CN101821290B - 流感病毒血细胞凝集素特异性单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及流感病毒血细胞凝集素特异性单克隆抗体,其识别在A型流感病毒血细胞凝集素的亚型H1和H3上以及在B型流感病毒血细胞凝集素上都存在的抗原结构。在B型流感病毒内,抗原结构存在于属于组B/Victoria和/或组B/Yamagata的B型流感病毒血细胞凝集素上。
Description
本发明涉及识别在A型流感病毒和B型流感病毒血细胞凝集素上都存在的糖基化抗原结构的单克隆抗体,及其用于诊断或治疗目的或用于纯化目的的用途。
存在负责人和动物中的传染性病变(pathology)的3种类型的流感病毒(A、B和C型)。目前,A型和B型病毒是负责在人中观察到的流感流行和大流行的因子。
主要在人和鸟中传播的A型病毒根据血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原结构再分成亚型,所述HA和NA是病毒包膜的主要组成成分。区分了16种HA亚型(H1至H16)和9种NA亚型(N1至N9)。A型病毒亚型通过它携带的HA亚型和NA亚型限定。H1N1和H3N2病毒亚型是目前在人中传播的那些。担心在鸟中传播的H5N1亚型或H7N1亚型将适应于人并且负责新的大流行。在1957和1968年之间在人中传播的H2N2亚型可能再次出现,并且也负责在小于40岁的个体中的大流行,并非毫无可能。
B型病毒毒株严格地是人的。在B型毒株内在HA中的抗原变异比在A型毒株内观察到的那些更弱。自20世纪70年代以来分离的B型毒株根据HA的遗传序列分成2个不同的系统发育和抗原组(LindstromSE,Journal of Virology,1999,第4413-4426页)。B/Victoria/2/87(B/Victoria)是第一个组的主要毒株,而B/Yamagata/16/88(B/Yagamata)是第二个组的主要毒株。在20世纪80年代分离的B型病毒毒株特别属于B/Victoria组,而在20世纪90年代分离的毒株特别属于B/Yamagata组。在1994年,B/Victoria组在中国再度出现,并且从那时起,属于2个组的B型毒株已在相同流感季节期间分离出(Nakagawa N等人,Journal of Medical Virology,2001,第745-750页)。
流感病毒HA以其天然形式是具有约220,000道尔顿分子量的三聚糖蛋白。对它实施强“选择压力”,因此具有下述表现:
-在其结构中的主要变异,导致“抗原性转变”。这些现象在A型病毒中观察到,并且负责具有新HA亚型的重排列(reassortant)病毒的出现。这些重排列病毒可能负责在人或动物中新的大流行;
-主要由于点突变在其结构中的次要变异,导致“抗原性漂移”。这些现象在A型病毒和B型病毒中都观察到。它们负责可触发在大流行时期间过程中流行或散发性流感病灶的新病毒毒株的出现。
流感病毒HA还包含众多糖基化位点(在H1和H3亚型上的7和9之间)。糖基化链借助于N-糖苷键与蛋白质结构连接,所述N-糖苷键使蛋白质序列的天冬酰胺与糖链的N-乙酰葡糖胺连接。根据其糖组成常规地区分2种类型的糖基化链:I型糖基化链基本上包含N-乙酰葡糖胺、甘露糖、半乳糖和岩藻糖,并且II型糖基化链基本上包含甘露糖和N-乙酰葡糖胺。HA的N-糖基化借助于多萜醇磷酸来执行,所述多萜醇磷酸将下述寡糖序列:(葡萄糖)3-(甘露糖)9-(N-乙酰葡糖胺)2作为区段(block)转移到天冬酰胺上,所述天冬酰胺在蛋白质链中的Asn-X-Ser/Thr型共有序列中(Virology,133,77-91(1984))。在区段中转移的寡糖序列具有以下述方式示意性表示的三触角构型:
如由Mir-Shekari S.Y.等人(Journal of biological Chemistry,272,4027-4036(1997)显示的,转移的最初三触角序列随后根据其在HA蛋白质链上的锚定位点个别经历转换过程。糖基化结构最后可以是二触角、三触角或四触角结构,在每个触角上具有较少或较多数目的糖。
为了预防流感流行,每年制备包含属于不同亚型(目前是H1N1和H3N2亚型)的2种A型病毒毒株和B型病毒毒株的疫苗。所使用的疫苗株考虑到从一年到另一年在HA蛋白质序列水平上已发生并且负责新流行疫源地出现的变异。使用非常精确的诊断工具,特别是借助于非常特异性地揭示观察到的变异的单克隆抗体,鉴定且表征这些新毒株。这些单克隆抗体具有非常窄的特异性,因为它们一般识别单个病毒毒株的HA。它们是“毒株”特异性的。
也存在具有称为“亚型”特异性的更广泛特异性的单克隆抗体用于表征A型病毒。在它们识别具有相同HA亚型的病毒毒株的HAs但并非另一个亚型病毒毒株的HAs范围内,它们是“亚型”特异性的。特别存在对于H1亚型或对于H3亚型特异的单克隆抗体。识别属于H1N1和H2N2亚型的流感病毒的HAs两者的交叉反应性单克隆抗体已在US 5,589,174中报告。
关于针对B型病毒HA的单克隆抗体,N.Nakagawa已描述了针对属于2个组B/Victoria和B/Yagamata的毒株的HA的一组单克隆抗体。单克隆抗体10B8、8E6、1H12、2H12和9E10识别在1996和1997之间分离的属于B/Victoria组的B型病毒毒株的HA,而不识别在这个相同时间段分离且属于B/Yamagata组的B型病毒毒株的HA(Nakagawa N等人,Journal of Virological methods(1999),113-120)。通过用属于B/Victoria组的B/Nagasaki/1/87毒株免疫接种小鼠获得这些单克隆抗体。也已描述了在用B/Mie/1/93毒株(其属于B/Yagamata组)免疫接种小鼠后获得的单克隆抗体1B2、5B1、5H4、7H11、8B3和9G6,其识别属于B/Yamagata组的B型病毒毒株的HA(Nakagawa N等人,Journal ofMedical Virology(2001),745-750)。就我们所知,识别属于B/Victoria组的毒株的HA和属于B/Yagamata组的毒株的HA两者的单克隆抗体从未得到描述。
即使发现具有受限制的特异性的单克隆抗体的使用对于跟踪HA抗原变异也是极其有价值的,所述HA的抗原变异在传播中的病毒毒株内有规律出现,也证明拥有具有广泛流感病毒识别谱的单克隆抗体是非常有用的。以这种方式,容易且快速检测出生物材料中流感病毒的存在,而无需使用整组抗体来揭示它。当毒株特异性单克隆抗体在足够短的时间段内不可用时,它们还可用作所述抗体的备选方案,所述毒株特异性单克隆抗体正常用于控制流感疫苗。
本发明满足了这个需要,并且涉及流感病毒血细胞凝集素特异性单克隆抗体,其识别在A型流感病毒血细胞凝集素的H1和H3亚型上以及在B型流感病毒血细胞凝集素上都存在的抗原结构。
根据本发明的单克隆抗体明显对于流感病毒HA特异,这是因为它不识别流感病毒的其他组分,特别是NA、M蛋白质或NP蛋白质。此外,它抑制至少由属于相同亚型的A型流感病毒毒株介导的血细胞凝集活性。另一方面,它就流感病毒血细胞凝集素而言的识别谱非常广泛。它比具有“亚型”特异性(限制于A型病毒的HA亚型的特异性)或“类型”特异性(限制于单个病毒类型的HAs的特异性)的单克隆抗体更广泛。事实上,根据本发明的单克隆抗体识别A型和B型病毒血细胞凝集素。
