CN109721655A - 抗人肌红蛋白抗体及其在检测试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型的抗人肌红蛋白抗体及其在检测试剂盒中的应用，属于免疫化学领域。本发明制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(M26及M08)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，可完全满足制备人肌红蛋白的荧光快速检测试纸卡的应用需求，所述荧光快速检测试纸卡操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能均符合商业化应用指标。

Description

抗人肌红蛋白抗体及其在检测试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的涉及两种抗人肌红蛋白(MYO)抗体及其制备方法以及上述抗体在人肌红蛋白检测中的应用。

背景技术

肌红蛋白(MYO)是骨骼肌和心肌特异性氧结合蛋白。分子量为16.7KDa，由一条含有153个氨基酸残基的多肽链和一个血红素辅基构成，呈紧密球形。

由于肌红蛋白分子量小，当肌细胞受损时，肌红蛋白会释放至循环系统中，1～2小时升高，12小时达到峰值，24小时后逐渐下降，是早期诊断急性心肌梗塞等疾病的重要参考指标。

目前肌红蛋白的免疫检测方法主要有胶体金免疫层析法、酶联免疫测定法和化学发光免疫测定法等。胶体金免疫层析法具备操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需要特殊设备等优点，但由于灵敏度不高，难以实现定量等缺点限制了这种方法的使用。酶联免疫测定法由于具备操作简单，试剂有效期长，无污染、高于胶体金的敏感性、特异性好、结果可用仪器测定等特点，但由于敏感性相对较低，所用标记酶与底物可定量测定范围窄及仪器测定范围窄等缺点，限制了其在微量免疫定量测定中的应用。化学发光免疫分析法虽具有准确、灵敏度高、特异性强、精密度好的优点，但其所用仪器价格昂贵，所用试剂又为进口试剂，一般实验室难以开展，并且不适用于急诊检验。因此，建立一种检测时间尽量短，并且除了能在实验室进行检测外，还能够进行床旁检测，同时能定量测定MYO的检测方法，从而为临床提供准确的诊断依据，是十分必要的。

为克服现有肌红蛋白(MYO)检测技术的不足，本发明提供了一种快速检测MYO的荧光定量试纸条及其制备方法与应用。本发明根据免疫荧光技术特点和MYO抗原抗体系统特点，设计新的原材料、试剂和工艺流程，应用本发明提供的试纸条检测MYO水平，具有简单、快速、灵敏和特异性好等特点,因此适用于检测精密度要求较高的检验中心或大型医院临床科室的应用需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供能有效的、特异性结合人肌红蛋白的抗体。更具体地说：

本发明的第一目的在于提供两种抗人肌红蛋白抗体。

第一种抗人肌红蛋白抗体(M26)，

其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；

其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

优选的是上述抗体(M26)的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

第二种抗人肌红蛋白抗体(M08)，

其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：10所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；

其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。

优选的上述抗体(M08)的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

本发明第二个目的是提供两种单链抗体，所述单链抗体(M26)的氨基酸序列如SEQID NO:17所示；所述单链抗体(M08)的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。

本发明第三个目的是提供两种编码上述单链抗体的核苷酸序列，编码单链抗体(M26)的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，和编码单链抗体(M08)的核苷酸序列如SEQ IDNO:20所示。

本发明第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。

本发明第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主细胞。所属宿主细胞可以是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞，优选为大肠杆菌。

本发明第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：

1)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；

2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。

本发明的第七个目的在于提供上述抗人肌红蛋白抗体在检测人肌红蛋白含量中的应用。

本发明的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人肌红蛋白的抗体对组合M26和M08；该抗体对组合的检测灵敏度高，特异性好。

本发明的第九个目的在于提供一种利用所述抗人肌红蛋白抗体检测人肌红蛋白的荧光定量检测试纸卡，包括样品垫、反应膜、吸水垫、荧光结合垫；所述荧光结合垫喷涂有荧光微球标记的抗体M08，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有抗体M26。

