EA003633B1

EA003633B1 - Способ установления предрасположенности к фонтанированию у напитка

Info

Publication number: EA003633B1
Application number: EA200000955A
Authority: EA
Inventors: Аули Хайкара; Туйя Клемола; Тиина Накари-Сетяля; Мерья Пенттиля
Original assignee: Ой Панимолабораторио-Брюггерилабораториум Аб
Priority date: 1998-04-17
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2003-08-28
Also published as: DE69919859D1; FI980863A; HK1036654A1; FI104390B; CN1189747C; FI980863A0; ATE275265T1; WO1999054725A1; EP1071949A1; CA2329223A1; DE69919859T2; AU3423099A; CN1300364A; AU750483B2; EA200000955A1; EP1071949B1

Abstract

Изобретение относится к способу установления предрасположенности к фонтанированию у напитка, при котором определяют количество гидрофобина в сырье для напитка и/или в напитке. Определение гидрофобина проводят иммунологически, используя иммунологическую реакцию между гидрофобиновым антигеном и антителом.

Description

Настоящее изобретение относится к способу установления предрасположенности к фонтанированию у напитка, как определено в ограничительной части п.1 формулы изобретения.

При производстве пива в случае если в пивоварении используется ячмень, зараженный плесневыми грибами, то произведенное пиво может быть подвержено фонтанированию. Фонтанирование - это феномен чрезмерного выделения пузырьков газа у пива, например пиво может забить струей из бутылки, когда ее открывают. К числу наиболее сильных факторов, вызывающих фонтанирование, относятся плесневые грибы рода Рикапит, но способность вызывать фонтанирование также наблюдают у плесневых грибов родов АЙсгпапа. Лкрегд111ик, №.|ГО5рога. РешсШшт и §1етрйу1шт. Исследование факторов фонтанирования, продуцируемых плесневыми грибами, ведется на протяжении десятков лет, но до настоящего времени было невозможно точно определить и охарактеризовать эти факторы. Было установлено, что факторы фонтанирования - это пептиды или, по меньшей мере, соединения, содержащие пептиды. Более того, было обнаружено, что они гидрофобной и кислой природы. Факторы фонтанирования большинства плесневых грибов достаточно богаты цистеином. Последние исследования дают основание полагать, что на факторы фонтанирования влияет шелуха ячменя.

В настоящее время предрасположенность пива к фонтанированию проверяют посредством определения в партии ячменя доли зерен, зараженных плесневыми грибами рода Рикапит. Партия бракуется, если доля зараженных зерен превышает допустимый уровень. Этот способ трудоемкий и медленный в исполнении и не является количественным. Самая слабая сторона этого способа заключается в том, что он не может быть применен для определения действительного фактора, который вызывает фонтанирование, фактора фонтанирования. Следовательно, результаты могут привести к неверным выводам.

Задача настоящего изобретения - устранить недостатки, упомянутые выше.

Конкретная задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы создать надежный способ установления предрасположенности к фонтанированию у напитков, особенно у пива, по сырью для напитков; способ, который применим в контроле качества. В частности, задача этого способа состоит в том, чтобы определить количество действительного фактора фонтанирования в пиве по зерну.

Способ по изобретению характеризуется так, как он представлен в п.1 формулы изобретения.

Изобретение базируется на исследовательской работе, выполненной с целью изучить факторы, вызывающие фонтанирование пива, в ходе которой было установлено, что факторами фонтанирования пива являются гидрофобные белки, гидрофобины.

