CN105974114A - 一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸及应用，所述试纸包括支撑板，粘贴在支撑板上的样品吸收垫、纳米金结合垫、检测垫、吸水垫；所述纳米金结合垫上包被有纳米金标记的抗鸡禽流感特异性抗体；所述检测垫为硝酸纤维膜或羧化纤维膜，且检测垫上设置有相互分离开的质控线和检测线，所述质控线上包被有羊抗鼠单克隆抗体为对照印记，所述检测线上包被有抗鸡禽流感特异性抗体为检测印记；所述特异性抗体为用噬菌体展示技术制备的禽流感病毒的单链抗体。本发明试纸用于检测鸡禽流感，具有特异性强，灵敏度高，操作简便，检测结果直接显示，简单明了，为鸡禽流感的检测，预防和控制提供了很好的依据。

Description

一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸及应用
技术领域
本发明涉及动物疾病检测技术领域，具体涉及一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸及应用。
背景技术
禽流感，即鸟禽类流行性感冒，是由病毒引起的动物传染病，通常只感染鸟类，少见情况会感染猪，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，禽流感病毒高度针对特定物种，但在罕有情况下会跨越物种障碍感染人。自从1997年在香港发现人类也会感染禽流感之后，此病症引起全世界卫生组织的高度关注，2013年3月31日，我国上海市和安徽省发现3例人感染H7N9禽流感病例，其中两个抢救无效死亡，这也是全球首次发现的新亚型流感病毒，目前国内外都没有针对H7N9禽流感病毒的疫苗。最早的禽流感记录在1878年，意大利发生鸡群大量死亡，当时被称为鸡瘟，到1955年，科学家证实其致病病毒为甲型流感病毒，此后，这种疾病更名为禽流感。禽流感被发现100多年来，人类并没有掌握有效的预防和治疗方法，仅能以消毒，隔离，大量宰杀禽畜的方法防止其蔓延。高致病性禽流感暴发的地区，往往蒙受巨大经济损失。在家禽中鸭、鹅一旦受到感染，抗病能力比较高之余，病发后的生存机会也很高，然而，鸡只对流感病毒非常敏感，一旦受到感染的话，不单止传播得快，而且染病的鸡很快就会死亡。农民过去一般称这种现象为“发鸡瘟”，并未有特别留意背后的原因或病发的机制，直到出现禽流感经动物向人传播并至死的病例后，人们才开始关注禽流感。目前人们应对禽流感的主要手段，是对染病以及可能染病的家禽集体屠杀后进行消毒深埋等无害化处理，以免病毒积累，并进而影响人类。
禽流感病毒依据其外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同而有许多亚型。目前已从禽类鉴定出15个HA亚型(H1～H15)，9个NA亚型(N1～N9)。特别是H5和H7亚型，对禽类具有高度的致病力，并可引起禽类重症流感的暴发流行。目前对H5型已经有了一定的研究，但H7型的检测和治疗还在研究阶段，故需一种可以对H7型禽流感进行检测为其治疗提供好的前提。
发明内容
本发明解决的技术问题就是提供一种快速准确地检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸及应用。
本发明的技术方案为：一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸，所述试纸包括支撑板，粘贴在支撑板上的样品吸收垫、纳米金结合垫、检测垫、吸水垫；所述纳米金结合垫上包被有纳米金标记的抗鸡禽流感特异性抗体，所述特异性抗体为用噬菌体展示技术制备的抗禽流感病毒的单链抗体；所述检测垫为硝酸纤维膜或羧化纤维膜，且检测垫上设置有相互分离开的质控线和检测线，所述质控线上包被有羊抗鼠单克隆抗体为对照印记，所述检测线上包被有抗鸡禽流感特异性抗体为检测印记；所述特异性抗体为用噬菌体展示技术制备的禽流感病毒的单链抗体。
优选的，所述用噬菌体展示技术制备的抗禽流感病毒的单链抗体的制备方法为：取分泌抗H7亚型流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞总RNA经基因重组配成单链可变抗体基因，再克隆植入噬菌粒载体细胞中，得到抗H7亚型流感病毒的抗体载体，经噬菌体感染后得到抗H7亚型流感病毒的噬菌体抗体库，再用H7亚型流感病毒抗原对其进行富集淘汰反应，洗去未结合的游离菌体，再用洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下来，如此反复筛选3轮，就可得到活性较高的与H7亚型流感病毒抗原结合的噬菌体克隆，再进行转化大肠杆菌进行诱导表达，得到所述抗禽流感病毒的单链抗体。
优选的，所述样品吸收垫经处理液处理，所述处理液为PBS缓冲液，其中，PBS浓度为0.03mol/L，还含有1.2％的牛血清白蛋白，0.9％的海藻糖，1.1％的Tween20。
优选的，所述禽流感病毒为高致病性的H7亚型禽流感病毒，对鸡具有高致病性。
