CN114349829A - Alv-j mhc-b2限制性表位肽的鉴定及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了ALV‑J MHC‑B2限制性表位肽的鉴定及其应用，属于基因工程技术领域。本发明公开了一种ALV‑J MHC‑B2限制性表位肽，所述ALV‑J MHC‑B2限制性表位肽的氨基酸序列为TVDTASSAI、FVDFANRLI或SALQAFREV。还公开了上述ALV‑J MHC‑B2限制性表位肽在制备ALV表位疫苗中的应用。本发明旨在通过体外结合洗脱实验确定鸡MHC I类分子B2单倍型结合多肽的限制性基序，并利用基序系统筛选ALV‑J表达的四种蛋白中潜在的表位，最终通过功能验证鉴定出具有免疫原性的B2单倍型鸡的ALV‑J T细胞表位肽，为ALV表位疫苗的研发提供物质和理论基础。

Description

ALV-J MHC-B2限制性表位肽的鉴定及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及ALV-J MHC-B2限制性表位肽的鉴定及其应用。
背景技术
禽白血病病毒(Avian Ieukosis virus，ALV)是属于反转录病毒科，甲型逆转录病毒属的禽类逆转录病毒，目前按照宿主范围、病毒囊膜蛋白的抗原差异性等可以分为11种亚型，其中J亚型禽白血病病毒感染会导致鸡只出现髓细胞性白血病、血管瘤等病变，自发现以来给养禽业造成了巨大的经济损失。J亚型禽白血病病毒和其他亚型的禽白血病病毒一样，其基因组由编码区和非编码区组成，编码区主要包括三个基因：衣壳蛋白基因(gag)、聚合酶基因(pol)和囊膜糖蛋白基因(env)，表达Gag、Pol、Gp85、Gp37四种蛋白。
I型主要组织相容性复合体表达于所有有核细胞表面，主要递呈细胞内经消化编辑后得到的抗原多肽以供下游的CD8+T细胞识别，进而激活机体的细胞免疫清除异常细胞。递呈的抗原多肽称为细胞毒性T细胞(CTL)表位，基于CTL表位研发的疫苗能使机体产生高水平的细胞免疫，是多种畜禽疾病疫苗研发的一个重要方向。已有报道证明CD8+T细胞在抵抗ALV感染的过程中发挥着关键作用，这说明研发能刺激机体产生细胞免疫的表位疫苗对ALV的防控具有重要意义。然而，目前ALV表位疫苗的相关报道甚少。
表位疫苗的制备需要筛选到具有免疫原性的多肽表位，而MHC I类分子与多肽的结合是多肽具有免疫原性的先决条件，因此，了解MHC I类分子结合表位的限制性基序对表位疫苗的研发具有重要意义。MHC I类分子具有多态性，不同倍型的MHC I类分子结合表位的限制性基序不尽相同，目前关于鸡MHC I类分子仅报道了B4、B12、B15、B19、B21单倍型的基序，未见关于B2单倍型基序的报道。但是MHC I类分子B2单倍型相比其他单倍型鸡更具有抵抗禽白血病病毒的能力，是进行ALV实验研究及疫苗开发的优良材料。因此筛选鉴定MHCI类分子B2单倍型结合多肽的限制性基序，并利用基序系统筛选获得ALV-J表达的具有免疫原性的多肽表位是十分有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供ALV-J MHC-B2限制性表位肽的鉴定及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过本发明的鉴定方法最终获得具有显著免疫原性的B2单倍型鸡的ALV-J T细胞表位肽，其为ALV表位疫苗的研发提供物质和理论基础，对ALV的防控具有重要意义。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种ALV-J MHC-B2限制性表位肽，所述ALV-J MHC-B2限制性表位肽的氨基酸序列为TVDTASSAI、FVDFANRLI或SALQAFREV。
本发明还提供一种根据上述ALV-J MHC-B2限制性表位肽在制备ALV表位疫苗中的应用。
本发明还提供一种用于鉴定上述ALV-J MHC-B2限制性表位肽的方法，包括以下步骤：
(1)利用原核表达系统获得MHC I分子重链和轻链蛋白，将MHC I分子重链蛋白、轻链蛋白和随机肽库混合反应，获得MHC I-肽复合物；
(2)洗脱步骤(1)获得的MHC I-肽复合物，将洗脱下来的多肽经质谱测序及分析，确定多肽限制性表位基序，再根据基序筛选ALV-J病毒蛋白序列，得到候选多肽；