Гидрофобины - это небольшие гидрофобные белки, продуцируемые плесневыми грибами, обычно содержащие, например, 100±25 аминокислот. К настоящему времени гидрофобины были выделены из нескольких плесневых грибов и съедобных грибов. Характерной особенностью гидрофобинов является то, что они содержат восемь остатков цистеина, которые расположены в белке согласно определенной формуле. Гидрофобины встречаются на поверхности мицелия и спор плесневых грибов и в секрете на субстрате. Гидрофобины являются агентами, способствующими присоединению мицелиев к субстрату и друг к другу, они образуют защитный слой на поверхности воздушного мицелия и спор, предохраняя их от пропитывания водой. Было установлено, что гидрофобины концентрируются на поверхности раздела фаз, например на поверхности воздушных пузырьков в культуральном растворе, образуя амфипатические пленки на поверхности раздела. Благодаря своей пленкообразующей способности гидрофобины изменяют поверхностные свойства материалов от гидрофобных до гидрофильных и наоборот. Их способность уменьшать поверхностное натяжение водного раствора сравнима с таковой у определенных синтетических моющих средств. Гидрофобины описаны, например, в следующих статьях: ХУеккеИ 1.С.Н., НубгорйоЫпк: Рго1ешк 111а( Сйапде Изе Иа1иге оГ 1йе Рипда1 БигГасе, Лбуапсек ίη МкгоЫа1 Рйукю1оду, уо1. 38, 1997 Асабетк Ргекк Ытйеб, рр. 1-45 и ^екке1к, 1.С.Н., Рипда1 йубгорйоЬтк: ргокшк 111а( ГипсБоп а! ап шкгГасе, Тгепбк ίη Р1ап! Бскпсе, уо1. 1, к. 9-15. Гидрофобины стабилизируют пузырьки, вызывая вспенивание у культурального раствора. Было установлено, что гидрофобин, выделенный в настоящее время из плесневых грибов, вызывает фонтанирование пива.

Согласно изобретению количество гидрофобина в сырье для напитка и/или в напитке, особенно в зерне, таком как ячмень, солоде и/или пиве, может быть определено любым способом, пригодным для определения гидрофобина.

В предпочтительном воплощении гидрофобин определяют иммунологически, применяя иммунологическую реакцию между гидрофобиновым антигеном и антителом. Иммунологический способ может представлять собой иммунорадиометрический, иммуноэнзимометрический, иммунофлуорометрический или иммунолюминометрический способ. Антитела, специфичные к гидрофобиновым белкам, которые необходимы для определения, получают традиционными способами производства антител.

Гидрофобиновые белки можно выделить из штаммов плесневых грибов, обладающих фонтанирующей активностью, особенно из штаммов Рикапит. Пригодными являются, на пример, штаммы О1ЬЬеге11а ауеиасеа (Е. ауеиасеит), Е. си1тогит, Е. роае, О1ЬЬеге11а хеае (Е. дгаттеагит), Мдгокрога кр. и Т. геекег Гидрофобины можно выделить из мицелия плесневых грибов и/или культуральных растворов традиционными способами, например экстрагированием, барботированием и/или холодной сушкой.

Гидрофобин может быть выделен из мицелия способом трехфазной экстракции и/или из культурального раствора путем барботирования раствора, вызывающего концентрирование гидрофобина в полученной пене, и/или путем глубокого замораживания культурального раствора, вызывающего седиментацию гидрофобина, который впоследствии может быть отделен центрифугированием раствора после его оттаивания.

В предпочтительном воплощении способа определения гидрофобина применяют метод ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ). Окрашивание или флуоресценция, получаемые в результате ферментативной реакции в этом способе, указывают на присутствие и количество гидрофобина. Метод ЕЫ8А, получение и очистка антител и ферментов, конъюгатов и субстратов, применяемых в этом методе, описаны, например, в статье Уаад, Р., ЕпхутеБткеб 1ттиио8огЬеи1 Аккау (ЕЬ18А) ίη 1бе Веуегаде 1ибик1пек: Ргшс1р1ек аиб РгасОсе, Аиа1ук1к о£ №п-Л1со1юНс Веуегадек (Мобеги Мебюбк о£ Р1ап1 Аиа1ук1к, пе\с кепек уо1. 8), Ебк. Шкеик, Н.Н. аиб 1асккои, ЕЕ., 8ргшдег-Уег1ад, Вегйи 1988, рр. 1-29.

