CN102702322B - 一种h1亚型特异性保守表位、抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于流感病毒领域，公开了高度保守的H1型流感病毒血凝素特异性抗原表位及其应用。该高度保守的H1型流感病毒血凝素特异性抗原表位序列如SEQ ID NO：1所示。本发明利用人工合成肽库与H1N1pdm流感病人恢复期血清IgG结合筛选反应性强的合成肽。通过合成肽偶联物免疫、免疫印迹鉴定、生物软件Bioedit比对和swiss-model数据库同源建模等方法，确定了一个高度保守的H1亚型流感病毒特异性抗原表位。本发明提供的抗原表位及其抗体可制备H1亚型流感病毒感染的诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及流感病毒，特别是可用于该病毒所致疾病的诊断和预防领域的新表位和相应的抗体。
背景技术
甲型流感病毒(简称IAV)是正粘病毒科的重要成员，广泛分布于自然界，对多种禽类和哺乳动物具有高度传染性。甲型流感病毒可引起每年季节性流行和反复的大流行，对全世界经济和公共卫生都造成了严重的危害。上世纪曾发生过三次流感大流行，其流行毒株分别是1918A/H1N1，1957A/H2N2和1968A/H3N2。1918年西班牙流感是其中最严重的大流行，共造成全球至少5000万人死亡。与1918大流行相比，其余的两次大流行危害较小，但也分别造成了近200万和100万人的死亡。2009年暴发的甲型H1N1流感大流行已遍布全球，在214个国家和地区造成了18389人死亡。
甲型流感病毒的基因组由八个单股负链RNA片段组成，至少编码10种蛋白，包括两种表面糖蛋白(HA和NA)，六种内部蛋白(NP，PB1，PB2，PA，M1和M2)和两种非结构蛋白(NS1和NS2)。根据HA和NA抗原性不同，甲型流感病毒可分为16个HA亚型(H1～H16)和9个NA亚型(N1～N9)。目前16个HA亚型均可感染禽类，而感染人的流感目前只发现H1、H2、H3、H5、H7及H9六个HA亚型。H1，H2和H3亚型可引起流感大流行。H1和H3两种亚型在人群中一直存在，与乙型流感病毒一起构成了季节性流感的主要病原。
HA由病毒基因组片段4编码，是一个长约550个氨基酸的糖蛋白，其生物活性形式为同源三聚体分子。HA是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，其疏水性羧基端插入病毒囊膜的脂质双层。HA在流感病毒的致病过程中发挥了重要作用。HA的主要作用是与靶细胞表面受体结合，进而介导病毒与细胞膜的融合。HA也是激发宿主保护性免疫特别是中和抗体的主要病毒成分。由于其免疫反应的特异性，HA也是免疫试验划分亚型的重要依据。
目前，甲型流感病毒抗体亚型划分主要依赖于血凝抑制试验(HI试验)。HI试验相对费力且需要从活病毒中制备抗原，具有潜在危险性。而且，HI试验结果可受NA抗体的干扰，导致非特异性的抑制和误鉴。微量中和试验也是流感病毒抗体亚型划分的替代方法。但是，由于需要细胞培养过程，该方法费时费力，不适合于大规模研究。最近，对不同种类的ELISA方法对IAV抗体进行亚型划分也有报道，然而目前的方法主要依赖于重组HA抗原，在一定程度上可导致非特异性检测。
A型流感来源的表位是准确评估免疫反应和区分反应特异性的有用工具。已有报道发现了HA亚型特异性和亚型间保守表位。利用表位研制的ELISA方法对某一特定HA亚型是高度保守和特异的将会对IAV的快速简单分型有用。然而，这样的表位仍未被充分研究。
H1亚型流感是人群中最主要的流感亚型，是造成至少两次大流行和多年来季节性流行的病原。2009甲型H1N1流感大流行的到来再次说明了H1亚型流感检测，监测和控制的重要性。
发明内容
在本研究中，我们成功鉴定了一个在所有H1亚型流感病毒株中高度保守的特异性表位。基于此表位，我们建立了H1亚型检测的方法，该方法与HI试验具有良好的相关性。这种使用本发明的抗原表位检测H1亚型的方法快速、简便并且没有活病毒的潜在危险。
在本发明的第一方面，提供一种高度保守的H1亚型特异性流感病毒血凝素抗原表位，该抗原表位是由15个氨基酸残基构成的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在本发明的第二方面，提供一种检测H1亚型的方法，该方法使用第一方面所述抗原表位进行检测。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)使待测样品与权利要求1所述抗原表位接触；
b)向步骤a)的所得物中加入带标记的对应二抗；
