CN103012592A

CN103012592A - 莱克多巴胺单克隆抗体的制备及其应用

Info

Publication number: CN103012592A
Application number: CN201110281716XA
Authority: CN
Inventors: 何方洋; 万宇平; 冯静; 扶胜; 聂雯莹; 邵小雪; 顾蓉蓉; 何丽霞
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2011-09-21
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明提供了一种莱克多巴胺单克隆抗体及其应用。本发明公开了一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，通过合成莱克多巴胺半抗原以及莱克多巴胺半抗原与载体蛋白免疫得到莱克多巴胺抗原，将其免疫动物得到高特异性单克隆抗体。本发明还提供的一种将莱克多巴胺单克隆抗体应用于酶联免疫试剂盒检测莱克多巴胺的方法。本发明还提供了一种将莱克多巴胺单克隆抗体应用于胶体金试纸卡检测检测莱克多巴胺的方法。本发明制备得到的莱克多巴胺单克隆抗体特异性高，成本低，以此莱克多巴胺单克隆抗体制备的莱克多巴胺酶联免疫试剂盒和胶体金试纸卡检测莱克多巴胺药物具有操作方便、检测成本低、特异性高、灵敏度高、准确度高、精确度高、检测快速等特点。

Description

莱克多巴胺单克隆抗体的制备及其应用

技术领域

本发明属于生物化学分析技术领域，具体涉及一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法以及用途，用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒和胶体金试纸卡，其特别适用于畜禽组织、尿样、饲料、乳制品等样品中莱克多巴胺药物残留的检测。

技术背景

莱克多巴胺(ractopamine，Rac)属于β-肾上腺素受体激动剂(简称β-激动剂)，国内外许多研究者将其作为饲料添加剂，分别对猪、牛、草鱼和鼠等动物进行试验，证明其具有营养重分配作用，该药物能改变动物的营养代谢，降低胴体脂肪，提高瘦肉率，同时使动物增重，提高饲料使用率。然而β-激动剂在动物体内的蓄积性残留会对食用者的安全构成潜在威胁，常常引起食用者发生心悸、肌肉震颤、恶心呕吐、发热寒战等临床症状，特别对心脏病、糖尿病、高血压等病人危害更大。在欧洲，1986年就颁布了禁用β-激动剂的禁令，1997年我国农业部严禁将β-激动剂等药物作为动物促生长剂使用。然而由于经济利益的驱使，违法滥用β-激动剂的现象仍非常普遍，各类中毒事件时有发生。另外由于美国FDA核准ElancoAnimal Health Products所制造的莱克多巴胺用作猪的饲料添加剂，这一规定成为许多非法使用者的借口。为了打击非法使用违禁药物，除了健全法律法规，建立有效的监督管理体系外，还需要健全相应的检测方法。

目前分析检测莱克多巴胺的方法主要有仪器检测法和免疫分析方法，其中仪器检测方法主要涉及高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)，但是仪器检测方法所用的仪器几乎都属于大型仪器，价格昂贵，样品前处理过程复杂，需要专业技术人员才可操作仪器，检测过程耗时长，检测成本高，不适合现场监控和大量样品的筛查；免疫分析方法主要包括酶联免疫吸附检测方法(ELISA)和免疫胶体金检测方法，这两种方法均属于快速检测方法，并在食品安全监管的现场大量样品筛查工作中已经被使用。两种检测方法均操作简单快速、不需大型仪器设备、不需专业技术人员操作即可完成检测，特别适合于现场大批量样品抽检。但是，目前的检测莱克多巴胺酶联免疫检测试剂盒对检测莱克多巴胺特异性不理想，试剂盒的灵敏度不高，稳定性不好，样品前处理方法繁琐费时；莱克多巴胺胶体金试纸卡存在着检测产品稳定性差，检测结果不够准确的缺点。本发明为了解决上述问题，从改造莱克多巴胺半抗原结构出发，进而优化免疫原和包被原结构，来改善抗体的质量，提高抗体的特异性，增强抗体与抗原的识别能力。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有莱克多巴胺检测技术的不足，提供了一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，使其具有抗体效价高、特异性强、成本低廉的特点。

本发明的莱克多巴胺单克隆抗体是通过以下技术方案得以实现的：

1、莱克多巴胺抗原的制备

(1)、本发明中的莱克多巴胺半抗原合成步骤为：

1.1g对苯二胺，溶入150ml 0.2M的HCl水溶液中，0-4℃下滴加0.7g NaNO2的20ml水溶液，避光反应0.5-1小时，然后缓慢滴加1.1g莱克多巴胺在20ml 0.5mol/L醋酸钠水溶液中的混合物。避光反应1-3小时。加入适量浓盐酸酸化，产生沉淀，离心，水洗，乙酸乙酯提取，除去溶剂后得到半抗原，为莱克多巴胺的偶氮衍生物，得率75-80％(如图1所示)。其分子结构如下：