В способе по изобретению могут также применяться другие соответствующие иммунологические процедуры, такие как метод ЕВ81гАЬ18А (твердофазный иммуноферментный анализ с биотинстрептавидиновой системой). Метод ЕВ81гАЬ18А описан, например, в статье Уаад, Р., 1ттиио1одюа1 бе1есбои о£ Еикагшт ш Ьаг1еу аиб та11, Ргос. Еиг. Вгете. Соиу. ШЬои 1991, рр. 553-560.

Во втором предпочтительном воплощении способа гидрофобин определяют иммунохроматографически, используя тест-пластинку на иммунохроматографической основе. Окрашивание, получаемое в результате иммунологической реакции в этом способе, указывает на присутствие и количество гидрофобина.

Применяемая тест-пластинка может включать в себя, например, хроматографическую мембрану, снабженную движущимися маркирующими частицами и двумя стационарными областями гидрофобинового антитела. Образец абсорбируется мембраной тест-пластинки, где он вступает в реакцию с маркирующими частицами и перемещается в области антитела на мембране. Если образец содержит гидрофобин, в областях антитела в результате иммунологической реакции появятся окрашивание и контрольные линии. Если образец не содержит гидрофобии, появится только контрольная линия.

Изобретение позволяет заменить полуколичественный способ обнаружения, основанный на выявлении гриба Еикагшт, который применялся в промышленном контроле качества, на новый надежный и точный способ, при котором первичный фактор фонтанирования должен определяться в зерне. Отбор зерна, особенно ячменного, пригодного для использования, с помощью нового способа позволит сократить потребность в мерах предосторожности, которые показали себя как дорогостоящие и неэффективные, особенно в годы риска, когда качество зерна низкое и пиво, произведенное из зерна, демонстрирует сильную тенденцию к фонтанированию.

Кроме того, новый иммунологический способ обнаружения обеспечивает более быстрый, простой и, следовательно, более дешевый способ определения тенденции ячменя к фонтанированию.

Далее изобретение будет описано подробно с помощью нескольких примеров.

Пример 1. Выделение и обнаружение гидрофобинов.

Гидрофобин выделяют из штаммов плесневых грибов, обладающих фонтанирующей активностью: 01ЬЬеге11а ауеиасеа (Е. ауеиасеит) (УТТ-Э-80141), Е. си1тогит (УТТ-О-80148), Е. роае (УТТ-Э-82182), 01ЬЬеге11а хеае (Е. дгаттеагит) (УТТ-Э-95470), Мдгокрога кр. (УТТ-Э-79122) и Т. гееке1 (УТТ-Э-74075).

Плесневые грибы культивируют на трех разных субстратах: на агаре, в культуральном растворе и на ячмене. Гидрофобин выделяют способом трехфазной экстракции и посредством барботирования культурального раствора. Молекулярное распределение белков, содержащихся в образце, устанавливают с помощью гельэлектрофореза. Гидрофобин, продуцируемый штаммом Т. геекег имеет размер около 7,5 кДа. Гидрофобины, продуцируемые штаммами N1дгокрога кр. (экстракция мицелия) и Е. роае (барботирование культурального раствора), имеют примерно тот же размер. Гидрофобин, экстрагированный из мицелия штамма О1ЬЬеге11а хеае, имеет размер около 20 кДа.

Для выявления гидрофобинов в образце применяют иммунологический тест ЕБ18А. Антитело, используемое в тесте, получают по следующему иммунизационному протоколу. Гидрофобином, продуцируемым плесневым грибом Т. геекег смешанным с адъювантом Фрейнда, иммунизируют кролика. Инъекции производят 4 раза в течение 3 месяцев. Увеличение титра контролируют дважды, определяя содержание антител в крови посредством метода ЕЫ8А. По окончании периода иммунизации собирают кровь кролика и отделяют сыворотку от крови. Реактивность сыворотки проверяют путем определения наиболее слабого разведения сыворотки, которое еще дает реакцию в методе ЕЫ8А. Разведение составляет более 1/100000.