(3)利用感染ALV-J病毒的B2单倍型动物模型材料检测步骤(2)所述候选多肽的免疫原性，具有免疫原性的候选多肽即为ALV-J MHC-B2限制性表位肽。
进一步地，步骤(1)中所述MHC I分子重链蛋白、轻链蛋白和随机肽库的摩尔比为1：1：(3-7)。
进一步地，步骤(1)所述随机肽库包括随机八肽、九肽或十肽。
进一步地，步骤(1)所述混合反应具体为：将所述MHC I分子轻链蛋白复性后，向其中加入所述随机肽库反应30min，再加入所述MHC I分子重链蛋白复性反应。
进一步地，步骤(2)所述多肽限制性表位基序是N端第二位为A或V，第九位为V、I或L。
进一步地，步骤(3)利用所述动物模型材料进行ELISpot试验，筛选出具有免疫原性的候选多肽。
本发明公开了以下技术效果：
本发明旨在通过体外结合洗脱实验确定鸡MHC I类分子B2单倍型结合多肽的限制性基序，最终确定筛选候选多肽表位的基序为：X-A/V-X-X-X-X-X-X-V/I/L，并利用基序系统筛选ALV-J表达的四种蛋白中潜在的表位，然后通过体外ELISpot试验检测候选多肽免疫原性，最终确定具有显著免疫原性的多肽表位，所述多肽表位的氨基酸序列为TVDTASSAI、FVDFANRLI或SALQAFREV。本发明首次鉴定出具有免疫原性的B2单倍型鸡的ALV-J T细胞表位肽，其为ALV表位疫苗的研发提供物质和理论基础，对ALV的防控具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为攻毒后鸡只病毒血症变化情况；
图2为攻毒后鸡只泄殖腔排毒情况；
图3为攻毒后CD8α+T细胞比例变化情况；
图4为攻毒后CD4+T细胞比例变化情况；
图5为攻毒后PBMC的细胞免疫相关基因变化情况；
图6为鸡BF2*0201、β2m的表达及纯化情况SDS-PAGE鉴定结果；其中A和B图中M为：marker；1：未诱导全菌；2：诱导后全菌；3：诱导后上清；4：破碎后上清；5：破碎后沉淀；C图中M：marker；1：纯化后BF2*0201；2：纯化后β2m；
图7为复性后分子筛层析洗脱流出图及洗脱组分SDS-PAGE鉴定图；洗脱组分SDS-PAGE鉴定图中M：marker；1：约11mL洗脱体积处的洗脱峰；2：约15mL洗脱体积处的洗脱峰；3：目的洗脱峰(约15.5mL洗脱体积处)；4：约18mL洗脱体积处的洗脱峰；
图8为分子筛层析后离子交换层析洗脱流出图及洗脱组分SDS-PAGE鉴定图，其中洗脱组分SDS-PAGE鉴定图中M：marker；1：目的洗脱峰(NaCl浓度约18％洗脱处)；
图9为洗脱肽的总离子流图；
图10为洗脱肽的Base peak图；
图11为洗脱肽部分de novo分析结果；
图12为B2单倍型鸡MHC I的基序鉴定结果weblogo图；
图13为ELISpot试验斑点图展示；
图14为三次ELISPot独立性重复实验检测IFN-γ的结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
术语解释：
ALV-J：J亚型禽白血病病毒；
MHC-I：I型主要组织相容性复合体；
BF2*0201：B2单倍型鸡I型主要组织相容性复合体重链；
β2m：鸡I型主要组织相容性复合体轻链；
ELISpot：酶联免疫斑点试验；
PBMC：外周血单个核细胞；
LC-MS/MS：高效液相色谱串联质谱；
de novo测序：从头测序；
SPF鸡：无特定病原体鸡；
CTL：细胞毒性T细胞；
IFN-γ：γ干扰素。
1试验材料
1.1试验动物和病毒
本试验所用的鸡为4周龄BW/G3(B2单倍型)SPF鸡，购自国家禽类实验动物资源库；ALV-J SCAU-HN06株为华南农业大学人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室保存。
1.2试验主要试剂
