CN106866798A - J亚群禽白血病病毒特异性抗原表位、融合蛋白、特异性抗体及其应用 - Google Patents
J亚群禽白血病病毒特异性抗原表位、融合蛋白、特异性抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于动物疾病检测技术领域，公开了J亚群禽白血病病毒特异性抗原表位、融合蛋白、特异性抗体及其应用。本发明所述J亚群禽白血病病毒特异性抗原表位其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。实验表明，该抗原表位对J亚群血清有反应同时对AB亚群血清无反应，能够特异性识别J亚群禽白血病病毒。本发明所述融合蛋白能够制成疫苗，刺激受体产生抗体，保护受体抵抗J亚群禽白血病病毒感染。本发明所述融合蛋白免疫动物可制备J亚群禽白血病病毒特异性抗体。本发明所述J亚群禽白血病病毒特异性抗体可以与J亚群禽白血病特异性抗原表位特异性识别，开发检测试剂盒，用于区分AB亚群和J亚群禽白血病。
Description
技术领域
本发明属于动物疾病检测技术领域，具体涉及J亚群禽白血病病毒特异性抗原表位、融合蛋白、特异性抗体及其应用，尤其是J亚群禽白血病病毒GP85型特异性抗原表位、融合蛋白、特异性抗体及J亚群禽白血病检测试剂盒。
背景技术
禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)和禽肉瘤病病毒(ASV)引起的禽类肿瘤性疾病，对我国养鸡业危害重大。ALV/ASV可分为A-J 10个亚群，其中A、B和J亚群为发生于田间鸡的外源性病毒。目前该病尚无有效治疗手段，主要通过排除阳性鸡净化种群来控制该病传播。J亚型ALV可水平传播和垂直传播，垂直传递可导致子代免疫耐受，抗体检测表现为阴性。同时发病鸡出现急性肿瘤引起死亡，一旦发现患病需立即处理。AB亚型ALV主要通过垂直传播影响鸡雏质量，病鸡体重增长缓慢，产蛋量减少。对于J亚型和AB亚型ALV的诊断有助于根据不同亚群病毒引起的机理和症状进行禽白血病的防控，而鸡场也可根据成本和需求对病鸡进行分批次处理，减少经济损失。
抗原表位是指位于抗原分子表面具有特殊结构和免疫活性的化学基团，可刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能被其识别的部位，又称抗原决定簇，禽白血病病毒RNA编码区翻译gag-pol-env。gag基因编码病毒内部结构的核衣壳蛋白主要有P27、P19、P15、P12四种蛋白，P27蛋白在禽白血病毒中高度保守，已根据P27蛋白开发出多种禽白血病检测试剂盒。但只能用于检测ALV病毒不能区别各病毒亚群。
Env是囊膜糖基化表面蛋白，水解后形成膜表面蛋白SU(surface glycoprotein)(gp85基因编码)和跨膜蛋白TM(transmembrane protein)(gp37基因编码)，gp85决定病毒亚群特异性和宿主范围，是抗原表位的主要潜在区域。目前对禽白血病特异性亚群特异性抗原表位的研究工作都是基于gp85蛋白进行。
目前对亚群特异性抗原表位研究的方法局限于对所研究的特定亚群gp85蛋白进行分析，如定位J亚群抗原表位只针对J亚群gp85蛋白进行分析，检测方法中待测样品为J亚群特异性血清或ALV-J蛋白制备的鼠单抗，这种方法能找到的J亚群抗原表位但是特异性不强，不能排除找到的抗原表位区域包含有其他禽白血病亚群的抗原识别位点。在用重组蛋白对不同亚型禽白血病病毒感染血清进行区分时，由于各亚群gp85蛋白存在一定的同源性，所以无法对禽白血病抗体亚型进行体外诊断。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供J亚群特异性抗原表位，继而开发检测试剂盒用于区分AB亚群和J亚群禽白血病。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了J亚群禽白血病病毒特异性抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
申请人通过比对不同亚群gp85蛋白序列，找到AB亚群和J亚群gp85蛋白的差异性区域，从差异性区域筛选来源于AB亚群和J亚群的15个多肽进行合成，精确找到可区分禽白血病AB亚群和J亚群的多肽，同时免疫实验分析15个多肽时采用AB亚群特异性血清和J亚群特异性血清为样本，如某J亚群来源多肽对J亚群血清有反应同时对AB亚群血清无反应即为J亚群特异性抗原表位。相比于以前的研究来说，可找到能区分AB亚群和J亚群的特异性抗原表位。
其中，一种J亚群禽白血病病毒特异性抗原表位的氨基酸序列为NGTNRTCVTFGSVCYEENSRSRVCHIFDGNFNGTG(J-Pep5，SEQ ID NO：1)。实验表明，该抗原表位对J亚群血清有反应同时对AB亚群血清无反应，能够特异性识别J亚群禽白血病病毒。