В этом тесте образец гидрофобина пипетируют в лунки на титрационном микропланшете так, чтобы белки в образце связались со стенками лунок. Затем добавляют гидрофобиновое антитело, и оно распознает гидрофобиновый белок на стенках и связывается с ним. Затем добавляют конъюгат, который, в свою очередь, связывается с антителом. Конъюгат содержит фермент, который производит окрашивание субстрата, пипетированного в лунки. Интенсивность окрашивания субстрата прямо пропорциональна содержанию гидрофобина в образце.

Наиболее сильную реакцию получают у образцов гидрофобина Р. роае, №дго8рога 8р. и Т. гее8е1.

Пример 2. Определение гидрофобина в образце ячменя.

Ячмень подвергают заражению штаммами Ршапцт и штаммом Т. гее8е1 из примера 1 в течение 2 недель. Ячменный экстракт готовят, смешивая 50 г ячменя и 100 мл воды в течение 1 мин. Смесь ячменя и воды центрифугируют 15 мин при скорости 4000 д Надосадочный экстракт собирают и содержащийся в нем гидрофобин определяют посредством прямого метода ЕЫБЛ, используя антитело, полученное против гидрофобина Т. геехет

Ячменный экстракт, разведенный 1/10 и 1/100, пипетируют в количестве 150 мкл/лунку на титрационные микропланшеты. Разведения готовят в натрийфосфатном буфере (10 мМ фосфата натрия, рН 7,3 и 150 мМ хлорида натрия=забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР)). Планшет выдерживают в холодильнике в течение ночи. На следующий день ЗФР раствор, содержащий 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,05% раствор Твин 20 (=раствор БСА/ЗФР), пипетируют на планшет в количестве 100 мкл/лунку. Планшет выдерживают при низкой температуре в течение ночи, после чего промывают ЗФР раствором с добавленным к нему 0,01% раствора Твин 20 (раствор ЗФРТ). Готовят разведение 1/100 гидрофобинового антитела в растворе БСА/ЗФР. Из этого разведения антитела по 100 мкл/лунку пипетируют на планшет и планшет инкубируют при +37°С в течение 2 ч. Планшет промывают раствором ЗФРТ. Затем 100 мкл/лунку конъюгата: козий антикроличий 1дС щелочная фосфатаза, разведенного 1/1000 в растворе БСА/ЗФР, пипетируют на планшет. Планшет инкубируют при +37°С в течение 2 ч и промывают раствором ЗФРТ. Наконец, на планшет пипетируют по 100 мкл на лунку следующего раствора: 1 таблетка пнитрофенилфосфата/5 мл буфера диэтиленамин +МдС1₂. Планшет инкубируют на шейкере в течение 30 мин при комнатной температуре. Поглощение измеряют при длине волны 405 нм на фотометре МиШхсаи. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна количеству гидрофобина, содержащегося в образце. В таблице представлены величины поглощения образцов ячменя.

Образец	Разведение образца
1/10	1/100
Контроль	0,551	0,388
УТТ-О-80141	1,823	1,360
УТТ-О-80148	0,452	0,374
УТТ-О-82182	1,088	0,898
νΓΓ-Ό-95470	0,664	0,634
УТТ-О-74075	0,863	1,914

Наибольшее содержание гидрофобина обнаружено в образцах ячменя, зараженного штаммами плесневых грибов С1ЬЬете11а ауепасеа, Р. роае и Т. теехек

Этот способ также хорошо подходит для применения к образцам солода.

Пример 3. Тесты на фонтанирование пива.

Тест на фонтанирование пива выполняют путем добавления 0,5-1 мл образца гидрофобина в бутылку пива. Бутылку встряхивают в течение 3 дней при комнатной температуре, после чего открывают и по изменению массы бутылки определяют количество пива, вылившегося фонтаном из бутылки.

Образцы гидрофобина Т. гее8е1 (экстракция мицелия) и Р. роае (барботирование культурального раствора) производят особенно интенсивное фонтанирование. Фонтанирование в случае первого образца составляет более чем 50%, а в случае последнего образца - 30-45%. Образец гидрофобина №дго8рота 8р. (экстракция мицелия) вызывает повторное фонтанирование от 1 до 10%. Образцы гидрофобина других протестированных плесневых грибов также вызывают фонтанирование пива различной степени.

