CN105319372B

CN105319372B - 莱克多巴胺检测试纸卡及试剂盒

Info

Publication number: CN105319372B
Application number: CN201510048150.4A
Authority: CN
Inventors: 马永; 丁娜; 秦承学; 周恩昆; 徐春林; 陈飞; 陈一飞
Original assignee: Jiangsu Jinghong Biological Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Jinghong Biological Medicine Technology Co., Ltd.
Priority date: 2015-01-29
Filing date: 2015-01-29
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2035-01-29
Also published as: CN105319372A

Abstract

本发明提供了一种莱克多巴胺检测试纸卡及试剂盒，其采用了具有更高特异性的抗莱克多巴胺单抗，属于食品安全检测领域。本发明通过莱克多巴胺抗原免疫动物及筛选得到杂交瘤细胞株，并进一步进行测序和重组表达得到所述高特异性抗体，本发明应用所述莱克多巴胺抗体制备得到酶联免疫试剂盒和胶体金试纸条。本发明制备得到的莱克多巴胺抗体特异性高，成本低，以此制备得到的莱克多巴胺酶联免疫试剂盒和胶体金试纸卡检测莱克多巴胺具有操作方便、检测成本低、特异性高、灵敏度高、准确度高等特点，可以定量或定性检测动物尿液、血样、组织及内脏等样品中的莱克多巴胺残留。

Description

莱克多巴胺检测试纸卡及试剂盒

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，尤其涉及莱克多巴胺的检测产品，更具体的说是采用一种新抗体的莱克多巴胺的胶体金检测试纸卡与ELISA检测试剂盒。

背景技术

“瘦肉精”是一类属于肾上腺类神经兴奋剂药物。其能使牲畜在代谢过程中促进蛋白质合成，加速脂肪的转化和分解，继而提高牲畜的生长速度，增加瘦肉率；同时还能减少饲料使用、使肉品提早上市、降低成本。国务院食品安全委员会办公室《“瘦肉精”专项整治方案》(食安办[2011]l4号)规定的“瘦肉精”品种目录为：盐酸克伦特罗(ClenbuterolHydrochloride)、莱克多巴胺(Ractopamine，Rac)、沙丁胺醇(Salbutamo1)等。其中，莱克多巴胺(Rac)易在动物组织，特别是内脏中积聚残留，并通过食物链进入人体。继而引起骨骼肌收缩增强，破坏快缩肌和慢缩肌纤维间的融合现象，引发肌肉震颤，出现面色潮红、头痛、头晕、胸闷、心悸、四肢麻木等不良反应，严重的可能危及生命。许多国家都将莱克多巴胺列为违禁物，我国已禁止在畜禽身上使用莱克多巴胺。

目前，国内外用于检测莱克多巴胺的常用方法有：酶联免疫吸附测定法(ELISA)、胶体金免疫层析法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用、色谱法、毛细管电泳法、免疫传感器法等。色谱法、毛细管电泳法、免疫传感器法检测灵敏，但所需的仪器设备昂贵，样品前处理复杂，一次检测样品量少，检测时间长，且不易普及，而ELISA、胶体金免疫层析法不需要借助昂贵的仪器，且样品前处理简单，具有高通量等优点。但目前已有的检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒或胶体金试纸卡的检测灵敏度或准确度还不是十分理想，分析其原因，主要在于所采用的抗莱克多巴胺抗体还有待提高。由于莱克多巴胺为化学小分子，其表面位点少，因而为制备其抗体带来了较大的困难，尤其是特异性较高的抗体，目前市用抗体的特异性普遍较低，半数抑制浓度(IC50)较高，无法满足应用的需求。

发明内容

本发明旨在提供能有效的、特异性结合莱克多巴胺(Rac)的抗体，及其检测莱克多巴胺(Rac)在动物体内残留的用途。更具体地说：

本发明第一个目的是提供一种抗体，所述抗体特异性结合莱克多巴胺(Rac)，所述抗体包括：

重链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：4所示的HCDR3；

以及轻链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：7所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：8所示的LCDR3。

优选的是本发明中的抗体含有氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的轻链可变区。

更优选的本发明中抗体的编码基因含有如SEQ ID NO:9所示的重链可变区和如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区。

本发明第二个目的是提供一种单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示。优选的，所述单链抗体中不含由六个组氨酸构成的HIS标签。

本发明第三个目的是提供一种编码上述单链抗体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

本发明第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。

本发明第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主细胞，所属宿主细胞可以是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞，优选为毕赤酵母。