作为优选上述试纸卡所用封闭液为：1％-10％BSA、50mM pH8.0的硼酸缓冲液。

作为优选上述试纸卡所用荧光抗体稀释液为：0-10％BSA、0-10％海藻糖、0-0.025％吐温20、50mM pH8.0的硼酸缓冲液。

作为优选上述试纸卡所用包被抗体稀释液为：0-3％甲醇、0-0.025％吐温-20、0.05mM pH7.2的PBS。

作为优选上述试纸卡所用样本稀释液为：0-0.5％BSA、0.05％安替比林、0-0.025％吐温-20、0.05％proclin300、0.05mM pH7.2-8.0的硼酸缓冲液。

本发明制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(M26及M08)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能均可满足人临床样本检测的荧光定量检测试纸卡。

附图说明

图1.抗体M08及M26特异性检测效果图(Western Blot)，

其中图1a为抗体M08Western Blot图；图1b为抗体M26Western Blot图。泳道1为标准蛋白质(Marker)；泳道2为人MYO。

图2.荧光定量检测试纸卡结构示意图。1为样品垫、2为反应膜、3为吸水垫、4为质控线(C线)、5为检测线(T线)、6为荧光结合垫、7为PVC片材。

图3.荧光定量检测试纸卡检测范围拟合曲线。其中横坐标为蛋白浓度(ng/mL)；纵坐标为检测值；R²为0.998。

图4.荧光定量检测试纸卡线性范围拟合曲线。其中横坐标为理论浓度(ng/mL)；纵坐标为检测值；R²为0.995。

图5.本发明的荧光定量检测试纸卡与化学发光法检测结果相关性。其中横坐标为强生化学发光法测定值(ng/mL)；纵坐标为检测值；R²为0.982。

具体实施方式

定义

“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。

“单链抗体”(scFv)指的是抗体的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)通过15～20个氨基酸短肽(linker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的linker通常富含甘氨酸和丝氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将V_L的N端连接至V_H的C末端，或者相反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异性，且其具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。

互补决定区(complementarity-determining region，CDR)，也叫做高变区。成型于抗体单体氨基酸的末端，是靶抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗体的互补决定区又被称为独特型或者基因型。

实施例1.抗人MYO杂交瘤细胞株的制备

1.动物免疫

以重组人MYO(大肠杆菌重组表达，本公司制备)按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠(购自常州卡文斯实验动物有限公司)。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验指南》。采用间接ELISA法跟踪免疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，进行小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。

2.细胞融合

(1).脾脏细胞的制备

将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟，于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基(购自Gibco公司)离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。

(2).饲养细胞的制备

取8～10周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL 1640HT培养基(购自SIGMA公司)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养基注入20％1640HAT培养基中备用；

取2～3周龄的雌性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的20％1640HAT培养基中，备用。

(3).细胞融合

选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，收集并计数。取约10⁸个上述脾细胞与2×10⁷个上述SP2/0细胞株加入融合管中混合，1000rpm离心10分钟后弃上清(尽量弃净)，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入1mL预热的PEG1450(聚乙二醇1450，购自SIGMA公司)，加入1640HT培养基30mL终止，1000rpm离心10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20％的1640HAT培养基中。

将上述HAT培养基充分混匀后，以200μL/孔分装至96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。一周后用10％1640HT培养基替换20％1640HAT培养基，3天后取上清进行检测。

3.抗人MYO特异性杂交瘤株筛选

(1).检测板的准备：用CB包被液稀释重组人MYO(大肠杆菌系统表达，本公司制备)至1μg/mL，包被96孔ELISA酶标板，100μL/孔，2～8℃包被过夜，洗涤一次拍干；含2％牛血清白蛋白的PBST缓冲液封闭(200ul/孔)，37℃封闭2小时；拍干，备用。

(2).阳性克隆的筛选：将待检细胞培养上清100μL/孔加入上述检测板中，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的TMB显色液，于37℃避光显色15分钟，每孔加入50μL的2M H₂SO₄终止反应，并于OD450处读取数值。阳性孔确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选取阳性克隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。杂交瘤细胞株M08及M26均具有较高的效价，遂后续进一步对上述杂交瘤细胞株进行抗体可变区序列测序分析。

