DE69835047T2

DE69835047T2 - Schaumproteine, monoklonale Antikörper dagegen, und deren Verwendungen

Info

Publication number: DE69835047T2
Application number: DE69835047T
Authority: DE
Inventors: Yoshihiko Mishima-gun Ishibashi; Tatsufumi Ibaraki-shi Kakui; Kazuo Nagaokakyo-shi Nakatani; Yoshitaka Ikeda-shi Terano
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 1997-03-07
Filing date: 1998-03-05
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2018-03-06
Also published as: CA2225183C; DK0863153T3; EP0863153B1; EP0863153A2; JP4310389B2; CA2225183A1; ATE331732T1; DE69835047D1; US6080405A; JPH10306100A; EP0863153A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine als einer der Hauptbestandteile, die für die Schaumretention von Bier notwendig sind, monoklonale Antikörper gegen die Proteine und einen Assay zur Bestimmung des Schaumproteingehalts in endgültigen Bierprodukten oder Bierproben während des Brauverfahrens unter Verwendung der monoklonalen Antikörper. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung der Schaumretention und der Schaumretentionsstabilität von Bier wie auch ein Verfahren zur Bewertung von Rohmaterialien für Bier und Stabilisatoren für Bier auf der Basis des Assays.
Bier wird im wesentlichen aus Malz hergestellt durch Saccharifizieren zu Bierwürze, Unterwerfen der Bierwürze einer primären Fermentation mit Hefe, und dann Führen des resultierenden Grünbiers zu einer Postfermentation (Konditionierung) gefolgt von einer Filtration und einer Verpackung.
Unter den besonders wichtigen Qualitäten des Erscheinungsbildes von Bier, das durch diesen Prozess gebraut wird, befindet sich der Schaum. Diese Eigenschaft wird im wesentlichen durch zwei Aspekte definiert, d.h., das Schäumen und Schaumretention.
Die Schaumretention wurde auf der Basis physikochemischer Eigenschaften des Schaums bewertet, wie z.B. der Desintegrationsgeschwindigkeit des Schaums oder einer Adhäsion an einer Glasoberfläche. Schaum hat jedoch komplexe Eigenschaften, so dass keine ausreichende Reproduzierbarkeit oder Genauigkeit auf einer solchen physikochemischen Basis erhalten werden kann. Außerdem können Rohmaterialien für Bier, wie z.B. Gerste und Malz oder die Stabilität von lang gelagertem Bier für eine Schaumretention nur bewertet werden, nachdem das Bier tatsächlich gebraut wurde. Es wurde daher gewünscht, ein reproduzierbares und schnelles Bewertungsverfahren zu etablieren.
So wurde ein Verfahren zur Bestimmung der Schaumretention und der Schaumretentionsstabilität unter Verwendung polyklonaler Antikörper gegen rohe Schaumproteine, extrahiert aus Bier, entwickelt (JPA Nr. 333223/95). Dieses Verfahren involvierte jedoch das umfangreiche Testen etlicher Schaumproteine und konnte nicht eine geringe Menge von Bestandteil-spezifi schen Schaumproteinen nachweisen. Daher wurde es gewünscht ein besseres Verfahren zu entwickeln, mit einer ausreichenden Empfindlichkeit, um selbst eine geringe Menge von Bestandteil-spezifischen Schaumproteinen nachzuweisen.
Die vorliegende Erfindung wurde mit dem Ziel der Isolierung und Reinigung eines neuen Bestandteils (Schaumprotein) unter den Hauptbestandteilen bewirkt, der für die Schaumretention von Bier notwendig ist, aus rohen Schaumproteinen, extrahiert aus Bier, Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, gerichtet gegen das neue Schaumprotein und dieses spezifisch erkennend und Bereitstellung eines Assays zur schnellen und exakten Bestimmung des Schaumproteingehalts durch Anwendung eines Immunoassays unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der Schaumretention oder Schaumretentionsstabilität von Bier unter Verwendung des Assays.
Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Bewertungsverfahrens von Rohmaterialien von Bier unter Verwendung des Assays, wie z.B. Gerste oder Malz, und eines Selektionsverfahrens von Stabilisatoren, die zugefügt werden können, um die Trübheitsstabilität von Bier zu verbessern.
1 zeigt eine Korrelation zwischen dem Schaumproteinniveau, bestimmt durch den Sandwich-Assay der vorliegenden Erfindung oder dem früheren Assay und dem SHV-Assay (A: Korrelation zwischen dem früheren Assay und dem SHV-Assay; B: Korrelation zwischen dem Sandwich-Assay der vorliegenden Erfindung und dem SHV-Assay).
2 zeigt Schaumproteinniveaus in Gerste-Malz-Varietäten A, B, C, D, bestimmt mit den monoklonalen Antikörperpaaren 1 bis 5.
Um die obigen Ziele zu erreichen, wurden sechs Schaumproteinfraktionen aus Rohschaumproteinfraktionen isoliert und gereinigt, wobei dann monoklonale Antikörper gegen die resultierenden Schaumproteine hergestellt und die monoklonalen Antikörper verwendet wurden, um die vorliegende Erfindung zu bewirken.
Die Isolation und Reinigung der neuen Schaumproteine der vorliegenden Erfindung wurde durch eine leichte Modifikation des Verfahrens von Asano et al. (Rept. Res. Lab. Kirin Brewery Co., Ltd., Nr. 23, S. 1-13 (1980)) durchgeführt. Es wurde nämlich das Bierprodukt direkt nach dem Brauen mit Ethanol ausgesalzt, um ein Präzipitat zu ergeben, das dann verschiedenen Säulenchromatographieschritten unterworfen wurde (Ionenaustausch und Umkehrphasenchromatographien, Gelfiltration, usw.) um Schaumproteinfraktionen zu isolieren und zu reinigen. Sechs Schaumproteinfraktionen wurden auf diese Weise isoliert und gereinigt.
Die resultierenden Schaumproteinfraktionen wurden im Hinblick auf ihre Molekulargewichte durch Western-Blot bestimmt und im Hinblick auf ihre Teilprimärstrukturen durch einen Aminosäuresequenzierer/ein Massenspektrometer.
Das Schaumprotein 1 wurde weiterhin im Hinblick auf seine Aminosäurezusammensetzung durch Säurehydrolyse mit Methansulfonsäure getestet.
Diese Schaumproteine sind wie folgt gekennzeichnet:
(A) SCHAUMPROTEIN 1