c)直接检测所述标记或者向步骤b)的所得物中加入与所述标记发生反应的指示剂后检测。
在一个具体实施方案中，所述方法为ELISA方法，并使用所述抗原表位作为包被抗原。
在本发明的第三方面，提供一种H1流感病毒的诊断试剂盒，该试剂盒包括第一方面所述抗原表位。
在本发明的第四方面，提供第一方面所述抗原表位在制备H1流感病毒的诊断试剂中的应用。
在本发明的第五方面，提供由第一方面所述抗原表位制备的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。
在一个具体实施方案中，所述抗体是由第一方面所述抗原表位免疫小鼠而获得的抗血清。
在另一个实施方案中，所述抗原先与大分子偶联再用于制备所述抗体。在一个优选实施方案中，所述大分子是KLH。
在本发明的第六方面，提供一种检测H1亚型的方法，该方法使用第五方面所述抗体进行检测。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)使待测样品与权利要求7-11任一项的抗体接触；
b)向步骤a)的所得物中加入带标记的对应二抗；
c)直接检测所述标记或者向步骤b)的所得物中加入与所述标记发生反应的指示剂后检测。
在一个具体实施方案中，所述方法为ELISA方法，并使用所述抗体作为包被抗体。
在另一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)将待测样品经SDS-PAGE后转至硝酸纤维素膜并使所述膜与所述抗体接触；
b)加入荧光标记的对应二抗；
c)用成像系统对所述膜成像。
在本发明的第七方面，提供一种H1流感病毒的诊断试剂盒，该试剂盒包括第五方面所述抗体。
在本发明的第八方面，提供第五方面所述抗体在制备H1流感病毒的诊断试剂中的应用。
附图说明
图1为流感毒株A/California/04/2009血凝素蛋白(NCBI登录号ACP41105)免疫优势表位的合成肽筛选图。
图2为合成肽抗血清的滴度及其与纯化HA0蛋白(未切割的成熟血凝素蛋白)的反应。
图3为免疫印迹确定合成肽诱导抗体的特异性。A：H1～H16亚型HA蛋白分别与合成肽P3、P5和P31所诱导的抗体反应，Actin为肌动蛋白，作为细胞内参；B：不同年代来源的H1亚型HA蛋白分别与合成肽P5和P31所诱导的抗体及H1亚型HA抗血清(由本实验室制备)反应。
图4为合成肽的三维结构位置及保守性。
图5为P5合成肽表位的精细定位。用ELISA方法检测在表6所示合成肽存在时P5与相应抗体结合的百分率。
具体实施方式
所述H1亚型流感病毒血凝素线性抗原表位，是H1亚型流感病毒HA1亚基膜外茎状区的一种线性抗原表位。
本发明提供的H1亚型流感病毒血凝素线性抗原表位是采用人工合成肽库与H1N1pdm流感病人恢复期血清IgG结合筛选得到的。
本发明的技术途径是首先人工合成H1N1pdm流感病毒株A/California/04/2009血凝素膜外区的肽库。每条肽段的长度为15个氨基酸残基，与相邻肽段重合5个氨基酸残基。以合成肽包被酶标板，用H1N1pdm流感病人恢复期血清进行筛选，获得反应性强的合成肽。将反应性强的合成肽与KLH偶联后免疫小鼠，收获抗血清。通过免疫印迹鉴定、生物软件Bioedit比对和swiss-model数据库同源建模等方法，确定了一种高度保守的H1亚型流感病毒特异性抗原表位。
下面结合优选实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规条件和方法，如分子克隆实验室手册(Sambrook，et al.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述方法或试剂制造商提供的方法。
实施例
实施例1.A/H1N1pdm血凝素蛋白免疫优势表位的鉴定
1.1A/H1N1pdm流感血凝素蛋白膜外区肽库的合成
以固相方式合成了50条A/H1N1pdm流感血凝素蛋白膜外区(18-523a.a)肽库。肽库由上海生物工程技术有限公司合成。每条肽的长度为15个氨基酸残基，与邻近肽重叠5个氨基酸残基。所用合成肽通过高效液相色谱纯化，纯度＞95％，并通过质谱鉴定。
所有合成肽的氨基酸序列及位置示于表1。
表1A/H1N1pdm流感血凝素蛋白膜外区肽库
1.2间接ELISA筛选免疫优势表位
11份A/H1N1pdm流感病人恢复期血清于2009年北京甲流暴发期间采集。10份健康人血清作为阴性对照。