优选的，所述试纸最上层覆盖有一层保护膜，其上印有标记线，以明确试纸的使用范围。
优选的，所述的纳米金溶液的制备方法为：在100mL沸腾的质量浓度为0.03％～0.04％氯金酸水溶液中加入5mL质量浓度为1-2％的柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为20nm的纳米金溶液。
优选的，所述的纳米金标记抗体的制备方法为：调节纳米金溶液pH值到7.5-8.5，取纳米金溶液100mL，向其中加入50μg抗禽流感病毒的单链抗体，搅拌混合均匀后，再加入质量浓度为5％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为1％，以500r/min的转速离心15min，去除多余纳米金颗粒，再加入12％BSA至终浓度为1.5％进行封闭，200r/min的转速再进行离心20min，弃去上清液，沉淀物5℃下保存，即为纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体。
一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸的制备方法为：
步骤一：将样品吸收垫经处理液处理，所述处理液为PBS缓冲液，其中，PBS浓度为0.03mol/L，还含有1.2％的牛血清白蛋白，0.9％的海藻糖，1.1％的Tween20；
步骤二：纳米金结合垫制备方法：
(1)纳米金溶液的制备方法为：在100mL沸腾的质量浓度为0.03％～0.04％氯金酸水溶液中加入5mL质量浓度为1-2％的柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为20nm的纳米金溶液，备用；
(2)纳米金标记抗体的制备方法为：调节纳米金溶液pH值到7.5-8.5，取纳米金溶液100mL，向其中加入50μg抗禽流感病毒的单链抗体，搅拌混合均匀后，再加入质量浓度为5％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为1％，以500r/min的转速离心15min，去除多余纳米金颗粒，再加入12％BSA至终浓度为1.5％进行封闭，200r/min的转速再进行离心20min，弃去上清液，沉淀物5℃下保存，即为纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体；
(3)将纯化的纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体以10μg/mm2的量均匀喷涂于尼龙纤维膜上，冷冻后经干燥处理，即为纳米金结合垫，备用；
步骤三：硝酸纤维素膜的包被方法为：在硝酸纤维素膜上用划膜仪依次在对应位置上划出检测线和质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠单克隆抗体，其包被量为20-30μg，所述检测线上包被有抗鸡禽流感特异性抗体，其包被量为30-40μg，备用；
步骤四：试纸的组装：将样品吸收垫、纳米金结合垫、检测垫、吸水垫按顺序粘贴在支撑板上，干燥处理后切成2mm宽的试纸条，包装封存，即为所述检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸。
本发明试纸的使用方法：将所制试纸的样品吸收区一端浸入待检血清样品中，10分钟后判读结果：质控线出现红色，表示试纸有效；质控线和检测线均出现红色则判定为阳性，即鸡感染禽流感病毒；检测线未出现显色反应即判定为阴性，即鸡未感染禽流感病毒；并可根据显色反应颜色深浅判断阳性强弱，从而判定感染的程度。
本发明的有益效果体现在：本发明试纸用于检测鸡禽流感，具有特异性强，灵敏度高，操作简便，检测结果直接显示，简单明了，为鸡禽流感的检测，预防和控制提供了很好的依据。
具体实施方式
实施例1：
一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸，所述试纸包括支撑板，粘贴在支撑板上的样品吸收垫、纳米金结合垫、检测垫、吸水垫；所述纳米金结合垫上包被有纳米金标记的抗鸡禽流感特异性抗体，所述特异性抗体为用噬菌体展示技术制备的抗禽流感病毒的单链抗体；所述检测垫为硝酸纤维膜或羧化纤维膜，且检测垫上设置有相互分离开的质控线和检测线，所述质控线上包被有羊抗鼠单克隆抗体为对照印记，所述检测线上包被有抗鸡禽流感特异性抗体为检测印记；所述特异性抗体为用噬菌体展示技术制备的禽流感病毒的单链抗体。