本发明第六个目的是提供一种生产上述抗体的方法，包括：

1)在合适的条件下培养上述重组宿主细胞表达抗体；

2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。

本发明第七个目的是提供上述抗体用于检测莱克多巴胺(Rac)残留的新用途。

本发明第八个目的在于提供一种检测莱克多巴胺的胶体金试纸卡或ELISA试剂盒，所述胶体金试纸卡或ELISA试剂盒含有上述所述抗体。

优选的，上述所述ELISA试剂盒，包括：包被了抗原莱克多巴胺的载体蛋白偶联物的酶标板、含有上述所述抗体的抗体工作液、酶标物、莱克多巴胺标准液、显色液、终止液、浓缩洗涤液。更优选的，所述载体蛋白为BSA、OVA、KLH。

优选的，上述所述抗体工作液是用酶稀释液将上述抗体稀释得到，所述酶稀释液是0.01M的PBST(pH7.4)缓冲液，其中含有质量体积比为0.335％的Na₂HPO₄·12H₂O、0.02％NaH₂PO₄·2H₂O、0.8％NaCl、0.02％KCl、0.1％Casein、0.05％BSA。

优选的，上述所述酶标物为抗His抗体-HRP、抗His抗体-AP、Protein L-HRP或Protein L-AP。

优选的，上述所述显色液为TMB显色液或BCIP/NBT显色液。

优选的，上述所述终止液为2M的H₂SO₄。

优选的，上述所述浓缩洗涤液为含0.05％TWEEN-20的0.2M PBS。

本发明的第九个目的在于提供一种检测莱克多巴胺的方法，包括以下步骤：

1.编号：将样本和标准品对应的微孔按序编号，每个样本及标准品设复孔平行；

2.加样：按序每孔加入标准品、样本、酶标物以及抗体工作液，于室温避光反应；

3.洗板：反应后，洗板并干燥处理；

4.显色：加入显色液，于室温避光反应；

5.终止及读数：加入终止液，测定每孔OD值。

6.结果判定：

i).定性判定：由样品孔的吸光率与标准品孔的吸光率的简单对比而来判定：样品孔的颜色比某一标准品孔的颜色浅则样品中莱克多巴胺的浓度比该孔所含标准品的浓度高，样品孔的颜色比某一标准品孔的颜色深则样品中莱克多巴胺的浓度比该孔所含标准品的浓度低；

ii).定量分析：以标准品的吸光度平均值与第一个标准(0ppb)的吸光度值的百分比为纵坐标，以莱克多巴胺标准品的浓度(ppb)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的吸光度平均值与第一个标准(0ppb)的吸光度值的百分比代入标准曲线中，从而计算出样本中莱克多巴胺的实际浓度。

本发明的第十个目的在于提供一种检测莱克多巴胺的胶体金试纸卡，包括样品垫1、金标垫6、硝酸纤维素膜2、吸收垫3、衬板7，样片垫1、金标垫6、硝酸纤维素膜2、吸收垫3两两相邻并部分层叠从左至右依次粘贴于衬板7上，所述硝酸纤维素膜2上有质控带4(C线)和检测带5(T线)，所述金标垫6内含有经胶体金标记的上述抗莱克多巴胺抗体。

优选的，质控带4位置包被有抗His抗体或Protein L，检测带5位置包被有莱克多巴胺半抗原与载体蛋白的偶联物。

本发明所提供抗体制备的ELISA检测试剂盒和胶体金试纸卡的灵敏度和准确度相比市售产品更加理想，并且特异性很好。

附图说明

图1.抗体K07重链、轻链可变区基因电泳图。条带1为标准DNA，条带2为K07抗体重链可变区DNA，Lane3为K07抗体轻链可变区DNA

图2.抗体K07结构示意图。V_H表示重链可变区序列，V_L表示轻链可变区序列，His标签为六个组氨酸。

图3.抗体表达PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图4.重组毕赤酵母菌株诱导表达上清培养液鉴定图。图a为SDS-PAGE电泳鉴定图、图b为Western blot鉴定图。

图5.抗体纯化效果图(SDS-PAGE)。条带1-10为不同收集管所获的抗体K07。

图6.抗体K07的Western Blot鉴定图。泳道1为标准蛋白质、泳道2为Rac-BSA、泳道3为Rac-OVA、泳道4为Cle-BSA、泳道5为Cle-OVA、泳道6为Sal-BSA、泳道7为Sal-OVA。