实施例2.杂交瘤细胞株抗体可变区序列的测定

对上述杂交瘤细胞株M08及M26抗体可变区序列进行测定。

a.RNA的提取：参照细胞总RNA抽提试剂盒(购自Roche公司)说明书对上述杂交瘤细胞株M08及M26进行总RNA提取并立即进行反转录；

b.RNA反转录成为DNA：参照Thermo Scientific Reverted First strand cDNASynthesisKit(购自Thermo公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存于-20℃备用；

c.可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，以鼠IgG亚型单克隆抗体可变区序列通用引物为引物，对重链及轻链的可变区序列进行PCR扩增，将PCR产物经DNA胶回收试剂盒(购自TIANGEN公司)进行回收；

d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pMD18-T kit(购自Takara公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

测序得到杂交瘤细胞株M26的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如序列SEQ IDNO：6所示的LCDR3。

测序得到杂交瘤细胞株M08的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ IDNO：10所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。

实施例3.单链抗体的重组表达及纯化

根据实施例2中测序结果，分别将M26及M08抗体重链及轻链可变区之间加入连接肽(GGGGS)₃，并将其全基因进行合成，进行单链抗体的表达载体构建和重组表达。上述单链抗体的重组表达具体如下：

a)单链抗体M26及M08表达质粒构建

单链抗体M26的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:17，单链抗体M08的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。将单链抗体M26和M08基因上游引入NcoI酶切位点，下游引入组氨酸标签和XhoI酶切位点，进行全基因合成并构建到pUC57质粒(由南京金斯瑞生物科技有限公司提供)中，得到一种长期保存质粒，质粒分别记为pUC57-M26-scFv和pUC57-M08-scFv。进行PCR扩增。

常规PCR程序后，琼脂糖凝胶电泳分析，显示两种产物大小与预期大小一致。将PCR获得基因产物回收纯化后，采用NcoI(#R0193S,购自New England BioLabs公司)和XhoI(#R0146S,购自New England BioLabs公司)双酶切，用T4连接酶连接到pET28a(69864，购自Merck公司)质粒中，转化到DH5a感受态细胞(CB101，购自北京天根生化科技有限公司)中，在含有卡那霉素(0408，购自Amresco公司)的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到单链抗体M26的表达质粒，记为pET28a-M26-scFv和pET28a-M08-scFv。

b)单链抗体M26及M08重组大肠杆菌工程菌株的构建、筛选及表达

具体步骤如下：

将实施例3步骤a中测序比对正确的pET28a-M26-scFv和pET28a-M08-scFv质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态菌株(CB105，购自北京天根生化科技有限公司)中，37℃卡那霉素平板中过夜培养。第二天分别挑阳性菌落，接入含有50μg/mL卡那霉素的LB培养液，37℃培养过夜。取50μL过夜培养物接入5mL含50μg/mL卡那霉素的LB诱导培养液，37℃振荡培养。待OD600＝1.0时，用1mmol/L的IPTG(购自Amresco公司)进行诱导表达。同时以未加入IPTG的大肠杆菌培养液做阴性对照。4h后12000rpm，3min收集菌液，用预冷的PBS清洗沉淀，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热10min，室温12000rpm，1min高速离心，取上清。未加入IPTG的大肠杆菌培养液也按此步骤处理。。

c)单链抗体M26和M08纯化

采用组氨酸标签亲和柱纯化单链抗体M26和M08，预装柱子选择为HisTrap HP，具体步骤如下：

取单链抗体M26和M08重组大肠杆菌工程菌株甘油管按照1％接种量接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600≈1.0时加入终浓度为1mMIPTG进行诱导表达，诱导表达4h后离心收集菌体。用预冷的PBS重悬，于4℃以12000rpm，离心15min；重复一次。吸去上清，称菌体沉淀重量，每克(菌体湿重)加入5mL结合缓冲液：300mM NaCl，20mM NaH₂PO4，10mM Imidazole，pH＝7.5。充分混匀后，每克(菌体湿重)菌体加入5μL 100mmol/L PMSF，5μL 100mg/mL溶菌酶，冰上孵育20min。样品置于冰上，用探针型超声波仪破碎菌体，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。4℃，12000rpm，离心15min，过0.45μm滤膜。