1) Molekulargewicht von ungefähr 48.000, bestimmt durch Western-Blot-Analyse,
2) Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 1,
3) Aminosäurezusammensetzung, wie dargestellt in Tabelle 1.

Tabelle 1
(B) SCHAUMPROTEIN 2

1) Molekulargewicht von ungefähr 48.000, wie bestimmt durch Western-Blot-Analyse;
2) Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2.

(C) SCHAUMPROTEIN 3

1) Molekulargewicht von ungefähr 40.000, wie bestimmt durch Western-Blot-Analyse;
2) Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 3.

(D) SCHAUMPROTEIN 4

1) Molekulargewicht von ungefähr 44.000, wie bestimmt durch Western-Blot-Analyse;
2) Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 4.

(E) SCHAUMPROTEIN 5

1) Molekulargewicht von ungefähr 40.000, wie bestimmt durch Western-Blot-Analyse;
2) Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 5.

(F) SCHAUMPROTEIN 6

1) Molekulargewicht von ungefähr 47.000, wie bestimmt durch Western-Blot-Analyse;
2) Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 6.

Eine Suche durch die Datenbank "SWISS-PROT" ergab, dass alle diese Aminosäuresequenzen neue Proteine waren.
Monoklonale Antikörper, die für die Schaumproteine der vorliegenden Erfindung spezifisch sind, können gemäß den konventionellen Verfahren hergestellt werden (siehe "Immunological Experiment Procedures II", S. 945-957, Nankodo) und zwar durch Immunisieren eines Tiers mit einem Antigen (jedem der Schaumproteine wie oben dargestellt), Gewinnen von Antikörpererzeugenden Zellen, Fusion zu Myelomzellen, Screening der fusionierten Zellen und Sammeln von Hybridomstämmen, die stark mit dem Zielantigen reagieren.
So erhaltene monoklonale Antikörper können verwendet werden, um den Schaumproteingehalt in endgültigen Bierprodukten und Bierproben während des Brauverfahrens durch einen Immunoassay zu bestimmen. Der Immunoassay beinhaltet einen Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay, Fluorimmunoassay, Lumineszenzimmunoassay, Trübheitsmessimmunoasssay, usw. unter denen der Enzymimmunoassay, insbesondere der ELISA (Enzym-gebundener Immunosorbentassay) bevorzugt wird, da er einen hoch-empfindlichen Nachweis von Schaumproteinen und eine automatische Bestimmung einer Anzahl von Proben bereitstellt.
Gemäß dem ELISA wird zunächst ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung als primärer Antikörper auf einem Träger immobilisiert. Der Träger ist vorzugsweise ein fester Träger, beispielsweise in Form eines Behälters, wie z.B. einer ELISA-Platte, geformt aus einem Polymer, wie z.B. Styrol oder Polystyrol. Die Immobilisierung des monoklonalen Antikörpers auf einem Träger kann beispielsweise durch Adsorption des monoklonalen Antikörpers, gelöst in einem Puffer, wie z.B. Carbonat- oder Boratpuffer, an den Träger bewirkt werden. Ein polyklonaler Antikörper (wie z.B. die in JPA Nr. 333233/95 beschriebenen polyklonalen Antikörper) wird als sekundärer Antikörper verwendet, um einen Sandwich-ELISA durchzuführen. Alternativ können Schaumproteine verlässlicher und genauer durch Anwendung eines Sandwich-ELISAs unter Verwendung einer der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung als primären Antikörper und einem anderen monoklonalen Antikörper als sekundären Antikörper nachgewiesen werden, wie in den Beispielen unten beschrieben.
Ein Beispiel für den Assay zur Bestimmung des Schaumproteingehalts in Bier gemäß der vorliegenden Erfindung wird unten erklärt.
Zunächst werden Aliquots eines primären Antikörpers auf Mikrotiterplatten verteilt und mit einem Antikörper-adsorbierenden Puffer inkubiert. Nachdem der Überstand entfernt wurde, werden die Platten mit einer Waschlösung gewaschen. Auf ähnliche Weise werden eine Blockierlösung, eine beabsichtigte Antigenlösung (Bierlösung), ein sekundärer Antikörper und ein Markierungsenzym sukzessiv verteilt, inkubiert und gewaschen. Schließlich wird eine Substratlösung verteilt und bei Raumtemperatur oder 37°C inkubiert, woraufhin die Absorption bei 405 nm gemessen wird, um die Konzentration des Schaumproteins in der Bierprobe unter Verwendung eines Kalibierungsgraphen zu berechnen, der getrennt aus einer Standardverdünnungsreihe des Schaumproteins hergestellt wurde.