就A型病毒而言,根据本发明的单克隆抗体识别在H1和H3亚型上存在的抗原决定簇。它特别识别属于H1N1亚型的病毒毒株,例如A/New Caledonia/20/99毒株和/或A/Chile/1/83X83毒株,以及属于H3N2亚型的病毒毒株,例如A/Panama/2007/99毒株、A/Wiscons/667/2005毒株、A/New York/55/2004毒株、A/Wyoming/03/2003毒株、A/HongKong/1/68毒株、A/Beijing/32/92毒株、A/Shangdong/9/93毒株、A/Johannesburg/33/94毒株、A/Nanchang/933/95毒株和/或A/Sydney/5/97毒株。
就B型流感病毒而言,抗体还识别在B型病毒毒株的HA上存在的抗原结构。它特别识别B/Shangdong/7/97毒株、B/Jiangsu/10/03毒株、B/Brisbane 23/02毒株、B/Yagamata 16/88毒株、B/Beijing 1/87毒株和/或B/Malaysia/2506/04毒株。它一般识别属于B/Victoria组的B型病毒毒株(例如B/Shangdong/7/97毒株)和属于B/Yagamata组的B型病毒毒株(例如B/Jiangsu/10/03毒株)两者。
本发明的目的因此也是流感病毒HA特异性单克隆抗体,其识别在A型流感病毒血细胞凝集素的H1和H3亚型上,以及在属于B/Victoria组和/或B/Yagamata组的B型流感病毒血细胞凝集素上都存在的抗原结构。
根据本发明的单克隆抗体因此特异性识别具有H1N1亚型的至少一个A型流感病毒毒株的HA、具有H3N2亚型的至少一个A型流感病毒毒株的HA、属于B/Victoria组的至少一个B型流感病毒毒株的HA、和属于B/Yagamata组的至少一个B型流感病毒毒株的HA。
总的来说,根据本发明的单克隆抗体识别具有H1N1亚型的几个A型流感病毒毒株的HAs、具有H3N2亚型的几个A型流感病毒毒株的HAs、属于B/Victoria组的几个B型流感病毒毒株的HAs、和属于B/Yagamata组的几个B型流感病毒毒株的HAs。作为由根据本发明的单克隆抗体识别的H1N1类型的病毒毒株,指出了A/New Caledonia/20/99和A/Chile/1/83/X83毒株。作为由根据本发明的单克隆抗体识别的H3N2类型的病毒毒株,指出了A/Wyoming/3/03和A/New York/55/04毒株。作为由根据本发明的单克隆抗体识别的属于B/Victoria组的B型病毒毒株,指出了B/Shandong/7/97和B/Brisbane/32/02毒株。作为由根据本发明的单克隆抗体识别的属于B/Yagamata组的B型病毒毒株,指出了B/Yagamata/16/88和B/Jiangsu/10/03毒株。指出了单克隆抗体Y6F5和Y13F9显示这些识别特征(参照实施例1.2)。
优选地,根据本发明的单克隆抗体识别这样的抗原结构,其存在于具有H1N1亚型的超过2个A型流感病毒毒株的HAs上、具有H3N2亚型的超过2个A型流感病毒毒株的HAs上、属于B/Victoria组的超过2个B型流感病毒毒株的HAs上、和属于B/Yagamata组的超过2个B型流感病毒毒株的HAs上。
具体地,根据本发明的单克隆抗体识别这样的病毒毒株,其中HAs属于H5和/或H7亚型,并且其可以与大流行流感毒株的发展有关。单克隆抗体特别识别A/Vietnam/1194/04NIBRG14毒株,这是可从NationalInstitute for Biological Standards and Controls(NIBSC)实验室获得的H5N1亚型的禽类毒株,并且通过如由Nicolson等人在Vaccine(2005),23:2943-2952中描述的反求遗传学获得。具有H5或H7亚型的病毒毒株尤其感染禽类群体,但担心新突变可能在HA蛋白质序列中发生,并且这些突变株可能变得对人有传染性,并且可能负责流感大流行的发展。因此能够检测和/或定量具有H5或H7亚型的HAs是非常重要的。
由根据本发明的单克隆抗体识别的A型和B型病毒毒株使用禽类起源的生物材料产生。禽类起源的生物材料包括其中流感病毒已繁殖的细胞、组织、器官、溢泌物或其提取物。通常,禽类起源的生物材料来自母鸡或小鸡。它特别是胚胎鸡成纤维细胞或鸡胚原代细胞的培养物。
特别地,当病毒在含胚卵上产生时,包含流感病毒的禽类起源的生物材料是鸡蛋的尿囊液。这种材料特别用于制造流感疫苗。适当时,使用包含纯化病毒或所述病毒的纯化组分的粗材料或纯化生物材料。
因此,其血细胞凝集素由根据本发明的单克隆抗体识别的流感病毒毒株在禽类起源的生物材料上产生。
本领域技术人员众所周知且易于实现的免疫酶技术,例如直接或间接ELISA,或斑点印迹,蛋白质印迹或表面等离振子共振技术,正常用于显示根据本发明的单克隆抗体识别各种HA亚型(关于A型流感病毒的H1、H3、H5和/或H7,以及关于B型流感病毒源于B/Victoria和B/Yagamata组的HAs)。
已找出了由根据本发明的单克隆抗体识别的抗原结构。抗原存在于由单克隆抗体识别的各种HAs的N-糖基化部分上:用N-天冬酰胺酶(PNGase)处理流感病毒HA导致识别丧失。
本发明的目的因此还是:
识别抗原结构的单克隆抗体,其中抗原结构是在血细胞凝集素的N-糖基化部分上的糖序列。
这起因于当流感病毒血细胞凝集素用N-天冬酰胺酶处理时,由单克隆抗体对抗原结构的识别消失的事实,所述N-天冬酰胺酶特异性切割N-糖苷键。
“血细胞凝集素的N-糖基化部分”定义为借助于N-糖苷键与流感病毒血细胞凝集素的氨基酸序列连接的任何糖链,所述N-糖苷键使这种序列的天冬酰胺与糖链的N-乙酰葡糖胺键合。
由根据本发明的单克隆抗体识别的糖序列是包含小数目糖的寡糖,所述寡糖一般是3至30个糖、优选3至20个糖、并且甚至更加优选3至10个糖。
在正文中采用的术语“大约”在本文中就可测量值而言使用,例如量、重量或持续时间,其值可以依赖于使用的测量技术的准确度而改变。这些值可以从对于最不准确的测量技术的±20%到对于最准确的测量技术的±1%变化。术语“大约”因此包含相对于测量的靶值±20%、±10%的变化,优选±5%,更优选±1%的变化。
借助于称为Y6F5的根据本发明的单克隆抗体,通过执行下述方法已分离且表征了所识别的糖基化抗原结构:根据本领域技术人员的常规方法纯化在含胚卵上产生的病毒。随后通过用菠萝蛋白酶处理纯化病毒提取HA。HA随后以此种方式变性,从而使得糖基化结构变得对PNGase的作用更敏感。为此,通过用去污剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)处理使蛋白质结构线性化;随后通过用还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)处理随后借助于碘乙酰胺的烷基化来切割二硫键。变性HA随后用PNGase进行处理:使蛋白质沉淀,而使用预先与Biacore 3000的“传感器芯片(sensorchip)”附着的Y6F5单克隆抗体分析包含聚糖混合物的上清液。该单克隆抗体仅保留它识别的糖基化结构。借助于使用的装置,使用氢氧化钠,随后可能使由抗体保留的抗原结构解吸。抗原结构随后通过质谱分析法进行分析。MALDI-TOF质谱分析法分析显示它是具有下述特征的含硫酸基团的寡糖:硫酸基团与半乳糖附着;通过MALDI-TOF质谱分析法测定的其分子量是约1240道尔顿,精确到通过该装置测量的不精确性区域内(约+/-10道尔顿)。