三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)、L-精氨酸(L-Arg)、还原性谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、盐酸胍、二硫苏糖醇(DTT)购自美国Amresco公司；氯化钠、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、考马斯亮蓝R-250、LB液体培养基干粉购自中国索莱宝公司；RPMI-1640培养基、FBS澳洲胎牛血清、L-谷氨酰胺(100X)、β-巯基乙醇购自美国GIBCO公司；二甲基亚砜(DMSO)、皂苷(saponin)、布雷菲德菌素A(BFA)购自美国Sigma公司；佛波酯和离子霉素(PMA+Ionomycin)、TMB ELISpot专用显色液购自中国达科为公司，Chicken IFN-γELISpotBASIC kit购自Mabtech公司，流式抗体Anti-chicken CD3antibody、Anti-chicken CD4 antibody、Anti-chicken CD8αantibody、Anti-chickenIFN-γ-FITC antibody购自SouthernBiotech公司。鸡外周血淋巴细胞分离液试剂盒、鸡脏器组织单个核细胞分离液试剂盒、红细胞裂解液购自天津灏洋生物公司；ChamQ SYRB qPCRMaster Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
1.3主要溶液配制
Washing Buffer：0.5％Triton-100，50mM Tris pH 8.0，300mM NaCl，10mM EDTA，1‰β-巯基乙醇；
Resuspension Buffer：50mM Tris pH 8.0，100mM NaCl，10mM EDTA，1‰β-巯基乙醇；
Dissolution Buffer：6M Gua-HCl，10％甘油，50mM Tris pH 8.0，100mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT
Refolding Buffer：100mM Tris pH 8.0，400mM L-Arg HCl，2mM EDTA，5mM GSH，0.5mM GSSG，0.5mM PMSF；
分子筛缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 8.0)，50mM NaCl；
离子交换A液：10mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM NaCl；
离子交换B液：10mM Tris-HCl(pH8.0)，1M NaCl；
2试验方法
2.1ALV-J感染B2单倍型鸡动物模型的建立
将12只4周龄B2单倍型鸡随机分为攻毒组和对照组，每组6只。攻毒组腹腔注射ALV-J 1mL，病毒滴度为104.7TCID50/100μl，对照组腹腔注射PBS 1mL。攻毒后采集相应样品进行以下检测：
2.1.1检测感染后B2单倍型鸡泄殖腔排毒情况
采集泄殖腔拭子加入到1mL PBS中冷冻保存，检测前恢复至室温。使用IDEXX公司的禽白血病抗原检测试剂盒，通过ELISA试验检测排毒情况。包被板上设好阴阳对照孔和样品孔，阴阳对照孔按试剂盒要求各加入对应标准品100μL，样品孔各加入100μL泄殖腔拭子液。18-26℃反应60min后，每孔加入350μL蒸馏水洗涤，重复5次，随后每孔加入100μL酶标抗体。18-26℃反应60min后，步骤同上洗涤5次，然后每孔加入100μL TMB底物液；18-26℃反应15min后，每孔加入100μL终止液终止反应，测量并记录各样品孔和阴阳对照孔于650nm波长的吸光值A。
2.1.2检测感染后B2单倍型鸡病毒血症的变化情况
将DF-1细胞铺板于24孔板中，待细胞生长至90％，采集鸡抗凝全血500μL，2000g，4℃离心8min分离血浆，取100μL血浆接种DF-1细胞，置于37℃培养箱培养24h，然后将培养基置换为含2％胎牛血清的1640培养基，继续培养5天。第6-7天时，取细胞培养上清做ELISA试验检测病毒抗原，具体步骤同2.1.1。
2.1.3检测感染后B2单倍型鸡PBMC中T细胞亚型的变化情况