Der Antikörper-adsorbierende Puffer beinhaltet beispielsweise PBS(-)-Puffer und das Verdünnungsmittel beinhaltet beispielsweise PBS(-)-Puffer, enthaltend Rinderserumalbumin (BSA), Gelatine oder Ovalbumin. Die Waschlösung beinhaltet beispielsweise PBS(-)-Puffer, enthaltend NaN₃ und Tween 20, Tris-gepufferte physiologische Salzlösung (TBS), enthaltend NaCl und Tween 20, usw. Die Blockierungslösung beinhaltet beispielsweise PBS(-)-Puffer, enthaltend 1 bis 3 % BSA, PBS(-)-Puffer, enthaltend 1 bis 5 % entfettete Milch, usw. Das Markierungsenzym beinhaltet beispielsweise Peroxidase, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, usw. Die Substratlösung kann in geeigneter Weise gewählt werden, um dem Markierungsenzym zu entsprechen, z.B. Dinatrium-p-nitrophenylphosphatsalz (PNPP) für die alkalische Phosphatase oder o-Nitrophenyl-β-D-galactosidase für β-Galactosidase.
Die Schaumretention und Schaumretentionsstabilität von Bier kann bewertet werden, indem der Schaumproteingehalt in den endgültigen Bierprodukten und Bierproben während des Bierbrauverfahrens wie oben beschrieben bestimmt wird.
Es ist beim Bierbrauen auch wichtig, dass verschiedene Stabilisatoren, wie z.B. Silicagel oder Gerbsäure zugefügt werden, um die Trübheitsstabilität zu verbessern oder auch für andere Zwecke und dass diese die Schaumretention nicht nachteilig beeinflussen. Der Assay der vorliegenden Erfindung kann auch für eine Bewertung der Effizienz solcher Stabilisatoren angewandt werden. In einem unten beschriebenen Beispiel wurden z.B. die Schaumproteinniveaus durch den ELISA-Assay der vorliegenden Erfindung in Gegenwart verschiedener Stabilisatoren bestimmt, die der Maische während des Bierbrauverfahrens zugefügt wurden, um zu ergeben, dass die Restschaumproteinniveaus je nach Art des Stabilisators variieren und so zu belegen, dass der Assay der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um Stabilisatoren zu bewerten.
Weiterhin kann der Assay der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um den Schaumproteingehalt in Rohmaterialien von Bier (Gerste, Malzgerste, usw.) zu bestimmen. So ermöglicht der Assay der vorliegenden Erfindung, dass die Qualität von Rohmaterialien des Biers einfach vor dem Brauen bewertet werden kann, obwohl Rohmaterialien vorher nur nach dem Brauen bewertet werden konnten.
Der Assay der vorliegenden Erfindung verwendet ein oder zwei monoklonale Antikörper zur Bestimmung von Schaumproteinen in Bierproben zur Reduktion der Variation zwischen den Messungen und stellt eine ausreichend hohe Empfindlichkeit bereit, um selbst eine geringe Menge von Schaumproteinen nachzuweisen. Der Assay der vorliegenden Erfindung zeigt auch eine gute Korrelation zu den Ergebnissen einer Messung durch den früheren Schaumretentionsassay (SHV-Assay), wie im Vergleichsbeispiel 1 unten beschrieben, und zeigt, dass er effektiv verwendet werden kann, um schnell und exakt die Schaumretention und die Schaumretentionsstabilität von Bier als Alternative zum früheren Assay zu bewerten.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Kit zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, bereit. Das Kit der vorliegenden Erfindung umfasst einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch ein Schaumprotein der vorliegenden Erfindung erkennt. Der Antikörper kann in dem Verdünnungsmittel verdünnt sein oder in lyophilisierter Form vorliegen. Zusätzlich zu dem Antikörper kann das Kit der vorliegenden Erfindung weiterhin eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, einen Proben-adsorbierenden Puffer, eine Waschlösung, eine Blockierlösung, eine Substratlösung, eine Verdünnung eines sekundären Antikörpers und einen Kalibrierungsgraphen, usw. enthalten.