用于鉴定这种化学结构的Y6F5单克隆抗体通过Y6F5杂交瘤产生,所述Y6F5杂交瘤于2007年7月10日在鉴定参考符号Y6F5和登记号CNCM I-3787下保藏于巴黎(法国)的Institut Pasteur的国立微生物保藏中心(Collection Nationale De Cultures de Microorganismes)[NationalCollection of Cultures of Microorganisms]。
根据本发明的单克隆抗体通常由杂交瘤产生,所述杂交瘤根据本领域技术人员众所周知的方法通过使小鼠脾细胞与鼠骨髓瘤细胞(Sp2/O-Ag14、p3x63Ag8、p3x63-Ag8.653等)融合而获得,所述小鼠用源于A型流感病毒毒株的纯化HA溶液超免疫。根据本发明的单克隆抗体一般是鼠单克隆抗体。这些单克隆抗体一般通过ELISA进行测试,以评估其识别属于H3N2亚型的毒株的HAs的能力,以及其识别属于H1N1亚型的毒株的HAs和B型病毒毒株的HAs的能力。选择识别属于H1N1亚型的A型病毒毒株、属于H3N2亚型的A型病毒毒株和B型病毒毒株的那些。
还验证它们抑制由属于与这样的病毒毒株相同亚型的病毒毒株介导的血细胞凝集能力,所述这样的病毒毒株用于提取用于免疫接种小鼠的HA。例如,如果单克隆抗体得自用源于具有H3N2亚型的毒株的HA溶液免疫接种的小鼠,那么验证它们抑制H3N2毒株的血细胞凝集能力。
还验证它们不识别流感病毒的其他蛋白质,特别是神经氨酸酶(NA)、M蛋白质和NP蛋白质。
通过研究其就禽类病毒毒株而言的行为,特别是关于其识别H5N1或H7N1病毒毒株的能力,完成这些单克隆抗体的表征。
事实上,选择识别属于H1N1亚型的A型毒株、属于H3N2亚型的毒株和B型病毒毒株的单克隆抗体。优选地,选择识别属于B/Victoria组和B/Yagamata组的2种B型病毒毒株的那些。在实施例1中描述的Y13F9和Y6F5单克隆抗体的情况特别是这样。
对于单克隆抗体的表征,使用本领域技术人员众所周知的方法,例如ELISA、蛋白质印迹、斑点印迹或表面等离振子共振。
本发明还包含本发明的单克隆抗体的片段和衍生物,特别是Fab、Fab’、F(ab)’2和sCFv片段(Blazar等人,1997,Journal of Immunology159:5821-5833和Bird等人,1988,Science 242:423-426),以及缀合物。本发明的单克隆抗体的衍生物尤其包括人源化形式的抗体。用于产生单克隆抗体片段以及单克隆抗体衍生物,包括特别地人源化形式的单克隆抗体的方法是本领域技术人员众所周知的。非人抗体例如鼠抗体的人源化形式是嵌合抗体,其包括衍生自非人免疫球蛋白的最低限度序列。大多数人源化抗体是人免疫球蛋白(受体(receiver)抗体),其中受体的高变区残基由具有所需特异性、亲和力和能力的非人供体物种(供体抗体)的高变区残基替换,所述非人供体物种例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。一般地,高变区来自小鼠。在特定情况下,人免疫球蛋白的Fv区残基(FR)由最通常是鼠起源的相应非人残基替换。此外,人源化抗体可以包括在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。执行这些修饰,以改善抗体的有效性。一般而言,人源化抗体将包括至少且优选2个可变结构域,其中所有或几乎所有高变环与非人免疫球蛋白对应(一般而言,它们与鼠免疫球蛋白对应),并且所有或几乎所有FR区将是人免疫球蛋白的那些。人源化抗体可以任选还包括免疫球蛋白例如人免疫球蛋白的至少部分恒定区(Fc)(Jones等人,Nature 321:522-525(1986);Reichmann等人,Nature 332:323-329(1988);和Presta等人,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))。
本发明的单克隆抗体可以在免疫测定中用于检测和/或定量禽类起源的生物材料中的A型或B型流感病毒的HA,所述生物材料假定包含一个或多个流感病毒毒株。它们可以特别在病毒感染的病原学背景中使用,或用于控制流感疫苗的内容物。
在感染诊断的背景中,所获取的样品一般是来自咽喉、气管或鼻分泌物的样品。当在家禽饲养所中怀疑禽流感时,通常使用泄殖腔或粪便样品。也可以获取组织样品。将样品引入运送培养基(M 199培养基、基于甘油的培养基)内,并且随后如果流感病毒存在于起源样品中,那么它一般通过将其接种到具胚鸡蛋内进行扩增。在病毒扩增、羊膜液收获和离心后,取出上清液并且在借助于根据本发明的单克隆抗体在免疫测定中进行测试。当设法使用粗尿囊液检测流感病毒时,优选使用蛋白质印迹技术。
在流感疫苗上执行的控制背景中,测定纯化疫苗形式的成品中存在的HA量,或在疫苗制造的各个阶段(阶段6、阶段15、阶段21)时执行控制测试。生物材料可以是纯化疫苗制剂或在制造过程中的制剂。纯化疫苗制剂可以为各种形式:完整、减毒或死病毒,以片段病毒(splitvirus)形式,病毒体,或甚至以基本上包含一种或多种高度纯化病毒HAs的亚单位形式。当疫苗由单个病毒毒株产生时,它可以为单价形式,或当它由几个毒株(一般为属于不同亚型的2个A型病毒毒株和1个B型病毒毒株)产生时,它可以为多价形式。用于制造疫苗的病毒一般在含胚卵上产生,并且起始生物材料是受感染的尿囊液。用于制造疫苗的A型病毒毒株的HA是H1、H3、H5或H7亚型。
本发明的目的因此还是用于检测生物材料中的流感病毒或流感病毒HA的方法,其包括其中使所述材料与根据本发明的单克隆抗体、或其片段或衍生物接触的步骤,以便在所述单克隆抗体、或其片段或衍生物与所述生物材料中包含的流感病毒血细胞凝集素之间的特异性相互作用后形成抗原/抗体复合物,以及其中揭示这些抗原/抗体复合物的存在的步骤。
这种方法特别在直接ELISA或斑点印迹技术中或使用Biacore仪器的技术中实现。将生物材料沉积在蛋白质与之吸附的固体支持体上,例如基于聚苯乙烯、基于尼龙或基于硝酸纤维素的支持体。在温育时间段后,随后为洗涤,加入直接或间接标记的根据本发明的单克隆抗体。单克隆抗体与病毒HAs的糖基化位点特异性结合,所述病毒HAs吸附在固体支持体上。随后使用本领域技术人员的常规技术测量与所形成的抗原/抗体复合物结合的标记量。通过使用Biacore装置测量等离振子共振信号强度,也可以在抗原/抗体复合物的形成过程中直接评价抗原与单克隆抗体的相互作用。