HisTrap HP亲和柱纯化：运用全自动智能蛋白纯化系统(AKTA avant150，购自GEhealthcare公司)对上述预处理获得的单链抗体M26和M08细胞裂解液分别进行亲和纯化，柱子为HisTrap HP(17-5248-02,购自GE healthcare公司)。结合缓冲液为300mM NaCl，20mM NaH₂PO₄，10mM Imidazole，pH7.5，洗脱缓冲液为300mM NaCl，20mM NaH₂PO₄，500mMImidazole，pH7.5。洗脱时进行线性洗脱，并收集各个洗脱峰。

通过SDS-PAGE电泳鉴定纯度，合并纯度较高符合要求的单链抗体M26和M08收集管，更换缓冲液为PBS溶液并超滤浓缩(1mg/ml)，过滤除菌于-20℃保存备用。

本领域技术人员知晓，重组蛋白可以不带标签，也可带其他标签，也可加入其他形式的连接肽。无论是否带标签或者带不同形式的标签都可采用protein L亲和填料纯化。

实施例4.抗体的性能评价

1、抗体M08及M26的Western blot鉴定

a.聚丙烯酰胺凝胶电泳：配置12％分离胶、5％浓缩胶，分别上样标准蛋白质及重组MYO(大肠杆菌系统表达，本公司制备)，恒压下电泳1小时；

b.转膜：恒流(35mA/膜)条件下转膜1小时，将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。考马斯亮蓝G250对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，观察蛋白的残留情况；

c.封闭：含5％脱脂奶的TBST缓冲液封闭(封闭液)，4℃过夜；封闭后洗涤液(TBST，详见TaKaRa公司TBST buffer)洗涤一次，10分钟；

d.抗原抗体反应：封闭液稀释(按1:1000体积比)辣根过氧化物酶标记M08(M08-HRP，1mg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)及辣根过氧化物酶标记M26(M26-HRP，1mg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)，分别加入上述两张硝酸纤维素膜中，室温反应1小时；TBST洗涤5次，每次10分钟；

e.显色及拍照：吸干硝酸纤维素膜上残留液体，硝酸纤维素膜加入2mL稳定型过氧化物酶溶液(1mL)与鲁米诺/增强剂溶液(1mL)的混合液(购买于Thermo公司)，均匀润湿硝酸纤维素膜的表面，室温避光反应一分钟后于凝胶成像系统(购买于GE公司)拍照(见图1)，留取结果。

检测结果可见，抗体M08及M26均具有较好的特异性，可特异性检测人MYO。

2、单链抗体M26及M08在时间分辨荧光检测平台的评价

用0.05mol/L pH7.2的PBS将M26抗体稀释至1mg/ml，划线于硝酸纤维素膜上；用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液将时间分辨荧光微球标记的M08抗体稀释10倍，喷涂于结合垫上；按附图2所示贴膜、切条、装卡(具体制备参见实施例5)。将检测卡分别检测浓度含量为200、50ng/ml的MYO抗原(大肠杆菌重组表达，本公司制备)和0.05mol/L pH7.2的PBS，检测结果如下：

由上述结果可知，M26、M08组成的双抗体夹心检测系统可应用于时间分辨荧光检测平台，能够检测一定浓度的MYO抗原。

实施例5.肌红蛋白的时间分辨荧光免疫检测卡的制备

本检测方法采用双抗体夹心免疫层析法的原理。

1、溶液配制

0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液制备：取0.1mol/L的H₃BO₃ 70ml，用0.025mol/L的Na₂B₄O₇·10H₂O调节pH至8.0，并定容至100ml，置于4℃备用，有效期3个月。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，购自SIGMA公司)溶液制备：1.5gEDC加入100ml去离子水，配成水溶液置于4℃备用，有效期3个月。

封闭液的制备：含10％BSA(所述百分比均为质量体积比)，0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液，用0.22um滤膜过滤，置于4℃备用，有效期7天。

荧光抗体稀释液制备：含1％BSA，10％海藻糖，0.025％吐温-20，0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液，用0.22um滤膜过滤，置于4℃备用，有效期7天。

包被抗体稀释液制备：含3％甲醇，0.025％吐温-20，0.05mol/L pH7.2的PBS，用0.22um滤膜过滤，置于4℃备用，有效期7天。

样本稀释液：含0.5％BSA，0.025％吐温-20，0.05％安替比林，0.05％proclin300，0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液，2-8℃保存有效期1年。