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es neue Proteine zu isolieren und zu reinigen, die bei der Schaumretention bei Bier eine Schlüsselrolle spielen. Weiterhin ermöglicht es die vorliegende Erfindung monoklonale Antikörper gegen diese Proteine herzustellen und einen Sandwich-ELISA, basierend auf den Antikörpern anzuwenden, um das beste Malz oder Stabilisatoren für Bier im Hinblick auf Schaumqualitäten zu selektieren oder optimale Bierbraubedingungen sowohl exakt als auch schnell zu bewerten.
Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung im Detail, sollten jedoch ihren Umfang nicht begrenzen.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: HERSTELLUNG VON SCHAUMPROTEINEN
ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON SCHAUMPROTEIN 1
Rohe Schaumproteinfraktionen wurden mit Ethanol aus einem endgültigen Bierprodukt (Suntory) ausgefällt. Nach der Dialyse wurden diese Fraktionen in aktive Fraktionen durch sukzessive Durchführung einer Gelfiltrationschromatographie (Toyopearl HW-55F) und eines Ionenaustausches (Toyopearl G650W) gereinigt und schließlich durch wiederholte Gelfiltrations-HPLC (Toyopearl G2000SW) und Umkehrphasen-HPLC (Toyopearl C8) gereinigt. Die Reinheit der endgültigen Fraktionen wurde sichergestellt, indem ein einzelner Peak auf den HPLC-Chromatogrammen und eine einzelne Bande auf dem SDS-PAGE beobachtet wurden. Nach Säulenchromatographieschritten wurden die aktiven Fraktionen durch Anwendung des Verfahrens von Asano et al. (Rept. Res. Lab. Kirin Brewery Co., Ltd., Nr. 23, S. 1-13 (1980)) bewertet. Es wurde nämlich eine Probe von 100 bis 300 mg in 1 1 einer 3,6%igen wässrigen Ethanollösung (pH 4,2) gelöst und 20 ml dieser Lösung wurden in einem graduierten Röhrchen bei 20°C für 5 Sekunden (400 Umdrehungen/min) geschüttelt. Das Volumen des Schaums nach dem Schütteln wurde gemessen und nur hoch-aktive Fraktionen wurden gesammelt.
Dieses Schaumprotein hatte ein Molekulargewicht von ungefähr 48.000, wie gemessen durch Western-Blot-Analyse.
Das Schaumprotein wurde durch einen Aminosäuresequenzierer bestimmt und hatte danach eine Partial-Primärsequenz von Ala-Val-Glu-Asn-Ala-Asn-Arg-Val-Asn-Lys-Phe-Leu-Phe-Leu-Ile-Arg-Glu-Ala-Ile (SEQ ID NO: 1). Eine Suche in der Datenbank "SWISS-PROT" ergab, dass diese Sequenz ein neues Protein ist.
Die Ergebnisse der Aminosäure-Zusammensetzungsanalyse dieses Schaumproteins durch saure Hydrolyse mit Methansulfonsäure sind wie in Tabelle 1 oben dargestellt.
ISOLIERUNG UND REINIGUNG DER SCHAUMPROTEINE 2 BIS 6
Rohe Schaumproteinfraktionen wurden mit Ethanol aus einem endgültigen Bierprodukt (Suntory) ausgefällt. Nach der Dialyse wurden diese Fraktionen konzentriert und durch eine Ionenaustauschsäule (Toyopearl G650M)-Chromatographie, Gelfiltrations-HPLC (Toyopearl G2000SW) und Umkehrphasen-HPLC (Toyopearl ODS) sukzessiv konzentriert und gereinigt, um etliche aktive Fraktionen zu isolieren. Die aktiven Fraktionen wurden durch Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie sukzessiv gereinigt. Die Reinheit der endgültigen Fraktionen wurde durch Beobachtung eines einzelnen Peaks auf SDS-PAGE bewertet. Nach den Säulenchromatographieschritten wurden die aktiven Fraktionen auf dieselbe Weise, wie für das Schaumprotein 1 oben beschrieben, bewertet.
Die resultierenden fünf Schaumproteine (bezeichnet als Schaumprotein 2, Schaumprotein 3, Schaumprotein 4, Schaumprotein 5 bzw. Schaumprotein 6) hatten Molekulargewichte von ungefähr 48.000 (Schaumprotein 2), ungefähr 40.000 (Schaumprotein 3), ungefähr 40.000 (Schaumprotein 4), ungefähr 40.000 (Schaumprotein 5) bzw. ungefähr 47.000 (Schaumprotein 6), jeweils gemessen durch Western-Blot-Analyse.