图7.本发明莱克多巴胺的ELISA检测试剂盒的标准曲线。其中横坐标为莱克多巴胺标准品浓度对数(lg)；纵坐标为莱克多巴胺标准品百分吸光率。

图8.本发明莱克多巴胺胶体金检测试纸卡结构示意图。

其中1为样品垫、2为硝酸纤维素膜、3为吸收垫、4为质控线(C线)、5为检测线(T线)、6为金标垫、7为衬板

具体实施例

定义

“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。该术语不仅包括完整的多克隆抗体，也包括其片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv)、单链抗体(single chain antibodyfragment，scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白和任一包含抗原识别位点的其他改变构型的免疫球蛋白分子。抗体包括任一类或多类的抗体，如IgG、IgA、IgD、IgE或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要为任一特定类。

“单链抗体”(scFv)指的是抗体的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)通过15～20个氨基酸短肽(linker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的linker通常富含甘氨酸和丝氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将V_L的N端连接至V_H的C末端，或者相反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异性，且其具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。

互补决定区(complementarity-determining region,CDR)，也叫做高变区。成型于抗体单体氨基酸的末端，是靶抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗体的互补决定区又被称为独特型或者基因型。本申请中HCDR是指重链可变区中的互补决定区，LCDR是指轻链可变区中的互补决定区。

实施例1:抗莱克多巴胺杂交瘤细胞株的制备

1、动物免疫

以莱克多巴胺偶联牛血清白蛋白(Rac-BSA)偶联物(免疫原)按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠(购自常州卡文斯实验动物有限公司)。首先将弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂与Rac-BSA偶联物等体积混合并反复吹打，使免疫原充分乳化，获得浓度为0.5mg/mL的乳化免疫原。选取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠采用皮下多点注射方式接种上述乳化免疫原，每两周免疫一次。具体免疫情况见下表：

从第二次免疫后开始，在免疫后一周时采用眼眶静脉丛采血，用间接ELISA和竞争ELISA法检测免疫小鼠血清(莱克多巴胺偶联卵清白蛋白偶联物Rac-OVA检测)的效价和半数抑制价，选取血清效价和抑制价都最高的小鼠，进行免疫小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合。

2、细胞融合

(1).脾脏细胞的制备

取步骤1中血清效价和抑制价都最高的免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟后，于无菌操作台中取其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基(购自Gibco公司)离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。

(2).饲养细胞的制备

取8～10周龄的雌性或雄性BALB/c小鼠一只，眼球取血制备阴性血清，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约5mL1640HT培养基(购自SIGMA公司)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养基注入20％1640HAT培养基中，备用；

取2～3周龄的雌性或雄性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，制成胸腺细胞悬液并注入上述含有巨噬细胞的20％1640HAT培养基中，备用。

(3).细胞融合

选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤株SP2/0，收集并计数，备用。

取约10⁸个上述脾脏细胞与2×10⁷个上述SP2/0加入融合管中混合，1000rpm离心10分钟后弃上清(尽量弃净)，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入1mL预热的PEG1450(聚乙二醇1450)(购自SIGMA公司)，加入1640HT培养基30mL终止，1000rpm离心10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤(2)所获得的20％1640HAT培养基中。

将上述20％1640HAT培养基充分混匀后，200μL/孔分装至96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

一周后，10％1640HT培养基替换20％1640HAT培养基；换液10天后取上清进行检测。

3、抗莱克多巴胺特异性淋巴细胞杂交瘤株筛选

(1).检测板的准备

用CB包被液稀释莱克多巴胺偶联卵清白蛋白偶联物(Rac-OVA)至2μg/mL，加入至96孔酶标板中(100uL/孔)，2～8℃包被过夜，洗涤拍干；2％酪蛋白封闭，37℃封闭2小时，PBST洗涤拍干，备用。

(2).阳性克隆的筛选

将待检细胞培养上清100μL/孔加入上述检测板中，置于37℃条件下反应30分钟后洗涤并拍干；加入100μL/孔的HRP标记的抗体IgG，置于37℃条件下反应30分钟后洗涤并拍干；加入100μL/孔的TMB显色液，于37℃避光显色15分钟后以50μL/孔的2M H₂SO₄终止反应，并于OD450处读取数值。阳性孔确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。

选取阳性克隆株进行竞争ELISA筛选，确定其抑制价：依次将50μL的Rac小分子，50μL的HRP标记的羊抗鼠IgG(购于博士德生物)以及50μL的阳性克隆株细胞培养上清加入检测板中，置于37℃条件下反应40分钟后洗涤并拍干；加入100μL/孔的TMB显色液，于37℃避光显色15分钟后以50μL/孔的2M H₂SO₄终止反应，并于OD450处读取数值并计算半数抑制浓度(IC50)。选取效价和半数抑制浓度最好的细胞株留种。