常规方法分离外周血淋巴细胞，台盼蓝染色计数后，每份样本取1×106个细胞置于流式管中，用抗鸡CD3、CD4和CD8α流式抗体进行染色，同时设置通道对照组和空白对照组。随后每管加入PBS至1mL。400g离心5min，弃掉上清。每种抗体按照说明书比例用流式Buffer稀释，每份样本加入100μL稀释后抗体重悬细胞，4℃孵育30min。孵育后加入PBS至终体积为1mL，400g离心5min清洗一遍。弃掉PBS后每管加入200μL流式Buffer重悬细胞，上机检测。
2.1.4检测感染后B2单倍型鸡PBMC的细胞免疫相关基因变化
利用TRIZOL法提取2.1.3中分离的外周血淋巴细胞RNA：向细胞中加入1mLTRIZOL，振荡混匀以裂解细胞，随后加入200μL氯仿，充分振荡混匀。室温静置10min后，12000g，4℃离心15min，然后吸取透明上层液体转移到新的无酶离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀后置于-20℃反应。30min后，取出样品，12000g，4℃离心10min，可见RNA沉淀。弃上清，加入1mL 75％乙醇，振荡后，12000g，4℃离心10min以清洗RNA。重复2次后，弃上清，打开管口使乙醇自然挥发，最后向沉淀加入30μL事先预热至65℃的0.1％DEPC水以溶解RNA。分光光度计测量RNA浓度。
利用TAKARA公司的PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒进行RNA反转录，体系如表1。反应程序：37℃反应15min，85℃灭活5s。
表1反转录体系
Figure BDA0003470299590000071
对反转录后的cDNA进行荧光定量PCR扩增，以检测PBMC中细胞免疫相关基因的变化。检测的目的基因及引物如表2，反应体系如表3。反应程序：预变性95℃，30s；循环反应95℃，10s，60℃，30s，共40个循环；溶解曲线分析95℃，15s，60℃，60s，95℃，15s。
表2细胞免疫相关基因qPCR引物
Figure BDA0003470299590000072
Figure BDA0003470299590000081
表3荧光定量体系
Figure BDA0003470299590000082
2.2B2单倍型鸡MHC I分子结合多肽的基序鉴定
2.2.1随机9肽库的合成
肽库合成由北京中科亚光生物科技有限公司负责，采用Fomc法，首先将除半胱氨酸外的19种α-氨基保护基团氨基酸与烷氧苄醇型树脂进行载体交联，随后将所有的载体合并并进行氨基脱保护，三乙胺中和游离氨基酸。充分洗涤后，混合物等分19份，活化新一批氨基酸并将19种氨基酸分别过量加入到19等分的混合物中进行缩合。共重复8次后，90％三氟乙酸切除载体，使用反向柱纯化，得到随机9肽库。
质检：通过将合成的随机9肽库进行LC-MS/MS以及de novo解析，对每一位氨基酸的分布进行分析质检。LC-MS/MS解析步骤如下：获得的随机9肽库使用20μL 0.1％甲酸/水溶液复溶，进样10μL，色谱柱(C18,3μm，100μm，
Figure BDA0003470299590000084
75μm*15cm)进行分离：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸的乙腈溶液，色谱梯度如表4，质谱仪参数设置如表5。收集到的数据进行de novo解析，软件参数设置如表6。
表4色谱梯度
Figure BDA0003470299590000083
Figure BDA0003470299590000091
表5质谱仪参数设置情况
Figure BDA0003470299590000092
表6 de novo软件分析参数设置
Figure BDA0003470299590000093
2.2.2MHC I分子重链和轻链的表达菌株获取
两个基因的原核表达载体主要由武汉金开瑞公司负责构建。在NCBI上下载B2单倍型鸡MHCⅠ分子的重链BF2*0201(GenBank:AY234770.1)以及轻链β2m(GenBank:AB178590.1)的CDS序列，利用TMHMM和SignalP工具分别对序列的跨膜区和信号肽进行预测。分别合成去除信号肽和跨膜区后的BF2*0201以及轻链β2m(GenBank:AB178590.1)的CDS序列，利用TMHMM和SignalP工具分别对序列的跨膜区和信号肽进行预测。分别合成去除信号肽和跨膜区后的BF2*0201以及β2m的DNA序列，随后通过NdeⅠ和HindⅢ两个酶切位点将两个DNA序列分别插入pET21a(+)载体中，测序无误则为构建成功。
