CN106795560A - 检测多种流感的试剂盒和使用其检测流感的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含单克隆抗体的检测多种流感的试剂盒和使用该试剂盒检测多种流感病毒的方法。更具体地，本发明涉及包含特异性结合A型、B型、H1亚型、H3亚型和H5亚型流感的单克隆抗体的检测多种流感的试剂盒，以及使用该试剂盒检测流感病毒的方法。包含根据本发明的单克隆抗体的检测多种流感的试剂盒可以同时检测A型和B型流感以及H1亚型、H3亚型和H5亚型流感，因此可用于快速和高灵敏地现场检测和诊断流感。

Description

检测多种流感的试剂盒和使用其检测流感的方法
技术领域
本发明涉及一种检测多种流感的试剂盒和使用该试剂盒检测多种流感病毒的方法。更具体地，本发明涉及包含特异性结合A型、B型、H1亚型、H3亚型和H5亚型流感的单克隆抗体的检测多种流感的试剂盒，以及使用该试剂盒检测流感病毒的方法。
背景技术
流感病毒是引起病毒性呼吸道疾病的病原体，基于它们的NP(核衣壳)和M(基质)蛋白的抗原差异而将其大致分为A型、B型和C型。其中，基于它们的HA(血凝素)蛋白的抗原性，可以将A型进一步分为H1至H15亚型，基于它们的NA蛋白的抗原特性，可以将A型进一步分为N1至N9亚型(参见Wiely DC和Skehel TT，Ann Rev Biochem，56：365-394,1987)。其中，H1、H2、H3、N1和N2亚型通常会在人类中引起疾病。出现在鸟类中的H和N抗原通常不会在人类中引起疾病，但是当病毒中发生遗传突变或当病毒与引起人类疾病的抗原交换基因时，其甚至可以变为能够在人类中引起疾病的类型。如果出现这种人类先前对其没有免疫力的新型流感病毒，那么其可能会引起全球范围的流行。
近年来，已经开发了用于检测这样的流感病毒的各种诊断试剂盒。特别是，随着由诸如猪流感的高致病性禽流感病毒所引起的死亡数量的迅速增加，人们需要用于早期诊断的快速诊断试剂盒。在诸如学校和工作地点等公共场所传播给许多非特定人群的疾病(如2009年的新型猪流感大流行)的情况下，需要在诊断时检疫早期感染者，以防止大流行，且需要快速和准确的早期检测系统。这样的系统是公共安全所必需的国家公共系统。用于现场诊断的快速诊断系统应当尺寸较小以便于携带，应该易于使用，并且应该提供用户界面以便用户较容易地操作。
用于诊断流感的三种主要常规方法是病毒培养测试、快速抗原测试和PCR测试。在这些方法中，作为传统诊断方法的病毒培养方法虽然准确，但其具有费时和复杂的局限，因此只能提供晚期诊断结果。另外，该方法也不能应用于治疗。此外，基于抗原—抗体反应以初步鉴别流感感染者的快速抗原测试法是一种仅需要约30分钟的方便且快速的测试，并且具有测试不需要额外的系统和技术人力的优点。然而，快速抗原测试的缺点在于，由于其仅检测A型和B型核蛋白，所以其灵敏度和准确度较低，因此可能导致错误诊断而引起患者死亡。因此，该方法难以应用于现场诊断。亚型流感的诊断成为能够预测对流感治疗药物的抗性的指数，并且指示流行病学上显著疾病的患病率。目前，仅通过RT-PCR对亚型流感诊断是可能的，但是昂贵，并且H1/A/B诊断试剂(SD有限公司)是用于抗原快速诊断的唯一试剂，其能够鉴定A型的亚型，而在世界范围内尚未开发和使用其他试剂。
已被用作猪流感诊断测试的实时PCR由于其高灵敏性和准确性而成为了感染性疾病诊断的最有效的手段。然而，其需要2～4小时的测试时间，因此可能不能用于现场诊断。基于这些原因，当由专业组织进行时，通常需要约2～3天的时间来确认测试结果。此外，该方法十分昂贵。因此，在预期感染性疾病大流行的时间点，该实时PCR不能用作国家范围内的最初措施。此外，感染各种鸟类(包括鸡、火鸡和野生鸟类)以及人类的禽流感迅速蔓延，具有各种致病性。因此，在高致病性禽流感发生的情况下，在世界上的大多数国家中已感染的鸟类被杀死。此外，由于不能出口鸡肉产品，发生高致病性禽流感的国家将遭受严重损失。
因此，本发明人进行了大量的努力以解决上述问题，最终，开发了一种流感检测试剂盒，其不仅能够检测A/B型流感的核蛋白，而且能够同时检测H1、H3和H5亚型流感的血凝素，而没有交叉反应，并且已发现使用开发的流感检测试剂盒甚至能够现场检测并且诊断甚至亚型流感(包括H5亚型禽流感)，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是为了提供除了A型和B型流感之外还能同时检测H1、H3和H5亚型流感的检测多种流感的试剂盒。本发明的另一个目的是提供使用所述检测多种流感的试剂盒检测流感的方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了包含第一检测条(strip)和第二检测条的检测多种流感的试剂盒，其中，所述第一检测条和第二检测条的每个包括样品垫、结合垫、信号垫和吸收剂垫，
