DE69919859T2 - Verfahren zum bestimmen eines überschäumfaktors für ein getränk - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bestimmen eines Überschäumfaktors für ein Getränk, wie es im Oberbegriff von Anspruch 1 definiert ist.
• Wenn bei der Bierherstellung mit Schimmelpilz infizierte Gerste beim Brauen verwendet wird, kann das erzeugte Bier dazu neigen, überzuschäumen. Das Überschäumen ist ein Phänomen des übermäßigen Aufbrausens von Bier, z. B. kann Bier aus einer Flasche herausspritzen, wenn sie geöffnet wird. Zu den schlimmsten Faktoren, die das Überschäumen verursachen, gehören Fusarium-Schimmelpilze, aber eine Überschäumaktivität wird auch bei Schimmelpilzen der Spezies Altenaria, Aspergillus, Nigrospora, Penicillium und Stemphylium beobachtet. Seit Jahrzehnten wurden Forschungen über Überschäumfaktoren durchgeführt, die von Schimmelpilzen erzeugt werden, aber bisher war es nicht möglich, diese Faktoren genau zu identifizieren und zu charakterisieren. Es wurde festgestellt, dass Überschäumfaktoren Peptide oder wenigstens Verbindungen, die Peptide enthalten, sind. Außerdem wurde festgestellt, dass sie von hydrophober und saurer Beschaffenheit sind. Die Überschäumfaktoren der meisten Schimmelpilze sind ziemlich reich an Cystein. Jüngste Forschungen geben Anlass für die Annahme, dass Überschäumfaktoren in den Schalen von Gerste konzentriert sind.
• Derzeit wird die Überschäumneigung von Bier durch Bestimmen des Anteils von Körnern, die mit einem Fusarium-Schimmel infiziert sind, in einer Gerstencharge getestet. Die Charge wird verworfen, wenn der Anteil von infizierten Körnern eine zulässige Grenze übersteigt. Dieses Verfahren ist mühsam und langsam durchzuführen und es ist nicht quantitativ. Die schlimmste Schwäche des Verfahrens ist die Tatsache, dass es nicht verwendet werden kann, um einen realen Faktor, welcher das Überschäumen verursacht, d. h. einen Überschäumfaktor zu bestimmen. Deshalb können die Ergebnisse zu unrichtigen Schlussfolgerungen führen.
• Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, die vorstehend erwähnten Nachteile zu beseitigen.
• Eine spezielle Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein zuverlässiges Verfahren zum Bestimmen der Überschäumneigung von Getränken, insbesondere von Bier aus den Ausgangsmaterialien der Getränke zu offenbaren, ein Verfahren, welches in der Qualitätskontrolle anwendbar ist. Insbesondere ist die Aufgabe des Verfahrens, die Menge eines realen Überschäumfaktors in Bier aus Getreide zu bestimmen.
• Das Verfahren der Erfindung ist durch das gekennzeichnet, was in Anspruch 1 angegeben ist.
• Die Erfindung beruht auf Forschungsarbeiten, die durchgeführt wurden, um die Faktoren zu untersuchen, welche das Überschäumen von Bier verursachen, bei denen festgestellt wurde, dass hydrophobe Proteine, nämlich Hydrophobine, Überschäumfaktoren in Bier darstellen.
• Hydrophobine sind kleine hydrophobe Proteine, die von Schimmelpilzen erzeugt werden und im Allgemeinen z. B. 100 ± 25 Aminosäuren enthalten. Bisher sind Hydrophobine aus mehreren Schimmelpilzen und essbaren Pilzen isoliert worden. Ein für Hydrophobine charakteristisches Merkmal ist, dass sie 8 Cysteinreste aufweisen, welche sich in Protein in Übereinstimmung mit einer bestimmten Formel befinden. Hydrophobine treten auf der Oberfläche des Pilzmyzels und der Sporen und in Ausscheidungen in das Substrat auf. Hydrophobine sind Mittel, welche die Anhaftung von Myzelien an das Substrat und aneinander fördern und sie bilden eine Schutzschicht auf der Oberfläche des Luftmyzels und der Sporen, welche sie davor schützt, sich mit Wasser vollzusaugen. Es wurde festgestellt, dass sich Hydrophobine an der Grenzfläche zwischen Phasen sammeln, z. B. an der Oberfläche von Luftblasen in einer Kulturlösung, wobei sie amphipathische Filme an der Grenzfläche bilden. Aufgrund ihres Filmbildungsvermögens verändern Hydrophobine die Oberflächeneigenschaften von Materialien von hydrophob zu hydrophil und umgekehrt. Ihre Fähigkeit, die Oberflächenspannung einer Wasserlösung zu verringern, ist vergleichbar mit der von bestimmten synthetischen Detergenzien. Hydrophobine sind z. B. in den folgenden Artikeln beschrieben: Wessels, J. G. H., Hydrophobins: Proteins that Change the Nature of the Fungal Surface, Advances in Microbial Physiology, Bd. 38, 1997 Academic Press Limited, S. 1–45 und Wessels, J. G. H., Fungal hydrophobins: proteins that function at an interface, Trends in Plant Science, Bd. 1, Abschnitt 9–15. Hydrophobine stabilisieren Blasen, wobei sie das Schäumen der Kulturlö sung verursachen. Es wurde festgestellt, dass das nun aus Schimmelpilzen isolierte Hydrophobin das Überschäumen von Bier verursacht.