根据本发明用于检测禽类起源的生物材料中的流感病毒的方法也在一维或二维蛋白质印迹技术中实现。在这种情况下,所形成的抗原/抗体复合物的存在不再借助于标记或借助于等离振子共振信号进行检测,如在先前情况下,而是通过具有约75KD或50KD分子量(当用β-巯基乙醇处理材料时)的电泳条带的存在进行检测,这是HA的特征。
当在包含HA的流感病毒或流感病毒组分中富集待分析的禽类起源的生物材料,并且它包含很少污染物或不包含污染物时,尤其使用直接ELISA或斑点印迹技术或Biacore装置,由于材料中糖基化污染物的存在,所述污染物可以产生假阳性结果。这些技术特别用于检测或测定纯化流感疫苗中的HA含量,所述纯化流感疫苗已使用由一个或多个病毒毒株感染的具胚鸡蛋获得。当HA含量相当于至少30%的总蛋白质(w/w)时,流感疫苗视为纯化的。
当生物材料未纯化时(例如,受感染的尿囊液),尤其使用蛋白质印迹技术,以便克服可能由糖基化污染物存在引起的问题,所述糖基化污染物能够与根据本发明的单克隆抗体相互作用。
根据本发明的另一个方面,实现的方法包括其中使材料与固体支持体接触的在前步骤,所述固体支持体与特异性识别流感病毒结构的捕获试剂结合。病毒、病毒级分或HA随后在固体支持体上特异性保留或“捕获”,而生物材料的其他组分在捕获步骤后执行的洗涤过程中消除。该方法随后使用根据本发明的单克隆抗体如前继续,以证实或定量测定生物材料中存在的一种或多种流感病毒血细胞凝集素。
捕获试剂使用本领域技术人员已知的方法与固体支持体结合,特别是借助于疏水作用或氢键或甚至借助于共价键。
对于HA的蛋白质部分特异的单克隆抗体一般用作捕获试剂,但也可以使用其他捕获试剂,特别是针对病毒包膜蛋白质(例如,对于神经氨酸酶或对于M蛋白质特异的抗体)、或甚至胎球蛋白的抗体。
正常地,对于流感病毒HA的蛋白质部分特异的单克隆抗体用作捕获试剂。当单克隆抗体具有“毒株”特异性时,仅保留特异性病毒毒株的HA。当单克隆抗体具有“亚型”特异性时,具有相同HA亚型的病毒毒株的HAs保留在支持体上。例如,可以提及单克隆抗体M322210(Tebu)、MAB825430-2F11-F5-A5(Chemicon)、9E10(Nakagawa laboratory)或7H11(Nakagawa laboratory),就涉及前2种而言,其分别识别HA的H1和H3亚型,而后2种分别识别属于Victoria组的B型病毒毒株的HAs和属于Yagamata组的B型病毒毒株的HAs。对于HA的蛋白质部分特异的单克隆抗体正常用作捕获试剂,无论用于特异性测定生物材料中源于特异性病毒毒株的HA量,还是源于属于相同亚型的一个或多个毒株的HA量。
为此,在具体方面,本发明的目的还是:
用于测定生物材料中包含的流感病毒血细胞凝集素的方法,其包括下述步骤:
a)使材料与结合第一种特异性单克隆抗体的固体支持体接触,所述第一种特异性单克隆抗体识别流感病毒血细胞凝集素的蛋白质结构;
b)起因于这种单克隆抗体与生物材料中包含的流感病毒血细胞凝集素的特异性相互作用的抗原/抗体复合物特异性保留在固体支持体上;
c)使固体支持体上保留的抗原/抗体复合物与直接或间接携带标记的根据本发明的第二种单克隆抗体、或其片段或衍生物接触;
d)测量已与抗原/抗体复合物特异性结合的标记量;和
e)基于测量的标记量,通过与一种或多种参照试剂相比较测定材料中包含的血细胞凝集素量。
当根据本发明的第二种单克隆抗体(或揭示单克隆抗体)具有与第一种单克隆抗体(或捕获单克隆抗体)相同的同种型时或当它源于与第一种单克隆抗体(或捕获单克隆抗体)相同的动物物种时,对它直接进行标记。在其他情况下,第二种单克隆抗体可以直接或间接进行标记。在间接标记的情况下,借助于对于第二种抗体的同种型或对于其动物物种特异的直接标记的第三种抗体识别根据本发明的第二种单克隆抗体。
在具体实施方案中,根据本发明的测定方法可以应用于由疫苗制剂表示的生物材料,其包含源于一个或多个不同流感病毒毒株的HA。这种疫苗制剂可以为各种形式(前提是它包含HA);它可以为纯化疫苗或在疫苗制造的各个阶段时收获的材料形式,特别包括得自受感染的具胚鸡蛋的受感染的粗尿囊液。
例如,本领域技术人员众所周知的“夹心型”免疫酶技术、或放射免疫学、免疫比浊法(immunonephelometric)或间接免疫荧光技术应用于实现这种测定方法。代替测量标记量,可能以相似方式使用Biacore系统直接评价抗原-抗体复合物的相互作用。
当生物材料包含很少的糖基化污染物或不包含糖基化污染物时,所述糖基化污染物可以由根据本发明的单克隆抗体识别,如在纯化疫苗制剂的情况下,捕获试剂可以由根据本发明的单克隆抗体例如Y6F5单克隆抗体或Y13F9单克隆抗体表示。根据本发明的一种和相同单克隆抗体可以用作捕获试剂和揭示抗体。还可以使2种不同单克隆抗体组合,使用例如Y13F9单克隆抗体作为捕获抗体和Y6F5单克隆抗体作为揭示抗体。
为此,在具体方面,本发明的目的还是:
用于测定生物材料中包含的流感病毒血细胞凝集素的方法,其包括下述步骤:
a)使材料与结合根据本发明的第一种单克隆抗体、或其片段或衍生物的固体支持体接触;
b)起因于单克隆抗体与生物材料中包含的流感病毒血细胞凝集素的特异性相互作用的抗原/抗体复合物特异性保留在固体支持体上;
c)使固体支持体上保留的抗原/抗体复合物与直接或间接携带标记的根据本发明的第二种单克隆抗体、或其片段或衍生物接触;第二种单克隆抗体与第一种抗体不同或相同都是可能的;
d)测量已与抗原/抗体复合物结合的标记量;和
e)基于测量的标记量,通过与一种或多种参照试剂相比较测定材料中包含的血细胞凝集素量。
如上所述,当第二种单克隆抗体(或揭示单克隆抗体)具有与第一种单克隆抗体(或捕获单克隆抗体)相同的同种型时或当它源于与第一种单克隆抗体(或捕获单克隆抗体)相同的动物物种时,对它直接进行标记。在其他情况下,第二种单克隆抗体可以直接或间接进行标记(在这种情况下,借助于识别第二种抗体的同种型或物种特异性的直接标记的第三种抗体来标记第二种单克隆抗体)。一般而言,为了使根据本发明的测定方法简化,第二种单克隆抗体通常直接进行标记。
在具体实施方案中,生物材料由包含源于一个或多个流感病毒毒株的HA的纯化疫苗制剂表示。如上所示,这种纯化疫苗制剂可以为各种形式,前提是它包含流感病毒HA。它可以特别包含完整流感病毒毒株(其也可以是灭活的)或片段流感病毒毒株、或病毒体形式或以基本上包含一种或多种高度纯化HAs的亚单位疫苗形式的流感病毒毒株。
在另一个方面,本发明的目的是:
用于纯化来自生物材料的流感病毒或流感病毒血细胞凝集素的方法,其包括下述步骤:
a)使材料与固体支持体接触,所述固体支持体结合根据本发明的第一种单克隆抗体、或其片段或衍生物;
b)起因于单克隆抗体与生物材料中包含的流感病毒血细胞凝集素的特异性相互作用的抗原/抗体复合物特异性保留在固体支持体上;
c)从固体支持体上保留的抗原-抗体复合物释放流感病毒或流感病毒血细胞凝集素;和
d)回收流感病毒或流感病毒血细胞凝集素。
固体支持体通常是基于葡聚糖、基于琼脂糖或硅基的层析支持体。通常使用本领域技术人员众所周知的偶联方法,使单克隆抗体与层析支持体共价键合。
使待纯化的样品与免疫层析支持体接触,所述免疫层析支持体选择性保留流感病毒HA或流感病毒。不由根据本发明的单克隆抗体识别的组分(污染物)不保留在固体支持体上,并且在层析缓冲液中直接消除。随后使用特异性洗脱缓冲液例如在pH=2下的甘氨酸或具有高盐体积摩尔浓度的离液剂,从固体支持体释放流感病毒或流感病毒血细胞凝集素。收集与HA或流感病毒对应的层析峰,并且一般针对生理学缓冲液进行透析。随后可以通过使这种纯化方法与其他层析法例如排阻层析或离子交换层析组合来增加制剂纯度。