将稀释于包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)中的合成肽(1μg/孔)包被于酶标板，4℃过夜，加入封闭液(1％BSA)37℃2-3小时，用含0.1％吐温-20(v/v)的PBST洗涤，甩干洗涤液。每孔加入100μl1∶200稀释的上述血清，37℃孵育2小时，甩掉液体，用PBST缓冲液洗涤5次。然后每孔加入100μl1∶40000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗人IgG，37℃孵育1小时，甩掉液体，用PBST洗涤5次。每孔加入100μl 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物显色，15分钟后加入50μl 2M H2SO4显色并立即测定450nm处的吸光值。以阴性对照血清的OD450nm值加上3倍标准差确定取舍点(cut-off)值(0.35)。计算每条合成肽在11份A/H1N1pdm流感病人恢复期血清中的阳性反应率，结果见图1。P3、P5、P15、P16和P31五条肽与H1N1pdm流感病人恢复期血清普遍反应，反应率依次为54.5％、100％、81.8％、81.8％和100％。
实施例2.免疫优势肽的抗原性
2.1肽与KLH的偶联
肽与KLH的偶联由上海生物工程技术有限公司完成。
肽的偶联以如下方式进行：
合成肽P3、P6和P30(P6和P30为阴性反应对照)分别直接与KLH偶联。
为了增加偶联物的溶解性和免疫原性，合成肽P5、P15、P16和P31分别首先与6-氨基己酸连接，然后添加一个三肽(KKC)，再与KLH偶联。
表2是免疫所用肽-KLH偶联物的序列
表2用于免疫的肽-KLH偶联物的氨基酸序列
[Acp]：氨基乙酸
2.2免疫方案
与KLH连接的肽的免疫方案如下：
共进行4次免疫，每次间隔14天。首次免疫时，将等体积肽-KLH偶联物与弗氏完全佐剂混合，皮下注射至6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠注射100μg 肽-KLH偶联物。加强免疫时，将等体积肽-KLH偶联物与弗氏不完全佐剂混合，皮下注射至6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠注射50μg 肽-KLH偶联物。在最后一次免疫5天后眼球采血。分离血清置于-20℃至后期使用。
2.3免疫血清滴度测定
将稀释于包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)中的合成肽(1μg/孔)包被于酶标板，4℃过夜，加入封闭液(1％BSA)37℃2-3小时，用PBST洗涤，甩干洗涤液。每孔加入100μl系列稀释的相应小鼠免疫血清，37℃孵育1小时，甩掉液体，用PBST缓冲液洗涤5次。然后每孔加入100μl 1∶40000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1小时，甩掉液体，用PBST洗涤5次。每孔加入100μl 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物显色，15分钟后加入50μl 2M H2SO4显色并立即测定450nm处的吸光值。以免疫前小鼠血清的OD450nm的2.1倍作为cut-off值。
结果见图2A。
除P15外，其余六条多肽均诱导出较强的抗体。P3、P5、P6、P16、P30和P31六条肽诱导的抗体滴度分别为1∶6400、1∶51200、1∶51200，1∶12800、1∶51200和1∶25600。
2.4免疫血清与HA蛋白反应性
通过ELISA和免疫印迹检测免疫血清与HA蛋白的反应性。
200ng纯化的H1N1pdm HA0蛋白(eENZYME产品)经10％SDS-PAGE后转至硝酸纤维素膜(Pall公司产品)。用5％脱脂奶封闭2小时，与1∶500稀释的合成肽免疫小鼠血清孵育过夜。膜经0.1％PBST洗涤四次，加入1∶10000稀释的Fluor 800标记的山羊抗小鼠IgG二抗(Li-Cor公司)。1％PBST洗膜，用近红外成像系统(Li-Cor公司)扫膜，用Odyssey软件进行分析。
结果示于图2B。
P3、P5和P31鼠抗血清与HA0蛋白显示出很强的反应，P6和P30鼠抗血清不与HA0蛋白反应，这一结果与预期相符。遗憾的是，P16抗血清不与HA0蛋白反应。