• Gemäß der Erfindung kann die Menge an Hydrophobin in dem Ausgangsmaterial eines Getränks und/oder in einem Getränk, insbesondere in Getreide, wie etwa Gerste, Malz und/oder Bier, durch ein beliebiges Verfahren bestimmt werden, das für die Bestimmung von Hydrophobin anwendbar ist.
• In einer bevorzugten Ausführungsform wird Hydrophobin immunologisch bestimmt, wobei eine immunologische Reaktion zwischen einem Hydrophobinantigen und einem Antikörper verwendet wird. Das immunologische Verfahren kann ein immunradiometrisches, immunenzymetrisches, immunfluorometrisches oder immunluminometrisches Verfahren sein. Die für Hydrophobinproteine spezifischen Antikörper, welche bei der Bestimmung benötigt werden, werden durch herkömmliche Verfahren zum Herstellen von Antikörpern hergestellt.
• Hydrophobinproteine können aus Schimmelpilzstämmen mit einer Überschäumaktivität, insbesondere aus Fusarium-Stämmen isoliert werden. Brauchbare Stämme sind z. B. Gibberella avenacea (F. avenaceum), F. culmorum, F. poae, Gibberella zeae (F. graminearum), Nigrospora sp. und T. reesei. Hydrophobine können aus Schimmelmyzel und/oder Kulturlösungen durch herkömmliche Verfahren, z. B. durch Extrahieren, Durchperlen und/oder kaltes Trocknen, isoliert werden.
• Hydrophobin kann aus Myzel durch ein dreiphasiges Extraktionsverfahren und/oder aus einer Kulturlösung durch Durchperlen der Lösung, was eine Konzentrierung von Hydrophobin in dem erzeugten Schaum bewirkt, und/oder durch Tiefgefrieren der Kulturlösung, was eine Sedimentation von Hydrophobin bewirkt, welches anschließend durch Zentrifugieren der Lösung, nachdem sie aufgetaut wurde, abgetrennt werden kann, isoliert werden.
• In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zum Bestimmen von Hydrophobin wird das ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)-Verfahren verwendet. Die Farbe oder Fluoreszenz, die bei der enzymatischen Reaktion in dem Verfahren erzeugt wird, zeigt das Vorhandensein und die Menge des Hydrophobins an. Das ELISA-Verfah ren, die Herstellung und Reinigung von Antikörpern und der Enzyme, Konjugate und Substrate, die darin verwendet werden, sind z. B. in dem folgenden Artikel beschrieben. Vaag, P., Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) in the Beverage Industries: Principles and Practice, Analysis of Non-Alcoholic Beverages (Modern Methods of Plant Analysis, new series Bd. 8), Hrsg. Lisken, H. H. und Jackson, J. F., Springer-Verlag, Berlin 1988, S. 1–29.
• In dem Verfahren der Erfindung können auch andere entsprechende immunologische Verfahren verwendet werden, wie etwa das EBStrALISA- (Enzyme Biotin Streptavidin Linked ImmunoSorbent Assay) -Verfahren. Das EBStrALISA-Verfahren ist z. B. in dem Artikel Vaag, P., Immunological detection of Fusarium in barley and malt, Proc. Eur. Brew. Conv. Lisbon 1991, S. 553–560 beschrieben.