本发明还提供了编码本发明所述特异性抗原表位的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特异性抗原表位的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组表达载体，含有本发明所述的DNA分子。
另一方面，本发明还提供了一种工程菌，其含有本发明所述的重组表达载体。
在本发明中，“工程菌”通过将重组表达载体热激转化进入宿主细胞所获得。本发明中所表达的“宿主细胞”包括原核或真核细胞。
所述宿主细胞选自大肠杆菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明所述的特异性抗原表位、DNA分子、重组表达载体、或所述工程菌都有益于禽白血病的预防或治疗，因此本发明提供了所述特异性抗原表位、DNA分子、重组表达载体、或所述工程菌在制备预防或治疗禽白血病的药物中的应用。所述特异性抗原表位、DNA分子、重组表达载体、或所述工程菌可单独使用，也可联合使用，或与其它已知药物联合使用。
进一步的，优选的，所述药物为疫苗。可直接作用到患者的受影响器官，也可全身给药。
本发明还提供了由所述工程菌表达的融合蛋白。所述工程菌经诱导后表达，分离纯化可获得表达的融合蛋白。
本发明所述融合蛋白能够刺激受体产生抗体，保护受体抵抗J亚群禽白血病病毒感染。因此，本发明提供的融合蛋白能够制成疫苗用于预防J亚群禽白血病病毒的感染。
本发明还要求保护一种疫苗，包括本发明所述融合蛋白。
进一步的，所述疫苗还包括佐剂。
作为优选，佐剂为氢氧化铝佐剂、弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。
本发明还要求保护J亚群禽白血病病毒特异性抗体，其是由所述融合蛋白免疫动物制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明所述J亚群禽白血病病毒特异性抗体可以与J亚群禽白血病特异性抗原表位特异性识别，开发检测试剂盒，用于区分AB亚群和J亚群禽白血病。因此本发明提供了所述J亚群禽白血病病毒特异性抗体在制备J亚群禽白血病检测试剂盒中的应用。
同时本发明还提供了一种J亚群禽白血病检测试剂盒，其含有：
(1)本发明所述的特异性抗原表位或本发明所述融合蛋白；
和/或
(2)本发明所述的J亚群禽白血病病毒特异性抗体。
作为优选，所述的J亚群禽白血病病毒特异性抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。
作为优选，本发明所述的试剂盒中还包括酶标板。
本领域技术人员可以理解，本发明提供的试剂盒可将融合蛋白固定于酶标板用于J亚群禽白血病病毒特异性抗体，也可将J亚群禽白血病病毒特异性抗体包被于酶标板，用于检测融合蛋白。
进一步的，作为优选，本发明所述试剂盒还包括包被液、封闭液、二抗、显色液、终止液。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种J亚群禽白血病病毒特异性抗原表位、融合蛋白、特异性抗体及其应用。本发明所述J亚群禽白血病病毒特异性抗原表位其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。实验表明，该抗原表位对J亚群血清有反应同时对AB亚群血清无反应，能够特异性识别J亚群禽白血病病毒。本发明所述融合蛋白能够制成疫苗，刺激受体产生抗体，保护受体抵抗J亚群禽白血病病毒感染。本发明所述融合蛋白免疫动物可制备J亚群禽白血病病毒特异性抗体。本发明所述J亚群禽白血病病毒特异性抗体可以与J亚群禽白血病特异性抗原表位特异性识别，开发检测试剂盒，用于区分AB亚群和J亚群禽白血病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示ALV-A，ALV-B，ALV-J病毒的gp85蛋白序列比对图；
图2为多肽与特异性血清的反应效果。
具体实施方式
本发明公开了J亚群禽白血病病毒特异性抗原表位及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中ELISA免疫检测方法涉及的试剂具体配置方法为：
包被缓冲液(pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，蒸馏水1000mL。
洗涤缓冲液(pH7.4PBST)：KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl0.2g，Tween-20 0.5mL，蒸馏水1000mL。
封闭液:牛血清白蛋白BSA 5g，洗涤缓冲液100mL。
ELISA免疫检测的实验方法为：