将构建好的载体分别按照分子克隆常规方法转化到BL21感受态细胞中，后续挑取单菌落送测序。
2.2.3MHC I分子重链及轻链蛋白表达及纯化
2.2.3.1MHC I分子重链和轻链蛋白表达形式鉴定
将测序无误的菌液按1:100比例分别接种到5mL抗性LB中，作蛋白的少量试表达。以200r/min的摇速37℃振荡培养至菌液OD600＝0.4-0.6之间时，停止培养。吸取2mL未诱导菌液作为阴性对照，其余菌液加入1mM IPTG诱导作为试验组。将对照组和试验组菌液以200r/min的摇速37℃振荡培养5h后，试验组吸取1mL菌液标记为诱导后全菌，剩余菌液以离心机最高转速离心2min，吸取部分上清标记为诱导后上清，弃掉剩余上清，沉淀用700μLPBS重悬在1.5mL EP管中，按照工作4s，停顿4s，功率3W的程序超声破碎悬液20个循环。然后，最高转速离心10min，取部分上清标记为破碎后上清，弃掉剩余上清，沉淀用700μL的PBS重悬，标记为破碎后沉淀。所有标记的样品取5μL并加入20μL 5×SDS Loading Buffer，混匀后沸水浴10min，用于下一步分析。
使用商品化聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定，组装好设备后，每孔依次加入10μL制备好的样品，同时加入蛋白Marker。先以80V的电压启动程序，待样品迁移至分离胶，增大电压至120V，运行约1h。电泳结束后，使用考马斯亮蓝染色液对凝胶进行常温过夜染色，次日使用脱色液进行脱色，直至凝胶上出现清晰的蛋白条带，通过条带出现的位置确定蛋白表达的形式。
2.2.3.2MHC I分子重链和轻链包涵体的表达纯化
菌液按1：100的比例接种到2L抗性LB中，37℃振荡培养至OD600＝0.4-0.6时，加入IPTG使终浓度为1mM，37℃继续振荡培养5h。以下步骤均在冰上或4℃进行：培养结束后，收集菌体，细胞高压破碎仪破碎。10000g离心10min，弃上清，沉淀用预冷Washing Buffer振荡悬浮，10000g离心10min清洗，重复3遍，随后加入预冷Resuspension Buffer振荡重悬，取10μL样品制样作SDS-PAGE分析，其余样品10000g高速离心10min，弃上清，沉淀称重，加入Dissolution Buffer使终浓度为30mg/mL，4℃磁力搅拌至完全溶解。
2.2.4MHC I-肽复合物的体外复性及纯化
以下步骤在4℃中进行：配制1L Refolding Buffer，置于磁力搅拌器上缓缓搅拌。取1mL β2m包涵体液逐滴加入Refolding Buffer中，复性8h后，加入约10mg经DMSO溶解的随机9肽库。反应30min后，取3mL BF2*0201包涵体液逐滴加入Refolding Buffer中，复性过夜。
复性结束后，用超滤浓缩杯浓缩样品至30mL，8000g离心10min，取上清，过分子筛使样品的溶剂换为分子筛缓冲液。然后超滤浓缩管高度浓缩样品至1.5mL，样品首先经分子筛层析纯化，收集目的峰蛋白后利用离子交换层析柱作进一步纯化，同时取样进行SDS-PAGE鉴定。
2.2.5复合物肽洗脱
超滤浓缩管高度浓缩纯化后的复合物至体积小于200μL，样品加入400μL 0.2M乙酸，在65℃中孵育1小时，随后转移到3KD的超滤浓缩管中离心，收集下层滤出液为洗脱下来的肽。
2.2.6LC-MS/MS质谱测序及de novo分析
步骤同2.2.1中质检步骤。
2.2.7数据分析及基序的确定
选取de novo分析后得分为50分以上的多肽进行统计，计算各位点变异系数(Vs＝σ/X)，数值最大的两位为限制性位点，同时利用weblogo网站(https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)绘制logo柱状图，以直观显示每个位点中氨基酸的分布比例情况。选取限制性位点中比例最高的两种氨基酸作为筛选多肽的基序。
2.2.8根据基序筛选及合成表位
根据2.2.7中确定的基序筛选ALV-J HN06株的各蛋白序列，如表7所示，多肽合成由金斯瑞生物科技股份有限公司负责，采用化学合成的方法，通过HPLC进行纯化，纯度达到95％以上。