• In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird Hydrophobin immunchromatografisch bestimmt, wobei ein Teststreifen verwendet wird, der auf Immunchromatografie beruht. Die in der immunologischen Reaktion erzeugte Farbe in dem Verfahren zeigt das Vorhandensein und die Menge an Hydrophobin an.
• Der verwendete Teststreifen kann z. B. eine chromatografische Membran umfassen, die mit beweglichen Markerteilchen und zwei stationären Hydrophobinantikörper-Bereichen versehen ist. Die Probe wird in die Teststreifenmembran absorbiert, wo sie mit den Markerteilchen reagiert und in die Antikörper-Bereiche auf der Membran gerät. Wenn die Probe Hydrophobin enthält, erscheinen gefärbte Test- und Kontrolllinien in den Antikörperbereichen in Folge einer immunologischen Reaktion. Wenn die Probe kein Hydrophobin enthält, erscheint nur eine Kontrolllinie.
• Die Erfindung macht es möglich, das semiquantitative Nachweisverfahren, das auf einer Anzeige des Fusarium-Pilzes beruht, wie es in der industriellen Qualitätskontrolle verwendet wird, durch ein neues verlässliches Präzisionsverfahren zu ersetzen, wenn ein primärer Überschäumfaktor aus Getreide bestimmt werden soll. Durch Auswählen des zu verwendenden Getreides, insbesondere Gerste, durch das neue Verfahren ist es möglich, die Notwendigkeit von Vorsichtsmaßnahmen zu verringern, welche sich als teuer und unwirksam erwiesen haben, insbesondere in Risikojahren, in denen die Ge treidequalität niedrig ist und aus Getreide hergestelltes Bier eine starke Neigung zum Überschäumen aufweist.
• Ferner stellt das neue immunologische Nachweisverfahren ein schnelleres und einfacheres und deshalb billigeres Verfahren zum Bestimmen der Überschäumneigung von Gerste bereit.
• Im Folgenden wird die Erfindung mittels einiger weniger Beispiele ausführlich beschrieben.
• Beispiel 1 Isolierung und Anzeige von Hydrophobinen
• Hydrophobin wurde aus Schimmelstämmen mit einer Überschäumaktivität isoliert: Gibberella avenacea (F. avenaceum) (VTT-D-80141), F. culmorum (VTT-D-80148), F. poae (VTT-D-82182), Gibberella zeae (F. graminearum) (VTT-D-95470), Nigrospora sp. (VTT-D-79122) und T. reesei (VTT-D-74075).
• Die Schimmelpilze wurden auf drei verschiedenen Substraten kultiviert: auf Agar, in Kulturlösung und in Gerste. Hydrophobin wurde durch ein dreiphasiges Extraktionsverfahren und durch Durchperlen der Kulturlösung isoliert. Die molekulare Verteilung der in der Probe enthaltenen Proteine wurde durch Gelelektrophorese festgestellt. Das von dem T. reesei-Stamm erzeugte Hydrophobin hat eine Größe von ungefähr 7,5 kDa. Die von den Stämmen Nigrospora sp. (Myzelextraktion) und F. poae (Durchperlen der Kulturlösung) erzeugten Hydrophobine hatten ungefähr die gleiche Größe. Das aus dem Myzel des Gibberella zeae-Stammes extrahierte Hydrophobin hatte eine Größe von ungefähr 20 kDa.
• Für die Anzeige von Hydrophobinen in einer Probe wurde der immunologische ELISA-Test verwendet. Der in dem Test verwendete Antikörper wurde unter Verwendung des vorstehenden Immunisierungsprotokolls hergestellt. Ein Kaninchen wurde unter Verwendung eines von T. reesei-Schimmelpilz erzeugten Hydrophobins, welches mit Freund-Adjuvans vermischt wurde, immunisiert. Die Injektionen erfolgten viermal während drei Monaten. Die Titerentwicklung wurde durch zweimaliges Bestimmen des Antikörpergehalts des Blutes überwacht, wobei das ELISA-Verfahren verwendet wurde. Am Ende des Immunisierungszeitraums wurde das Blut des Kaninchens gesammelt und das Serum wurde von dem Blut getrennt. Die Reaktivität des Serums wurde durch Bestimmen der schwächsten Serumverdünnung getestet, welche immer noch eine Reaktion in dem ELISA-Verfahren ergibt. Die Verdünnung betrug mehr als 1/100000.