(2)免疫原的合成

本发明所述免疫原为莱克多巴胺半抗原与牛血清蛋白(BSA)偶联得到。

免疫原具体的合成方法如下：

a)取莱克多巴胺半抗原30mg用1.5ml水溶解；

b)取50％的1，5-戊二醛(GA)10μl加入(1)中，室温下搅拌反应18h得到溶液I；

c)取BSA 100mg用5.5ml水稀释后加入溶液I中，得到溶液II；

d)溶液II反应24h后加入24mg NaBH₄，反应2h得到溶液III；

e)溶液III用三蒸水透析48小时，即得免疫原。

(3)包被原的合成

本发明所述包被原为莱克多巴胺半抗原与卵清白蛋白(OVA)进行偶联得到。

包被原的具体合成方法如下：

a)取莱克多巴胺半抗原30mg用1.5ml水溶解；

b)取50％的GA 10μl加入(1)中，室温下搅拌反应18h得到溶液I；

c)取OVA30mg用4.5ml水稀释后加入到溶液I中，得到溶液II；

d)溶液II反应24h后，向其中加入24mg NaBH₄反应2h，得到溶液III；

e)溶液III用三蒸水透析48h，即得包被原。

2、莱克多巴胺鼠单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

用莱克多巴胺半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的免疫原对8-10周龄的Balb/c小鼠进行三次间隔免疫，在第三次免疫后再进行一次加强免疫，激活体内的淋巴细胞，产生莱克多巴胺特异性抗体。

(2)细胞融合和克隆化

将产生莱克多巴胺特异性抗体的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP20按8∶1比例进行融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。将阳性细胞在检测后2天内采用有限稀释法进行亚克隆，直到得到稳定的能够分泌莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)单克隆抗体的腹水制备和纯化

用液体石蜡致敏Balb/c小鼠，将收集得到的杂交瘤细胞株用1640进行清洗，并注射与小鼠的腹腔，一周后可见小鼠状态不活跃并且腹腔肿大。采集到的腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化(腹水中富集了莱克多巴胺特异性的单克隆抗体)，纯化后的腹水放入-20℃环境保存，腹水在使用前经过0.01mol/LNaCl于4℃环境下透析。

3、抗抗体的制备

本发明的抗抗体为羊抗鼠抗抗体，是以羊作为免疫动物，以鼠源抗原作为免疫原对羊进行免疫得到。

本发明的另一个目的是提供一种检测莱克多巴胺酶联免疫试剂盒及其检测方法。

1、本发明试剂盒，它包含：

(1)包被了莱克多巴胺抗原的96孔酶标板；

(2)酶标二抗；

(3)莱克多巴胺抗体工作液；

(4)莱克多巴胺标准品溶液；

(5)莱克多巴胺高浓度标准品溶液；

(6)底物液A液；

(7)底物液B液；

(8)终止液；

(9)2×浓缩洗涤液。

所述的包被了莱克多巴胺抗原的96孔酶标板，酶标板孔中包被的抗原为上述发明中的包被原。在酶标板制备过程中所使用的包被液为pH为9.4～9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液。所用的封闭液为1％OVA溶液与pH为7.2的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液混合配制得到。

本发明所述的酶标板的制备方法为：用pH为9.4的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将莱克多巴胺包被原稀释成0.1～0.5μg/mL，向酶标板的微孔中加入包被原稀释液，放入37℃环境中温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤，拍干，然后在每孔中加入封闭液，37℃孵育，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

所述的试剂盒包括的抗体为上述发明中所述的莱克多巴胺单克隆抗体和抗抗体。

所述抗体工作液由常规抗体稀释液和莱克多巴胺特异性单克隆抗体进行1∶2×10⁴倍稀释，所述抗体稀释液为pH为7.2的含有8％BSA和0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

酶标二抗的酶标记物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，本发明优选辣根过氧化物酶。酶标记的羊抗鼠抗抗体采用戊二醛法或过碘酸盐氧化法将酶与抗抗体偶联得到，本发明经过长期的劳动创造选用改良过的过碘酸盐氧化法对羊抗鼠抗抗体进行标记，可以有效节省酶与抗体的偶联用量，提高了酶标记效率，保证了酶标二抗较高的活性；将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶通过改良后的过碘酸钠法进行偶联得到酶标二抗。

所述莱克多巴胺标准品溶液是将莱克多巴胺标准品溶解于pH为7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，分别配制成浓度为0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L的莱克多巴胺6个标准品溶液。

底物显色液A液为0.75％的过氧化氢脲加入到pH为5.0的0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制而成；底物显色液B液为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的乙醇水溶液。

所述终止液为2mol/L的H₂SO₄溶液。

所述浓缩洗涤液为pH为7.2的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液与0.05％吐温-20混合配制而成。

本发提供一种应用上述酶联免疫试剂盒检测莱克多巴胺的方法，包括的步骤有：

(1)样品前处理；

(2)进行样品中莱克多巴胺残留量的检测，测定百分吸光度；

(3)将得到的检测结果进行分析，以莱克多巴胺标准品百分吸光率为纵坐标，以莱克多巴胺标准品浓度的半对数为横坐标，绘制标准曲线，将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度。

样品的前处理主要目的是为了从样品中最大限度地除去影响测定的干扰物，能够快捷、简便地获得纯度较高、回收率较高的磺胺类药物，样品前处理所用到试剂对人体危害程度降低到最小。

2、本发明样品前处理方法：

(1)猪尿：取一定量的猪尿样品直接进行测定，如果尿样浑浊必须过滤或离心的方法，直至尿样清亮方可直接测定。

(2)猪肝：称取2.0g猪肝样品匀浆，加入3ml 2％NaCl-0.2M HCl-甲醇混合液振荡30s，室温3000g以上离心5min，取0.5ml上清液，加入15μl 0.5M氢氧化钠溶液，再加入1ml用去离子水和2×浓缩液按1∶1体积比混合而成的样品复溶工作液，混匀，用于分析。