其中，所述第一检测条的结合垫和信号垫包含能够分别特异性结合H3亚型流感、A型流感和B型流感的单克隆抗体，并且
其中，所述第二检测条的结合垫和信号垫包含能够分别特异性结合H1亚型流感和H5亚型流感的单克隆抗体。
本发明还提供了使用所述检测多种流感的试剂盒检测流感的方法。
附图说明
图1示出了多种流感抗原诊断系统的基本原理。在图1中，检测条A和检测条B分别表示第一检测条和第二检测条；
图2示出了制备的胶体金颗粒的光密度(O.D.)作为波长的函数；
图3是多种流感抗原诊断系统的示意图。在图3中，检测条A和检测条B分别表示第一检测条和第二检测条；
图4示出了包含样品垫、结合垫、NC膜(信号垫)和吸收垫的检测条的结构；
图5是示出了检测条结构和设备的示意图，其中，A和B分别表示第一检测条和第二检测条；
图6描述了流感检测试剂盒的照片，其示出了灵敏度作为多种流感抗原的浓度的函数；
图7描述了流感检测试剂盒的照片，其示出了在病毒的各种稀释因子下测试H5N3亚型病毒的检测限的结果；
图8描述了流感检测试剂盒的照片，其示出了在病毒的各种稀释因子下测试H5N2亚型病毒的检测限的结果；
图9描述了流感检测试剂盒的照片，其示出了测试具有各种亚型的H5亚型检测试剂盒的交叉反应的结果。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，本领域中公知且通常使用本文所用的术语。
在本发明中，所制备的流感检测试剂盒包含：第一检测条，其包含特异性结合H3亚型流感、A型流感和B型流感的单克隆抗体；以及第二检测条，其包含特异性结合H1亚型流感和H5亚型流感的单克隆抗体。为了检验流感检测试剂盒是否可以有效地检测甚至A型流感，H1、H3和H5亚型流感，可以评价试剂盒的灵敏度和特异性，并且进行了交叉反应测试。结果发现，与只能检测A型和B型的其他公司的试剂盒相比，本发明的流感检测试剂盒具有更高的灵敏度，并且它可以甚至有效地检测H1、H3和H5亚型。
因此，一方面，本发明涉及检测多种流感的试剂盒，其包含第一检测条和第二检测条，其中，第一检测条和第二检测条的每个包含样品垫、结合垫、信号垫和吸收垫，其中，所述第一检测条的结合垫和信号垫包含能够分别特异性结合H3亚型流感、A型流感和B型流感的单克隆抗体，并且其中，所述第二检测条的结合垫和信号垫包含能够分别特异性结合H1亚型流感和H5亚型流感的单克隆抗体。
在本发明中，包括在第一检测条的结合垫和信号垫中并特异性结合H3亚型流感的单克隆抗体可以是特异性结合H3亚型流感的血凝素的单克隆抗体；特异性结合A型流感的单克隆抗体可以是特异性结合A型流感的核蛋白的单克隆抗体；并且特异性结合B型流感的单克隆抗体可以是特异性结合B型流感的核蛋白的单克隆抗体。
此外，包括在第二检测条的结合垫和信号垫中并特异性结合H1亚型流感的单克隆抗体可以是特异性结合H1亚型流感的血凝素的单克隆抗体；并且特异性结合H5亚型流感的单克隆抗体可以是特异性结合H5亚型流感的血凝素的单克隆抗体。
在本发明中，第一检测条的结合垫可以包含：特异性结合H3亚型流感的血凝素的单克隆抗体NCCP.76024、特异性结合A型流感的核蛋白的单克隆抗体7307SPTN-5以及特异性结合B型流感的核蛋白的单克隆抗体9901SPTNE-10。
此外，第一检测条的信号垫可以包含：特异性结合H3亚型流感的血凝素的单克隆抗体NCCP.76024、特异性结合A型流感的核蛋白的单克隆抗体A60010044P以及特异性结合B型流感的核蛋白的单克隆抗体10-I55B。
在本发明中，第二检测条的结合垫可以包含：特异性结合H1亚型流感的血凝素、并含有包含SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的重链可变区以及包含SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的轻链可变区的单克隆抗体；以及特异性结合H5亚型流感的核蛋白的单克隆抗体3H5N-15A6。
此外，第二检测条的信号垫可以包含：特异性结合H1亚型流感的血凝素、并含有包含SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的重链可变区以及包含SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的轻链可变区的单克隆抗体；以及特异性结合H5亚型流感的核蛋白的单克隆抗体3H5N-15A6。