本发明还涉及药物组合物,其包括作为与药学上可接受的载体的混合物的根据本发明的一种或多种单克隆抗体、或其片段或衍生物。术语“药学上可接受的载体”意指可以施用于人类或动物的支持体和载体,如例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Mack PublishingCo.中描述的。
它还涉及根据本发明的一种或多种单克隆抗体、或其衍生物或片段用于制备用于通过被动免疫接种治疗或预防流感感染的药物的用途。
它涉及用于阻止个体染上流感或治疗患有流感的个体的方法,其中给个体施用有效量的药物组合物,所述药物组合物包括根据本发明的一种或多种单克隆抗体。
本发明因此包括用于治疗或预防目的的针对流感被动免疫接种方法,其由给个体特别是人或哺乳动物(例如犬、猫、猪、马)或鸟类施用治疗或预防有效量的本发明的单克隆抗体、片段或衍生物,或其组合组成。针对位于HA蛋白质部分上的抗原结构或针对NA的一种或多种其他单克隆抗体或多克隆抗体也可以与根据本发明的一种或多种单克隆抗体结合或组合。
本发明还涉及根据本发明的单克隆抗体特别是Y6F5单克隆抗体用于分离和纯化寡糖的用途,所述寡糖由本发明人表征且在第9页上描述。
下述实施例以非限制性方式举例说明本发明的各种实施方案。
图1表示在用氨水处理前(底部谱)和后(顶部谱)的聚糖MALDI-TOF质谱。
实施例
1.1单克隆抗体的产生
根据下述规程使6至8周大的雌性BALB/c小鼠免疫接种:它们接受100μl纯化HA和纯化NA的混合物的第一次腹膜内注射,所述混合物具有64,000单位的血细胞凝集滴度,以用等体积完全弗氏佐剂获得的乳剂形式,随后为以在不完全弗氏佐剂的存在下产生的乳剂形式的相同混合物间隔2周的2次注射。使用A/Sydney/5/97(H3N2)IVR 108毒株制备纯化HA和纯化NA的混合物。病毒毒株在含胚卵上产生,并且通过使受感染的尿囊液经由0.45μ过滤且随后执行在蔗糖梯度上的沉降进行纯化。随后根据Gerentes等人的技术(Journal of Virological methods:73(1998)185-195),用triton X100处理纯化病毒毒株,以便获得HA和NA的混合物。最后的注射后3天,根据Kohler和Milstein的技术,取出脾细胞并且与小鼠骨髓瘤细胞系p3x63-Ag8.653融合。使用ELISA测定筛选杂交瘤上清液,其中“包被”抗原是纯化病毒或根据Gerentes等人的技术(Journal of Virological methods:58(1996)155-165)通过免疫层析从HA和NA的混合物纯化的NA。随后使杂交瘤克隆几次,并且随后以腹水形式产生,所述杂交瘤在使用纯化病毒作为“包被”抗原的ELISA测定中是阳性的,并且在使用纯化NA作为“包被”抗原的ELISA测定中阴性的。腹水得自这样的小鼠,所述小鼠预先已接受Pristane(商品名)注射,随后为相隔几天约106杂交瘤细胞的注射。通过这些杂交瘤产生的单克隆抗体随后以腹水形式或以纯化腹水形式使用。
腹水通过在10,000g在+4℃离心5分钟进行纯化。上清液随后用饱和硫酸铵(终体积40%的终浓度)处理5分钟,伴随搅拌,以使单克隆抗体沉淀。通过在3500g离心15分钟收集沉淀。使沉淀吸收在不含Ca2+且不含Mg2+的2ml 8mM磷酸盐缓冲液,pH=7.5(PBS 1x)中,并且随后针对不含Ca2+且不含Mg2+的4升1x PBS透析2次2小时,其中PBS在2小时后更换。透析的单克隆抗体随后在10,000g离心10分钟,并且随后通过Bradford法进行测定。
对于在控制生物样品的测试中特别是用于控制流感疫苗的用途,使用Pierce法用过氧化物酶标记最有利的单克隆抗体,例如Y13F9单克隆抗体。
1.2单克隆抗体特异性的研究
根据段落1.1中所述的规程获得的单克隆抗体以及特定数目的商购可得的单克隆抗体或源于Naoko Nakagawa实验室的单克隆抗体(对于B型病毒毒株特异的抗体),就其识别A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/Panama/2007/99(H3N2)和B/Shandong/7/97毒株(来自2003-2004年的三价疫苗的毒株)血细胞凝集素的能力进行测试。这些病毒毒株在含胚卵上产生,并且随后在蔗糖梯度上纯化。使用正式SRD(单辐射免疫扩散(Single Radial Immunodiffusion))测试来测定在每个纯化毒株中包含的HA量。HA含量表示至少30%的病毒蛋白质。
通过向每个孔中引入在0.05M碳酸盐缓冲液,pH:9.6中包含1μg/mlHA的100μl纯化单价毒株,在+4℃下过夜,用3个纯化单价毒株之一包被3个系列的ELISA微量培养板(ref:655071)。在已吸去微量培养板的内容物后,微量培养板随后用150μl/孔磷酸盐缓冲液-0.05%tween 20-1%脱脂乳(饱和缓冲液)在37℃饱和1小时。在已吸去内容物后,向每个孔中引入每种纯化单克隆抗体或腹水形式的单克隆抗体的连续2倍稀释物,测试的第一个稀度是1/1000。稀释物在饱和缓冲液中制备。引入稀释至1/10,000的超免疫小鼠血清作为阳性对照。在37℃温育1.5小时后,随后为在磷酸盐缓冲液-0.05%tween 20(洗涤缓冲液)中的4次洗涤,向每个孔中引入在磷酸盐缓冲液-0.05%tween 20中稀释1/4,000的100μl过氧化物酶标记的羊抗小鼠Ig缀合物(Amersham NA931)。在37℃进一步温育1.5小时后,随后为4次洗涤,用四甲基联苯胺(TMB)溶液揭示酶促反应;通过分光光度法在450和在600nm测量孔的着色强度。于是对于测试的每种单克隆抗体,测定其为在450nm产生光密度(O.D)1的抗体稀度倒数(表示为log10)的滴度。在表1中以形式(≤)表示的小于或等于2.7的滴度意指单克隆抗体不识别纯化单价毒株的HA。鉴定了由Y13F9和Y6F5杂交瘤产生的2种单克隆抗体,所述单克隆抗体根据实施例1的规程获得,其识别3种纯化毒株的HAs:A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/Panama/2007/99(H3N2)和B/Shandong/7/97(在3种ELISA测定中滴度>2.7)。另一方面,商业单克隆抗体(1351、48079、M322210、58CE8-1-5、58AB7-19-18、62ID5-11、30-2F11-F7-A5、BGN/5G8、C102、3B3、4H7)或Naoko Nakagawa实验室的那些(1H12、2H12、5B12、9E10、10B8)(其获得针对B型病毒毒株的一组单克隆抗体(Journal of Virological methods 79:113-120(1999);Journal of Medical Virology 65:745-750(2001);Journal ofGeneral Virology 82:2169-2172)),无一识别3种毒株的HAs。30-2F11-F7-A5单克隆抗体识别A/New Caledonia/20/99(H1N1)和A/Panama/2007/99(H3N2)毒株的HAs。其他单克隆抗体仅识别测试的3种毒株之一(参照表1)。