Diese Schaumproteine eluierten nach den folgenden Retentionszeiten während der Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen. (CHROMATOGRAPHIEBEDINGUNGEN)

Säule:	TSK-Gel 80 Ts (6 mm I.D. × 150 mm)
Elutionsbedingungen:
	0–10 min. H20
	10–40 min. H20 → 100 % MeCN linearer Gradient
	40–50 min.100 % MeCn.
Flussrate:	1,0 ml/min.
Nachweisbedingung:	280 nm (UV)

(RETENTIONSZEIT)

Schaumprotein 2:	30 bis 32 Minuten
Schaumprotein 3:	26 bis 28 Minuten
Schaumprotein 4:	21 bis 23 Minuten
Schaumprotein 5:	23 bis 25 Minuten
Schaumprotein 6:	33 bis 35 Minuten

Die Retentionszeit von Schaumprotein 1, chromatographiert unter denselben Bedingungen, lag bei 22 bis 24 Minuten.
Die Schaumproteine 2 bis 6 wurden durch einen Aminosäuresequenzierer bestimmt, und hatten eine Partialprimärstruktur von Phe-Asn-Pro-Gly-Gln-Val-Asp-Gly-Lys-Met-Leu-Pro-Tyr-Leu-Thr (Schaumprotein 2, SEQ 2D NO: 2), Val-Tyr-Pro-Val-Gln-Tyr-Ala-Gly-Gln-Gly-Leu-Pro-Leu-Asn-Gly (Schaumprotein 3, SEQ ID NO: 3), Phe-Asn-Pro-Val-Gln-Val-Asp-Ala-Lys-Met-Pro-Pro-Leu-Phe-Leu (Schaumprotein 4, SEQ ID NO: 4), Val-Tyr-Pro-Pro-Gln-Tyr-Pro-Gly-Met-Gly-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu (Schaumprotein 5, SEQ ID NO: 5) bzw. Asp-Val-Val-Ala-Asn-Met-Leu-Pro-Leu-Phe-Leu-Ile (Schaumprotein 6, SEQ ID NO: 6).
Eine Suche in der Datenbank "SWISS-PROT" ergab, dass alle diese Sequenzen neue Proteine waren.
BEISPIEL 2: HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTISCHAUMPROTEINANTIKÖRPERN
MONOKLONALE ANTIKÖRPER, GERICHTET GEGEN SCHAUMPROTEIN 1
Das aus Beispiel 1 erhaltene Schaumprotein 1 wurde als Antigen verwendet, um monoklonale Antikörper herzustellen. Zunächst wurde das Schaumprotein 1 in destilliertem Wasser suspendiert und auf ein geeignetes Proteinniveau (1 mg/ml) mit physiologischer Salzlösung (0,9 Gew./Gew.% wässrige NaCl-Lösung) eingestellt. Diese Suspension wurde mit komplettem Freund's-Adjuvans in einem Volumenverhältnis von 3:5 vermischt, um eine Wasser-in-Öl-Emulsion herzustellen. Drei BALB/c-Mäuse (4 Wochen alt) wurden durch intraperitoneale und subkutane Injektionen in der Emulsion in einer Menge äquivalent zu 0,18 mg/Maus des Antigens geprimt. Eine Booster-Emulsion wurde ähnlich mit inkomplettem Feund's-Adjuvans hergestellt und ebenfalls intraperitoneal und subkutan den Tieren in einer Menge äquivalent zu 0,09 mg/Maus des Antigens injiziert. Die Tiere erhielten drei Booster-Aussetzungen in Intervallen von einer Woche bis 10 Tagen.
Drei Tage nach der letzten Antigenaussetzung wurde die Milz extrahiert und vollständig mit RPMI-1640-Medium gewaschen. Die Milzzellen (1 × 10⁸) wurden mit den Elternzellen (2 × 100) (Myelom, P3X63Ag-Ul) vermischt, mit 1,5 ml einer 50%igen Lösung Polyethylenglycol 1500 in RPMI-1640 kombiniert und bei 1.000 Upm ungefähr 40 Sekunden zentrifugiert. Die Lösung wurde durch graduelle Zugabe von 5 ml RPMI-1640-Medium verdünnt und dann bei 1.000 Upm 3 Minuten zentrifugiert. Nachdem der Überstand verworfen worden war, wurden 6 ml HT (Hypoxanthinthymidin) -Medium zugefügt und die gemischte Lösung wurde wiederum bei 900 Upm 5 Minuten zentrifugiert. Dann wurden die Zellen in 20 ml HT-Medium dispergiert und ein 100 μl Aliquot wurde in jede von 60 inneren Vertiefungen von Kulturplatten mit 96 Vertie fungen gegossen und am folgenden Tag wurden 40 μl HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin) -Medium zugefügt. Daraufhin wurde die Hälfte des Mediums durch ein frisches HT-Medium alle 3 Tage ersetzt und der Kulturüberstand wurde im Hinblick auf den Antikörpertiter nach 14 Tagen getestet, um 12 positive Vertiefungen zu zeigen. Dann wurde die limitierende Verdünnung etliche Male durch Verdünnung dieser positiven Hybridome mit HT-Medium wiederholt, gefüttert mit BALB/c-Mausthymocyten, um schließlich etliche Hybridome zu erhalten, die monoklonale Anti-Schaumprotein-Antikörper erzeugten.
So erhaltene Hybridome wurden intraperitoneal in BALB/c-Mäuse injiziert, die mit Pristan (2, 6, 10, 14-Tetramethylpentadecan) behandelt worden waren und der Aszites wurde nach 2 bis 3 Wochen gesammelt, um monoklonale Anti-Schaumprotein-Antikörperrohfraktionen zu erhalten. Diese monoklonalen Antikörper wurden durch das Sulfatammoniumverfahren ausgesalzt und durch Affinitätschromatographie auf Protein G gereinigt.
Die resultierenden monoklonalen Antikörper wurden im Hinblick auf die Reaktivität mit Schaumprotein 1, wie erhalten in Beispiel 1, einem Screening unterworfen.
Auf diese Weise wurden etliche monoklonale Antikörper, einschließlich dem Antikörper A und dem Antikörper B erhalten.
MONOKLONALE ANTIKÖRPER, GERICHTET GEGEN DIE SCHAUMPROTEINE 2 BIS 6
Zwei Hybridome, gerichtet gegen jedes der Schaumproteine 2 bis 6 wurden auf dieselbe Weise wie oben beschrieben erhalten. Die erhaltenen Hybridome wurden intraperitoneal BALB/c-Mäusen injiziert, die mit Pristan behandelt wurden und der Aszites wurde nach 2 bis 3 Wochen gesammelt, um monoklonale Anti-Schaumprotein-Antikörperrohfraktionen zu erhalten. Diese monoklonalen Antikörper wurden durch das Sulfatammoniumverfahren ausgesalzt und durch Affinitätschromatographie auf Protein G gereinigt.
Monoklonale Antikörper C, D, gerichtet gegen Schaumprotein 2, monoklonale Antikörper E, F, gerichtet gegen Schaumprotein 3, monoklonale Antikörper G, H, gerichtet gegen Schaumprotein 4, monoklonale Antikörper I, J, gerichtet gegen Schaumprotein 5, monoklonale Antikörper K, L, gerichtet gegen Schaumprotein 6 wurden erhalten.
BEISPIEL 3: QUANTIFIZIERUNG VON SCHAUMPROTEINEN IN BIERPROBEN DURCH DEN SANDWICH-ASSAY
Schaumproteine in Bier wurden durch den Sandwich-Assay unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers A, gerichtet gegen Schaumprotein 1, erhalten in Beispiel 2, und biotinyliertem monoklonalen Antikörper B wie folgt quantifiziert:

1) Zunächst wurde ein verdünnter Antikörper A als primärerer Antikörper mit einem Antikörper-adsorbierenden Puffer (0,01 M PBS(-), enthaltend 0,05 bis 0,1 % NaN₃, pH 7,5 bis 8,5) verdünnt, 100 μl Aliquot in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verteilt und man ließ den Antikörper bei 4°C über Nacht adsorbieren.
2) Dann wurde der Überstand entfernt und die Platte zweimal mit einer Waschlösung (0,01 M PBS(-), enthaltend NaN₃ und Tween-20, pH 7,5 bis 8,5) gewaschen, dann wurden 200 μl Vertiefung einer Blockierungslösung (0,01 M PBS(-), enthaltend 1 bis 3 % BSA und NaN₃, pH 7,5 bis 8,5) verteilt und bei 37°C eine Stunde inkubiert.
3) Herstellung einer Verdünnungsreihe einer Bierprobe mit einem Verdünnungsmittel (0,01 M PBS(-), enthaltend 0,1 % BSA und 0,05 bis 0,1 % NaN₃, pH 7,5 bis 8,5). Separate Herstellung einer Standardverdünnungsreihe von Schaumprotein 1 und einer verdünnten Lösung des biotinylierten Antikörpers B, verwendet als sekundärer Antikörper zum Zweck der Zeichnung einer Kalibrierungskurve des Schaumproteins.
4) Waschen der blockierten Platte mit 96 Vertiefungen zweimal mit der Waschlösung, dann Verteilen von 100 μl/Vertiefung von jeder der verdünnten Lösungen der Bierprobe und des Schaumproteins und Inkubieren für 1,5 Stunden bei 37°C.

Zweimaliges Waschen der Platte mit der Waschlösung, dann Verteilen von 100 μl/Vertiefung des biotinylierten Antikörpers B als sekundären Antikörper und Inkubieren bei 37°C für 1,5 Stunden.

5) Weiteres waschen der Platte zweimal auf dieselbe Weise, und Verteilen von 100 μl/Vertiefung von Streptavidin-konjugierter alkalischer Phosphatase (1.000-fache Verdünnung, Dakopatts) und Inkubieren für 30 Minuten bei 37°C.
6) Darauffolgend Waschen der Platte weiterhin zweimal mit der Waschlösung, Verteilen von 100 μl pro Vertiefung einer Substratlösung (Dinatrium-p-nitrophenylphosphatsalz (PNPP), verdünnt in einer Diethanolaminlösung (pH 9,0 bis 9,5) enthaltend MgCl₂) und Inkubieren für 10 bis 15 Minuten bei 37°C, dann Löschen mit 50 μl von 1 bis 3 N NaOH und Messung der Absorption bei 405 nm durch ein automatisches Absorptiometer.
7) Auftragen der gemessenen Werte der Absorption von der Standardverdünnungsreihe zum Zeichen einer Kalibrierungskurve für das Schaumprotein 1. Diese Kalibrierungskurve kann verwendet werden, um die Konzentration von Schaumprotein 1, enthalten in jeder Bierprobe, zu berechnen.