根据本发明的流感检测试剂盒包括第一检测条和第二检测条，其中，第一检测条和第二检测条的每个包含样品垫、结合垫、信号垫和吸收垫的集合。样品垫用于快速吸收待分析的样品(血清、血液或唾液)；结合垫用于沉积有色胶体金和抗体的偶联物，以可视地检测信号；信号垫用于通过物理吸附方法固定抗体，使得在抗原—抗体反应后出现信号；并且吸收垫用于提供驱动力，使得样品在添加后通过毛细管作用向上发展(develop)。
基于它们的可溶性核蛋白(NP)的抗原性，将流感病毒分类为A型、B型和C型流感。基于存在于其表面上的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白的抗原性，将A型流感进一步分类为H亚型和N亚型。在本发明的一种实例中，为了单独检测每种亚型流感，使用特异性结合病毒中不同核蛋白的单克隆抗体来检测A型和B型流感病毒，使用特异性结合病毒表面上不同血凝素的单克隆抗体来检测H1、H3和H5亚型流感。如下面实施例2的表1所示，本发明人制备了用于H1亚型的单克隆抗体，其他类型的单克隆抗体购自韩国疾病控制和预防中心，HyTest Ltd.，Biospacific，Inc.，Fitzgerald Ltd.，Medix Ltd.等，然后引入本发明的流感检测试剂盒中，但本发明的范围并不限于此。
在本发明中，第一检测条的纵向轴线可以平行于第二检测条的纵向轴线设置；包含在第一检测条和第二检测条的结合垫中的单克隆抗体可以作为与标记物的偶联物存在；并且包含在信号垫中的单克隆抗体可以以测试线的形式被固定。此外，在本发明中，与包含在结合垫中的单克隆抗体结合的标记物可以是胶体金。
第一检测条的纵向轴线平行于第二检测条的纵向轴线设置的意思是如图5所示的第一检测条和第二检测条彼此并置，它们的纵向轴线彼此接近布置。在本发明的实施方式中，当抗体—标记物偶联物结合至抗原并移动至信号垫上，然后其结合至信号垫的固定测试线抗体上时，将胶体金用作通过显色来发出信号的标记物。除了胶体金外，可以使用酶作为标记物，例如辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶(Arthromyces ramosus peroxidase)、葡萄糖氧化酶、脲酶、青霉素氧化酶和胆固醇氧化酶。此外，可以使用金属离子如Co2+、Cu2+、Mg2+和Fe2+或它们的化合物。含有酶的底物的溶液包含用于显色的底物组分和化学发光组分(例如鲁米诺)，用于产生电化学信号的底物组合物或银化合物，并且示出了来自用于通过酶—底物反应或化学反应的信号：显色、变色、发光的信号、电导率的变化、电流变化或电压变化。
在本发明中，第一检测条的信号垫的测试线可以包括H3亚型流感测试线、A型流感测试线和B型流感测试线，它们从靠近样品垫的一侧以此顺序固定，并且第二检测条的信号垫的测试线可以包括H1亚型流感测试线和H5亚型流感测试线，它们从靠近样品垫的一侧以此顺序固定。
在本发明中，第一检测条和第二检测条的每个中的信号垫还可以包含与用作确认样品显影对照的特异性结合小鼠抗体C的抗体。具体地，可以将与小鼠抗体C特异性结合的抗体固定为离样品垫距离最远处的测试线。
具体地，第一检测条的信号垫的H3亚型流感测试线可以位于距离信号垫下端0.7～1.1cm处；第一检测条的信号垫的A型流感测试线可以位于距离信号垫下端1.1～1.5cm处；第一检测条的信号垫的B型流感测试线可以位于距离信号垫下端1.5～1.9cm处；并且第一检测条的信号垫的小鼠抗体C测试线可以位于距离信号垫下端1.9～2.3cm处。此外，第二检测条的信号垫的H1亚型流感测试线可以位于距离信号垫下端0.6～1.2cm处；第二检测条的信号垫的H5亚型流感测试线可以位于距离信号垫下端1.2～1.8cm处；并且第二检测条的信号垫的小鼠抗体C测试线可以位于距离信号垫下端1.8～2.4cm处。然而，本发明的范围并不限于此。
更具体地，第一检测条的信号垫的H3亚型流感测试线可以位于距离信号垫下端0.9cm处；第一检测条的信号垫的A型流感测试线可以位于距离信号垫下端1.3cm处；第一检测条的信号垫的B型流感测试线可以位于距离信号垫下端2.1cm处；并且第一检测条的信号垫的小鼠抗体C测试线可以位于距离信号垫下端2.1cm处。此外，第二检测条的信号垫的H1亚型流感测试线可以位于距离信号垫下端0.9cm处；第二检测条的信号垫的H5亚型流感测试线可以位于距离信号垫下端1.5cm处；并且第二检测条的信号垫的小鼠抗体C测试线可以位于距离信号垫下端2.1cm处。
如本文所用，“小鼠抗体C”中的“C”是指用于确认样品显影的小鼠抗体对照。
在本发明的实施方式中，在第一检测条中，H3亚型流感测试线、A型流感测试线、B型流感测试线和小鼠抗体C测试线从靠近样品垫的一侧以此顺序固定，并且在第二检测条中，H1亚型流感测试线、H5亚型流感测试线和小鼠抗体C测试线从靠近样品垫的一侧以此顺序固定，从而避免抗体的交叉反应。