其中，所述用噬菌体展示技术制备的抗禽流感病毒的单链抗体的制备方法为：取分泌抗H7亚型流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞总RNA经基因重组配成单链可变抗体基因，再克隆植入噬菌粒载体细胞中，得到抗H7亚型流感病毒的抗体载体，经噬菌体感染后得到抗H7亚型流感病毒的噬菌体抗体库，再用H7亚型流感病毒抗原对其进行富集淘汰反应，洗去未结合的游离菌体，再用洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下来，如此反复筛选3轮，就可得到活性较高的与H7亚型流感病毒抗原结合的噬菌体克隆，再进行转化大肠杆菌进行诱导表达，得到所述抗禽流感病毒的单链抗体；所述样品吸收垫经处理液处理，所述处理液为PBS缓冲液，其中，PBS浓度为0.03mol/L，还含有1.2％的牛血清白蛋白，0.9％的海藻糖，1.1％的Tween20；所述禽流感病毒为高致病性的H7亚型禽流感病毒；所述试纸最上层覆盖有一层保护膜，其上印有标记线，以明确试纸的使用范围；所述的纳米金溶液的制备方法为：在100mL沸腾的质量浓度为0.03％氯金酸水溶液中加入5mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为20nm的纳米金溶液；所述的纳米金标记抗体的制备方法为：调节纳米金溶液pH值到7.5，取纳米金溶液100mL，向其中加入50μg抗禽流感病毒的单链抗体，搅拌混合均匀后，再加入质量浓度为5％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为1％，以500r/min的转速离心15min，去除多余纳米金颗粒，再加入12％BSA至终浓度为1.5％进行封闭，200r/min的转速再进行离心20min，弃去上清液，沉淀物5℃下保存，即为纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体。
一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸的制备方法为：
步骤一：将样品吸收垫经处理液处理，所述处理液为PBS缓冲液，其中，PBS浓度为0.03mol/L，还含有1.2％的牛血清白蛋白，0.9％的海藻糖，1.1％的Tween20；
步骤二：纳米金结合垫制备方法：
(1)纳米金溶液的制备方法为：在100mL沸腾的质量浓度为0.03％氯金酸水溶液中加入5mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为20nm的纳米金溶液，备用；
(2)纳米金标记抗体的制备方法为：调节纳米金溶液pH值到7.5-8.5，取纳米金溶液100mL，向其中加入50μg抗禽流感病毒的单链抗体，搅拌混合均匀后，再加入质量浓度为5％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为1％，以500r/min的转速离心15min，去除多余纳米金颗粒，再加入12％BSA至终浓度为1.5％进行封闭，200r/min的转速再进行离心20min，弃去上清液，沉淀物5℃下保存，即为纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体；
(3)将纯化的纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体以10μg/mm2的量均匀喷涂于尼龙纤维膜上，冷冻后经干燥处理，即为纳米金结合垫，备用；
步骤三：硝酸纤维素膜的包被方法为：在硝酸纤维素膜上用划膜仪依次在对应位置上划出检测线和质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠单克隆抗体，其包被量为20μg，所述检测线上包被有抗鸡禽流感特异性抗体，其包被量为30μg，备用；
步骤四：试纸的组装：将样品吸收垫、纳米金结合垫、检测垫、吸水垫按顺序粘贴在支撑板上，干燥处理后切成2mm宽的试纸条，包装封存，即为所述检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸。
实施例2：
一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸，所述试纸包括支撑板，粘贴在支撑板上的样品吸收垫、纳米金结合垫、检测垫、吸水垫；所述纳米金结合垫上包被有纳米金标记的抗鸡禽流感特异性抗体，所述特异性抗体为用噬菌体展示技术制备的抗禽流感病毒的单链抗体；所述检测垫为硝酸纤维膜或羧化纤维膜，且检测垫上设置有相互分离开的质控线和检测线，所述质控线上包被有羊抗鼠单克隆抗体为对照印记，所述检测线上包被有抗鸡禽流感特异性抗体为检测印记；所述特异性抗体为用噬菌体展示技术制备的禽流感病毒的单链抗体。