2、肌红蛋白荧光检测卡制备

1)时间分辨荧光微球标记

M08抗体标记方法如下(以500ul反应体系为例)：加400ul硼酸缓冲溶液于2ml离心管中，加入100ul浓度1％粒径200nm的空载荧光微球(购自Thermo公司)，漩涡振荡混匀。再加入10ulEDC溶液，室温振荡15min。14000rpm 10℃离心10min，去上清，沉淀用0.5ml硼酸缓冲液溶解，超声分散，功率100W，时间1min(超声3s间隔3s)。

活化后的微球中加入浓度1mg/ml的M08抗体75ul，250r/min25℃恒温震荡反应2h；加入58ul封闭液，恒温震荡反应4h。14000rpm 10℃离心15min，洗涤2次，去上清，沉淀用0.5ml硼酸缓冲液溶解，最后一次离心后沉淀用荧光抗体稀释液溶解并超声分散，置于4℃恒温保存。

2)荧光结合垫的喷涂

M08抗体荧光结合垫6喷点方法如下：用荧光抗体稀释液将上述制备的M08荧光抗体稀释10倍，喷涂于整条结合垫(长300mm，宽12mm的玻璃纤维)上。

3)硝酸纤维素膜的包被

硝酸纤维素膜包被方法如下：取0.5ml浓度4mg/ml的M26抗体，加到5ml刻度离心管中，加包被抗体稀释液至1ml，包被于硝酸纤维素膜2的T线5位置。取0.5ml浓度为4mg/ml抗His抗体，加到离心管中，加包被抗体稀释液至1ml，包被于硝酸纤维素膜2的C线4位置。

4)贴膜、切条、装卡

样品垫1、荧光结合垫6、包被有M26抗体的硝酸纤维素膜(反应膜)2、将吸水垫3从左至右依次设置，且两两之间少许接触，所述硝酸纤维素膜的T线5在左、C线4在右(如附图2所示)，并根据卡壳大小进行切割，装入卡壳，完成检测卡制备。

5)试剂盒组装

取铝箔袋和干燥剂；打开热封机，预热；将检测卡、干燥剂装入铝箔袋中；用热封机封好铝箔袋；贴上标签。

3、肌红蛋白荧光检测卡的使用方法

1)稀释待测样本：在洁净的离心管加入1mL样本稀释液，再精确吸取10μL血清/血浆样本，加入到离心管中，振荡充分混匀。

2)加样及判读：用移液枪吸取50μL稀释后的样本慢慢加入加样孔中，开始计时，10～15分钟内用荧光免疫层析仪定量判定结果。超过15分钟判定，结果无效。

4、肌红蛋白荧光检测卡检测效果评估

1)精密性：将M26(包被)-M08(标记)检测卡按检测卡使用方法检测20、50、200ng/ml的MYO参考品各10次重复测定。实验结果显示三个浓度检测结果变异系数CV<15％。

浓度点(ng/ml)	20	50	200
				CV	11.4％	10.5％	8.5％

2)检测范围：将M26(包被)-M08(标记)检测卡检测不同浓度的MYO抗原，0、50、105、205、415ng/ml，拟合曲线及检测范围为0-415ng/mL(如附图3)。

3)线性范围：将高值样本与样本稀释液按照一定比例配制成5个系列浓度样本(0、50、100、200、400ng/ml)，用M26(包被)-M08(标记)检测卡检测，每个样本检测3次，将结果与理论浓度进行回归统计，判断在该浓度范围内是否成线性。线性范围为0-400ng/mL(如附图4)。

4)准确度—回收率：将M26(包被)-M08(标记)的检测卡检测添加量分别为50、100、200ng/ml的MYO抗原，检测结果如下表。

浓度点(ng/ml)	50	100	200
				回收率	103％	97％	102％

5、准确度—方法学比对：

上述结果显示M26(包被)-M08(标记)的MYO检测卡性能较优，选择市售肌红蛋白(MYO)定量检测试剂盒(化学发光法)作对照产品比对验证。选择30份临床病人标本，按1到30的顺序编号，用对照产品和待评价的M26(包被)-M08(标记)的MYO荧光检测卡同时进行实验，按照1，2，3......28，29，30，30，29，28......3，2，1的样本顺序进行测定。对照和待评价产品的检测结果相关系数R²＝0.982，说明两种方法检测结果有较好的相关性(如附图5)。

