KR20180038261A - H7n9 조류 인플루엔자 바이러스 검출을 위한 효소면역 측정키트 - Google Patents

H7n9 조류 인플루엔자 바이러스 검출을 위한 효소면역 측정키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 단백질에 대한 항원 검출을 위한 효소면역 측정키트에 관한 것이다.

Description

H7N9 조류 인플루엔자 바이러스 검출을 위한 효소면역 측정키트 {An enzyme immuno assay kit for detecting H7N9 avian influenza virus}
본 발명은 H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 항원 검출을 위한 효소면역 측정키트에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 오트로믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae)에 속하며, 이는 단쇄, 나선형 RNA 바이러스로, 핵산의 구성에 따라 A, B, C 형으로 구분된다. A 형 인플루엔자 바이러스는 표면 항원인 HA (hemagglutinin)와 NA (neuraminidase)에 의해서 아형 (subtype)이 결정된다. 이러한 HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며 16 가지 아형 (H1 ~ H16)이 존재한다. NA는 바이러스가 감염된 세포로부터 방출되어 새로운 호흡기 세포로 전파되는데 중요한 역할을 하며, 이는 9 가지 아형 (N1 ~ N9)이 있다.
인플루엔자 바이러스 중, H7N9 조류 인플루엔자는 조류에서 저병원성으로 나타나는 것으로 알려져 있으나, 2013년 중국에서 처음으로 인체감염이 발생한 이후 감염이 증가되고 있으며, 감염자의 대다수가 심각한 질환을 일으킨 것으로 확인되었다. 이러한 H7N9 조류 인플루엔자바이러스에 대해 현재까지 사람 간 전파는 보고되지 않았으나, 노출경로와 바이러스가 일으키는 질병의 범위 등의 정보는 제한적으로 알려져 있으므로 잠재적인 대유행 가능성 우려가 크다. H7N9 조류인플루엔자 바이러스는 주로 중국에서 발병되었고, 현재까지 총 19 개 지역에서 722 명의 감염자가 확인되었으며, 이 중 286 명의 사망이 확인되어 약 40 %의 사망률을 보이고 있다.
이러한 인플루엔자 바이러스의 효과적인 예방책은 백신이며, 이는 인플루엔자 바이러스의 HA와 NA 표면항원, 그 중 HA에 대한 면역이 인플루엔자 바이러스 예방에 큰 영향을 미친다. 인플루엔자 백신은 비활성화백신과 생백신이 있으며, 비활성화백신은 유정란에서 배양한 바이러스를 정제하여 비활성화하여 만든다. 이에 대한 것이 전바이러스 백신 (whole virus vaccine), 분할 백신 (split vaccine), HA와 NA 성분을 정제한 아단위 백신 (subunit vaccine) 등이 있고, 생백신에는 약독화 백신 (live attenuated virus vaccine)이 개발되어 사용되고 있다.
인플루엔자 백신의 제조 공정 중, 항원 함량 검출 시험방법은 SRID (Single Radial Immunodiffusion) 방법을 이용하여 측정하고 있다. 상기 시험방법에 사용되는 시료는 WHO에서 지정한 연구 기관 등에서 공급하고 있는데, 특정 바이러스의 대유행 상황 (Pandemic 혹은 epidemic)에서 다수의 해외 백신 제조 회사가 이의 시료를 공급받게 된다면 병목현상으로 인하여 국내 수급이 어려울 수 있고, 이에 따라 백신 공급에 차질이 발생할 수 있다. 이러한 상황에서 SRID 시험방법의 대체 시험방법에 대해 논의가 되고 있으며, 그 중 한 가지 방법이 효소면역 측정방법이다.