(3)肌肉：称取2.0g肌肉样品匀浆，加入3ml 2％NaCl-0.2MHCl-甲醇混合液振荡30s，室温3000g以上离心5min，取0.5ml上清液，加入30μl 0.5M氢氧化钠溶液，再加入0.5ml上述复溶工作液，混匀，用于分析。

(4)饲料：称取1.0g饲料样品至50ml离心管中，加入10ml甲醇，振荡1min，室温3000g以上离心5min，移取1ml上层有机相至10ml干净玻璃管中，于50-60℃水浴氮气/空气流下吹干，加入0.5ml正己烷，涡动1min，再加入1ml复溶工作液，涡动30s，室温3000g以上离心5min，去除上层有机相，取50μl下层水相，加入200μl复溶工作液，混匀，用于分析。

3、样品中莱克多巴胺检测方法

1)加标准品/样品(猪尿、猪肝、鸡肉、饲料)、酶标二抗和抗体工作液：加入莱克多巴胺标准品/样品50μl到对应微孔中，随即加入酶标二抗50μl/孔，再加入抗体工作液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，置25℃避光环境中反应30min。

2)洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用去离子水与浓缩洗涤液按1∶19体系混合制得的溶液250μl/孔充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。

3)显色：分别加入底物显色液A液和B液各100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，置25℃环境中反应20min。

4)测定：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔的OD值。(弱无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)

4、结果分析

1)粗略判定：用样品的平均吸光光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(μg/L(kg))，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中莱克多巴胺残留的浓度范围；

2)定量分析：计算百分吸光率，标准品或样品的百分吸光率等于标准品或样品的吸光光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光光度值(B₀)，再乘以100％，即：

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

3)标准曲线的绘制与计算：以标准品百分吸光率为纵坐标，以莱克多巴胺标准品浓度的半对数为横坐标，绘制标准曲线。将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品种莱克多巴胺的实际浓度(如图2所示)。

本发明另一个目的是提供一种检测莱克多巴胺胶体金试纸卡及其检测方法。

本发明所提供的检测莱克多巴胺胶体金试纸卡，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述结合物释放垫包被有胶体金标记的上述发明中所述的莱克多巴胺特异性单克隆抗体；所述反应膜上包括检测区和指控区，检测区包被有上述发明所述的包被原；质控区包被有上述发明所述的羊抗鼠抗抗体。

本发提供一种应用上述胶体金试纸卡检测莱克多巴胺的方法，包括的步骤有：

(1)样品的前处理

猪尿、牛尿、羊尿：取一定量的猪尿样品直接进行测定，如果尿样浑浊必须过滤或离心的方法，直至尿样清亮方可直接测定；

猪肉、猪肝：取去掉脂肪的猪肉、猪肝样品于均质器中均质1min，称取1.0g均质物于10ml离心管中，加入1mlpH为7.4的0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，涡动1min，放入80℃水浴中15min，取出冷却至室温，用于分析；

饲料：将饲料样品粉碎，称取1.0g粉碎的饲料样品至4ml离心管中，加入1ml乙腈涡动1min，静止5min，取上液50μl用150μl pH为7.4的0.02mol/L的磷酸盐缓冲液中吐温-20的含量为0.5％混合溶液配制而成的稀释液进行稀释，用于分析。

血清：收集的血清先凝血处理，如血清溶血严重或混浊需离心收集上清液，用于分析。

(2)检测方法：用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加2～3滴(约70μl)于加样孔。

本发明通过有机合成对对苯二胺化合物的结构进行了改造，得到莱克多巴胺的偶氮衍生物，更易与载体蛋白发生偶联反应。本发明的酶联免疫试剂盒和胶体金试纸卡采用的样品前处理方法省时、简便，有效地降低了前处理工作量，整体地提高了检测效率，样品前处理方法能够高效地从动物尿液、猪肉、猪肝、饲料和牛奶、牛血清等复杂基质样品中将莱克多巴胺提取出来，提高了样品中莱克多巴胺回收率。本发明所提供的莱克多巴胺单克隆抗体具有特异性高、抗体效价高、成本低廉等特点；同时本发明所提供的莱克多巴胺酶联免疫试剂盒和胶体金试纸卡具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高、构造简单、便于携带、操作方便、价格便宜等特点，能够对大批量样品进行定性、定量筛查，能够检测的样品种类比较多，能够满足基层实验室、市场监控检测、临时抽检时对于莱克多巴胺检测检测的要求。

附图说明

图1：莱克多巴胺半抗原合成路线

图2：以莱克多巴胺半抗原与载体蛋白的偶联物为包被原的酶联免疫试剂盒的标准曲线

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围

实施例1莱克多巴胺单克隆抗体的制备

一、莱克多巴胺抗原的制备

1、莱克多巴胺半抗原的合成(如图1a-1b所示)

1.1g对苯二胺，溶入150ml 0.2M的HCl水溶液中，0-4℃下滴加0.7g NaNO2的20ml水溶液，避光反应0.5-1小时，然后缓慢滴加1.1g莱克多巴胺在20ml 0.5mol/L醋酸钠水溶液中的混合物。避光反应1-3小时。加入适量浓盐酸酸化，产生沉淀，离心，水洗，乙酸乙酯提取，除去溶剂后得到半抗原，为莱克多巴胺的偶氮衍生物，其分子结构如下：

