CN115991733A - 一种alv-j mhc-b21限制性表位肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种ALV‑J MHC‑B21限制性表位肽及其应用，属于生物工程领域。本发明利用已鉴定出的B21单倍型SPF鸡MHC I类分子结合多肽的限制性基序，系统筛选MHC B21限制性ALV‑J潜在的表位，最终通过功能实验验证确定具有免疫原性的多肽表位，该表位的多肽序列为PRLMGPFYEQL，这为ALV‑J表位疫苗的研发提供物质和理论基础。

Description

一种ALV-J MHC-B21限制性表位肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是涉及一种ALV-J MHC-B21限制性表位肽及其应用。

背景技术

禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus)为单股、正链RNA病毒，属于反转录病毒科α反转录病毒属，目前根据宿主范围、病毒囊膜蛋白的抗原差异性等可以分为11种亚型，其中J亚型禽白血病病毒感染会诱发鸡产生肿瘤如髓细胞瘤血管瘤等，自发现以来，对全球的养禽业危害严重。J亚型禽白血病病毒和其他亚型的禽白血病病毒一样，其基因组分子有三个主要编码基因，即衣壳蛋白基因(gag)、聚合酶基因(pol)和囊膜糖蛋白基因(env)，表达Gag、Pol、Gp85、Gp37四种蛋白。

I型主要组织相容性复合体表达于所有有核细胞表面，主要参与内源性抗原递呈，将胞内抗原处理成多肽递呈给下游的CD8+T细胞识别，进而激活机体的细胞免疫清除异常细胞。递呈的抗原多肽称为细胞毒性T细胞(CTL)表位，基于CTL表位研发的疫苗能使机体产生高水平的细胞免疫，是多种畜禽疾病疫苗研发的一个重要方向。已有报道证明在抵抗ALV感染的过程中CD8+T细胞发挥着关键作用，这说明研发能刺激机体产生细胞免疫的表位疫苗对ALV的防控意义重大。然而，目前ALV表位疫苗的相关报道甚少。

具有免疫原性的表位是诱导T细胞产生免疫效应的先决条件，所以制备表位疫苗首先要筛选到有免疫原性的多肽表位，而抗原表位通过与MHC I类分子结合被下游TCR识别，因此，了解MHC I类分子结合表位的限制性基序对表位疫苗的研发具有重要意义。目前，根据MHC B基因区的基因序列，可以将鸡分为B1到B29共29种单倍型；MHC I类分子具有多态性，不同倍型的MHC I类分子结合表位的限制性基序不尽相同，关于鸡MHC I类分子已经报道了B4、B12、B15、B19、B21单倍型的基序，B21单倍型基序由Michael Koch等人确定。同时根据报道我们得知B21单倍型SPF鸡对马立克氏病病毒感染具有抗性，而禽白血病病毒和马立克氏病病毒一样都属于肿瘤病，所以该倍型也是进行ALV实验研究的优良材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种ALV-J MHC-B21限制性表位肽及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，检测候选多肽表位的免疫原性，筛选出优势的针对J亚型禽白血病病毒的表位肽，为J亚型禽白血病病毒表位疫苗的研发提供物质和理论基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种ALV-J MHC-B21限制性表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为PRLMGPFYEQL(SEQ ID NO：1)。

本发明还提供编码所述的ALV-J MHC-B21限制性表位肽的基因。

本发明还提供所述的ALV-J MHC-B21限制性表位肽或所述的基因在制备抗J亚型禽白血病病毒表位疫苗中的应用。

本发明还提供所述的ALV-J MHC-B21限制性表位肽或所述的基因在制备抗J亚型禽白血病病毒药物中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明首先用ALV-J SCAU-HN06株感染B21(BW/G6)单倍型SPF鸡，通过检测鸡只的泄殖腔排毒情况，血清抗体水平，病毒血症，PBMC中T细胞亚型的变化情况以及PBMC中细胞免疫相关基因的变化，成功建立感染应答模型以充当后续的试验材料。然后，根据文献报道的B21单倍型SPF鸡MHC I类分子结合多肽的基序(X-H/K/R-X-X-X-X-X-(X)-E/D-X-A/V/L/I/F/M)，筛选针对ALV-J的候选多肽表位，最后经ELISpot试验验证上述多肽的免疫原性，确定有效的T细胞表位肽(PRLMGPFYEQL)，为ALV表位疫苗的研发提供依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为攻毒后鸡只病毒血症变化情况；