효소면역 측정방법 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)이란 면역정량법으로 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 복합체를 형성함으로써 이의 효소와 기질의 반응을 통해 흡광도를 이용하여 정량하는 방법이다. 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법 (colormetric method), 전기화학법 (electrochemical method), 형광법 (fluorimetric methd), 발광법 (luminometry), 입자계수법 (particle counting method) 등에 적용이 가능하다. 항원-항체 복합체를 형성하여 사용하는 효소면역 측정방법은 시험 방법이 간단하고 비용이 많이 들지 않으며 다량 분석이 가능하여 가장 널리 쓰이고 있는 분석법의 하나가 되고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 대유행 상황에서 기존 시험법을 적용하지 못할 상황을 대비하여, 신속히 항원을 검출할 수 있는 효소면역 진단방법을 구축하기 위해 예의 노력한 결과, 대장균 발현 시스템을 이용하여 제조한 H7N9 바이러스의 항원 재조합 단백질을 이용한 효소면역 측정키트를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는, H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (Hemagglutinin, HA) 단백질 변이체를 항원으로 포함하는 인플루엔자 바이러스에 특이적인 혈청 진단용 또는 중화항체 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항원과 동물의 혈청 시료를 접촉시키는 단계, 및 상기 혈청 시료 중 항원과 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7N9에 특이적인 혈청 진단 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는, H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (Hemaglutinin, HA) 단백질 변이체를 항원으로 포함하는 인플루엔자 바이러스에 특이적인 혈청 진단용 또는 중화항체 스크리닝용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 항원 검출을 위한 효소면역 진단키트를 개발하기 위해 H7N9 A/Anhui/1/2013 바이러스의 HA (Hemagglutinin) 단백질 부분에 대하여 재조합 단백질 부분을 선정하였고, 이 부분을 대장균 단백질 발현 시스템을 이용하여, 제조 및 정제하였다. 이를 토끼에 접종하여 항혈청을 확보하였고, 혈청 내 항체를 정제하여 효소면역 진단키트의 원료를 확보하였다. 나아가, 상기 원료에 대한 결합 테스트를 통해 적정 농도 및 결합 조건을 확인하였으며, 개발된 효소면역 측정키트를 이용한 H7N9 바이러스의 항원 검량을 확인하여, 이를 바탕으로 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에서 상기 키트는 선행 특허 (특허출원번호 제10-2016-0075619)에서 개발한 재조합 단백질을 이용하여, 효소면역 진단키트의 원료 물질로 이용한다. 이에, 상기 선행 특허에 기술된 사항은 모두 본 발명의 범주 내에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 재조합 단백질은 B 세포 결정기 (B cell epitope) 핵심 배열인 150 ~ 300 아미노산 잔기의 말단에 해당하는 염기 배열을 바꾸어서 제조한 것 중에서 가장 효과적인 재조합 단백질을 선별한 것으로, 본 발명자들은 이를 HA-B (서열번호 1)로 명명하였다.
이러한 원료 물질을 대장균 발현시스템을 이용해 발현시켜, 이로부터 단백질을 확보하고, 이를 토끼에 접종하여, 키트의 원료물질인 항체를 확보할 수 있다.
상기 키트는 구체적으로 효소면역측정법 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 키트일 수 있고, 상기 ELISA는 직접 ELISA, 간접 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA 또는 간접적 샌드위치 ELISA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 키트는 H7N9 조류 인플루엔자 바이러스에 특이적인 중화항체를 확인하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명은 다른 양태로서, (a) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7N9의 HA 단백질 변이체 항원과 분리된 동물의 혈청 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 혈청 시료 중 상기 HA 단백질 변이체 항원과 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7N9에 특이적인 혈청 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 항원 검출을 위해 SRID (Single radial immunodiffusion) 시험 방법 부재 시, 이의 대체의 효과를 제공한다.
도 1은 본 발명에서 H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 효소면역 측정키트를 개발하기 위한 재조합 단백질 모식도이며, 이의 발현 플라스미드인 pET-21a(+)의 모식도와 이의 유전자 클로닝 결과이다.
도 2는 본 발명에서 H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 효소면역 측정키트를 개발하기 위한 재조합 단백질을 확인한 것이다. 이는 도 1에서 개발한 플라스미드를 이용하여 숙주 세포인 BL21(DE3)에 형질전환을 수행하고, 이의 배양을 통해 재조합 단백질의 발현 및 정제를 통하여 개발된 최종 산물이다.