如在本发明的实施例中所发现的，在用于检测A型流感的反应中可检测到H5亚型的阳性信号，而在用于检测H5亚型流感的反应中没有检测到其它流感类型的阳性信号。为此，将用于检测A型流感和H5亚型流感的抗体置于不同的检测条中，以避免交叉反应。此外，可以发现根据本发明的流感检测试剂盒特别是对H5亚型具有高灵敏度和特异性。
另一方面，本发明涉及检测流感的方法，该方法使用包含单克隆抗体的本发明的检测多种流感的试剂盒。
实施例
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。对本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅以说明为目的，而不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同范围所限定。
实施例1：胶体金的制备
1-1：胶体金的制备
通过用柠檬酸盐还原HAuCl4制备胶体金。具体地，打开安装在加热套上的10升三颈烧瓶的一个颈部，通过打开的颈部小心地向烧瓶中加入1.98L三重蒸馏水，然后向其中加入0.4mL 5％氯化金并在搅拌下加热至95℃。此时，以中等速度进行搅拌。当使用储备溶液时，由于其以冷冻状态储存，因此应当在完全溶解后充分搅拌。此外，由于氯化金在与金属材料接触时会被立即氧化，因此使用塑料铲称量氯化金。用连接到烧瓶上的冷却器收集蒸发的蒸汽，以使反应溶液的量保持在恒定水平。此时，溶液为浅黄色。
当溶液达到95℃或更高的温度时，搅拌速度加快到尽可能高的速度。然后，使用注射器或移液管将预先制备的包含20mL 5％柠檬酸钠溶液、0.1mL 25mM K2CO3和0.1mL 1％鞣酸的混合物快速注入到烧瓶中。由于打开的烧瓶的颈部非常热，因此应该小心，要尽可能快地加入混合物，以防止蒸汽损失。反应溶液的颜色立即变为黑色，然后变为红色，随着时间的流逝其颜色变得更深，然后稳定为紫色(葡萄酒颜色)。随后，降低搅拌速度，将溶液进一步搅拌约20分钟，然后停止加热。
最后，在溶液冷却后，用分光光度计在500～600nm的波长扫描溶液。结果，在520nm处形成的峰对应于0.8的O.D.值(图2)。
1-2：制备胶体金的注意事项
应该用非金属设备处理HAuCl4，并且应该用非金属洗涤器洗涤用于制备胶体金溶液的设备。此外，在添加HAuCl4溶液期间，叶轮的旋转速度是重要的，并且每次应该尽可能快地添加HAuCl4溶液。这是因为当溶液的添加速度缓慢时，反应会停止，并且在这种情况下，溶液的颜色不会由深蓝色发生变化。此外，应使用去离子水(DIW)处理过的容器处理金溶液。另外，金溶液应存储于棕色瓶中并存放于暗处。该实验所使用的水是三重蒸馏水，因此不需要灭菌，但应通过孔径为0.2μm的滤纸过滤，从而使金颗粒以外的颗粒物质不会掺入金溶液中。
实施例2：抗体—胶体金偶联物的制备
2-1：筛选和纯化用于检测H1亚型流感的抗体
购买了A型、B型、H3亚型和H5亚型流感的特异性抗体，并且本发明人制备了H1亚型特异性抗体。
为了筛选用于检测H1亚型流感病毒的抗体，采用本领域已知的杂交瘤细胞系制备方法(Kohler,G.和Milstein,C,.1975；Kozbar等人，1983)由2009年猪流感病毒抗原免疫制备抗体库。简言之，通过腹腔注射来使用猪流感病毒免疫6～8周龄的小鼠，并提取脾脏。从脾脏获得单细胞，并与骨髓瘤细胞温育，以制备杂交瘤细胞系。重复克隆制备的杂交瘤细胞系，直到获得稳定的单克隆细胞系，由此制备产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系。在杂交瘤细胞系中产生的抗体中，筛选对H1亚型流感病毒具有亲和力的抗体。
采用ELISA方法来筛选用于检测H1亚型流感病毒的抗体。使用SRID的标准抗体(A/Brisbane/59/2007(IVR-148)；NIBSC批号10/120)作为捕获抗体，通过用一种流感病毒感染MDCK细胞制备的样品上清液(A/Brisbane/59/2007(IVR-148))用作抗原。
将用于SRID的标准抗体和用IVR-148感染的培养上清液依次涂抹在96孔板上，然后用流感抗体库的每种抗体处理，从而筛选对IVR-148病毒具有亲和力的抗体。接下来，通过本领域已知的IgG纯化方法纯化每种抗体，以便在建立第二次筛选和ELISA条件中使用抗体。
在纯化抗体后，分析对H1亚型流感病毒蛋白显示高结合亲和力的SF587和SF757Fab片段的可变轻链和可变重链的氨基酸序列(表1)。
表1：SF587和SF757抗体的氨基酸序列
(下划线和粗体部分表示CDR区)