На основе проведенных испытаний можно утверждать, что гидрофобиновые белки вызывают фонтанирование пива.

Пример 4. Секвенирование гидрофобина.

Образцы гидрофобина Ршатшт роае (барботирование культурального раствора) и №дто8рога 8р. (экстракция мицелия) в примере 1, вызывающие фонтанирование пива, фракционируют с использованием методики ВЭЖХ хроматографии (высокоэффективная жидкостная хроматография) с обращенной фазой (аппарат: Акка Ехр1огег, Рйаттааа Вюкесй; колонка: С4, Уубас). В качестве рабочих буферов используют 0,1%-ную трифторуксусную кислоту (ТФУ) в воде (А) и 0,1%-ную ТФУ в ацетонитриле (Б). Градиент устанавливают так, что работу начинают с буфера А, а долю буфера Б увеличивают в процессе работы, так что в конце рабочий раствор состоит из одного буфера Б. Белки, такие как гидрофобин, элюируют, когда концентрация буфера Б составляет около 50%. Проводят электрофорез полученных фракций в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДДСПААГ) с использованием аппарата Рйа8к (Рйаттас1а), применяя 20%-ные Рйа8к гели. На фрак7 циях, содержащих белки с размером гидрофобинов, проводят анализ Ν-терминальной последовательности. Характеристика порядка аминокислот в гидрофобинах такова, что имеются восемь остатков цистеина, локализованных в белке согласно следующей формуле (\Уекке1к, Ю.Н. (1996) Рипда1 йубгорйоЫпк: рго1етк 1йа1 Гипсбоп а! ап нИегГасе. Ттепбк ίη р1ап1 каепсе. 1: 9-15):

Х2-З8-С-Х5-9-С-С-Х11-39-С-Х8-23-С-Х5-9-С-С^Х6-18^-С-Х2-13

X = аминокислота, иная, чем цистеин

С = цистеин Сук

Для фракций образцов получили следующие частичные Ν-терминальные последовательности:

Р. роае:

ΤΡΡ0Υ000000808ΧΕ0Α С Ρ0ΑΙ .ΥδΟΤΟ сс δΑονοΌΐνυν....

То есть Х18-С-Х9-С-С....

Мдгокрога кр.:

ΤΝΩΟΡΑΤΟΡνΑ С ΑΝΝΟΑΕΡδΑΡΝ СС ΑΤΌνΤΟΤΑΌΤΌ С ΤΤΡΡΚνΡΤδΡΧΌΡρ.....

То есть Х₁₁-С-Х₁₁-С-С-Х₁₁-С...

Т=’ГЪг, Ρ=1То, С=С1у, Υ==Туг, 8=8ег, Ν=Ακ! Ε=Ρ1κ, ^=Αкр. Α=ΑΗ, Т=Ьеи, 0=0111 V=Vа1, 1=11е, К=Ьук.

Последовательности образцов хорошо согласуются с формулой последовательности гидрофобинов. Когда фракцию образца Мдгокрога кр. добавляют в пиво и проводят тест на фонта нирование, половина пива выливается фонтаном. Фракции, которые не содержат белков с размером гидрофобинов, не производят фонтанирования.

Изобретение не ограничено примерами его воплощений, описанными выше, возможны многочисленные вариации в рамках объема изобретения, определенного в формуле изобретения.

Claims

1. Способ установления предрасположенности к фонтанированию у напитка, отличающийся тем, что определяют количество гидрофобина в сырье для напитка и/или в напитке.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что предрасположенность к фонтанированию у пива устанавливают посредством определения количества гидрофобина в зерне, солоде и/или пиве.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что гидрофобин определяют иммунологически, используя иммунологическую реакцию между гидрофобиновым антигеном и антителом.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что гидрофобин определяют методом ΕΜδΑ (твердофазный иммуноферментный анализ), методом ΕΒδίτΑΜδΑ (твердофазный иммуноферментный анализ с биотинстрептавидиновой системой) и/или иммунохроматографически.