2、免疫原的合成

将莱克多巴胺半抗原与牛血清白蛋白进行偶联得到免疫原。

免疫原的具体合成方法为：

(1)取莱克多巴胺半抗原30mg用1.5ml水溶解；

(2)取50％的1，5-戊二醛(GA)10μl加入(1)中，室温下搅拌反应18h得到溶液I；

(3)取BSA 100mg用5.5ml水稀释后加入溶液I中，得到溶液II；

(4)溶液II反应24h后加入24mg NaBH₄，反应2h得到溶液III；

(5)溶液III用三蒸水透析48小时，即得免疫原。

(5)分装，于-20℃保存备用。

3、包被原的合成

将莱克多巴胺半抗原与卵清蛋白进行偶联得到包被原。

包被原的具体合成方法为：

(1)取莱克多巴胺半抗原30mg用1.5ml水溶解；

(2)取50％的GA 10μl加入(1)中，室温下搅拌反应18h得到溶液I；

(3)取OVA30mg用4.5ml水稀释后加入到溶液I中，得到溶液II；

(4)溶液II反应24h后，向其中加入24mg NaBH₄反应2h，得到溶液III；

(5)溶液III用三蒸水透析48h，即得包被原。

二、莱克多巴胺单克隆抗体的制备

1、动物免疫

用无菌pH7.0的PBS液将合成的免疫原(CL-BSA)溶解，然后按免疫原与弗氏佐剂(FCA)1∶3的比例充分乳化制成油乳剂疫苗。首次免疫用弗氏完全佐剂疫苗，对8-10周龄Balb/c小鼠进行免疫，颈背部皮下多点注射，免疫剂量为150μg/只。14天后二免，采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量同上；28天后三免，采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量同上；31天后加强免，不加佐剂，直接采用CL-BSA免疫。

表1免疫Balb/c小鼠时间表

2、细胞的融合和克隆化

将产生莱克多巴胺特异性抗体的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP20按8∶1比例混合，将混合好的细胞离心，倒干上清，把沉淀细胞块弹成糊状，置37℃水浴，在1min内加入1ml融合剂，融合剂为聚乙二醇(PEG)4000，作用2min，并轻轻搅拌细胞，在随后4min内加入20ml无血清的PEG营养液，1000rpm离心10min，弃上清。用20～50ml完全培养液重悬细胞，铺种于含饲养细胞96孔细胞培养板，每孔100μl。置培养箱中。待细胞长至孔底的1/2～1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。将阳性细胞在检测后2天内采用有限稀释法进行亚克隆，直到得到稳定的能够分泌莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将此细胞株进行扩大培养和传代，可以无限量的产生莱克多巴胺特异性单克隆抗体，且该抗体的灵敏度可以达到0.025μg/L(kg)。

3、单克隆抗体的腹水制备和纯化

(1)小鼠致敏：液体石蜡致敏Balb/c小鼠，6～8周，注射体积500μl/只。10天后可制备腹水。

(2)注射细胞：收集杂交瘤细胞并用1640洗细胞两遍，取100到150万细胞注射于小鼠腹腔，一周后可见小鼠状态不活跃并且小鼠的腹腔肿大。

(3)腹水采集：注射细胞一周后对腹腔肿大的鼠用无菌注射器于小鼠腹腔采集腹水，每隔一到两天采集一次，这样多次反复采集直到小鼠自然死亡。

(4)腹水纯化：采集到的腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20℃环境保存，腹水在使用前经过0.01mol/LNaCl于4℃环境下透析48h，中间每隔6～8h换液一次。

4、抗体效价的测定

在酶标板上每孔包被100μl经稀释的包被原，37℃孵育2h，用洗涤液洗板3次后，每孔加入封闭液100μL，37℃封闭2h，洗板3次后，每孔分别加入用常规酶标二抗稀释液稀释2000倍的酶标二抗，再加入梯度稀释的抗体100μl，25℃避光反应30min，洗板4-5次后，加入50μl底物液A液，50μl底物液B液，显色30min后加入50μL终止液终止；用酶标仪测定吸光度，吸收波长为450/630nm。

5、羊抗鼠抗抗体的制备

实施例2检测莱克多巴胺酶联免疫试剂盒制备及应用

一、检测莱克多巴胺酶联免疫试剂盒组分的配制

本发明检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒，它包含：

(1)包被了莱克多巴胺抗原的96孔酶标板；

(2)酶标二抗；

(3)莱克多巴胺抗体工作液；

(4)莱克多巴胺标准品溶液；

(5)莱克多巴胺高浓度标准品溶液；

(6)底物液A液；

(7)底物液B液；

(8)终止液；

(9)2×浓缩洗涤液。

1、酶标板的制备

用pH为9.4的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将实施例1中莱克多巴胺包被原稀释成0.1～0.5μg/mL，向酶标板的微孔中加入100μl包被原稀释液，放入37℃环境中温育2h，倾去包被液，用稀释20倍的浓缩洗涤液洗涤2次，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃孵育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

2、酶标二抗的制备

将实施例2中羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶(HRP)通过改良后的过碘酸钠法进行偶联得到酶标二抗。具体操作步骤如下：