2-2：抗体—胶体金偶联物的制备
采用下述方式制备抗体—胶体金偶联物。首先，通过向其中加入0.1M碳酸盐缓冲液，将40nm金胶体调节至适合偶联物的pH值8.0。然后，用10mM硼酸盐缓冲液将与H1、H3、H5、A和B流感中的每一种特异性结合的单克隆抗体稀释至0.1mg/mL的浓度。然后将100μL抗体溶液以0.1mg/mL的浓度加入到1mL的胶体金溶液中，并轻轻摇动30分钟进行反应。反应30分钟后，向抗体—胶体金溶液中加入100μL 10％BSA(牛血清白蛋白)至终浓度为1％，轻轻振荡温育30分钟。
为了回收形成的抗体—胶体金偶联物，将溶液在4℃下以13,000rpm离心5分钟。然后，除去1mL上清液，并将沉淀物(抗体—胶体偶联物)重悬浮于剩余的上清液中并收集在一个管中，并向其中加入1mL的1％BSA/10mM硼酸盐，随后在4℃下以1,3000rpm离心5分钟。最后，完全除去上清液，用50μL 1％BSA/10mM硼酸盐再水化沉淀物(抗体—胶体偶联物)，并以20倍浓缩。最终，获得抗体—胶体偶联物。
实施例3：第一检测条和第二检测条的制造和组装
3-1：制造第一检测条和第二检测条中各自的信号垫
为了建立期望的可检测抗体浓度并通过物理吸附法将抗体固定到信号垫上，使用分配器将特异性结合H3亚型流感、A型流感和B型流感的单克隆抗体分别绘制为距离第一检测条的信号垫下端0.9cm、1.3cm和1.7cm的线。此外，作为用于确认样品向上发展的对照，通过使用分配器在距离信号垫下端2.1cm处绘制与小鼠抗体特异性结合的抗体的线。然后，将抗体在37℃下温育过夜，从而使其固定至信号垫上。
类似地，使用分配器将特异性结合H1和H5亚型流感的单克隆抗体分别绘制为距离第二检测条的信号垫下端0.9cm和1.5cm的线。此外，作为用于确认样品向上发展的对照，通过使用分配器在距离第二检测条的信号垫下端2.1cm处绘制与小鼠抗体特异性结合的抗体的线。然后，将抗体在37℃下温育过夜，从而使其固定至信号垫上。
下表2示出了固定于信号垫并特异性结合流感类型的单克隆抗体的种类。
表2：固定至信号垫的单克隆抗体
名称 供应来源 目录号
H1 内部生产 -
H3 疾病控制和预防中心 NCCP.76024
H5 Hytest 3H5N-15A6
A Biospacific A60010044P
B Fitzgerald 10-I55B
3-2：制造第一检测条和第二检测条中各自的结合垫
为了制备包含抗体—胶体金偶联物的结合垫，使用将垫完全浸泡在偶联物溶液中的浸泡方法。为了制备用于第一检测条的结合垫，将通过由40nm金胶体与特异性结合H3亚型流感、A型流感和B型流感的每一种的单克隆抗体结合而获得的偶联物与海藻糖混合至终浓度为5％，将用于第一检测条的结合垫用混合物浸泡，随后冷冻干燥1小时，从而将抗体—胶体金偶联物沉积在结合垫上。
为了制备用于第二检测条的结合垫，将通过由40nm金胶体与特异性结合H1和H5亚型流感的每一种的单克隆抗体结合而获得的偶联物与海藻糖混合至终浓度为5％，并将用于第二检测条的结合垫用混合物浸泡，随后冷冻干燥1小时，从而将抗体—胶体金偶联物沉积在结合垫上。
下表3示出了结合至胶体金顶部形成偶联物并特异性结合流感类型的单克隆抗体的种类。
表3：与胶体金结合以形成偶联物的单克隆抗体
名称 供应来源 目录号
H1 内部生产 -
H3 疾病控制和预防中心 NCCP.76024
H5 Hytest 3H5N-15A6
A Medix 7307 SPTN-5
B Medix 9901 SPTNE-10
3-3：第一检测条和第二检测条的组装
第一检测条和第二检测条各自由吸收垫、信号垫、结合垫和样品垫组成。将结合垫附着至信号垫的下端，并将样品垫附着至已附着的结合垫上。将吸收垫附着至信号垫的上端，以此组装每个检测条(图3和图4)。使用切割器以3.9mm的间隔精确地切割每个组装的检测条，并用盒子(图5)组装切割的检测条，以暴露包括结合垫和样品垫的部分。第一检测条和第二检测条平行地放置，使它们的长轴彼此平行。
实施例4：在各种抗体浓度下的灵敏度
用样品提取物稀释每种标准抗原(H1、H3、H5、A和B)，并将180μL稀释液加到组装的检测条的样品入口，并使其静置15分钟，随后观察由抗原—抗体反应引起的信号。在不同浓度的H1、H3、H5、A和B抗原下进行实验，结果，在高达50ng/mL的浓度下观察到信号(图6)。
实施例5：多种流感抗原快速测试(Green Cross Medical ScienceCorp.)快速诊断试剂的灵敏度和特异性
据报道，迄今在韩国开发的流感检测试剂的灵敏度在31.3至91.4％之间。