其中，所述用噬菌体展示技术制备的抗禽流感病毒的单链抗体的制备方法为：取分泌抗H7亚型流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞总RNA经基因重组配成单链可变抗体基因，再克隆植入噬菌粒载体细胞中，得到抗H7亚型流感病毒的抗体载体，经噬菌体感染后得到抗H7亚型流感病毒的噬菌体抗体库，再用H7亚型流感病毒抗原对其进行富集淘汰反应，洗去未结合的游离菌体，再用洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下来，如此反复筛选3轮，就可得到活性较高的与H7亚型流感病毒抗原结合的噬菌体克隆，再进行转化大肠杆菌进行诱导表达，得到所述抗禽流感病毒的单链抗体；所述样品吸收垫经处理液处理，所述处理液为PBS缓冲液，其中，PBS浓度为0.03mol/L，还含有1.2％的牛血清白蛋白，0.9％的海藻糖，1.1％的Tween20；所述禽流感病毒为高致病性的H7亚型禽流感病毒；所述试纸最上层覆盖有一层保护膜，其上印有标记线，以明确试纸的使用范围；所述的纳米金溶液的制备方法为：在100mL沸腾的质量浓度为0.035％氯金酸水溶液中加入5mL质量浓度为1.5％的柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为20nm的纳米金溶液；所述的纳米金标记抗体的制备方法为：调节纳米金溶液pH值到8，取纳米金溶液100mL，向其中加入50μg抗禽流感病毒的单链抗体，搅拌混合均匀后，再加入质量浓度为5％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为1％，以500r/min的转速离心15min，去除多余纳米金颗粒，再加入12％BSA至终浓度为1.5％进行封闭，200r/min的转速再进行离心20min，弃去上清液，沉淀物5℃下保存，即为纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体。
一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸的制备方法为：
步骤一：将样品吸收垫经处理液处理，所述处理液为PBS缓冲液，其中，PBS浓度为0.03mol/L，还含有1.2％的牛血清白蛋白，0.9％的海藻糖，1.1％的Tween20；
步骤二：纳米金结合垫制备方法：
(1)纳米金溶液的制备方法为：在100mL沸腾的质量浓度为0.035％氯金酸水溶液中加入5mL质量浓度为1.5％的柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为20nm的纳米金溶液，备用；
(2)纳米金标记抗体的制备方法为：调节纳米金溶液pH值到7.5-8.5，取纳米金溶液100mL，向其中加入50μg抗禽流感病毒的单链抗体，搅拌混合均匀后，再加入质量浓度为5％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为1％，以500r/min的转速离心15min，去除多余纳米金颗粒，再加入12％BSA至终浓度为1.5％进行封闭，200r/min的转速再进行离心20min，弃去上清液，沉淀物5℃下保存，即为纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体；
(3)将纯化的纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体以10μg/mm2的量均匀喷涂于尼龙纤维膜上，冷冻后经干燥处理，即为纳米金结合垫，备用；
步骤三：硝酸纤维素膜的包被方法为：在硝酸纤维素膜上用划膜仪依次在对应位置上划出检测线和质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠单克隆抗体，其包被量为25μg，所述检测线上包被有抗鸡禽流感特异性抗体，其包被量为35μg，备用；
步骤四：试纸的组装：将样品吸收垫、纳米金结合垫、检测垫、吸水垫按顺序粘贴在支撑板上，干燥处理后切成2mm宽的试纸条，包装封存，即为所述检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸。
实施例3：
一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸，所述试纸包括支撑板，粘贴在支撑板上的样品吸收垫、纳米金结合垫、检测垫、吸水垫；所述纳米金结合垫上包被有纳米金标记的抗鸡禽流感特异性抗体，所述特异性抗体为用噬菌体展示技术制备的抗禽流感病毒的单链抗体；所述检测垫为硝酸纤维膜或羧化纤维膜，且检测垫上设置有相互分离开的质控线和检测线，所述质控线上包被有羊抗鼠单克隆抗体为对照印记，所述检测线上包被有抗鸡禽流感特异性抗体为检测印记；所述特异性抗体为用噬菌体展示技术制备的禽流感病毒的单链抗体。