(1)多肽包被
用DMSO重悬多肽至20mg/ml，在15ml离心管中用包被缓冲液稀释多肽至20ug/ml，各配制10ml。在96孔酶标板中每孔加入100μl多肽包被液置于4℃冰箱过夜。
(2)取出多肽包被板，在水池中甩去包被液，然后每孔加入200μl 2％脱脂乳(封闭液)，与37度温箱孵育2小时。
(3)在水池中甩去封闭液，在吸水纸上控干，然后每孔加入100μl用2％脱脂乳50×稀释的鸡血清，37度温箱反应1小时。
(4)甩去血清样品，每孔用300μl洗涤液TBST各洗涤3次，滤纸上控干，然后加100μl5000x稀释的HRP-羊抗鸡IgG酶标二抗，37度温箱反应1小时。
(5)甩去酶标二抗，每孔用300μl洗涤液TBST各洗涤3次，然后每孔再用300μl超纯水洗涤两次。滤纸上控干后，每孔加入100μl TMB底物溶液，等待底物溶液反应20分钟,平板拍照。
(6)加入50μl终止液，测量在OD450的吸光。
(7)阳性结果的判定，样品OD450吸光值大于>阴性对照均值+2x标准偏差(95％置信区间)
实施例1、多肽合成：
在NCBI上获取代表流行毒株的ALV-A，ALV-B，ALV-J病毒的gp85蛋白氨基酸序列，蛋白序列号分别为：gi/559807359、gi/382933114、gi/350606570。用ClustalX2结合MEGA5.1软件对这三个亚群病毒gp85蛋白比对结果如下图1。从ALV-A，ALV-B，ALV-J病毒的gp85蛋白序列中选取多肽的规则为比对结果AB亚群和J亚群差异大的区域。选择了15个多肽，其中J亚型来源多肽共7个，AB亚型来源多肽共8个。合成的多肽序列见下表1，通过多肽固相合成仪合成，并进行脱盐初步纯化。
表1 ALV-A，ALV-B，ALV-J亚群特异性多肽的合成序列
| 编号 | 序列 | 名称 | 长度 | 来源 |
| 1 | GYFFFQMILVCVVIISVVPGVGG | J-Pep1 | 23 | J |
| 2 | VNYILTIGVLVLCEVTGVRAD | A-Pep2 | 21 | A |
| 3 | NCTTLGTDRLVSSASITGGPDNSTT | A-Pep3 | 25 | A |
| 4 | DNSTTLTYRKVSCLLLKLNVSMWED | A-Pep4 | 25 | A |
| 5 | NGTNRTCVTFGSVCYEENSRSRVCHIFDGNFNGTG | J-Pep5 | 35 | J |
| 6 | GTGGAEAELRDFIEKWKGDDHLIRPYVNQSWTMVSPIN | J-Pep6 | 38 | J |
| 7 | PINTGSFSISS RYCGFTSNEARYYGGNLSDWCNSK | J-Pep7 | 35 | J |
| 8 | SNSTEPFTVVTADRHNLFTGSEYCGAYGYRFWE | A-Pep8 | 33 | A |
| 9 | VNQSREINETEPFSFTVNCTASNL | A-Pep9 | 22 | A |
| 10 | GGNCTAEWNYYAYGFTFGKQPEVLWNNGTA | J-Pep10 | 30 | J |
| 11 | SPNFTTWITYGPNITGHRRSR | J-Pep11 | 21 | J |
| 12 | APNHTDILKILANSSRTGIRRK | AB-Pep12 | 21 | AB |
| 13 | AIIPCIIKCFQDCLSRTMNQFMDDRIR | J-Pep13 | 27 | J |
| 14 | VCLPCLLQIVSRSVRKMVDN | A-Pep14 | 23 | A |
| 15 | NSIGYHTEYKKLQKACRQP | A-Pep15 | 19 | A |
实施例2、筛选表位识别区：
用AB亚群和J亚群特异性血清对15个多肽进行筛选，用间接ElISA法检测多肽效果。具体检测方法为：取合成的15个多肽用DMSO重悬至20mg/ml，分别用pH9.6碳酸盐缓冲液(包被液)稀释至20μg/ml包被CORNING酶标板，4℃过夜，未包被组作为对照用于阴阳性判定标准；加2％脱脂乳37℃封闭2h；每孔加300μlPBST清洗，每次倒出液体时甩干酶标板中残留水分并在干净的吸水纸上控干，清洗5遍；加AB亚群和J亚群特异性血清100μl/孔，血清稀释倍数为50倍、250倍、1000倍，37℃孵育1小时，清洗5遍；加1：5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY(IgG)酶标二抗100μl/孔，37℃孵育1小时，清洗5遍；加TMB显色剂100μl/孔，静止10-15分钟，加终止液50μl后酶标仪检测D450值。结果的判定由检测OD450>标准阴性样品的均值+2×标准阴性样品的标准差进行阳性判定，在统计学上该判定结果可以达到95％的置信区间。