其中杂交瘤细胞株上清检测效价>10⁵，半数抑制率为2.5ng/mL，命名为抗莱克多巴胺特异性杂交瘤细胞株C07，简称杂交瘤细胞株C07。

实施例2:抗莱克多巴胺杂交瘤细胞株抗体可变区序列的测定

对上述杂交瘤细胞株C07抗体可变区序列进行测定。

a.RNA的提取：参照细胞总RNA抽提试剂盒(购自Roche公司)说明书对上述杂交瘤细胞株C07进行总RNA提取并立即进行反转录；

b.RNA反转录成为DNA：参照Thermo Scientific Reverted First strand cDNASynthesis Kit(购自Thermo公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存于-20℃备用；

c.可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，以鼠IgG亚型抗体可变区序列通用引物为引物，对重链及轻链的可变区序列进行PCR扩增，将PCR产物经DNA胶回收试剂盒(购自TIANGEN公司)进行回收，见附图1；

d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pMD18-T kit(购自Takara公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，交由Invitrogen^TM公司进行测序。

测序得到杂交瘤细胞株C07的抗体重链可变区基因序列如SEQ ID NO:9所示、轻链可变区基因序列如SEQ ID NO：10所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：4所示的HCDR3；轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：7所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：8所示的LCDR3。

实施例3.抗体的重组表达及纯化

根据实施例2中测序结果，将杂交瘤细胞株C07的抗体重链及轻链可变区之间加入连接肽(GGGGS)₃，引入六个组氨酸并将其全基因按照毕赤酵母表达系统的偏爱性进行密码子优化和抗体的重组表达，所表达得到的抗体命名为抗体K07，其结构组成如附图2所示。上述抗体的重组表达具有如下步骤：

a)融合蛋白基因的表达质粒构建

密码子优化后的抗体K07的基因序列如SEQ ID NO:12所示、氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示。将优化后的抗体K07全基因合成的片段上游引入pPICZαA载体中XhoI序列后DNA序列，下游引入XbaI酶切位点，构建到pMD19-T Simple Vector质粒(购自Invitrogen公司)中，得到一种长期保存质粒，质粒记为pMD19-K07。进行PCR扩增，所用引物序列如下：

上游引物：

P1:CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC

下游引物：

P2:AGCGGATAACAATTTCACACAGGA

常规PCR程序后，琼脂糖凝胶电泳分析(附图3)，显示产物大小与预期大小(790bp)一致。将PCR获得基因产物回收纯化后，采用XhoI(#R0146S,购自New England Biolabs公司)和XbaI(#R0145V，购自New England Biolabs公司)双酶切，用T4连接酶连接到pPICZαA(V19520，购自Invitrogen)质粒中，转化到DH5α感受态细胞中，在含有Zeocin(R250-01，购自Invitrogen公司)的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到抗体K07的表达质粒，记为pPICZα-K07。

b)融合蛋白基因在毕赤酵母宿主工程菌株的构建、筛选及表达

毕赤酵母感受态细胞及其相关的YPDS固体培养基、BMGY培养基、BMMY培养基均购自Invitrogen公司。

将pPICZα-K07质粒，用SacI限制性内切酶酶切线性化。乙醇沉淀后将线性化载体，电转化进入到X-33感受态酵母细胞，涂布到含有Zeocin的YPDS固体培养基，30℃培养3-5天，就有阳性克隆产生。

挑取上述获得的单克隆于5mL BMGY培养基中，30℃培养至OD₆₀₀＝2.0～6.0时，取1mL保存菌种，并将剩余菌液重悬后转移到BMMY中小量诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％(v/v)。一周后，离心收集菌液上清，通过SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白免疫印迹分析(Western blot)，观察目标蛋白表达情况(附图4)。Western blot中一抗为抗HIS-Tag抗体(His-Tag(2A8)Mouse mAb，M20001，购于艾比玛特生物医药(上海)有限公司)。