• In dem Test wurde eine Hydrophobinprobe in die Vertiefungen auf einer Mikrotiterplatte pipettiert, mit dem Ergebnis, dass die Proteine in der Probe an die Wände der Vertiefungen gebunden wurden. Dann wurde Hydrophobinantikörper zugegeben und er erkannte das Hydrophobinprotein an den Wänden und band daran. Danach wurde ein Konjugat zugegeben, welches seinerseits an den Antikörper band. Das Konjugat enthielt ein Enzym, welches eine Färbung des Substrats erzeugte, das in die Vertiefungen pipettiert wurde. Die Intensität der Farbe des Substrats war direkt proportional zu dem Hydrophobingehalt der Probe.
• Die stärksten Reaktionen wurden von Hydrophobinproben von F. poae, Nigrospora sp. und T. reesei erhalten.
• Beispiel 2 Bestimmung von Hydrophobin aus einer Gerstenprobe
• Gerste wurde mit den Fusarium-Stämmen und T. reesei-Stamm von Beispiel 1 zwei Wochen lang kontaminiert. Ein Gerstenextrakt wurde durch Vermischen von 50 g Gerste/100 ml Wasser während einer Minute hergestellt. Das Gerste-Wasser-Gemisch wurde 15 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 4000 g zentrifugiert. Der überstehende Extrakt wurde gesammelt und das darin enthaltene Hydrophobin wurde durch das direkte ELISA-Verfahren unter Verwendung eines gegen T. reesei-Hydrophobin hergestellten Antikörpers bestimmt.
• Auf Mikrotiterplatten wurde ein auf 1/10 und 1/100 verdünnter Gerstenextrakt in einer Menge von 150 μl/Vertiefung pipettiert. Die Verdünnungen wurden in einem Natriumphosphatpuffer (10 mM Natriumphosphat pH 7,3, 150 mM Natriumchlorid = PBS-Lösung) hergestellt. Die Platte wurde über Nacht in einem Kühlschrank aufbewahrt. Am Tag wurde PBS-Lösung, die 0,1% Rinderserumalbumin und 0,05% Tween 20-Lösung enthielt (= BSA/PBS-Lösung) in einer Menge von 100 μl/Vertiefung auf die Platte pipettiert. Die Platte wurde über Nacht bei einer tiefen Temperatur aufbewahrt, wonach sie mit einer PBS-Lösung, die 0,01% Tween 20-Lösung hinzugefügt enthielt, (PBST-Lösung) gewaschen wurde. Von dem Hydrophobin-Antikörper wurde eine 1/100-Verdünnung in der BSA/PBS-Lösung hergestellt. Von dieser Antikörperverdünnung wurden 100 μl/Vertiefung auf die Platte pipettiert und die Platte wurde 2 h bei +37°C inkubiert. Die Platte wurde mit PBST-Lösung gewaschen. Anschließend wurden 100 μl/Vertiefung von Konjugat: Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-alkalische Phosphatase, verdünnt auf 1/1000 in BSA/PBS-Lösung, auf die Platte pipettiert. Die Platte wurde 2 h bei +37°C inkubiert und mit PBST-Lösung gewaschen. Schließlich wurden 100 μl/Vertiefung des Substrats: 1 Tablette p-Nitrophenylphosphat/5 ml Diethylenamin + MgCl₂-Puffer auf die Platte pipettiert. Die Platte wurde in einem Schüttler 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion wurde bei der Wellenlänge 405 nm gemessen, wobei ein Multiscan Photometer verwendet wurde. Die Intensität der Farbe ist direkt proportional zu der Menge an Hydrophobin, die in der Probe enthalten ist. Tabelle 1 gibt die Extinktionswerte der Gerstenproben wieder.
• Tabelle 1

  
• Die höchsten Hydrophobingehalte wurden aus Gerstenproben bestimmt, die mit Gibberella avenacea-, F. poae- und T. reesei-Schimmelstämmen kontaminiert waren.
• Das Verfahren ist auch für die Verwendung mit Malzproben gut anwendbar.
• Beispiel 3 Bierüberschäum-Tests
• Ein Bierüberschäum-Test wurde durch Zugeben von 0,5–1 ml Hydrophobinprobe in eine Bierflasche durchgeführt. Die Flasche wurde 3 Tage bei Raumtemperatur geschüttelt, wonach sie geöffnet wurde, und die Menge an Bier, die herausschäumte, wurde durch die Änderung des Gewichts der Flasche bestimmt.