(1)4mg的HRP溶于1ml蒸馏水中；

(2)加入100mmol/LNaIO₄溶液0.2ml，室温搅拌反应20min；

(3)用1mmol/L醋酸盐缓冲液于4℃透析过夜，除去多余的NaIO₄，同时使自身偶联的酶还原；

(4)加pH9.5的200mmol/L碳酸盐缓冲液20μl和含羊抗鼠抗抗体8mg的pH9.5的10mol/L碳酸盐缓冲液1.0ml，室温搅拌反应2小时；

(5)加入4mg/ml的NaBH₄水溶液0.1ml，4℃反应2小时；

(6)加入等量饱和(NH₄)₂SO₄溶液，平衡1小时后，6000×离心15min，以沉淀游离的和酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(7)用半饱和的(NH₄)₂SO₄溶液洗涤沉淀，然后离心，重复进行三遍；

(8)过SPA-Sepharose层析柱分离游离酶和结合酶，层析柱预先用含100mmol/L磷酸钠和100mmol/LNaCl的pH7.2的磷酸盐缓冲液平衡；

(9)分部收集各管，根据A403nm值作洗脱曲线。合并第二峰各管，加等量甘油，分装后于-20℃避光保存。

3、抗体工作液的制备

所述抗体工作液由常规抗体稀释液和实施例2中莱克多巴胺特异性单克隆抗体进行1∶4×10⁴倍稀释，所述抗体稀释液为pH为7.4的含有6％OVA和0.1mol/L PBS液，将6g OVA加入到配制好的0.1mol/L PBS液溶解定量至100g，得到抗体工作液。

4、底物显色液的配制

(1)底物显色液A液的配制：称取Na₂HPO₄·12H₂O 14.34g，柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水，加0.75％过氧化氢尿素1.28ml，定容至200ml，调pH至5.0-5.4。

(2)底物显色液B液的配制：称取3，3’，5，5’-四甲基联苯胺20mg溶于10ml无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至100ml。

5、终止液的配制

称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至100ml。

6、莱克多巴胺标准品溶液的配制

将莱克多巴胺标准品溶解于pH为7.4的0.1mol/L PBS液，分别配制成浓度为0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L的莱克多巴胺6个标准品溶液。

7、浓缩洗涤液的配制

将50μl吐温-20溶入到100ml的pH为7.2的0.05mol/LPBS液中，振荡混匀。

二、利用酶联免疫试剂盒检测样品中莱克多巴胺的方法

1、样品前处理

(1)猪尿：澄清的猪尿样品可直接进行测定，如果尿样浑浊必须过滤或3000g以上，15℃离心10min，直至尿样清亮方可直接测定。

(2)猪肝：称取2.0g匀浆样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入3ml 2％NaCl-0.2M HCl-甲醇混合液(量取30ml 2％氯化钠溶液、30ml 0.2M盐酸溶液和30ml甲醇混匀)，振荡30s，室温3000g以上离心5min，取0.5ml上清液，加入15μl 0.5M氢氧化钠，再加入1ml复溶工作液(用去离子水将2×浓缩复溶液按1∶1体积比进行稀释(1份2×浓缩复溶液+1份去离子水))用于样品的复溶，混匀，用于分析。

(3)肌肉：称取2.0g匀浆样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入3ml 2％NaCl-0.2MHCl-甲醇混合液振荡30s，室温3000g以上离心5min，取0.5ml上清液，加入30μl 0.5M氢氧化钠，再加入0.5ml复溶工作液用于样品的复溶，混匀，用于分析。

(4)饲料：称取1.0g饲料样品至50ml离心管中，加入10ml甲醇，振荡1min，室温3000g以上离心5min，移取1ml上层有机相至10ml干净玻璃试管中，于50-60℃水浴氮气/空气流下吹干，加入0.5ml正己烷，涡动1min，再加入1ml复溶工作液，涡动30s，室温3000g以上离心5min，除去上层有机相，取50μl下层水相，加200μl复溶工作液混匀，用于分析。

2、试剂盒检测

向包被有莱克多巴胺抗原的酶标板微孔中加入不同浓度的标准品溶液(每个浓度各两孔)或样品溶液20μl，然后加入酶标二抗50μl/孔，再加入抗体工作液80μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min，揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液(用去离子水将浓缩洗涤液按1∶19体积比进行稀释)充分洗涤4～5次，拍干，加入底物显色液A液50μl/孔，再加底物显色液B液50μl/孔，轻轻振荡摇匀，用盖板膜盖板后，置25℃避光环境中反应20min，加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔的OD值。

三、检测结果分析

(1)粗略判定：用样品的平均吸光光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(μg/L)，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中莱克多巴胺残留的浓度范围；

(2)定量分析：计算百分吸光率，标准品或样品的百分吸光率等于标准品或样品的吸光光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光光度值(B₀)，再乘以100％，即：

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

(3)标准曲线的绘制与计算：以标准品百分吸光率为纵坐标，以莱克多巴胺标准品浓度的半对数为横坐标，绘制标准曲线。将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品种莱克多巴胺的实际浓度。(标准曲线见图2)

四、灵敏度的测定

50％抑制浓度(即IC₅₀，指零标准品溶液的吸光度值的50％处所对应的药物浓度)常作为评价竞争酶联免疫试剂盒的灵敏度指标。利用莱克多巴胺标准品溶液进行反应，根据实验结果绘制标准曲线，如图2所示，可知试剂盒莱克多巴胺标准曲线在0.05～4.05μg/L之间。