在本实施例中，将能够鉴定亚型的本发明的商品化流感检测试剂盒多种流感抗原快速测试(Green Cross Medical Science Corp.)与韩国和其他国家开发的各种快速抗原测试以及称为流感验证测试的PCR测试进行比较，以评价其性能，并与已被广泛使用的外国产品的性能进行比较。
下表4示出了多种流感抗原快速测试(Green Cross MedicalScience Corp)和其他公司的试剂之间对A型和B型流感的灵敏度的比较。从中可以看出，多种流感抗原快速测试(Green Cross Medical Science Corp)快速诊断试剂的灵敏度比目前市售产品(平均54.22％)的灵敏度高约15％。
表4：多种流感抗原快速测试(Green Cross Medical ScienceCorp)和其他公司的流感诊断试剂的流感检测灵敏度比较
n＝样本数
下表5示出了对A型流感亚型的灵敏度的比较。从中可以看出，多种流感抗原快速测试(Green Cross Medical Science Corp)的H1灵敏度为65.38％，其高于流感Ag A/B/A(H1N1/2009)(SD，26.92％)，并且其H3灵敏度良好，达到了70.83％，即使由于没有H1的商购产品而与其他产品不可比。此外，多种流感抗原快速测试(Green Cross Medical Science Corp)的H1和H3灵敏度分别为99.32％和98.41％。
表5：多种流感抗原快速测试(Green Cross Medical ScienceCorp)与其他公司诊断试剂盒的亚型流感检测灵敏度比较
n＝样本数
实施例6：用于H5流感抗原测试的多种流感抗原快速测试试剂盒的临床有用性评价
6-1：用于检测H5亚型的诊断试剂盒的灵敏度
为了检验本发明的试剂盒对H5亚型禽流感病毒的检测限，进行了两种H5亚型(H5N3和H5N2)的灵敏度测试。通过血细胞凝集单位(HA单位)的比较来进行灵敏度测试。具体地，将含有128个HA单位的H5N3或H5N2亚型流感病毒从1/2至1/256或从1/4至1/128连续稀释两倍，并使其与试剂盒反应。
使用H5N3亚型病毒进行测试的结果表明，在用于检测H亚型流感病毒的反应中，本发明的试剂盒在1HA单位或更低的病毒浓度时为阴性，而在病毒浓度为2个HA单位及更高时为阳性(表6和图7)。此外，在A型流感病毒的检测反应中，与H亚型检测测试的结果相似，试剂盒在病毒浓度为2HA单位或更高时为阳性。然而，在用于检测B型流感病毒的反应以及用于检测H1和H3亚型的反应中，试剂盒甚至在64HA单位的病毒浓度仍然为阴性。
表6：用于H5亚型检测的诊断试剂盒的检测限的测试(使用H5N3亚型病毒进行测试的结果)
病毒浓度 稀释因子 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
测试结果 HA单位 64 32 16 8 4 2 1 0.5
A + + + + + + - -
B - - - - - - - -
H1 - - - - - - - -
H3 - - - - - - - -
H5 + + + + + + - -
使用H5N2亚型病毒进行测试的结果也类似于使用H5N3亚型流感病毒进行测试的结果。具体地，使用H5N2亚型流感病毒进行测试的结果表明，在用于检测H亚型流感病毒的反应中，当病毒浓度为2个HA单位或更高时，本发明的试剂盒为阳性。另外，在A型流感病毒的检测反应中，与H亚型检测测试的结果(表7和图8)相似的，本发明的试剂盒在病毒浓度为2个HA单位或更高时为阳性。然而，在用于检测B型流感病毒的反应以及用于检测H1和H3亚型的反应中，本发明的试剂盒甚至在64HA单位的病毒浓度仍然为阴性。
表7：用于H5亚型检测的诊断试剂盒的检测限的测试(使用H5N2亚型病毒进行测试的结果)
病毒浓度 稀释因子 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
检测结果 HA单位 64 32 16 8 4 2 1 0.5
A + + + + + + - -
B - - - - - - - -
H1 - - - - - - - -
H3 - - - - - - - -
H5 + + + + + + - -
对H5亚型检测限的测试结果表明，本发明的试剂盒在病毒浓度为1个HA单位或者更低时对H5N3亚型和H5N2亚型病毒均为阴性，而在病毒浓度为2个HA单位或更高时为阳性。这表明本发明的试剂盒的所有反应在病毒浓度为2个HA单位或者更高时为阳性。
6-2:与其他流感病毒H亚型交叉反应的检验
为了检验H5亚型检测试剂盒是否与流感病毒的其他H亚型交叉反应，测试试剂盒与A型流感病毒的各种亚型的反应性。在测试中，使用了从鸟类中分离出的46种亚型流感病毒株。具体地，使用46株中的总共8种H亚型(H1(2株)、H4(1株)、H5(6株)、H6(12株)、H7(12株)、H9(10株)、H11(2株)和H12(1株))。在测试中使用的病毒具有约16～64HA单位的滴度(titer)。