图2为攻毒后鸡只泄殖腔排毒情况；

图3为攻毒后鸡只血清抗体水平；

图4为流式圈门策略示意图；

图5为攻毒后CD8⁺T细胞比例变化情况；

图6为攻毒后CD4⁺T细胞比例变化情况；

图7为攻毒后CD4⁺CD8α⁺T细胞比例变化情况；

图8为攻毒后B21单倍型鸡PBMC中天然免疫相关基因表达情况；

图9为攻毒后B21单倍型鸡PBMC中CTLs相关基因表达情况；

图10为攻毒后B21单倍型鸡PBMC中Th2相关基因表达情况；

图11为攻毒后B21单倍型鸡PBMC中趋化因子和炎性细胞因子表达情况；

图12为#1鸡ELISpot试验部分斑点图；

图13为#2鸡ELISpot试验部分斑点图；

图14为#3鸡ELISpot试验部分斑点图；

图15为肽刺激淋巴细胞后IFN-γ的表达水平；运用unpaired t-test进行统计学分析，除阳性对照外，每条肽三个技术重复，*：P<0.05，差异显著；***：P<0.001，差异极显著。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明中相关术语的解释：

ALV-J：J亚型禽白血病病毒；

MHC-I：I型主要组织相容性复合体；

ELISpot：酶联免疫斑点试验；

DPI：攻毒后天数；

PBMC：外周血单个核细胞；

SPF鸡：无特定病原体鸡

CTL：细胞毒性T细胞

IFN-γ：γ干扰素

实施例1

1、试验材料

1.1试验动物和病毒

本试验所用的鸡为4周龄B21单倍型(BW/G6)SPF鸡，购自国家禽类实验动物资源库；ALV-J SCAU-HN06株来自华南农业大学人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室。

1.2试验主要试剂

RPMI-1640培养基、FBS澳洲胎牛血清购自美国GIBCO公司；二甲基亚砜(DMSO)、皂苷(saponin)、布雷菲德菌素A(BFA)购自美国Sigma公司；佛波酯和离子霉素(PMA+Ionomycin)、TMB ELISpot专用显色液购自中国达科为公司，Chicken IFN-γELISpotBASICkit购自Mabtech公司，

抗体Anti-chicken CD3 antibody、Anti-chicken CD4 antibody、Anti-chickenCD8αantibody、Anti-chicken IFN-γ-FITC antibody购自SouthernBiotech公司。鸡外周血淋巴细胞分离液试剂盒、鸡脏器组织单个核细胞分离液试剂盒、红细胞裂解液购自天津灏洋生物公司；ChamQ SYRB qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.3主要溶液配制

流式Buffer：2％FBS+98％PBS，配制完成后放于4℃备用。

细胞冻存液：10％DMSO+90％FBS，配制完成后放于4℃备用。

2、试验方法

2.1ALV-J感染B21单倍型SPF鸡动物模型的建立

将12只4周龄B21单倍型SPF鸡随机分为攻毒组和对照组，每组6只。攻毒组腹腔注射病毒滴度为10^4.7TCID₅₀/100μl的ALV-J病毒液1mL，对照组腹腔注射PBS 1mL。攻毒后每只鸡采集相应样品进行以下检测：