其中，所述用噬菌体展示技术制备的抗禽流感病毒的单链抗体的制备方法为：取分泌抗H7亚型流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞总RNA经基因重组配成单链可变抗体基因，再克隆植入噬菌粒载体细胞中，得到抗H7亚型流感病毒的抗体载体，经噬菌体感染后得到抗H7亚型流感病毒的噬菌体抗体库，再用H7亚型流感病毒抗原对其进行富集淘汰反应，洗去未结合的游离菌体，再用洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下来，如此反复筛选3轮，就可得到活性较高的与H7亚型流感病毒抗原结合的噬菌体克隆，再进行转化大肠杆菌进行诱导表达，得到所述抗禽流感病毒的单链抗体；所述样品吸收垫经处理液处理，所述处理液为PBS缓冲液，其中，PBS浓度为0.03mol/L，还含有1.2％的牛血清白蛋白，0.9％的海藻糖，1.1％的Tween20；所述禽流感病毒为高致病性的H7亚型禽流感病毒；所述试纸最上层覆盖有一层保护膜，其上印有标记线，以明确试纸的使用范围；所述的纳米金溶液的制备方法为：在100mL沸腾的质量浓度为0.04％氯金酸水溶液中加入5mL质量浓度为2％的柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为20nm的纳米金溶液；所述的纳米金标记抗体的制备方法为：调节纳米金溶液pH值到8.5，取纳米金溶液100mL，向其中加入50μg抗禽流感病毒的单链抗体，搅拌混合均匀后，再加入质量浓度为5％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为1％，以500r/min的转速离心15min，去除多余纳米金颗粒，再加入12％BSA至终浓度为1.5％进行封闭，200r/min的转速再进行离心20min，弃去上清液，沉淀物5℃下保存，即为纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体。
一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸的制备方法为：
步骤一：将样品吸收垫经处理液处理，所述处理液为PBS缓冲液，其中，PBS浓度为0.03mol/L，还含有1.2％的牛血清白蛋白，0.9％的海藻糖，1.1％的Tween20；
步骤二：纳米金结合垫制备方法：
(1)纳米金溶液的制备方法为：在100mL沸腾的质量浓度为0.04％氯金酸水溶液中加入5mL质量浓度为2％的柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为20nm的纳米金溶液，备用；
(2)纳米金标记抗体的制备方法为：调节纳米金溶液pH值到8.5，取纳米金溶液100mL，向其中加入50μg抗禽流感病毒的单链抗体，搅拌混合均匀后，再加入质量浓度为5％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为1％，以500r/min的转速离心15min，去除多余纳米金颗粒，再加入12％BSA至终浓度为1.5％进行封闭，200r/min的转速再进行离心20min，弃去上清液，沉淀物5℃下保存，即为纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体；
(3)将纯化的纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体以10μg/mm2的量均匀喷涂于尼龙纤维膜上，冷冻后经干燥处理，即为纳米金结合垫，备用；
步骤三：硝酸纤维素膜的包被方法为：在硝酸纤维素膜上用划膜仪依次在对应位置上划出检测线和质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠单克隆抗体，其包被量为30μg，所述检测线上包被有抗鸡禽流感特异性抗体，其包被量为40μg，备用；
步骤四：试纸的组装：将样品吸收垫、纳米金结合垫、检测垫、吸水垫按顺序粘贴在支撑板上，干燥处理后切成2mm宽的试纸条，包装封存，即为所述检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸。
临床统计试验：
本发明者收集100例鸡禽流感阳性样本，用本发明实施例2制备的试纸进行检测，结果显示全部为阳性，假阴性率为0，说明本发明可对鸡禽流感进行快速检测，结果准确，方法简单。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸，其特征在于，所述试纸包括支撑板，粘贴在支撑板上的样品吸收垫、纳米金结合垫、检测垫、吸水垫；所述纳米金结合垫上包被有纳米金标记的抗鸡禽流感特异性抗体，所述特异性抗体为用噬菌体展示技术制备的抗禽流感病毒的单链抗体；所述检测垫为硝酸纤维膜或羧化纤维膜，且检测垫上设置有相互分离开的质控线和检测线，所述质控线上包被有羊抗鼠单克隆抗体为对照印记，所述检测线上包被有抗鸡禽流感特异性抗体为检测印记；所述特异性抗体为用噬菌体展示技术制备的禽流感病毒的单链抗体。