五、试剂盒精密度和准确度试验

分别向空白猪尿样品中添加0.2g/L和0.4μg/L浓度的莱克多巴胺(样品的稀释倍数为1)；空猪肉、猪肝样品中添加0.6μg/kg和1.2μg/kg浓度的莱克多巴胺(样品的稀释倍数为6)；空白饲料样品中添加5μg/kg和10μg/kg浓度的莱克多巴胺(样品的稀释倍数为50)进行测定，取3个不同批次的试剂盒，并且每个批次抽取2个试剂盒进行检测，每种样本做6次平行，每个样本重复2次，分别计算添加样本回收率和批内、批间变异系数，结果见下表。

表2添加0.2μg/L猪尿样品精密度及准确度试验

表3添加0.4μg/L猪尿样品精密度及准确度试验

从表中可以看出，对于猪尿样品，添加0.2μg/L莱克多巴胺的测定值在0.153～0.207μg/L之间，回收率在76.5％～103.5％之间，批内和批间变异系数均小于15％；添加0.4μg/L莱克多巴胺的测定值在0.303～0.415μg/L之间，回收率在75.8％～103.8％之间，批内和批间变异系数均小于15％。

表4添加0.6μg/kg猪肉样品精密度及准确度试验

表5添加1.2μg/kg猪肉样品精密度及准确度试验

从表中可以看出，对于猪肉样品，添加0.6μg/kg莱克多巴胺的测定值在0.427～0.592μg/kg之间，回收率在71.2％～98.7％之间，批内和批间变异系数均小于15％；添加1.2μg/kg莱克多巴胺的测定值在0.845～1.196μg/kg之间，回收率在70.4％～99.7％之间，批内和批间变异系数均小于15％。

表6添加0.6μg/kg猪肝样品精密度及准确度试验

表7添加1.2μg/kg猪肝样品精密度及准确度试验

从表中可以看出，对于猪肝样品，添加0.6μg/kg莱克多巴胺的测定值在0.434～0.589μg/kg之间，回收率在72.3％～98.2％之间，批内和批间变异系数均小于15％；添加1.2μg/kg莱克多巴胺的测定值在0.848～1.169μg/kg之间，回收率在70.7％～97.4％之间，批内和批间变异系数均小于15％。

表8添加5.0μg/kg饲料样品精密度及准确度试验

表9添加10.0μg/kg饲料样品精密度及准确度试验

从表中可以看出，对于饲料样品，添加5.0μg/kg莱克多巴胺的测定值在3.269～4.621μg/kg之间，回收率在65.4％～92.4％之间，批内和批间变异系数均小于15％；添加10.0μg/kg莱克多巴胺的测定值在6.663～9.431μg/kg之间，回收率在66.7％～94.3％之间，批内和批间变异系数均小于15％。

六、交叉反应率试验

选择与莱克多巴胺有类似结构和类似功能的药物进行交叉反应率的测定，交叉反应率越大，此试剂盒对莱克多巴胺检测的特异性就越好。

交叉反应率(％)＝(IC₅₀(莱克多巴胺)/IC₅₀(结构类似物))×100％

表10交叉反应率测定试验

药物名称	交叉反应率(％)	IC₅₀值(μg/kg)
			莱克多巴胺	100	0.305
多巴酚丁胺	＜1	---
			克伦特罗	＜0.1	---
特布它林	＜0.1	---
			沙丁胺醇	＜0.1	---

由表12可知，本发明制备的莱克多巴胺单克隆抗体与莱克多巴胺的交叉反应率很高，而与其他几种药物的交叉反应率很低，故筛选到的单克隆抗体对莱克多巴胺具有很强的特异性。

七、试剂盒稳定性试验

将制备好的试剂盒保存于2～8℃环境下，分别在8个时间段(第0、1、2、3、6、9、12、15月)取出做保存试验，测定其零标准品的OD值，IC₅₀，0.2μg/L、0.4μg/L添加猪尿样品的回收率；0.6μg/kg、1.2μg/kg添加猪肉、猪肝的回收率；5μg/kg、10μg/kg添加饲料样品的回收率；并将试剂盒保存于37℃和-20℃环境中，在4个时间段(第0、3、6、9天)取出做加速和冻融试验，通过试验结果可知，克仑特罗酶联免疫试剂盒在2～8℃条件下至少可以保存12个月。

实施例3检测莱克多巴胺胶体金试纸卡的制备及应用

一、试纸卡的制备

1、莱克多巴胺单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

取0.01％氯金酸水溶液100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠水溶液2ml，继续匀速搅拌加热15min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积，4℃保存。

(2)金标抗体的制备

用0.1mol/L的碳酸钾调节胶体金溶液至pH为7.2，按每毫升胶体金溶液中加入抗体24μg的标准向胶体金溶液中加入实施例2中莱克多巴胺单克隆抗体，搅拌混匀10min，加入10％BSA使其在胶体金溶液中的终浓度为1％，静置10min。12000rpm，4℃离心40min，弃上清液，沉淀物用含有0.5％的BSA、0.3％的表面活性剂、pH为7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液(金标抗体稀释液)洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的金标抗体稀释液将沉淀重悬，置4℃环境中备用。

2、莱克多巴胺单克隆抗体-胶体金标记物包被到结合物释放垫

将结合物释放垫浸泡于含有BSA(BSA在缓冲液中的浓度为0.5％)和pH为7.2的0.05mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡1h，37℃烘2h备用；用Isoflow点膜仪将制备好的莱克多巴胺金标记抗体均匀包被在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫包被0.01ml莱克多巴胺金标记抗体后，置于37℃环境中60min后取出，置于4℃环境中保存备用。