将稀释于包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)中的H1N1pdm纯化HA0蛋白(0.1μg/孔，eENZYME公司)包被于酶标板，4℃过夜，加入封闭液(1％BSA)37℃2-3小时，用PBST洗涤，甩干洗涤液。每孔加入100μl1∶400稀释的小鼠免疫血清，37℃孵育1小时，甩掉液体，用含0.1％吐温-20(v/v)的PBST缓冲液洗涤5次。然后每孔加入100μl 1∶40000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1小时，甩掉液体，用PBST洗涤5次。每孔加入100μl 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物显色，15分钟后加入50μl 2M H2SO4显色并立即测定450nm处的吸光值。以免疫前小鼠血清的OD450nm的2.1倍作为cut-off值。
结果示于图2C。
P3、P5和P31鼠抗血清显示出很强的阳性反应，P6和P30鼠抗血清不反应。P16鼠抗血清显示出相对较弱的阳性反应。
实施例3.表位的特异性
3.1H1-H16亚型HA真核表达载体的构建
不同年份的H1亚型及H2-H16亚型流感病毒血凝素基因的信息见表3。
表3不同年份的H1亚型及H2-H16亚型流感病毒血凝素基因信息
根据不同年份的H1亚型及H2-H16亚型流感病毒血凝素基因的开放阅读框(ORF)序列设计引物。引物序列见表4。
表4不同年份的H1亚型及H2-H16亚型流感病毒血凝素基因扩增引物
PCR扩增不同年份的H1亚型及H2-H16亚型流感病毒血凝素基因的ORF片段，切胶回收。采用EcoRV边切边连的方式插入pCAGGS载体(购自Addgene)。切连体系(25μl)：10×T4DNA连接酶缓冲液2.5μl，EcoRV 1.5μl，T4DNA连接酶1μl，pCAGGS质粒1μl(50ng)，DNA回收片段19μl。PCR和DNA测序鉴定。
3.2免疫印迹检测表位的特异性
分别用上述鉴定正确的真核质粒转染293T细胞。转染后48h收集细胞并用Triton X-100裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，150mMNaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100，蛋白酶抑制剂)裂解细胞。等量(80μg总蛋白)细胞裂解物经10％SDS-PAGE后转至硝酸纤维素膜(Pall公司产品)。5％脱脂奶封闭2小时，与1∶500稀释的合成肽免疫小鼠血清孵育过夜。膜经0.1％PBST洗涤四次，加入1∶10000稀释的Fluor 800标记的山羊抗小鼠IgG二抗(Li-Cor公司)。0.1％PBST洗膜，用近红外成像系统(Li-Cor公司)扫膜并用Odyssey软件分析。
结果示于图3。
P3抗血清与H1(包括07H1和09H1)、H2、H5和H6亚型HA蛋白反应，P5和P31抗血清仅与H1亚型HA蛋白反应。而且，P5和P31抗血清与不同年代来源的H1亚型HA蛋白均反应。
实施例4.同源建模分析和序列比对
将H1N1pdm流感毒株的HA氨基酸序列递交到Swiss-model数据库中，寻找已知空间构象的同源蛋白。通过Swiss-model自动同源建模程序，依据蛋白2wr0B的三维结构模拟出H1N1pdm流感HA的三维结构。用Rasmol软件标记出反应性强的合成肽对应的三维结构位置，确定P5表位位于茎部区。结构见图4A。
从上述表3所示H1亚型不同年份毒株和H2-H16亚型流感病毒血凝素基因信息中找出P5肽所对应的氨基酸序列，用Bioedit软件对P5氨基酸序列进行比对。结果发现P5肽在不同年份H1亚型HA序列中保守，其氨基酸序列与H2-H16亚型相应序列同源性不高(图4B)。
实施例5.In silico分析
用流感研究数据库(http://www.fludb.org)中的生物信息学工具对P5表位进行了In silico分析。我们先用蛋白短肽鉴定程序搜寻与P5肽相似的短肽序列，当数据库参数设为Influenza A segment 4H1proteins(A型流感病毒H1亚型血凝素蛋白)或Influenza Ahemagglutinin proteins(A型流感病毒血凝素蛋白)时，查找到的短肽数分别为9860和10650个。然后我们用蛋白搜寻工具进行查找，当亚型参数设为H1或H2-H16时，搜到的蛋白数分别为10767和23895个。由此鉴定P5在H1亚型HA蛋白的出现率为91.6％(9860/10767)，在H2-H16亚型HA的出现率为3.3％(790/23895)，说明P5肽是H1亚型特异的且非常保守。结果见表5。
表5P5在H1亚型HA蛋白中的出现频率
实施例6.P5合成肽表位的精细定位
为了进一步确定P5肽中起关键作用的氨基酸残基，我们合成了一系列肽段，见表6。
表6用于P5合成肽精细定位的肽段
