 (ja) * | 1988-04-05 | 1995-07-12 | 日東化学工業株式会社 | 青酸製法 |
| JP2950851B2 (ja) * | 1989-06-23 | 1999-09-20 | 三菱レイヨン株式会社 | 鉄・アンチモン・リン含有金属酸化物触媒組成物およびその製法 |
| TW199905B (en) * | 1992-02-03 | 1993-02-11 | J E Siebel Sons Company Inc | Method and composition for enhancing foam properties of fermented malt beverages |
-
1997
- 1997-12-04 JP JP33422997A patent/JP4310389B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-03-05 DK DK98103922T patent/DK0863153T3/da active
- 1998-03-05 DE DE69835047T patent/DE69835047T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-05 CA CA002225183A patent/CA2225183C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-05 AT AT98103922T patent/ATE331732T1/de active
- 1998-03-05 EP EP98103922A patent/EP0863153B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-06 US US09/035,749 patent/US6080405A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008108470A1 (ja) * | 2007-03-07 | 2008-09-12 | Sapporo Breweries Limited | 麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定方法及び泡持ち判定用マーカー |
| JP2008249704A (ja) * | 2007-03-07 | 2008-10-16 | Sapporo Breweries Ltd | 麦芽発酵飲料の泡持ちの良さの判定方法及び泡持ち判定用マーカー |
| CN113355203A (zh) * | 2021-06-10 | 2021-09-07 | 佛山市海天（江苏）调味食品有限公司 | 一种降低食醋发酵过程中泡沫产生量的方法 |
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| EP0863153B1 (en) | 2006-06-28 |
| CA2225183A1 (en) | 1998-09-07 |
| US6080405A (en) | 2000-06-27 |
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| CA2225183C (en) | 2008-01-08 |
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