3、样品吸收垫的准备

将样品吸收垫置于pH为7.2、含有2％BSA、1％活性剂、0.2mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃环境中2h后备用。

4、反应膜的处理与包被

用pH为7.2、0.01mol/L磷酸盐缓冲液将实施例1中的包被原稀释到1mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于NC膜上的检测限(T线)，包被量为1μl/cm；用pH为7.4、0.02mol/L磷酸盐缓冲液将实施例2中羊抗鼠二抗稀释到1mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C线)，包被量为1μl/cm。包被完毕后将包被好的NC膜置于37℃烘干60min，取出。

5、试纸卡的组装

将上述样品吸收垫、结合物释放垫、NC膜、吸水垫依次按顺序黏贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与NC膜的始端连接，NC膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对其，吸水垫的末端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述NC膜上有检测区和质控区，检测区(T)线和质控区(C)线均为与所述试纸的长相垂直的条状带；检测区位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控区位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡。

二、利用胶体金试纸卡检测样品中莱克多巴胺的方法

1、样品前处理方法

(1)猪尿：取一定量的猪尿样品直接进行测定，如果尿样浑浊必须过滤或离心的方法，直至尿样清亮方可直接测定；

(2)猪肉、猪肝：取去掉脂肪的猪肉、猪肝样品于均质器中均质1min，称取1.0g均质物于10ml离心管中，加入1mlpH为7.4的0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，涡动1min，放入80℃水浴中15min，取出冷却至室温，用于分析；

(3)饲料：将饲料样品粉碎，称取1.0g粉碎的饲料样品至4ml离心管中，加入1ml乙腈涡动1min，静止5min，取上液50μl用150μl pH为7.4的0.02mol/L的磷酸盐缓冲液中吐温-20的含量为0.5％混合溶液配制而成的稀释液进行稀释，用于分析。

(4)血清：收集的血清先凝血处理，如血清溶血严重或混浊需离心收集上清液，用于分析。

2、检测方法：用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加2～3滴(约70μl)于加样孔。

3、结果判断：

阴性(+)：T线和C线都显色，并且T线肉眼可见，表示样品中莱克多巴胺浓度低于检测限，判断为阴性；

阴性(-)：T线无显色C线显色，表示样品中莱克多巴胺浓度高于检测限，判断为阳性；

无效：未出现C线，无论T线是否显色，表明该试纸卡已经变质失效，结果判断为无效。

三、交叉反应试验

选择与莱克多巴胺具有类似结构和类似功能的药物，将莱克多巴胺类似物(沙丁胺醇、特普他林、非诺特罗、马布特罗、西马特罗、溴布特罗、塞曼特罗、异丙肾上腺素)进行稀释，用实施例3中所述的试纸卡进行检测，测定的样品溶液：含有3μg/L的克仑特罗标准品的PBS、含有300μg/L的沙丁胺醇标准品的PBS、含有300μg/L的特普他林标准品的PBS、含有300μg/L的菲诺特罗标准品的PBS、含有300μg/L的马布特罗标准品的PBS、含有300μg/L的溴布特罗标准品的PBS、含有300μg/L的塞曼特罗标准品的PBS、含有300μg/L的异丙肾上腺素标准品的PBS。检测结果见表11：

表11交叉反应率测定试验

结果显示为莱克多巴胺代谢物(葡萄糖苷酸酶A、B、C、D)在3μg/L时，试纸卡质控线显色，检测限不显色，检测结果呈阳性；克伦特罗、盐酸多巴胺、沙丁胺醇、链霉素、四环素药物在300μg/L时，试纸卡质控线和检测线均显色，检测结果呈阴性，可以得出本发明的莱克多巴胺胶体金试纸卡与莱克多巴胺(葡萄糖苷酸酶A、B、C、D)交叉反应率为100％，对克伦特罗、盐酸多巴胺、沙丁胺醇、链霉素、四环素均无交叉反应。

四、假阳性率验证试验

取经过高效液相色谱-串联质谱仪确证的阴性猪尿、猪肉、猪肝、饲料、血清阴性样本各50份，编号为1-50，用试纸卡进行检测，结果见下表：

表12假阳性率测定试验结果

猪尿	猪肉	猪肝	饲料	血清
					50份阴性	50份阴性	50份阴性	18号为阳性	25、47号为阳性

结果在50份阴性饲料样品的测定中，试纸卡检测出18号饲料样品为阳性，假阳性率为2％；在50份阴性血清样品的测定中，试纸卡检测出25和47号血清样品为阳性，假阳性率为4％。

五、假阴性率验证试验

取经过高效液相色谱-串联质谱仪确证过的阴性猪尿、猪肉、猪肝、饲料、血清阴性样本各50份，编号为1-50，分别向50份阴性猪尿样品中添加6μg/L的莱克多巴胺标准品；向50份阴性猪肉、猪肝样品中添加10μg/kg的莱克多巴胺标准品；50份阴性饲料样本中添加40μg/kg莱克多巴胺标准品；50份血清阴性样品中添加6μg/L莱克多巴胺标准品。将样品按照实验二中所述的方法处理后，分别用试纸卡进行检测：