6、配方筛选：

除上述最优制备例1外，申请人还尝试多种制备方案，例如下面3组检测卡制备及应用结果如下表：

序列表

<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司

<120> 抗人肌红蛋白抗体及其在检测试剂盒中的应用

<130> 抗人肌红蛋白抗体及其在检测试剂盒中的应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ile Ala Pro Glu Gly Asp Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Ala Arg Glu Val Arg Asn Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Gln Asn Ile His Val Trp

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Glu Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Gln Gln Gly Gln Arg Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Ala Pro Glu Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Met Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Ile Gln Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Val Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile His Val Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Asn Ile Thr Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Arg Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Ile Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Thr

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Thr Arg Ile Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

Trp Ala Ser

1

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Gln Asn Asp Tyr Asn Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 15

<211> 117

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ile Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 113

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Asn Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 17

<211> 239

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Ala Pro Glu Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Met Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Ile Gln Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Val Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

130 135 140

Ala Ser Leu Gly Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn

145 150 155 160

Ile His Val Trp Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Asn Ile Thr

165 170 175

Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln

210 215 220

Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 18

<211> 245

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ile Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr

130 135 140

Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

180 185 190

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

195 200 205

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

210 215 220

Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Asn Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

225 230 235 240

Lys Leu Glu Leu Lys

245

<210> 19

<211> 717

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 19

caggtccagc tgcagcagtc tggagatgat ctggtaaagc ctggggcctc agtgaagttg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga ttaactggat aaaacagagg 120

cctggacagg gccttgagtg gataggacgt attgctcctg aaggtgatag tacttactac 180

aatgaaatgt tcaagggcaa ggcaacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240

attcagctca gcagcctgtc atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagagaggta 300

cgaaatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc aggtggtggt 360

ggatccggag gtggtggttc tggtggtggt ggttctgaca tccagatgaa ccagtctccg 420

tccagtctgt ctgcatccct tggagacaca attaccatca cttgccatgc cagtcagaac 480

attcatgttt ggttaagctg gtacctgcag aaaccaggaa atataactaa actattgatc 540

tatgaggctt ccaacttgca cacaggcgtc ccatcaaggt ttagtggcag tggatctgga 600

acaggtttca cattaaccat cagcagcctg cagcctgagg acattgccac ttactactgt 660

caacagggtc aaaggtatcc tctgacgttc ggtggaggca ccaagctgga aatcaaa 717

<210> 20

<211> 735

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 20

caggtccagc ttcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agctactgga tgcactgggt aaagcagagg 120

cctggacagg gtctggagtg gattggatac attaaaccta acactgatta tactgaatac 180

aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtac aagaattcgc 300

ggctatgctt tggactattg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc aggtggtggt 360

ggatccggag gtggtggttc tggtggtggt ggttctgaca ttgtgatgac acagtctcca 420

tcctccctga ctgtgacagc aggagagaag gtcactatga tctgcaagtc cagtcagagt 480

ctcttaaaca gtggaaatca aaagaactac ttgacctggt accagcagaa accagggcag 540

cctcctaaac tgttgatcta ctgggcatcc actagggaat ctggggtccc tgatcgcttc 600

acaggcagtg gatctggaac agatttcact ctcaccatca gcagtgtgca ggctgaagac 660

ctggcagttt attactgtca gaatgattat aattttccgc tcacgttcgg tgctgggacc 720

aagctggagc tgaaa 735

Claims (8)

1.抗人肌红蛋白抗体，包括：

重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如SEQID NO：2所示的HCDR2和如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；

以及轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

2.如权利要求1所述的抗人肌红蛋白抗体，其特征是所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

3.如权利要求2所述的抗人肌红蛋白抗体，其特征是所述抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:17所示。

4.编码权利要求3所述抗体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。

5.含有权利要求4所述核苷酸序列的表达载体。

6.含有权利要求5所述表达载体的重组宿主细胞。

7.生产权利要求3所述抗体的方法，包括：

1)在合适的条件下培养权利要求6所述重组宿主细胞表达抗体；

2)然后从宿主细胞中纯化、收集抗体。

8.权利要求1-3任一项抗人肌红蛋白抗体在检测样本中肌红蛋白含量中的应用。