2.如权利要求1所述的一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸，其特征在于，所述用噬菌体展示技术制备的抗禽流感病毒的单链抗体的制备方法为：取分泌抗H7亚型流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞总RNA经基因重组配成单链可变抗体基因，再克隆植入噬菌粒载体细胞中，得到抗H7亚型流感病毒的抗体载体，经噬菌体感染后得到抗H7亚型流感病毒的噬菌体抗体库，再用H7亚型流感病毒抗原对其进行富集淘汰反应，洗去未结合的游离菌体，再用洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下来，如此反复筛选3轮，就可得到活性较高的与H7亚型流感病毒抗原结合的噬菌体克隆，再进行转化大肠杆菌进行诱导表达，得到所述抗禽流感病毒的单链抗体。
3.如权利要求1所述的一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸，其特征在于，所述样品吸收垫经处理液处理，所述处理液为PBS缓冲液，其中，PBS浓度为0.03mol/L，还含有1.2％的牛血清白蛋白，0.9％的海藻糖，1.1％的Tween20。
4.如权利要求1所述的一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸，其特征在于，所述禽流感病毒为高致病性的H7亚型禽流感病毒。
5.如权利要求1所述的一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸，其特征在于，所述试纸最上层覆盖有一层保护膜，其上印有标记线。
6.如权利要求1所述的一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸，其特征在于，所述的纳米金溶液的制备方法为：在100mL沸腾的质量浓度为0.03％～0.04％氯金酸水溶液中加入5mL质量浓度为1-2％的柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为20nm的纳米金溶液。
7.如权利要求1所述的一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸，其其特征在于，所述的纳米金标记抗体的制备方法为：调节纳米金溶液pH值到7.5-8.5，取纳米金溶液100mL，向其中加入50μg抗禽流感病毒的单链抗体，搅拌混合均匀后，再加入质量浓度为5％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为1％，以500r/min的转速离心15min，去除多余纳米金颗粒，再加入12％BSA至终浓度为1.5％进行封闭，200r/min的转速再进行离心20min，弃去上清液，沉淀物5℃下保存，即为纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体。
8.如权利要求1所述的一种检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸，其特征在与，所述制备方法为：
步骤一：将样品吸收垫经处理液处理，所述处理液为PBS缓冲液，其中，PBS浓度为0.03mol/L，还含有1.2％的牛血清白蛋白，0.9％的海藻糖，1.1％的Tween20；
步骤二：纳米金结合垫制备方法：
(1)纳米金溶液的制备方法为：在100mL沸腾的质量浓度为0.03％～0.04％氯金酸水溶液中加入5mL质量浓度为1-2％的柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为20nm的纳米金溶液，备用；
(2)纳米金标记抗体的制备方法为：调节纳米金溶液pH值到7.5-8.5，取纳米金溶液100mL，向其中加入50μg抗禽流感病毒的单链抗体，搅拌混合均匀后，再加入质量浓度为5％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为1％，以500r/min的转速离心15min，去除多余纳米金颗粒，再加入12％BSA至终浓度为1.5％进行封闭，200r/min的转速再进行离心20min，弃去上清液，沉淀物5℃下保存，即为纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体；
(3)将纯化的纯化的纳米金标记的抗禽流感病毒的单链抗体以10μg/mm2的量均匀喷涂于尼龙纤维膜上，冷冻后经干燥处理，即为纳米金结合垫，备用；
步骤三：硝酸纤维素膜的包被方法为：在硝酸纤维素膜上用划膜仪依次在对应位置上划出检测线和质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠单克隆抗体，其包被量为20-30μg，所述检测线上包被有抗鸡禽流感特异性抗体，其包被量为30-40μg，备用；
步骤四：试纸的组装：将样品吸收垫、纳米金结合垫、检测垫、吸水垫按顺序粘贴在支撑板上，干燥处理后切成2mm宽的试纸条，包装封存，即为所述检测鸡禽流感的纳米金免疫层析试纸。
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