该测试结果表明，在检测H5亚型流感病毒的反应中，本发明的试剂盒对于总共6种H5亚型流感病毒(H5N2(No.2)、H5N2(No.14)、H5N3(No.20)、H5N3(No.23)、H5N2(No.33)和H5N3(No.44))为阳性，但不与流感病毒的其他亚型反应。另外，在用于检测A型流感病毒的反应中，本发明的试剂盒对于测试中使用的所有禽流感病毒亚型为阳性。在检测H1亚型的反应中，试剂盒仅对H1的H1N1(NO.1)和H1N1(NO.11)亚型为阳性，并且不与其他亚型的病毒反应。上述结果表明，本发明的试剂盒仅与流感病毒的各种亚型中的H5亚型反应，而不与流感病毒的其他亚型交叉反应，表明该试剂盒对流感病毒的H5亚型具有特异性(表8和图9)。
表8：H5亚型检测试剂盒与多种亚型交叉反应的测试结果
*？：没有准确鉴定其亚型的病毒。
工业实用性
如上所述，包含根据本发明的单克隆抗体的检测多种流感的试剂盒可以同时检测A型和B型流感以及H1、H3和H5亚型流感，因此可用于快速且高灵敏地现场检测和诊断流感。
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序列表
<110> 株式会社绿十字MS
<120> 多流感检测试剂盒和使用其检测流感的方法
<130> 1594
<150> KR 10-2014-0085147
<151> 2014-07-08
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SF587 重链可变区
<400> 1
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Asp
20 25 30
Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
35 40 45
Gly Ile Leu Gly Gly Gly Glu Arg Ser Tyr Tyr Asn Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Lys Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg His Gly Ser Ser Gly Tyr Val Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SF587 轻链可变区
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Asp Asn
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Val Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Ser Asn Tyr Pro Met
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SF757 重链可变区
<400> 3
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Asp
20 25 30
Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
35 40 45
Gly Ile Leu Gly Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Lys Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg His Ser Trp Gly Ala Tyr Val Gln Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SF757 轻链可变区
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Asn Lys Gly Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110

Claims (12)

1.一种检测多种流感的试剂盒，包含第一检测条和第二检测条，
其中，所述第一检测条和所述第二检测条的每个包含样品垫、结合垫、信号垫和吸收垫，
其中，所述第一检测条的结合垫和信号垫包含能够分别特异性结合H3亚型流感、A型流感和B型流感的单克隆抗体，并且