表1:通过针对流感病毒HA的各种单克隆抗体对A/NC/20/99(H1N1)、A/Panama/2007/99(H3N2)和B/Shangdong/7/97毒株的识别。
*:ELISA滴度
NS:非特异性
Y13F9和Y6F5单克隆抗体也就其识别其他流感病毒毒株的能力进行测试,所述其他流感病毒毒株特别是A/Taiwan/1/86xX31(H1N1)、A/Chile/1/83X83(H1N1)、A/Wisconsin/67/2005(H3N2)、A/NewYork/55/2004(H3N2)、A/Wyoming/03/2003(H3N2)、A/Hong Kong/1/68(H3N2)、A/Mississippi/1/85X87(H3N2)、A/Sichuan/2/87(H3N2)、A/Leningrad/360/86(H3N2)、A/Shanghai/11/87X99、B/Malaysia/2506/04、B/Jiangsu/10/2003、B/Brisbane/32/02、B/Yagamata/16/88和B/Beijing/1/87毒株。所有这些毒株都在含胚卵上产生且纯化,并且都为纯化病毒形式,或当纯化病毒已经历用tween-醚或用triton的处理时,为片段病毒。在特定情况下,测试的毒株为单价疫苗或单价疫苗混合物形式。使用间接夹心ELISA技术,其中测试的病毒毒株的HA夹在用作捕获抗体的Y13F9或Y6F5单克隆抗体与用作揭示抗体的用过氧化物酶直接标记的Y13F9单克隆抗体之间。为了实现技术,用在碳酸盐缓冲液,pH=9.6中约2μg/ml浓度的100μl纯化单克隆抗体(用作捕获抗体)溶液在+4℃过夜包被ELISA板,随后为如上用于板饱和的步骤。随后使待测试的100μl毒株样品沉积,在饱和缓冲液中执行样品的连续稀释,并且随后使微量培养板在37℃静置1.5小时。洗涤板后,使在饱和缓冲液中0.1μg/ml浓度的100μl揭示抗体(用过氧化物酶直接标记的单克隆抗体Y13F9)溶液沉积。在37℃进一步温育1.5小时后,随后洗涤,如上执行揭示步骤和用于测量反应强度的步骤。结果揭示测试的所有H1N1和H3N2毒株以及B型病毒毒株由Y6F5单克隆抗体和Y13F9单克隆抗体识别。这2种单克隆抗体还抑制A/Beijing/32/92(H3N2)、A/Shangdong/9/93(H3N2)、A/Johannesburg/33/94、(H3N2)、A/Nanchang/933/95(H3N2)和A/Sydney/5/97(H3N2)病毒毒株的血细胞凝集活性。最后,其为H5N1类型禽类毒株的A/Vietnam/1194/04毒株由Y13F9单克隆抗体识别。
这些结果明确证明Y6F5和Y13F9单克隆抗体识别A型流感病毒的H3和H1血细胞凝集素(这是因为识别众多H3N2和H1N1毒株),以及B型流感病毒血细胞凝集素(这是因为识别属于B/Yagamata组和B/Victoria组的众多B型流感病毒毒株)。Y13F9单克隆抗体还识别血细胞凝集素H5。
1.3单克隆抗体用于控制流感疫苗的用途
我们使用2种间接(夹心)ELISA法
在第一种方法中,捕获单克隆抗体是“亚型”特异性单克隆抗体或B型病毒特异性单克隆抗体,揭示单克隆抗体是用过氧化物酶标记的Y13F9单克隆抗体。这种“亚型”特异性或B型病毒特异性ELISA使得可能测定三价疫苗中存在的每个毒株的HA含量。事实上它包含属于不同亚型的2个A型病毒毒株和1个B型病毒毒株。通过执行3种不同“毒株”特异性ELISAs来测定三价疫苗中包含的每个疫苗株的HA量,所述ELISAs仅就捕获单克隆抗体而言不同。通过将3个量相加测定在三价疫苗中包含的HA总量。
在第二种方法中,使用用作捕获抗体和揭示抗体的根据本发明的一种和相同单克隆抗体。Y13F9单克隆抗体用作捕获抗体,并且用过氧化物酶标记的Y13F9单克隆抗体用作揭示抗体。三价疫苗中包含的HA总量通过执行单次ELISA进行测定,但在这种情况下,不能测定“直到(down to)”每个毒株的HA量。这种测定法被视为“多特异性的”,因为可以控制来自不同年的流感疫苗中包含的HA量。
在关于来自2003-2004年的疫苗上执行的控制背景中使用这2种方法,所述疫苗包含A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/Panama/2007/99(H3N2)和B/Shandong/7/97毒株。在其制造的各个阶段时控制疫苗:在其制造开始时,即在其中疫苗由受感染的粗尿囊液表示的阶段时(阶段6),在其中疫苗为浓缩且纯化完整病毒形式的阶段时(阶段15),以及在其中疫苗为三价疫苗(vaxigrip)(包含已纯化且在去污剂的作用下裂解的3个病毒毒株的疫苗)形式的阶段时。在这些控制的背景中,还使用由NISBC提供的参照抗原,其是源于A/New Caledonia/20/99毒株(批次01/614)、A/Panama/2007/99毒株(批次02/100)或B/Shandong/7/97毒株(批次02/108)的半纯化病毒溶液,并且根据SRD参照法具有65、53和55μg/ml HA的理论滴度。还通过用菠萝蛋白酶处理随后为排阻层析(纯化HA),对从3个浓缩且纯化病毒毒株的每一个(阶段15)提取的纯化HA执行控制。遵循的用于HA提取和纯化的规程是在段落2.1中描述的那种。
为了执行第一种方法的3种特异性ELISAs,M322210单克隆抗体的纯化制剂(Fitzgerald-ref 10I50)用作捕获单克隆抗体,以测定A/NC/20/99毒株(H1N1)的HA含量,MAB825430-2F11-F7-A5单克隆抗体的纯化制剂(Chemicon-ref mab8254)用作捕获抗体,以测定A/Panama/2007/99毒株(H3N2)的HA含量,并且9E10单克隆抗体的制剂用于B/Shangdong/7/97毒株。它们在0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液,pH 9.6中稀释,并且随后以1/1000以100μl/孔的比率沉积在96孔板(Dynex)的孔底部上。在4℃的过夜时间段后,使板倒空并且随后用包含1%脱脂乳的150μl/孔磷酸盐-tween 20(0.05%)缓冲液饱和。在37℃温育1小时30分钟后,再次使板倒空,并且随后使每个孔沉积由兼性去污剂(zwittergent)处理或未处理的100μl待测定样品。待测定的样品在-80℃下保存,并且在使用前在融化后进行超声处理。此外,如果待控制的样品包含非片段(nonsplit)病毒(NIBSC的抗原,阶段6或阶段15),那么预先在实验室温度下伴随搅拌使它们与10%(w/v)兼性去污剂溶液以9体积样品/1体积兼性去污剂溶液的比率接触30分钟。如果样品浓度通过SRD已知,那么它进行稀释(在饱和缓冲液中),以便在第一个孔中沉积1μg/ml HA,并且随后样品经过12个杯形器连续稀释2倍。这是例如对于参照和对照进行的那种。如果待滴定样品的浓度未知,那么它在第一个孔中彻底沉积,并且随后经过12个孔连续稀释2倍。板随后在37℃温育1小时30分钟,倒空,在磷酸盐-tween 20(0.05%)缓冲液中洗涤4次,并且随后向每个孔中加入与过氧化物酶缀合且在饱和缓冲液中稀释1/10,000的100μl Y13F9单克隆抗体。板在37℃再次温育1小时30分钟,随后倒空它的内容物并且将其洗涤4次,并且用100μl 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB,Tebu Bio)揭示夹心。在20分钟后,用100μl 1N HCl(Prolabo)停止反应。板在450-650nm下进行读数(Molecular Devices Versa Max)。