2.1.1检测感染后B21单倍型SPF鸡泄殖腔排毒情况

采集泄殖腔拭子加入到1mL PBS中于-80℃保存，检测前恢复至室温。使用IDEXX公司的禽白血病p27抗原检测试剂盒，进行ELISA试验检测排毒情况。

首先，在包被板上选定阴阳对照孔和样品孔区域，按说明书要求在阴阳对照孔各加入对应标准品100μL，阴阳对照各做2个重复，样品孔各加入100μL泄殖腔拭子液。18～26℃孵育60min后，每孔加入350μL蒸馏水洗涤，重复5次，之后加酶标抗体，每孔100μL。18～26℃反应60min后，步骤同上洗涤5次，然后加TMB底物液，每孔100μL；18～26℃反应15min后，加终止液终止反应，每孔100μL，最后用酶标仪测量并记录阴阳对照孔和各样品控于650nm波长的吸光值A，根据说明书计算S/P值。

2.1.2检测感染后B21单倍型SPF鸡病毒血症的变化情况

将DF-1细胞铺于24孔贴壁培养板中，待细胞生长至90％，采集鸡抗凝全血1mL，2000g，4℃离心8min分离血浆，取100μL血浆接种DF-1细胞，置于37℃培养箱培养24h，PBS洗涤后加入细胞维持液，成分为含2％胎牛血清的1640培养基，继续培养5天。第6～7天时，取细胞培养上清做ELISA试验检测病毒抗原，具体步骤同2.1.1。

2.1.3血清抗体水平的检测

采集非抗凝血室温放置至血清析出后，1.5mL离心管收集血清。随后4℃、2000rpm离心10min去除红细胞，剩余血清用于检测血清抗体水平。

使用IDEXX公司的禽白血病J亚群抗体检测试剂盒，进行ELISA试验检测抗体水平。

2.1.4检测感染后B21单倍型SPF鸡PBMC中T细胞亚型的变化情况

常规方法分离B21单倍型SPF鸡外周血淋巴细胞，台盼蓝染色计数后，每份样本取1×10⁶个细胞于流式管中，同时设置通道对照组和空白对照组。随后每管加入1mL PBS清洗，400g离心5min，弃掉上清。随后用抗鸡CD3、CD4和CD8α流式抗体进行染色，每种抗体按照说明书比例用流式Buffer稀释，每份样本加入100μL稀释好的抗体重悬细胞，4℃孵育30min。孵育后加入PBS至终体积为1mL终止染色反应，400g离心5min。弃掉PBS后每管加入200μL流式Buffer重悬细胞，上机检测。

2.1.5检测感染后B21单倍型SPF鸡PBMC的细胞免疫相关基因变化

利用TRIZOL法提取2.1.4中分离的外周血淋巴细胞RNA：向细胞中加入1mLTRIZOL，振荡混匀以裂解细胞，随后加入200μL氯仿，充分振荡混匀后室温静置10min，12000g，4℃离心15min，然后将上层透明液体转移至新的无酶离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，置于-20℃反应30min后取出样品，12000g，4℃离心10min，RNA沉淀于管底。弃上清后加入1mL 75％乙醇，振荡，12000g，4℃离心10min以清洗RNA。重复2次后，弃上清，打开管口使乙醇自然挥发，最后向沉淀中加入30μL事先预热至65℃的0.1％DEPC水以溶解RNA。分光光度计测量RNA浓度。

利用TAKARA公司的PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒进行RNA反转录，体系如表1。反应程序：37℃反应15min，85℃灭活5s。

表1反转录体系

荧光定量PCR扩增反转录后的cDNA，以检测PBMC中细胞免疫相关基因的变化。检测的目的基因及引物如表2，体系如表3。反应程序：预变性95℃，30s；循环反应95℃，10s，60℃，30s，共40个循环；溶解曲线分析95℃，15s，60℃，60s，95℃，15s。