其中，所述第二检测条的结合垫和信号垫包含能够分别特异性结合H1亚型流感和H5亚型流感的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的检测多种流感的试剂盒，其中，包括在所述第一检测条的结合垫和信号垫中并与H3亚型流感特异性结合的单克隆抗体是特异性结合H3亚型流感的血凝素的单克隆抗体；特异性结合A型流感的单克隆抗体是特异性结合A型流感的核蛋白的单克隆抗体；并且特异性结合B型流感的单克隆抗体是特异性结合B型流感的核蛋白的单克隆抗体，并且
其中，包括在所述第二检测条的结合垫和信号垫中并与H1亚型流感特异性结合的单克隆抗体是特异性结合H1亚型流感的血凝素的单克隆抗体；并且特异性结合H5亚型流感的单克隆抗体是特异性结合H5亚型流感的血凝素的单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的检测多种流感的试剂盒，其中，所述第一检测条的结合垫包含：特异性结合H3亚型流感的血凝素的单克隆抗体NCCP.76024、特异性结合A型流感的核蛋白的单克隆抗体7307SPTN-5以及特异性结合B型流感的核蛋白的单克隆抗体9901SPTNE-10，并且
其中，所述第一检测条的信号垫包含：特异性结合H3亚型流感的血凝素的单克隆抗体NCCP.76024、特异性结合A型流感的核蛋白的单克隆抗体A60010044P以及特异性结合B型流感的核蛋白的单克隆抗体10-I55B。
4.根据权利要求1所述的检测多种流感的试剂盒，其中，所述第二检测条的结合垫包含：特异性结合H1亚型流感的血凝素的单克隆抗体，并且该单克隆抗体包含具有SEQ IDNO：1或3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的轻链可变区；以及特异性结合H5亚型流感的核蛋白的单克隆抗体3H5N-15A6，并且
其中，所述第二检测条的信号垫包含：特异性结合H1亚型流感的血凝素的单克隆抗体，并且该单克隆抗体包含具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ IDNO：2或4的氨基酸序列的轻链可变区；以及特异性结合H5亚型流感的核蛋白的单克隆抗体3H5N-15A6。
5.根据权利要求1所述的检测多种流感的试剂盒，其中，所述第一检测条的纵向轴线平行于所述第二检测条的纵向轴线设置。
6.根据权利要求1所述的检测多种流感的试剂盒，其中，所述第一检测条和所述第二检测条的结合垫包含一类偶联物，该偶联物包含单克隆抗体以及与其结合的标记物，并且所述信号垫包含分别以测试线的形式固定的单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的检测多种流感的试剂盒，其中，所述结合垫中包含的与所述单克隆抗体结合的标记物为胶体金。
8.根据权利要求6所述的检测多种流感的试剂盒，其中，所述第一检测条的信号垫的测试线包含H3亚型流感测试线、A型流感测试线以及B型流感测试线，所述H3亚型流感测试线、所述A型流感测试线以及所述B型流感测试线从靠近所述样品垫的一侧以此顺序固定，并且所述第二检测条的信号垫的测试线包含H1亚型流感测试线以及H5亚型流感测试线，所述H1亚型流感测试线以及所述H5亚型流感测试线从靠近所述样品垫的一侧以此顺序固定。
9.根据权利要求8所述的检测多种流感的试剂盒，其中，所述第一检测条和所述第二检测条的每个中的信号垫还包含与小鼠抗体C特异性结合的抗体，所述抗体用作确认所述样品显影的对照。
10.根据权利要求9所述的检测多种流感的试剂盒，其中，与小鼠抗体C特异性结合的抗体作为测试线固定在距离所述样品垫的最远处。
11.根据权利要求9所述的检测多种流感的试剂盒，其中，所述第一检测条的信号垫的H3亚型流感测试线位于距离所述信号垫下端0.7～1.1cm处；所述第一检测条的信号垫的A型流感测试线位于距离所述信号垫下端1.1～1.5cm处；所述第一检测条的信号垫的B型流感测试线位于距离所述信号垫下端1.5～1.9cm处；并且所述第一检测条的信号垫的小鼠抗体C测试线位于距所述信号垫下端1.9～2.3cm处，并且，其中，所述第二检测条的信号垫的H1亚型流感测试线位于距离所述信号垫下端0.6～1.2cm处；所述第二检测条的信号垫的H5亚型流感测试线位于距离所述信号垫下端1.2～1.8cm处；并且所述第二检测条的信号垫的小鼠抗体C测试线位于距离所述信号垫下端1.8～2.4cm处。
12.一种使用权利要求1所述的检测多种流感的试剂盒检测流感的方法。
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