表7基于基序筛选的ALV-J表位
Figure BDA0003470299590000121
2.3ELISpot试验检测候选多肽免疫原性
取2.1中感染28d的B2单倍型鸡，按鸡脏器组织单个核细胞分离液试剂盒说明书要求分离鸡的脾脏淋巴细胞，进行ELISpot试验检测候选多肽表位的免疫原性，具体步骤如下：
(1)活化PVDF 96孔板：每孔加入15μL 35％乙醇，反应至多1min，然后用无菌水洗涤5次；
(2)包被抗体：将抗鸡IFN-γ稀释至15μg/mL，每孔加入100μL，4℃作用过夜；
(3)封闭：倒掉包被液，再用DPBS洗涤5次，随后在灭菌的吸水纸上扣干板子。按200μL/孔在PVDF 96孔板上加入含10％FBS的RMPI 1640培养基，室温封闭反应30min；
(4)刺激：倒掉封闭液，每孔加入100μL预先准备好的浓度为5×106cells/mL的淋巴细胞悬液。同时向实验组加入50μL稀释后的抗原多肽，使终浓度为10μg/mL，阳对照组加入终浓度为10μg/mL的PMA，阴对照组则不加入任何刺激物。所有的样品加完后，将PVDF 96孔板放入CO2培养箱，37℃作用24-48h；
(5)二抗孵育：培养结束后，甩去细胞，用DPBS洗涤5次，每孔加入100μL浓度为1μg/mL的生物素标记二抗，室温孵育2h；
(6)HRP孵育：甩掉二抗液，用DPBS洗涤5次，随后向孔内加入100μL链霉亲和素标记的HRP，室温孵育1h；
(7)显色：甩掉HRP孵育液，用DPBS洗涤5次，随后每孔加入100μL TMB显色底物，室温或37℃作用15-30min，当阳对照组出现明显斑点即可甩掉显色液，用纯水终止显色，风干读板。
3结果
3.1ALV-J感染后B2单倍型鸡病毒血症及泄殖腔排毒情况
攻毒后鸡只病毒血症变化情况如图1所示，7DPI(攻毒后第7天)时血液中病毒含量最高，表明攻毒组所有鸡只都成功感染ALV-J，14DPI时检测血液中的病毒含量已显著下降(P<0.001)，到21DPI时均已检测不到病毒。攻毒后鸡只泄殖腔排毒情况如图2所示，均未见排毒。
3.2ALV-J感染后B2单倍型鸡PBMC中T细胞亚型的变化情况
攻毒后7、14、21天分别采集鸡外周血分离PBMC，流式检测CD8α+T细胞和CD4+T细胞比例。CD8α+T细胞比例变化如图3所示，7DPI时攻毒组与对照组相比无统计学差异，14DPI时可检测到攻毒组CD8α+T细胞比例显著增高，表明病毒的感染能引起鸡体内的CD8α+T细胞免疫；21DPI时攻毒组的CD8α+T细胞恢复到正常水平。CD4+T细胞比例如图4所示，在整个检测过程中，攻毒组的CD4+T细胞比例与对照组相比均没有统计学差异。
3.3感染后B2单倍型鸡PBMC的细胞免疫相关基因表达变化
根据图3结果，选取14DPI的PBMC样品用于检测细胞免疫相关基因的表达情况，相关基因变化如图5所示。除TNF-α和IL-2外，选用于检测的细胞免疫相关基因与对照组相比均显著上调，包括NK lysin，Poly(ADP-ribose)polymerase 1(PARP)，High-mobilitygroup-2protein(HMG-2)，Perforin，IFN-γ，IL-1β和Granzyme K。结合3.2中CD8α+T细胞比例增加，进一步说明ALV-J感染成功激活了B2单倍型鸡的细胞免疫。综合上述结果，ALV-JSCAU-HN06株感染BW/G3(B2单倍型)SPF鸡并且能有效引起细胞免疫的模型建立成功。
3.4鸡BF2*0201、β2m的表达及纯化
图6A和图6B表明BF2*0201及β2m两种蛋白表达成功，两种蛋白都以包涵体表达为主；如图6C所示，经过系列操作后，两种蛋白纯化效果明显。
3.5MHC I-肽复合物的体外复性及纯化
纯化好的包涵体与随机9肽库进行体外复性，经过分子筛层析(图7)以及离子交换层析(图8)后，SDS-PAGE鉴定，MHC I-肽复合物得到纯化并高度浓缩，可用于结合肽洗脱。
3.6LC-MS/MS及de novo分析
主要由中国农业大学生物质谱实验室负责，图9展示了洗脱肽在质谱测序过程中产生的总离子流图，图10展示了洗脱肽在质谱测序过程中产生的Base Peak图，图11展示了洗脱肽部分de novo分析结果。
3.7B2单倍型鸡MHC I多肽结合基序鉴定