将上述获得的K07重组融合蛋白基因工程菌株分别接种于BMGY培养基中，30℃，220rpm培养至菌体密度到OD₆₀₀＝2.0～6.0，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1.0％(v/v)。一周后，收集发酵培养液。

c)融合蛋白纯化

主要采用组氨酸标签亲和柱纯化抗体K07融合蛋白，预装柱子选择为HisTrap HP，具体步骤如下：

(1)发酵液的除杂预处理：将上述表达得到抗体K07融合蛋白发酵液上清，离心收集上清，并加入结合缓冲液，使得上清终浓度为300mM NaCl，20mM NaH₂PO₄，10mMImidazole，调pH7.5，0.45μm滤膜过滤。

(2)HisTrap HP亲和柱纯化：运用全自动智能蛋白纯化系统(AKTA avant150，购自GE healcare公司)对预处理获得的抗体K07融合蛋白发酵液进行亲和纯化，柱子为HisTrapHP(17-5248-02,购自GE healcare公司)。结合缓冲液为300mM NaCl，20mM NaH₂PO₄，10mMImidazole，pH7.5，洗脱缓冲液为300mM NaCl，20mM NaH₂PO₄，500mM Imidazole，pH7.5。洗脱时进行线性洗脱，并收集各个洗脱峰。通过SDS-PAGE电泳鉴定纯度，由附图5可知，纯化后的蛋白纯度达到95％以上；合并符合要求的收集管，更换缓冲液为PBS溶液并超滤浓缩(1mg/ml)，过滤除菌于-20℃保存备用。

本领域技术人员知晓，可将杂交瘤细胞株C07的抗体重链及轻链可变区之间加入连接肽(GGGGS)3，而不引入六个组氨酸，重组表达成不带His标签的融合蛋白，此时蛋白的纯化可采用Protein L蛋白亲和纯化方法(具体参照GE公司亲和层析介质Capto L)。

实施例4.抗体K07的性能鉴定

1.抗体K07的Western blot鉴定

a.聚丙烯酰胺凝胶电泳：配置12％分离胶、5％浓缩胶，分别上样标准蛋白质、莱克多巴胺偶联BSA(Rac-BSA)、莱克多巴胺偶联OVA(Rac-OVA)、盐酸克伦特罗偶联BSA(Cle-BSA)、盐酸克伦特罗偶联OVA(Cle-OVA)、沙丁胺醇偶联BSA(Sal-BSA)、沙丁胺醇偶联OVA(Cle-OVA)(上述抗原均购买于上海佑隆公司)，恒压下电泳1小时；

b.转膜：恒流(35mA/膜)条件下转膜1小时，将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转移至两张硝酸纤维素膜上。考马斯亮蓝G250对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，观察蛋白的残留情况；

c.封闭：含5％脱脂奶的TBST缓冲液封闭(封闭液)，4℃过夜；封闭后洗涤液(TBST，详见TaKaRa公司TBST buffer)洗涤一次，10分钟；

d.抗原抗体反应：封闭液稀释(按1:400体积比)辣根过氧化物酶标记K07(K07-HRP，1mg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记)，加入上述硝酸纤维素膜中，室温反应1小时；TBST洗涤5次，每次10分钟；

e.显色及拍照：吸干硝酸纤维素膜上残留液体，硝酸纤维素膜加入2mL稳定型过氧化物酶溶液(1mL)与鲁米诺/增强剂溶液(1mL)的混合液(购买于Thermo公司)，均匀润湿硝酸纤维素膜的表面，室温避光反应一分钟后于凝胶成像系统(购买于GE公司)拍照，留取结果。

实验结果(附图6)表明，K07抗体与莱克多巴胺具有特异性反应，未与盐酸克伦特罗及沙丁胺醇发生交叉反应。

2.抗体K07在莱克多巴胺胶体金检测平台的性能评价

除下表中的参数及封闭液(0.5％Casein+0.05％PEG2000)外，其余试纸卡的制备步骤及参数同实施例8。分别制备含5ppb，10ppb，50ppb，100ppb的含莱克多巴胺标准品的阳性猪尿，与阴性猪尿一起进行检测。

K07抗莱克多巴胺抗体与商品化莱克多巴胺抗体在相同缓冲液中的检测结果表明，本发明所制备抗体可用于胶体金检测试纸卡的构建，且尿液样本检测灵敏度与市售试纸卡相当，优化后有望完全达到市售试纸卡的水平；本发明抗体用于构建胶体金试纸卡，K07用量以及C线抗体用量更少，更经济节约。