表13假阴性率测定试验结果

猪尿	猪肉	猪肝	饲料	血清
					50份阳性	50份阳性	50份阳性	50份阳性	50份阳性

结果在对50份阳性猪尿样品中，试纸卡检测出的阴性样品个数为0；对50份阳性猪肉样品中，试纸卡检测出的阴性样品个数为0；分别对50份阳性猪肝样品中，试纸卡检测出的阴性样品个数为0；分别对50份阳性饲料样品中，试纸卡检测出的阴性样品个数为0；分别对50份阳性血清样品中，试纸卡检测出的阴性样品个数为0。故试纸卡的假阴性率为0。六、试纸卡保存试验

(1)37℃老化试验：随机抽取足量的试纸卡，置于37℃条件下保存，分别空白猪尿、猪肉、猪肝、饲料和血清样品各20份；测定6μg/L莱克多巴胺标准品添加的猪尿样品20份；10μg/kg莱克多巴胺标准品添加的猪肉、猪肝样品各20份；40μg/kg莱克多巴胺标准品添加的饲料样品20份；6μg/L莱克多巴胺标准品添加的牛血清样品20份，测定结果表明试纸卡在100天内测定各项指标均符合要求。

(2)稳定性试验：分别随机抽取足量的试纸卡置于4℃、25℃、30℃条件下保存，在第0～15个月时，分别测定空白猪尿、猪肉、猪肝、饲料和血清样品各20份；测定6μg/L莱克多巴胺标准品添加的猪尿样品20份；10μg/kg莱克多巴胺标准品添加的猪肉、猪肝样品各20份；40μg/kg莱克多巴胺标准品添加的饲料样品20份；6μg/L莱克多巴胺标准品添加的血清样品20份，结果显示试纸卡在分别置于4℃、25℃、30℃时，从生产之日起，第12个月，各项指标均符合规定，到13个月时，试纸卡检测出现了少量的假阳性和失效的现象，从上述结果中可以得出莱克多巴胺胶体金试纸卡在4～30℃条件下可以保存12个月。

Claims

1.一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述莱克多巴胺单克隆抗体采用合成的莱克多巴胺半抗原与载体蛋白偶联得到的抗原进行动物免疫而得到的，其中所述莱克多巴胺半抗原的制备方法步骤为：1.1g对苯二胺，溶入150ml 0.2M的HCl水溶液中，0-4℃下滴加0.7g NaNO₂的20ml水溶液，避光反应0.5-1小时，然后缓慢滴加1.1g莱克多巴胺在20ml0.5mol/L醋酸钠水溶液中的混合物。避光反应1-3小时。加入适量浓盐酸酸化，产生沉淀，离心，水洗，乙酸乙酯提取，除去溶剂后得到莱克多巴胺半抗原，为莱克多巴胺的偶氮衍生物。

2.根据权利要求1所述的莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于：莱克多巴胺小分子经过结构改造得到带有氨基结构的莱克多巴胺的偶氮衍生物，其分子结构如下：

3.根据权利要求1所述的莱克多巴胺单克隆抗体，其特征在于其制备方法包括以下步骤：

(1)将权利要求2所述的莱克多巴胺半抗原与牛血清白蛋白偶联得到的免疫原对8-10周龄的Balb/c小鼠进行三次间隔免疫，在第三次免疫后再进行一次加强免疫，激活体内的淋巴细胞，产生莱克多巴胺特异性抗体。

(2)将产生莱克多巴胺特异性抗体的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按8∶1比例进行融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。将阳性细胞采用有限稀释法进行亚克隆，得到稳定的能够分泌莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞。

(3)用液体石蜡致敏Balb/c小鼠，将收集得到的杂交瘤细胞株用1640进行清洗，并注射与小鼠的腹腔。采集到的腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20℃环境保存。

4.如权利要求1所述的莱克多巴胺单克隆抗体制备的莱克多巴胺酶联免疫试剂盒，其包括：

(1)包被了莱克多巴胺抗原的96孔酶标板；

(2)羊抗鼠酶标二抗；

(3)莱克多巴胺抗体工作液；

(4)莱克多巴胺标准品溶液；

(5)底物液A液；

(6)底物液B液；

(7)终止液；

(8)2×浓缩洗涤液。

5.根据权利要求4所述酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的羊抗鼠酶标二抗是采用改良过的过碘酸钠法将所述羊抗鼠二抗与辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶偶联得到。

6.如权利要求4或5所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于当所述标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物A液为pH 5.0，含有0.75％过氧化氢脲的0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，底物显色液B液为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的乙醇水溶液，所述终止液为2mol/L硫酸；当所述标记酶为碱性磷酸酯酶时，底物显色液为4-硝基酚磷酸钠盐缓冲液，终止液为1～2mol/L的氢氧化钠溶液，所述百分含量为质量百分比。

7.如权利要求4或5所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述包被缓冲液为pH为9.4～9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液，所述封闭液为pH为7.2，含有1％卵清白蛋白，0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，所述洗涤液为pH7.2，含有0.05％吐温-20，0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为质量百分比。

8.如权利要求4或5的酶联免疫试剂盒，其特征在于莱克多巴胺标准品溶液的浓度分别为0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L。

9.由权利要求3所述的莱克多巴胺单克隆抗体制备的莱克多巴胺胶体金试纸卡，其由样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫依次粘贴在PVC底板上组成，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的莱克多巴胺单克隆抗体，所述反应膜上有检测区和质控区，检测区包被有莱克多巴胺半抗原和载体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。

10.如权利要求9所述的莱克多巴胺胶体金试纸卡，其特征在于莱克多巴胺半抗原和载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白。