对于每个毒株,使与经由SRD测定的单价疫苗(即在去污剂的作用下裂解的纯化病毒毒株)对应的参照和对照沉积在每块板上。因此确立4-参数曲线,这使得可能定量待控制样品中的HA(Soft Max Pro软件)。
通过使用这种ELISA测定法,不再需要使用NISBC试剂作为参照抗原。可能使用通过ELISA针对纯化HA测定的毒株特异性单价体作为参照,其自身通过Bradford法进行测定。在这种情况下,在使用其作为参照前不再必要等待单价体的SRD测定。
使用Soft Max Pro软件在0.2和2.0的光密度(OD)值之间以μg/ml测量每种样品的HA量,随后从由参照单价体获得的曲线进行计算。
用于多特异性ELISA的操作规程与已描述的那种相同,具有下述特性。捕获抗体是以在碳酸盐缓冲液,pH=9.6中2μg/ml浓度使用的Y13F9单克隆抗体的纯化溶液。包含非片段病毒(NIBSC抗原,或阶段15)的待控制样品不用兼性去污剂进行预处理。
当SRD滴度可获得时,使特异性ELISA滴度与SRD滴度相比较,或当涉及纯化HA时,使其与Bradford测定相比较。使用毒株特异性ELISA法获得的结果在表2中给出。使用多特异性ELISA法获得的结果在表3中给出。
表2:在各种流感样品中A/NC/20/99(H1N1)毒株的HA、A/Panama/2007/99(H3N2)毒株的HA和B/Shangdong/7/97毒株的HA的测定(特异性ELISA)
*:指示样品用兼性去污剂进行处理
NA:不可用
滴定2次或甚至3次的样品具有随后与平均值±标准差对应的ELISA滴度。仅滴定1次的样品仅具有一个指示值。SRD滴度可以改变约20%。检出限的数量级是1ng/ml。
表3:在各种流感样品中A/NC/20/99(H1N1)毒株的HA、A/Panama/2007/99(H3N2)毒株的HA和B/Shangdong/7/97毒株的HA的测定(多特异性ELISA)
NA:不可用
*:获得的值不是等价的,因为使用的参照在3种测定中不同。在第一种测定中,参照是纯化和片段单价A/NC/20/99毒株,在第二种测定中,参照是纯化和片段单价A/Panama/2007/99毒株,并且在第三种测定中,参照是纯化和片段单价B/Shangdong/7/97毒株。
滴定2次或甚至3次的样品具有随后与平均值±标准差对应的ELISA滴度。仅滴定1次的样品仅具有一个指示值。SRD滴度可以改变约20%。检出限的数量级是1ng/ml。
一般而言,在用SRD法或Bradford法获得的滴度与用特异性ELISAs或用多特异性ELISA法获得的滴度之间观察到良好对应。就NISBC的参照抗原而言,应当指出当使用多特异性ELISA法时,在ELISA滴度和SRD滴度之间存在更佳对应。就高度纯化HA而言,无论毒株起源如何,还应当指出当使用多特异性ELISA法时,在ELISA滴度和通过Bradford法获得的滴度之间存在更佳对应。
特异性ELISAs具有能够定量作为在三价体中的混合物的每个毒株,以及寻找可能异源污染的优点,但必须能够具有对于该年的疫苗株特异的单克隆捕获抗体。
“多特异性”ELISA具有能够定量任何纯化流感病毒毒株同时逃避特异性抗体的周期性供应的奇怪形为的优点。
2种方法特别是需要使用特异性ELISAs的那种使得可能展望在线的生产控制,且特别是来自大量每种单价体的Vaxigrip三价疫苗的高危制剂;不依赖于NIBSC试剂的可用性。
2.1:由单克隆抗体识别的抗原结构是糖基化基序
根据实施例1的操作规程纯化的A/New Caledonia/20/99(H1N1)毒株在+4℃用稀释至1/1000的β-丙酸内酯溶液灭活过夜,并且随后进行超速离心。随后通过加入在PBS中悬浮的55μg菠萝蛋白酶/mg纯化病毒,并且随后加入8μl β-巯基乙醇/ml混合物在+4℃过夜,对病毒沉淀实施用菠萝蛋白酶的双重处理。随后提取病毒包膜的HA。随后对上清液实施在8mM PBS缓冲液中在superose 6凝胶(Pharmacia)上的排阻层析,以分离且收集包含HA的洗脱物。
随后通过向HA溶液(pH=7.5)中加入1.3单位PNGase(Calbiochemref:362185.)/mg HA,用PNGase F处理部分。PNGase是在天冬酰胺位点上切割N-聚糖的内切糖苷酶。在37℃处理2小时后,获得去糖基化HA。其余部分未用PNGase进行处理。借助于以1μg/ml浓度使用的Y6F5和Y13F9单克隆抗体以及稀释1/1000的碱性磷酸酶偶联的抗小鼠缀合物(Zymed ref:61-6422),通过蛋白质印迹控制用PNGase F处理或未处理的HA样品。结果显示当样品不用PNGase处理时,存在55KD条带。另一方面,当样品用PNGase预处理时,条带具有更低质量。
2.2:糖基化基序的表征
2.2.1:源于B/Jiangsu病毒毒株的HA处理和聚糖提取
选择Y6F5单克隆抗体和通过蔗糖梯度沉降纯化的B/Jiangsu病毒毒株用于这种表征。
根据与先前段落中描述的那种相同的规程执行HA提取。通过在100,000g在4℃超速离心1小时取出残留病毒。HA在超速离心上清液中。
随后通过将1mg/ml十二烷基硫酸钠加入2.2mg/ml HA溶液中,在十二烷基硫酸钠(SDS)的存在下使HA变性。在5分钟后,加入二硫苏糖醇(DTT),从而使得在混合物中的DTT终浓度是5mM。在60℃温育15分钟后,加入碘乙酰胺,从而使得混合物中的碘乙酰胺终浓度是10mM。在黑暗中在实验室温度进一步温育20分钟后,混合物最后针对PBS缓冲液进行透析。
糖蛋白随后为线性形式,并且聚糖更暴露,用于由PNGase F的酶促切割。
在约1mg/ml浓度下的变性HA随后在50mM磷酸盐缓冲液,pH=7.5中用PNGase F(ref:Calbiochem ref:362185)以0.4单位/mg的比率处理16小时。在酶促处理时间段过程中,通过在SDS的存在下在聚丙烯酰胺凝胶上执行电泳来控制其就HA而言的酶促活性。PNGaseF的内切糖苷酶活性导致HA质量中的减少,这通过更低质量条带的存在在聚丙烯酰胺凝胶上进行表征。
在酶作用后,通过用10%三氯乙酸处理使蛋白质沉淀。在10,000g离心15分钟后,最后收集包含聚糖混合物的上清液。与之平行,除PNGase处理外,对源于纯化B/Jiangsu病毒的纯化HA等分试样执行相同处理。这种样品用作阴性对照用于后续实验。