将稀释于包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)中的P5肽(1μg/孔)包被于酶标板，4℃过夜，加入封闭液(1％BSA)37℃2-3小时，用PBST洗涤，甩干洗涤液。将不同浓度的上述合成肽与1∶5000稀释的P5小鼠抗血清混合，37℃孵育1小时。同时设立未加合成肽的P5小鼠抗血清对照。每孔加入100μl上述孵育后的肽-抗体混合物，37℃孵育1小时，甩掉液体，用含0.1％吐温-20(v/v)的PBST缓冲液洗涤5次。然后每孔加入100μl 1∶40000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1小时，甩掉液体，用PBST洗涤5次。每孔加入100μl3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物显色，15分钟后加入50μl2M H2SO4显色并立即测定450nm处的吸光值。
结果示于图5。
合成肽N10～N14及C12～C14可明显抑制P5与相应抗体的结合，而合成肽N6～N9及C6～C11不能明显抑制P5与相应抗体的结合，由此推测与P5所诱导抗体结合所需的最短氨基酸序列为LRGVAPL。
实施例7.H1亚型流感病毒抗体诊断方法的构建及与HI试验结果比较
7.1ELISA试验
直接以人工合成SEQ ID NO：1所示的P5肽作为抗原，包被96孔酶标板，4℃包被过夜，PBST洗板三次，用1％BSA4℃封闭过夜；弃封闭液，PBST洗板3次，每孔加入100μl1∶400稀释的正常人血清，同时以等量1∶400稀释的健康人血清做阴性对照，37℃孵育1小时，PBST洗板5次，每孔加入100μl 1∶40000倍稀释的HRP标记的山羊抗人抗体，37℃孵育1小时，PBST洗板4次，以TMB显色剂进行显色，酶标仪检测各孔OD450。阴性对照血清平均OD450为0.107，Cut-off值为0.224。计算100份正常人血清中H1亚型流感病毒抗体的阳性数和阴性数。
7.2HI试验
1体积待检血清与4体积RDE(受体破坏酶)混合，37℃水浴过夜，此步骤除去非特异性凝集素。RDE处理血清经56℃热灭活30min，然后经待检红细胞4℃1小时吸附去除非特异性凝集素，1体积红细胞可去除20倍体积RDE处理血清。待检血清在V型血凝板中进行2倍系列倍比稀释，起始稀释度为1∶10，每孔25μl。每孔加入25μl四血凝单位参比抗原，室温孵育30min。然后每孔加入50μl1％鸡红细胞悬液，室温孵育30min。待检血清对参比抗原的抑制效价≥1∶40算为阳性。此次试验分别以流感毒株A/Tianjinjinnan/15/2009(H1N1)、A/California/04/2009(H1N1)和A/Fujiantongan/196/2009(H3N2)(以上流感毒株由中国CDC提供)作为参比抗原，检测100份正常人血清中相应抗体的检出率。
合成肽ELISA和HI试验结果的比较见表7。合成肽ELISA和HI试验结果的一致性为87％，两种方法具有相关性。
表7合成肽ELISA与HI试验结果比较
＊x2＝58.01，P＜0.01，两种方法具有相关性。
Claims (6)
1.一种H1亚型特异性流感病毒血凝素抗原表位，该抗原表位是由15个氨基酸残基构成的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种检测H1亚型的非诊断方法，其特征在于，使用权利要求1所述抗原表位进行检测。
3.一种权利要求2的非诊断方法，包括以下步骤：
a)使待测样品与权利要求1所述抗原表位接触；
b)向步骤a)的所得物中加入带标记的对应二抗；
c)直接检测所述标记或者向步骤b)的所得物中加入与所述标记发生反应的指示剂后检测。
4.一种权利要求2或3的非诊断方法，其特征在于，所述方法为ELISA方法，并使用所述抗原表位作为包被抗原。
5.一种H1流感病毒的诊断试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求1所述抗原表位。
6.权利要求1所述抗原表位在制备H1流感病毒的诊断试剂中的应用。
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Non-Patent Citations (3)
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| CN102702322A (zh) | 2012-10-03 |
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