备注：商品化莱克多巴胺抗体购买于武汉华美生物工程有限公司

实施例5.本发明莱克多巴胺ELISA检测试剂盒的制备

本ELISA试剂盒采用间接竞争ELISA方法。

1.检测板的制备：包被缓冲液(含质量体积比为0.3％的Na₂CO₃及0.58％的NaHCO₃)稀释莱克多巴胺偶联牛血清白蛋白偶联物(Rac-BSA)稀释至1μg/mL，以100μL/孔加入96孔酶标板中，2～8℃包被过夜；次日，用含0.05％TWEEN-20的PBST洗板一遍；加入200μL/孔的封闭液(含质量体积比为0.3％Na₂CO₃、0.58％NaHCO₃、10％蔗糖、体积比10％小牛血清)于室温(25℃)封闭2小时，弃去液体，低温干燥，封装备用。

本领域技术人员知晓，由于莱克多巴胺为小分子化合物，较难直接包被至酶标板上，一般会在其上偶联载体蛋白再进一步包被到酶标板上，因此，莱克多巴胺偶联的牛血清白蛋白(BSA)也完全可以用卵清白蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白替代。

2.酶稀释液、抗体工作液，酶标抗体的配制：

①酶稀释液：0.01M的PBST(pH7.4)缓冲液，含有质量体积比为0.335％的Na₂HPO₄·12H₂O、0.02％NaH₂PO₄·2H₂O、0.8％NaCl、0.02％KCl、0.1％Casein、0.05％BSA

②抗体工作液的制备：用酶稀释液将K07抗体以1/500000体积比稀释，涡旋混匀，分装(10mL/瓶)；

③酶标抗体的制备：用酶稀释液将鼠抗His抗体-HRP以1/2000体积比稀释，涡旋混匀，分装7mL/瓶。

3.TMB显色液、终止液以及莱克多巴胺标准液：

①TMB显色液：TMB(购自SIGMA公司)的浓度是0.3g/L，分装为14mL/瓶；

②终止液：2M的H₂SO₄，分装为7mL/瓶；

③、④、⑤、⑥、⑦、⑧莱克多巴胺标准液：各1mL，浓度分别为0ppb，0.1ppb，0.3ppb，0.9ppb，2.7ppb，8.1ppb。

4.20倍浓缩洗涤液：含0.05％TWEEN-20的0.2M PBS，分装为40mL/瓶。

5.组装：将所有瓶装试剂插于盒托的对应孔内，与酶联板、说明书、自封袋、封板膜一起放入纸盒，储存于2～8℃，检验合格后贴检封签。

根据实际需要本实施例中酶标抗体完全可以用抗His抗体-AP、Protein L-HRP、ProteinL-AP替代，显色液也完全可以用BCIP/NBT显色液替代。

实施例6.本发明莱克多巴胺ELISA检测试剂盒的使用方法

1.样本前处理：

尿液样本：清亮尿液样本可直接用于测定，浑浊尿液须先3000g以上离心以获得上清；取50uL用于样本检测；

猪肉或猪肝等样本：称取2±0.05g匀浆样本至50mL离心管中，加入4mL洗涤工作液，再加入2mL 0.1M盐酸，涡旋30s，室温条件下离心(≥3000g，5分钟)；取上清液1mL，加入30uL 0.5M NaOH至样本液PH值在6.5～8.0之间，混匀；取50uL用于样本检测；

2.将所需试剂及酶标板从冷藏环境中取出，置于室温(25℃)平衡；

3.用去离子水将20倍浓缩洗涤液按体积比1:19进行稀释制成洗涤工作液，用于酶标板的洗涤，临用前进行配制；

4.编号：将样本和标准品对应的微孔按序编号，每个样本及标准品设复孔平行；

5.加样：在对应的微孔中按序分别加入50μL/孔标准品或样本，50μL/孔酶标抗体以及50μL/孔抗体工作液，轻轻振荡混匀，于室温(25℃)避光反应40分钟；

6.洗板：反应时间达到后，将孔内液体甩干，用300μL/孔的洗涤工作液洗板，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，甩干液体，用吸水纸拍干；

7.显色：加入100μL/孔的TMB显色液，轻轻振荡混匀，于室温(25℃)避光反应15分钟；

8.终止及读数：加入50μL/孔的终止液，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。

9.结果判定：

i).粗略判定：由样品孔的吸光率与标准品孔的吸光率的简单对比而来判定：样品孔的颜色比某一标准品孔的颜色浅则样品中莱克多巴胺的浓度比该孔所含标准品的浓度高，样品孔的颜色比某一标准品孔的颜色深则样品中莱克多巴胺的浓度比该孔所含标准品的浓度低；