2.2.2:使用Biacore 3000纯化聚糖
使用供应商的说明书,使在10mM乙酸盐缓冲液,pH=4.5中250μg/ml浓度的Y6F5单克隆抗体与Biacore 3000的传感器芯片共价结合。随后将用PNGase F处理的HA样品以及未处理的阴性对照注射入装置内。
观察到的单克隆抗体-捕获的聚糖信号巨大(约1000RU),尽管使用的材料量非常小(几μg)。用充当阴性对照的样品未观察到信号。
随后通过注射几μl的5mM氢氧化钠溶液,从传感器芯片解吸由Y6F5单克隆抗体保留的聚糖。在装置出口处回收2μl聚糖溶液。实验执行2次以具有足够体积。
随后在通过质谱分析法分析样品前,将1ul三氯乙酸(TFA)加入纯化聚糖溶液中。
2.2.3:糖基化基序的表征
分析在MALDI Tof装置(Autoflex II Bruker)上执行。由于可用分析物的小量,选择这种类型的装置。以负reflectron模式检测离子。
如下执行基质和分析物制备及其沉积:使用的基质是二羟基苯甲酸(DHB)。通过制备基质在丙酮中的饱和溶液来执行基质制备,并且随后通过加入一定体积水来稀释上清液。随后使1μl这种基质溶液与包含聚糖的1μl分析物混合。随后将0.5μl这种混合物在2个不同位置处沉积在不锈钢MALDI板上。
通过用PNGase处理的样品和不用PNGase处理的样品(阴性对照)之间获得的谱扣除执行糖苷结构的鉴定。
2个谱的比较分析使得可能检测在1240Da质量处的离子(参照图1)。我们随后计算了在这种基于特别由W Keil等人(Virology,133,77-91(1984))和更近由S.Y.Mir-Shekari等人(Journal of biologicalChemistry,272,4027-4036(1997))描述的流感聚糖结构的结构中包含的糖数目。借助于多萜醇磷酸转移且由其执行转换过程的在其三触角形式的基本寡糖序列结构:(葡萄糖)3-(甘露糖)9-(N-乙酰葡糖胺)2,用作基础以基于其1240道尔顿的分子量测定由Y6F5单克隆抗体识别的寡糖结构,所述过程一般通过葡萄糖残基丧失、甘露糖残基丧失至各种程度和新糖残基引入反映,所述新糖残基为N-乙酰葡糖胺、半乳糖和岩藻糖,其嫁接到修饰的基本结构上。通过研究糖残基的所有可能组合,我们得出结论为,不存在使得可能测定我们的离子质量的那种。因此考虑在由Y6F5单克隆抗体识别的糖苷基序上也可能存在非糖残基,特别是硫酸基团。
为了支持这个假设,在装置出口处回收的纯化聚糖溶液用一定体积1M氨水溶液在60℃处理1小时。这个处理的目的是取出可能与糖残基附着的硫酸基团。获得的例子随后以相同方式进行处理且分析。
如图1中所示(顶部谱),我们注意到硫酸基团丧失的80Da特征性质量丧失。这因此证实在由Y6F5单克隆抗体识别的糖基化基序上硫酸基团的存在。未用氨水处理的纯化聚糖样品谱显示2个目的峰(在1240处和在约1160处)(参照在图1中的底部谱);这是由于在分析物的离子化过程中硫酸基团的不稳定性。
还观察到2个谱不具有相等质量。这通过下述事实得到解释,除在脱硫酸实验过程中造成的稀释外,后者引入取代已存在的盐的铵基。这2种现象的组合意味着占优势地观察到分子离子并且观察到的加合物至少得多的程度。
基于借助于Y6F5单克隆抗体通过免疫亲和分离的聚糖基序的MW和脱硫酸实验,由此推导聚糖基序包含7个糖。在这种情况下,所有这7个糖的MW是1160Da,与通过质谱分析法测定的脱硫酸聚糖基序的MW对应。硫酸基团与半乳糖连接,因为其中流感病毒繁殖的细胞包含用于半乳糖硫酸化的酶(半乳糖硫酸酯酶)。
Claims (13)
1.一种流感病毒血细胞凝集素特异性单克隆抗体,其由在登记号CNCM I-3787下在CNCM保藏的Y6F5杂交瘤产生。
2.如权利要求1中所述的单克隆抗体,其为人源化形式。
3.一种用于检测生物材料中的流感病毒或流感病毒血细胞凝集素的方法,其包括使所述材料与如权利要求1至2之一中所述的单克隆抗体接触的步骤,以便在所述单克隆抗体与所述生物材料中包含的流感病毒血细胞凝集素之间的特异性相互作用后形成抗原/抗体复合物,以及其中揭示这些抗原/抗体复合物的存在的步骤,其中所述方法不用于疾病的治疗或诊断。
4.如权利要求3中所述的方法,其包括使所述材料与固体支持体接触的在前步骤,所述固体支持体与特异性识别流感病毒结构的捕获试剂结合。
5.一种用于测定生物材料中包含的流感病毒血细胞凝集素的方法,其中所述方法不用于疾病的治疗或诊断,其包括下述步骤:
a)使所述材料与结合第一种特异性单克隆抗体的固体支持体接触,所述第一种特异性单克隆抗体识别所述流感病毒血细胞凝集素的蛋白质结构;
b)起因于这种单克隆抗体与所述生物材料中包含的流感病毒血细胞凝集素的特异性相互作用的抗原/抗体复合物特异性保留在所述固体支持体上;
c)使所述固体支持体上保留的所述抗原/抗体复合物与直接或间接携带标记的如权利要求1至2之一中所述的第二种单克隆抗体接触;
d)测量已与所述抗原/抗体复合物特异性结合的所述标记量;和
e)基于测量的所述标记量,通过与一种或多种参照试剂相比较测定所述材料中包含的所述血细胞凝集素量。
6.如权利要求5中所述的测定法,其中所述材料是包含源于一个或多个流感病毒毒株的血细胞凝集素的疫苗制剂。
7.一种用于测定生物材料中包含的流感病毒血细胞凝集素的方法,其中所述方法不用于疾病的治疗或诊断,其包括下述步骤:
a)使所述材料与固体支持体接触,所述固体支持体结合如权利要求1至2之一中所述的第一种单克隆抗体;
b)起因于所述单克隆抗体与所述材料中包含的流感病毒血细胞凝集素的特异性相互作用的抗原/抗体复合物特异性保留在所述固体支持体上;
c)使所述固体支持体上保留的所述抗原/抗体复合物与直接或间接携带标记的如权利要求1至2之一中所述的第二种单克隆抗体接触;所述第二种单克隆抗体与所述第一种抗体不同或相同都是可能的;
d)测量已与所述抗原/抗体复合物结合的所述标记量;和
e)基于测量的所述标记量,通过与一种或多种参照试剂相比较测定所述材料中包含的所述血细胞凝集素量。
8.如权利要求7中所述的测定法,其中所述生物材料是包含源于一个或多个流感病毒毒株的血细胞凝集素的纯化疫苗制剂。
9.如权利要求3至8之一中所述的测定法,其中所述生物材料是禽类起源的。
10.一种用于纯化来自禽类起源的生物材料的流感病毒或流感病毒血细胞凝集素的方法,其包括下述步骤:
a.使所述材料与固体支持体接触,所述固体支持体结合如权利要求1至2之一中所述的第一种单克隆抗体;
b.起因于所述单克隆抗体与所述材料中包含的流感病毒血细胞凝集素的特异性相互作用的抗原/抗体复合物特异性保留在所述固体支持体上;
c.从所述固体支持体上保留的所述抗原-抗体复合物释放所述流感病毒或流感病毒血细胞凝集素;和
d.回收所述流感病毒或所述流感病毒血细胞凝集素。
11.一种药物组合物,其包括如权利要求1至2之一中所述的单克隆抗体。
12.如权利要求1至2之一中所述的单克隆抗体用于制备预期用于预防或治疗流感的药物的用途。
13.有效量的如权利要求11中所述的药物组合物在制备用于阻止个体染上流感或治疗患有流感的个体的药物中的用途。
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