도 3은 본 발명에서 개발한 재조합 단백질을 토끼에 면역하여 얻은 혈청에 대한 재조합 단백질 간의 효소면역 반응시험으로 혈청 내 항체 형성 여부를 확인한 시험이다.
도 4는 본 발명에서 확보한 혈청에서 항체를 정제한 이후, 이에 대한 전기 영동을 통해 단백질을 분석한 시험이며, 정제된 항체에 대한 재조합 단백질 간의 효소면역 반응시험으로 항체 효능을 확인한 결과이다
도 5는 본 발명에서 항체를 biotin conjugation을 수행한 이후, 이를 이용한 효소면역 측정키트에 사용하기 위한 결합 반응 시험으로 최적 조건을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 개발한 효소면역 측정키트에 H7N9 조류 인플루엔자 바이러스를 적용하여, 항원을 검출한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: 헤마글루티닌 (hemagglutinin) 단백질 변이체의 선별
본 발명에서는 H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 효소면역 측정키트 개발을 위해, H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (Hemagglutinin, HA) 단백질 서열 중 B 세포 결정기 (B cell eptiope)의 핵심 배열인 150 ~ 300 아미노산 잔기의 말단에 해당하는 염기배열을 바꾸어서 재조합 단백질 후보들을 발생시켰으며, 그 중에서 효소면역 측정키트 개발을 위한 가장 효과적인 후보를 선정하였고, 이를 HA-B (서열번호 1)로 명명하였다.
실시예 2: HA-B 발현 플라스미드 벡터 및 HA-B 단백질의 제조
HA-B의 발현을 위해 pET-21a(+) 발현 플라스미드를 이용하여 클로닝을 수행했다. 상기 플라스미드는 일반적으로 대장균에서 발현 플라스미드로 사용되는 것이다. HA-B의 클로닝을 완료한 후, DH5α에 삽입하여 클로닝 완료를 확인하였다 (도 1). 완료가 된 플라스미드를 BL21(DE3) 대장균 세포주에 형질전환을 진행하여, 37 ℃에서 통상적으로 사용되는 LB 배지와 IPTG 1 mM을 이용하여 배양하였다. 배양이 완료된 세포를 6000 rpm, 4 ℃로 20 분간 원심분리를 진행하여, 배양배지가 제거된 세포주를 확보하였다. 그 다음, 소니케이션 (sonication)을 이용하여, 세포의 파쇄를 진행하였다. 파쇄가 완료된 배양물을 13000 rpm, 4 ℃에서 10 분간 원심분리를 진행하여, 가용성 단백질과 불용성 단백질을 분리하였다. 이 중 불용성 단백질에 요소 (urea)를 이용하여 상온에서 약 2 시간 동안 반응시켜, 변성 (denaturation)을 완료하였다. 반응이 완료된 단백질을 13000 rpm, 4 ℃에서 10 분간 원심분리를 진행하여, 변성이 완료된 단백질을 확보하며, 이를 Nikel resin을 통하여 정제과정을 완료했다. 각 정제 시 발생하는 용출 분획 (elution fraction)들을 SDS-PAGE 분석을 수행하여, 정제된 HA-B 부분을 확인하였으며, 선정된 분획들을 urea dialysis를 통해 최종 사용하려는 HA-B를 정제하였다 (도 2).
실시예 3: HA-B 단백질을 이용한 항체 생산
상기 실시예 2를 통하여 정제된 HA-B 단백질을 이용하여 항체를 생산하기 위해, 항원을 토끼 (New Zealand white)에 접종하였다. 1 차 면역은 항원을 complete Freund's adjuvant와 혼합하여 피하 (SC) 주사하고 4 주 후 incomplete Freund's adjuvant와 혼합하여 1 차 부스팅 (boosting)을 진행하였다. 2 주 간격으로 부스팅을 진행하였고, 3 차 부스팅 1 주 후 토끼 심장으로부터 채혈하여 최종 혈청을 분리하였다. 상기 혈청 내에 항체가 형성된 것을 확인할 수 있었다 (도 3).