实施例7.本发明莱克多巴胺ELISA检测试剂盒的性能鉴定

本实施案例将本发明莱克多巴胺ELISA检测试剂盒与市售同类试剂盒进行检测性能的比较。

两种试剂盒分别检测70份新鲜阴性尿液样本及70份新鲜阳性尿液样本(新鲜阴性尿液样本中加入1ppb莱克多巴胺)。本发明莱克多巴胺ELISA检测试剂盒按照上述检测方法进行操作；市售同类试剂盒按照试剂说明书进行操作。检测结果见下表，两种检测试剂盒均无假阳性的出现；阳性样本检测中，本发明莱克多巴胺ELISA检测试剂盒的回收率范围较市售试剂盒更窄，反映出更高的准确性，具备检测更准确的优势。

实施例8.本发明莱克多巴胺胶体金检测试纸卡的制备

本试纸卡应用竞争抑制免疫层析，可用以动物体液中莱克多巴胺的定性检测，尤其适用于猪尿液中莱克多巴胺的定性检测，检测限为3-5ppb。具体制备方法如下：

1.K07抗莱克多巴胺抗体的胶体金标记：

用0.2M K₂CO₃调节胶体金pH值至8.15，向胶体金溶液中缓慢加入以0.02M的PBS稀释的K07抗体至10ug/mL，低速搅拌30分钟；

加入封闭剂：加入BSA至其终浓度为1％(质量百分比)，搅拌10分钟后继续加入PEG2000至其终浓度为0.05％(质量百分比)；

胶体金复溶：搅拌10分钟后加入与胶体金相同体积的复溶液(1％BSA+5％蔗糖+0.1％Tween20+25mM PBS缓冲液(pH7.5))，于2～8℃静置过夜。所得即为胶体金标记的K07抗体；

2.用上述胶体金标记的K07抗体喷涂于金标垫6内，将包被抗体稀释液(3％甲醇+25mM PBS缓冲液(pH7.5))稀释后的鼠抗His抗体、Rac-OVA偶联物分别在硝酸纤维素膜2上划线于C线4、T线5，再将样片垫1金标垫6、硝酸纤维素膜2、吸收垫3按附图8所示两两相邻并部分层叠从左至右依次粘贴于衬板7上，装条。

本领域技术人员知晓，由于莱克多巴胺为小分子化合物，通常需偶联大分子载体蛋白后再用作包被，本实施例所用于偶联莱克多巴胺的卵清白蛋白(OVA)也可以用牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白替代。

3.将试纸卡与说明书、滴管一起放入纸盒，储存于4～30℃阴凉避光处，检验合格后贴检封签。

4.本发明曾尝试多种试纸卡制备方法，下表展示几种不同制备方式(表中未列出的步骤、参数等同本实施例所述)及相应试剂盒的检测性能。

实施例9.本发明莱克多巴胺胶体金检测试纸卡的使用

1.样品前处理：清亮尿液样本可直接用于测定，浑浊尿液须先离心(≥3000g)以获得上清；

2.将试纸卡从冷藏环境中取出，置于室温(25℃)平衡；

3.将塑料卡平放，用滴管吸取待检样品，垂直滴加3滴(约75μL)于加样孔中；

4.液体流动时开始计时，5～10分钟内读取结果。

5.结果判定：如T线无显色、C线显色，则判定样品为阳性，表示样品中含有高于检测限的莱克多巴胺；如T线和C线都显色，则判定样品为阴性，表示样品中无莱克多巴胺或莱克多巴胺的浓度低于检测限；如C线不显色，则表明操作不正确，或本次使用的试纸卡已经失效。

实施例10.本发明莱克多巴胺胶体金检测试纸卡的检测性能评价

1、灵敏度检测

1.1试剂和溶液：

a)莱克多巴胺储备液(1mg/mL)：准确称取莱克多巴胺标准品50mg，用甲醇溶解后稀释至50mL，摇匀，-18℃以下冰箱中贮存备用，有效期90天。

b)莱克多巴胺工作液(1μg/mL)：取莱克多巴胺储备液0.1mL，加甲醇定容至100mL，2℃～8℃冰箱中贮存备用，有效期7天。

c)3ng/mL莱克多巴胺标准品：取莱克多巴胺工作液90μL，用尿液稀释至30mL，混匀。

d)5ng/mL莱克多巴胺标准品：取莱克多巴胺工作液100μL，用尿液稀释至20mL，混匀。

e)10ng/mL莱克多巴胺标准品：取莱克多巴胺工作液200μL，用尿液稀释至20mL，混匀。

1.2检测及结果

取同一批号的本发明莱克检测试纸卡9条，分别检测三种浓度的Rac标准品(3ng/mL，5ng/mL，10ng/mL)各3次，每种浓度的3次结果均为阳性才可判断为此浓度的结果为阳性。3ng/ml标准品检测时，三次检测结果中，两次为阴性，一次为阳性；5ng/ml标准品检测时，三次检测结果均为阳性。根据三种浓度的检测结果进行判断，本发明检测试纸卡的灵敏度为3-5ppb。