采用间接ELISA法通过AB亚群和J亚群特异性血清筛选到AB亚群特异性抗原表位为J亚群来源5号多肽(J-Pep5)NGTNRTCVTFGSVCYEENSRSRVCHIFDGNFNGTG。
图2结果显示5号多肽对J亚群特异性血清不同稀释倍数样品均有反应而对AB亚群特异性血清不同稀释倍数样品基本无反应，说明5号多肽的亚群特异性，是J亚群禽白血病的抗原表位。
实施例3、检测抗原表位的特异性和敏感度：
通过上述ELISA筛选获得具有特异性的多肽，满足J亚群来源多肽只对J亚群特异血清有反应，AB亚群多肽只对AB亚群特异性血清有反应。通过与田间鸡血清的反应初步模拟ELISA试剂盒的检测效果，样本共156份：标准阴性血清6份；IDEXX试剂盒(购自北京爱德士元亨生物科技有限公司)检测得到的AB特异性血清82份；J特异性血清77份。
用间接ElISA法检测抗原表位的特异性和敏感度：多肽用pH9.6碳酸盐缓冲液(包被液)稀释至20μg/ml包被CORNING酶标板，4℃过夜；加2％脱脂乳37℃封闭2h；每孔加300μlPBST清洗，每次倒出液体时甩干酶标板中残留水分并在干净的吸水纸上控干，清洗5遍；加上述稀释50倍血清100μl/孔，37℃孵育1小时，清洗5遍；加1：5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY(IgG)酶标二抗100μl/孔，37℃孵育1小时，清洗5遍；加TMB显色剂100μl/孔，静止10-15分钟，加终止液后酶标仪检测D450值。结果的判定由检测OD450>标准阴性样品的均值+2×标准阴性样品的标准差进行阳性判定，在统计学上该判定结果可以达到95％的置信区间。特异度反应多肽正确判断阴性血清的比率，敏感度反应多肽正确判断阳性的比率。结果见表2。计算公式如下：
敏感度＝A/(A+C)*100％；特异度＝D/(B+D)*100％
表2 5号多肽(J-Pep5)/6号多肽(J-Pep6)的敏感度特异度
表2结果显示5号多肽(J-Pep5)的敏感度和特异度达到80％以上，适合开发J亚群禽白血病特异性抗体检测试剂盒。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> J亚群禽白血病病毒特异性抗原表位、融合蛋白、特异性抗体及其应用
<130> MP1625681
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asn Gly Thr Asn Arg Thr Cys Val Thr Phe Gly Ser Val Cys Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Asn Ser Arg Ser Arg Val Cys His Ile Phe Asp Gly Asn Phe Asn
20 25 30
Gly Thr Gly
35
<210> 2
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Thr Gly Gly Ala Glu Ala Glu Leu Arg Asp Phe Ile Glu Lys Trp
1 5 10 15
Lys Gly Asp Asp His Leu Arg Pro Tyr Val Asn Gln Ser Trp Thr Met
20 25 30
Val Ser Pro Ile Asn
35
Claims (10)
1.J亚群禽白血病病毒特异性抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.编码权利要求1所述特异性抗原表位的DNA分子。
3.一种重组表达载体，其含有权利要求2所述核苷酸序列。
4.一种工程菌，其含有权利要求3所述的重组表达载体。
5.权利要求1所述的特异性抗原表位、权利要求2所述的DNA分子、权利要求3所述的重组表达载体、或权利要求4所述工程菌在制备预防或治疗禽白血病的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗。
7.由权利要求4所述工程菌表达的融合蛋白。
8.J亚群禽白血病病毒特异性抗体，其是由权利要求5所述融合蛋白免疫动物制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。
9.权利要求8所述J亚群禽白血病病毒特异性抗体在制备J亚群禽白血病检测试剂盒中的应用。
10.一种J亚群禽白血病检测试剂盒，其含有：
(1)权利要求1所述的特异性抗原表位或权利要求5所述融合蛋白；
和/或
(2)权利要求8所述的J亚群禽白血病病毒特异性抗体。
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