• Die Hydrophobinproben von T. reesei (Myzelextraktion) und F. poae (Durchperlen der Kulturlösung) ergab ein besonders intensives Überschäumen. Das Überschäumen im Fall der erstgenannten Probe betrug sogar mehr als 50% und im Fall der letztgenannten Probe 30–45%. Die Hydrophobinprobe von Nigrospora sp. (Myzelextraktion) führte zu einem wiederholten Überschäumen von 1–10%. Die Hydrophobinproben der anderen getesteten Schimmelpilze verursachten ebenfalls ein Überschäumen des Biers in variierenden Ausmaßen.
• Auf der Grundlage der durchgeführten Tests kann festgestellt werden, dass Hydrophobinproteine das Überschäumen von Bier verursachen.
• Beispiel 4 Hydrophobinsequenzierung
• Die Hydrophobinproben in Beispiel 1 von Fusarium poae (Durchperlen der Kulturlösung) und Nigrospora sp. (Myzelextraktion), welche das Überschäumen von Bier verursachen, wurden fraktioniert, wobei die Methode der Umkehrphasen-HPLC-Chromatografie (Hochleistungsflüssigchromatografie) verwendet wurde (Gerät: Äkta Explorer, Pharmacia Biotech; Säule: C4, Vydac). Die für den Betrieb verwendeten Puffer waren 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser (A) und 0,1% TFA in Acetonitril (B). Der Gradient entwickelte sich so, dass der Betrieb mit Puffer A begonnen wurde und der Anteil der Puffer B im Lauf des Betriebs zunahm, so dass am Ende die Betriebslösung nur aus Puffer B bestand. Proteine, wie Hydrophobin, wurden eluiert, wenn die Konzentration von Puffer B ungefähr 50% betrug. Von den erhaltenen Fraktionen wurde eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mittels eines Phast-Geräts (Pharmacia) unter Verwendung von 20% Phast-Gelen durchgeführt. Bei Fraktionen, die Proteine in Hydrophobin-Größe enthielten, wurde eine N-terminale Sequenzanalyse durchgeführt. Ein Charakteristikum der Reihenfolge von Aminosäuren in Hydrophobinen ist, dass es acht Cysteinreste gibt, die sich in dem Protein in Übereinstimmung mit der folgenden Formel befinden (Wessels, J. G. H. (1996) Fungal hydrophobins: proteins that function at an interface, Trends in plant science. 1: 9–15): X_2-38-C-X_5-9-C-C-X_11-39-C-X_8-23-C-X_5-9-C-C-X_6-18-C-Xp_2-13 X = von Cystein verschiedene Aminosäure
  C = Cystein Cys.
• Für die Probenfraktionen wurden die folgenden partiellen N-terminalen Sequenzen erhalten: F. poae

  

  d. h. X₁₈-C-X₉-C-C Nigrospora sp

  

  d. h. X₁₁-C-X₁₁-C-C-X₁₁-C

  
• Die Sequenzen für die Proben stimmen gut mit der Sequenzformel für Hydrophobine überein. Wenn eine Probenfraktion von Nigrospora sp. zu Bier zugegeben wurde und ein Überschäumtest durchgeführt wurde, schäumte die Hälfte des Bieres heraus. Fraktionen, die keine Proteine in Hydrophobin-Größe enthielten, riefen keinerlei Überschäumen hervor.
• Die Erfindung ist nicht auf die Beispiele ihrer Ausführungsformen, die vorstehend beschrieben sind, beschränkt, sondern es sind viele Variationen innerhalb des in den Ansprüchen definierten Umfangs der erfinderischen Idee möglich.

Claims (4)

1. Verfahren zum Bestimmen eines Überschäumfaktors für ein Getränk, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Hydrophobin aus dem Ausgangsmaterial des Getränks und/oder aus dem Getränk bestimmt wird.
2. Verfahren wie in Anspruch 1 definiert, dadurch gekennzeichnet, dass der Überschäumfaktor in Bier durch Bestimmen der Menge an Hydrophobin aus dem Getreide, Malz und/oder Bier bestimmt wird.
3. Verfahren wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin immunologisch bestimmt wird, wobei eine immunologische Reaktion zwischen einem Hydrophobinantigen und einem Antikörper verwendet wird.
4. Verfahren wie in einem der Ansprüche 1–3 definiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin durch das ELISA-Verfahren, das EBStrALISA-Verfahren und/oder immunchromatografisch bestimmt wird.