그 다음, 상기 확보한 최종 혈청으로부터 항체 IgG를 정제하기 위해 Protein G를 이용했다. 이를 위해 확보된 혈청과 Protein G 수지를 상온에서 4 시간 동안 반응시켜주었다. 그 다음 항체를 정제하기 위해 글리신 완충액 (glycine buffer)을 이용하여, 용출 분획을 확보한 이후, 중화 용액인 트리스 완충액 (Tris buffer)을 투여하였다. 확보된 용출 분획에 대해 SDS-PAGE 분석을 수행하여, 최종 항체를 정제하였다. 정제된 항체에 대해 HA-B 단백질로 효소면역 반응시험을 수행하여 항체의 효능을 확인하였다 (도 4).
실시예 4: 효소면역 측정키트의 제작
상기 실시예 3에서 정제한 항체를 이용하여 효소면역 측정키트를 제작하기 위해, 각 항체에 바이오틴 결합 (biotin conjugation)을 수행한 이후, 적정 결합 조건을 찾기 위해 농도에 따른 시험을 수행했다. 포획 항체 (Capture antibody)는 정제된 항체를 사용하였고, 검출자 항체 (Detector antibody)는 바이오틴이 결합된 항체를 이용하였다. 이에 따라, Capture 5 ㎍/ml, Detector 2000 ng/ml과 Capture 1 ㎍/ml, Detector 4000 ng/ml 시험 조건을 확보하였고, spiking recover로 적정 수준 (80 ~ 120 %)을 유지하는 것을 확인할 수 있었다 (도 5). 이를 H7N9 인플루엔자 바이러스에 적용하여, 원액 바이러스로부터 1 ~ 20 배 희석에 대한 적정 항원 측정량을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> IL-YANG PHARM. CO.,LTD <120> An enzyme immuno assay kit for detecting H7N9 avian influenza virus <130> KPA161404-KR <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 498 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-B <400> 1 atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgaggat ccggatcttc attctatgca 60 gaaatgaaat ggcttctttc aaacacagat aatgctgcat tcccacagat gactaagtca 120 tataaaaata caagaaaaag cccagctcta atagtatggg gaatccatca ttccgtatca 180 actgcagagc aaaccaagct atatggaagt ggaaacaaac tggtgacagt tggaagttct 240 aattatcaac aatcttttgt accaagtcca ggagcgagac cacaagttaa tggtctatct 300 ggaagaattg actttcattg gctaatgcta aatccaaatg atacagtcac tttcagtttc 360 aatggagctt tcatagctcc agaccgtgct agcttcctga gaggaaaatc tatgggaatc 420 cagagtggag tacaggttga tgccaattgt gaaggagact gctatcatag tggaggaaca 480 ataataagta accttgag 498

Claims (5)

  1. 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는, H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (Hemagglutinin, HA) 단백질 변이체를 항원으로 포함하는 인플루엔자 바이러스에 특이적인 혈청 진단용 또는 중화항체 스크리닝용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 키트는 효소면역측정법 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 키트인 것을 특징으로 하는, 혈청 진단용 또는 중화항체 스크리닝용 키트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 ELISA는 직접 ELISA, 간접 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA 및 간접적 샌드위치 ELISA로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 혈청 진단용 또는 중화항체 스크리닝용 키트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 키트는 H7N9 조류 인플루엔자 바이러스에 특이적인 중화항체를 확인하는 것을 특징으로 하는, 혈청 진단용 또는 중화항체 스크리닝용 키트.
  5. (a) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7N9의 HA 단백질 변이체 항원과 분리된 동물의 혈청 시료를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 혈청 시료 중 상기 HA 단백질 변이체 항원과 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 조류 인플루엔자 바이러스 H7N9에 특이적인 혈청 진단 방법.
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