计算各结合位点的变异系数(N端第一位到第九位分别为：0.96，1.21，1.07，0.65，0.64，0.56，0.60，0.78，2.11)，确定N端第二位及第九位为限制性位点。利用weblogo在线工具绘制可视化的motif后直接观察，如图12所示，选取结合概率最高的两或三种氨基酸为偏好氨基酸，最终确定候选多肽表位的基序为：X-A/V-X-X-X-X-X-X-V/I/L。按照该基序筛选ALV-J各蛋白序列中符合条件的肽段作为下一步试验对象(见表7)。
3.8ELISpot试验检测候选多肽免疫原性
在阳性对照组成立的前提下，与阴性对照组相比，表7中多肽分别作为刺激物的试验组中仅ALV-J-52、ALV-J-59、ALV-J-61、ALV-J-3、ALV-J-4、ALV-J-7能产生斑点，而以ALV-J-52、ALV-J-59、ALV-J-61作为刺激物的试验组能显著产生更多斑点(P<0.05)，如图13所示，说明这三条多肽能刺激细胞分泌IFN-γ，是具有免疫原性的T细胞表位，三次独立重复实验结果如图14所示。鉴定出符合条件的三条多肽的序列如SEQ ID NO.1-3所示，见表8：
表8三条针对B2单倍型鸡的ALV-J T细胞表位信息
Figure BDA0003470299590000151
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> ALV-J MHC-B2限制性表位肽的鉴定及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Val Asp Thr Ala Ser Ser Ala Ile
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Phe Val Asp Phe Ala Asn Arg Leu Ile
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Ala Leu Gln Ala Phe Arg Glu Val
1 5

Claims (8)

1.一种ALV-J MHC-B2限制性表位肽，其特征在于，所述ALV-J MHC-B2限制性表位肽的氨基酸序列为TVDTASSAI、FVDFANRLI或SALQAFREV。
2.一种根据权利要求1所述ALV-J MHC-B2限制性表位肽在制备ALV表位疫苗中的应用。
3.一种用于鉴定权利要求1所述ALV-J MHC-B2限制性表位肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用原核表达系统获得MHC I分子重链和轻链蛋白，将MHC I分子重链蛋白、轻链蛋白和随机肽库混合反应，获得MHC I-肽复合物；
(2)洗脱步骤(1)获得的MHC I-肽复合物，将洗脱下来的多肽经质谱测序及分析，确定多肽限制性表位基序，再根据基序筛选ALV-J病毒蛋白序列，得到候选多肽；
(3)利用感染ALV-J病毒的B2单倍型动物模型材料检测步骤(2)所述候选多肽的免疫原性，具有免疫原性的候选多肽即为ALV-J MHC-B2限制性表位肽。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述MHC I分子重链蛋白、轻链蛋白和随机肽库的摩尔比为1：1：(3-7)。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述随机肽库包括随机八肽、九肽或十肽。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述混合反应具体为：将所述MHCI分子轻链蛋白复性后，向其中加入所述随机肽库反应30min，再加入所述MHC I分子重链蛋白复性反应。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述多肽限制性表位基序是N端第二位为A或V，第九位为V、I或L。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)利用所述动物模型材料进行ELISpot试验，筛选出具有免疫原性的候选多肽。
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