2、特异性

2.1试剂和溶液：

a)盐酸克仑特罗工作液100μg/mL，甲醇作为溶剂。

b)500ng/mL盐酸克仑特罗标准品：取盐酸克仑特罗工作液100μL，用尿液稀释至20mL，混匀。

c)沙丁胺醇工作液100μg/mL，甲醇作为溶剂。

d)500ng/mL沙丁胺醇标准品：取沙丁胺醇工作液100μL，用尿液稀释至20mL，混匀。2.2检测及结果

分别对500ng/mL盐酸克仑特罗、500ng/mL沙丁胺醇标准品进行检测，各重复3次，各溶液的3次结果均为阴性。检测结果表明，本发明莱克多巴胺检测试纸卡具有较好的特异性。

Claims

1.一种检测莱克多巴胺的ELISA试剂盒，包括包被了莱克多巴胺的酶标板、含有抗莱克多巴胺抗体的抗体工作液、酶标物、莱克多巴胺标准液、显色液、终止液、浓缩洗涤液，其特征在于，所述抗莱克多巴胺抗体包括：

重链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQIDNO：2所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：3所示的HCDR2和如序列SEQIDNO：4所示的HCDR3；

以及其轻链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQIDNO：6所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：7所示的LCDR2和如序列SEQIDNO：8所示的LCDR3。

2.一种检测莱克多巴胺的胶体金试纸条，包括样片垫(1)、金标垫(6)、硝酸纤维素膜(2)、吸收垫(3)、衬板(7)，样片垫(1)、金标垫(6)、硝酸纤维素膜(2)、吸收垫(3)两两相邻并部分层叠从左至右依次粘贴于衬板(7)上，所述硝酸纤维素膜(2)上有质控带(4)和检测带(5)，所述金标垫(6)内含有经胶体金标记的抗莱克多巴胺抗体，其特征在于，所述抗莱克多巴胺抗体包括：

3.根据权利要求1所述的检测莱克多巴胺的ELISA试剂盒或权利要求2所述的检测莱克多巴胺的胶体金试纸条，其特征在于，所述抗莱克多巴胺抗体含有氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQIDNO:5所示的轻链可变区。

4.根据权利要求1所述的检测莱克多巴胺的ELISA试剂盒或权利要求2所述的检测莱克多巴胺的胶体金试纸条，其特征在于，所述的抗莱克多巴胺抗体为单链抗体，其氨基酸序列如SEQIDNO:11所示。

5.根据权利要求1所述的检测莱克多巴胺的ELISA试剂盒或权利要求2所述的检测莱克多巴胺的胶体金试纸条，其特征在于，所述的抗莱克多巴胺单链抗体中含由六个组氨酸构成的HIS标签。

6.根据权利要求1所述的检测莱克多巴胺的ELISA试剂盒，其特征在于，所述抗体工作液是用酶稀释液将氨基酸序列如SEQIDNO:11所示的单链抗体稀释得到，所述酶稀释液是0.01M pH7.4的PBST缓冲液，其中含有质量体积比为0.335％的Na₂HPO₄·12H₂O、0.02％NaH₂PO₄·2H₂O、0.8％NaCl、0.02％KCl、0.1％Casein、0.05％BSA。

7.根据权利要求4所述的检测莱克多巴胺的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标物为抗His抗体-HRP、抗His抗体-AP、Protein L-HRP或Protein L-AP；所述显色液为TMB显色液或BCIP/NBT显色液。

8.根据权利要求1所述的检测莱克多巴胺的ELISA试剂盒，其特征在于，所述终止液为2M的H₂SO₄。

9.根据权利要求1所述的检测莱克多巴胺的ELISA试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含0.05％TWEEN-20的0.2MPBS。

10.根据权利要求2所述的检测莱克多巴胺的胶体金试纸条，其特征在于，所述质控带(4)位置包被有鼠抗His抗体或Protein L，所述检测带(5)位置包被有莱克多巴胺半抗原与载体蛋白的偶联物。