BEISPIEL 4: VERGLEICH DES SANDWICH-ASSAYS MIT DEM FRÜHEREN SCHAUM-PROTEINASSAY DURCH ELISA UNTER VERWENDUNG POLYKLONALER ANTIKÖRPER
Schaumproteine in verschiedenen kommerziell erhältlichen endgültigen Bierprodukten wurden im Sandwich-Assay der vorliegenden Erfindung unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die gegen das Schaumprotein 1 gerichtet waren, wie beschrieben in Beispiel 3, im Vergleich mit dem früheren Assay (JPA Nr. 333223/95) unter Verwendung polyklonaler Antikörper gegen Schaumprotein-Rohfraktionen bestimmt (1). Der frühere Assay verwendet polyklonale Antikörper gegen Schaumprotein-Rohfraktionen als primäre Antikörper und biotinyliertes Ziegen-anti-Kaninchen-Immunglobulin als einen sekundären Antikörper. Den gegenwärtigen Schaumretentionsassay (SHV-Assay), wie in Vergleichsbeispiel 1 dargestellt, ließ man ebenfalls laufen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt, die die Schaumretention in cm², wie bestimmt durch den SHV-Assay und die Schaumproteinniveaus (mg/l) beinhaltet, berechnet aus jeder Kalibrierungskurve unter den Schäumen des vorherigen Assays unter Verwendung polyklonaler Antikörper gegen Rohschaumproteinfraktionen und dem gegenwärtigen Assay.
Tabelle 2
Ein Korrelationsfaktor, abgeleitet von den obigen Ergebnissen, zeigte eine sehr gute Korrelation zwischen dem Sandwich-Assay der vorliegenden Erfindung und dem SHV-Assay (Vergleichsbeispiel 1) (Korrelationsfaktor von 0,926: 1B). Dieser Korrelationsfaktor war höher als der Korrelationsfaktor zwischen dem früheren Assay und dem SHV-Assay (0,896: 1A). Ähnlich wurde auch ein hoher Korrelationsfaktor (0,965) zwischen dem Assay der vorliegenden Erfindung und dem früheren Assay erhalten.
Dies zeigt deutlich, dass dieser Sandwich-Assay verwendet werden kann, um die Schaumretention von Bier exakt vorherzusagen.
Dann wurde eine Standardverdünnungsreihe von Schaumprotein hergestellt, um die Empfindlichkeiten des Sandwich-Assays und des früheren Assays zu vergleichen (Tabelle 3). Der Sandwich-Assay hatte eine 60- bis 100-fach höhere Empfindlichkeit als diejenige des vorherigen Assays, was zeigte, dass er sogar ein sehr geringe Menge von Schaumproteinen messen kann.
Tabelle 3: EMPFINDLICHKEITSVERGLEICH
Dann wurden monoklonale Antikörper C/D, gerichtet gegen Schaumprotein 2 (hiernach bezeichnet als Paar 1), monoklonale Antikörper E/F, gerichtet gegen Schaumprotein 3 (hiernach bezeichnet als Paar 2), monoklonale Antikörper G/H, gerichtet gegen Schaumprotein 4 (hiernach bezeichnet als Paar 3), monoklonale Antikörper I/J, gerichtet gegen Schaumprotein 5 (hiernach bezeichnet als Paar 4) und monoklonale Antikörper K/L, gerichtet gegen Schaumprotein 6 (hiernach bezeichnet als Paar 5), erhalten in Beispiel 2, verwendet, um jedes Schaumprotein in Bier durch denselben Sandwich-Assay, wie oben beschrieben, zu bestimmen. In den jeweiligen Paaren von monoklonalen Antikörpern, wurden C, E, G, I und K als primäre Antikörper verwendet, während D, F, H, J und L als sekundäre Antikörper verwendet wurden.
Die Korrelation zwischen den Ergebnissen der Messungen von dem Sandwich-Assay und dem gegenwärtigen Schaumretentionsassay von Bier (SHV-Assay; Vergleichsbeispiel 1) wurden bewertet. Im Ergebnis wurde eine sehr gute Korrelation dazwischen beobachtet (die Korrelationsfaktoren waren 0,973, 0,967, 0,982, 0,917 und 0,971 in dieser Reihenfolge von den Paaren 1 bis 5). Der Korrelationsfaktor zwischen dem früheren Assay (JPA Nr. 333223/95) und dem SHV-Assay betrug 0,906. (Alle Tests wurden mit 8 Proben durchgeführt.)
BEISPIEL 5: BEWERTUNGSVERFAHREN BEI STABILISATOREN
Stabilisatoren, die von unterschiedlichen Quellen erworben wurden (eine Gesamtzahl von 6 Proben, beinhaltend 5 Proben von Silicagel und eine Probe Gerbsäure) wurden zu einer Maische mit einer Konzentration von 400 mg/l zugefügt (Gerbsäure wurde jedoch mit einer Konzentration von 50 mg/l zugefügt) und unter Rühren für 5 Minuten unter Kühlung mit Eis umgesetzt. Die mit Gerbsäure behandelte Probe ließ man jedoch bei 0°C über Nacht stehen. Dann wurde jede Maische abgekühlt und zentrifugiert (12.000 Upm für 3 Minuten) und dann einem ELISA, wie in Beispiel 3 beschrieben, unterworfen, wobei ein monoklonaler Antikörper, gerichtet gegen Schaumprotein 1, verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt (worin ein Stabilisator B Gerbsäure ist, während die anderen Silica gel sind). Es erwies sich, dass das restliche Niveau mit der Art des Stabilisators variiert.
Tabelle 4: BEHANDLUNG MIT VERSCHIEDENEN STABILISATOREN
BEISPIEL 6: BEWERTUNGSVERFAHREN FÜR ROHMATERIALIEN VON BIER (GERSTEN-MALZ)
Bierwürze wurde aus verschiedenen Varietäten von Gersten-Malzen aus unterschiedlichen Gegenden hergestellt (eine Gesamtzahl von 4 Proben, einschließlich 1 Probe von braunem Malz, 2 Proben von hellem Malz und 1 Probe von schwarzem Malz) und der Schaumproteingehalt in diesen Proben wurde gemäß der in Beispiel 3 oben beschriebenen Prozedur bestimmt. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse des Sandwich-Assays unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers A, gerichtet gegen Schaumprotein 1 und des biotinylierten monoklonalen Antikörpers B. Es erwies sich, dass der Schaumproteingehalt je nach Malztyp stark variiert.
Tabelle 5: VERSCHIEDENE GERSTEN-MALZ-SORTEN
Auf ähnliche Weise wurde Bierwürze aus vier unterschiedlichen Varietäten von Gersten-Malzen aus unterschiedlichen Gegenden (Varietäten A, B, C, D) hergestellt und der Schaumproteingehalt in jeder dieser Proben wurde gemäß den in Beispiel 3 oben beschriebenen Verfahren bestimmt. 2 zeigt die Ergebnisse des Sandwich-Assays unter Verwendung der monoklonalen Antikörperpaare 1, 2, 3, 4, 5, gerichtet gegen die Schaumproteine 2 bis 6. Es erwies sich, dass der Schaumproteingehalt breit mit dem Malztyp variiert.
BEISPIEL 7: BEWERTUNGSVERFAHREN FÜR ROHMATERIALIEN VON BIER (GERSTE)
Der Schaumproteingehalt in Proben von vier unterschiedlichen Varietäten von Gersten-Malzen aus unterschiedlichen Gegenden wurde gemäß der in Beispiel 3 oben beschriebenen Prozedur bestimmt. Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse des Sandwich-Assays unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers A, gerichtet gegen das Schaumprotein 1 und des biotinylierten monoklonalen Antikörpers B. Es erwies sich, dass der Schaumproteingehalt stark mit der Gerstenart variiert.
Tabelle 6: VERSCHIEDENE GERSTENARTEN
VERGLEICHSBEISPIEL 1: SCHAUMRETENTIONSASSAY (SHV-SCHAUMHAFTVERMÖGEN-ASSAY)
Dieser Assay bewertet die Schaumretention von Bier durch Untersuchung der Schäumungstendenz und der Adhäsion von Schaum an Glasoberflächen. Die gesamte Menge von Bier wird nämlich konstant gleichzeitig in einen eingeteilten Zylinder für 20 Sekunden gegossen und die Schaumretention wird quantitativ durch Messungen der Menge von Schaum bewertet, die 30 Minuten nach Abschluss des Gießens noch an der Wand des graduierten Zylinders verbleibt, und zwar durch ein Planimeter. Die Schaumretention wird in cm² ausgedrückt (siehe "Chemistry and Biology", Bd. 13, Nr. 8, S. 504-509 (1975)).
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Schaumprotein, das für die Schaumretention von Bier essentiell ist, wobei das Protein durch Folgendes gekennzeichnet ist: 1) ein Molekulargewicht von ungefähr 98000, bestimmt durch Westernblot, 2) die in SEQ ID NO. 1 dargestellte Aminosäuresequenz, 3) eine Aminosäurezusammensetzung wie dargestellt in Tabelle 1: Tabelle 1
Monoklonaler Antikörper, der das Protein von Anspruch 1 spezifisch erkennt.
Hybridom, das den monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 2 erzeugt.
Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 2, umfassend die Schritte der Züchtung des Hybridoms von Anspruch 3 in vitro und Sammeln der monoklonalen Antikörper aus der Kultur oder Ascites.
Verfahren zur Bestimmung von einem Schaumproteingehalt in einem Bierendprodukt oder einer Bierprobe während des Brauverfahrens durch Immunoassay unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers von Anspruch 2.
Verfahren zur Bestimmung der Schaumretention oder der Schaumretentionsstabilität von Bier durch Immunoassay unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers von Anspruch 2.
Verfahren zur Bewertung von Rohmaterialien von Bier durch den Immunoassay unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers von Anspruch 2.
Verfahren zur Selektion eines Stabilisators für Bier durch Immunoassay unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers von Anspruch 2.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Stabilisator Kieselsäuregel oder Gerbsäure ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei der Immunoassay ein ELISA ist.
Kit zur Verwendung in dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 10, umfassend den monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 2, und ein oder mehr Mitglieder, gewählt aus einer Microtiterplatte mit 96 Vertiefungen, einem Proben-adsorbierenden Puffer, einer Waschlösung, einer Blockierlösung, einer Substratlösung, einer Verdünnung eines sekundären Antikörpers und eines Kalibrierungsgraphen.