表2免疫相关基因qPCR引物

表3荧光定量体系

2.2B21单倍型SPF鸡MHC I分子结合多肽的基序鉴定

2.2.1根据基序筛选及合成表位

根据文章中发表的B21单倍型SPF鸡MHC I类分子结合多肽的基序(X-H/K/R-X-X-X-X-X-(X)-E/D-X-A/V/L/I/F/M)，按照步移法每次步移一个氨基酸来筛选ALV-JHN06株的各蛋白序列中的候选表位，如表4所示，多肽由金斯瑞生物科技股份有限公司负责合成，采用化学合成的方法，进行三次反向高效液相色谱(RP-HPLC)和质谱分析(MS)以确保每条多肽的质量，纯度达到95％以上。

表4基于基序筛选的ALV-J表位

2.3ELISpot试验检测候选多肽免疫原性

取2.1中感染28天后的B21单倍型SPF鸡，分离鸡的脾脏淋巴细胞，分离程序按鸡脏器组织单个核细胞分离液试剂盒说明书要求进行，之后进行ELISpot试验检测候选多肽表位的免疫原性，具体步骤如下：

(1)活化PVDF 96孔板：每孔加入15μL 35％乙醇，30s～1min后用无菌水洗涤5次；

(2)包被抗体：每孔加入100μL稀释至15μg/mL抗鸡IFN-γ，4℃孵育过夜；

(3)封闭：弃掉包被液，再用DPBS洗涤5次，随后在灭菌的吸水纸上拍干板子。将含10％FBS的RMPI 1640培养基加入PVDF 96孔板中，每孔200μL，室温进行30min封闭反应；

(4)刺激：弃掉封闭液，每孔加入100μL预先准备好的淋巴细胞悬液，细胞悬液浓度为5×10⁶cells/mL。同时向实验组加入50μL稀释后的抗原多肽，使其终浓度为10μg/mL，阳性对照组加入终浓度为10μg/mL的PMA，阴性对照组则不加入任何刺激物。所有的样品加完后，将PVDF 96孔板放入37℃的CO₂培养箱，反应24～48h；

(5)二抗孵育：培养结束后，甩去细胞，用DPBS洗涤5次，加入浓度为1μg/mL的生物素标记二抗，每孔100μL，室温孵育2h；

(6)HRP孵育：甩掉二抗液，用DPBS洗涤5次，随后加入链霉亲和素标记的HRP，每孔100μL，室温孵育1h；

(7)显色：甩掉HRP孵育液，用DPBS洗涤5次，随后加入TMB显色底物，每孔100μL，室温或37℃作用15～30min，当阳性对照组出现明显斑点即可甩掉显色液，用纯水终止显色，风干后读板。

2.4数据分析

使用软件GraphPad Prism 8对所有实验数据进行统计学分析，其中ns表示P>0.05，差异不显著；*表示P<0.05，差异显著；**表示P<0.01，差异极显著；***表示P<0.001，差异极显著，****表示P<0.0001，差异极显著。

3、结果

3.1ALV-J感染后B21单倍型SPF鸡病毒血症、泄殖腔排毒情况和血清抗体水平

攻毒后鸡只病毒血症变化情况如图1所示，7DPI时血液中病毒含量最高，表明攻毒组所有鸡只都成功感染ALV-J，14DPI时检测血液中的病毒含量已显著下降(P<0.001)，到21DPI时均已检测不到病毒。攻毒后鸡只泄殖腔排毒情况如图2所示，均未见排毒，图3为B21单倍型SPF鸡的抗体ELISA检测结果，B21单倍型SPF鸡在7DPI抗体水平检测为阴性，14DPI和21DPI有50％的鸡只检测出抗体水平阳性，说明感染组的B21单倍型SPF鸡攻毒成功(注：运用unpaired t-test进行统计学分析)。

3.2ALV-J感染后B21单倍型SPF鸡PBMC中T细胞亚型的变化情况

为检测攻毒后B21单倍型SPF鸡T细胞免疫应答情况，按实验安排颈静脉采集鸡外周血，攻毒后的第7、14、21天分别采集B21单倍型SPF鸡外周血分离PBMC，流式检测CD8α+T细胞、CD4+T细胞和CD4+CD8α+T细胞比例。CD8α+T细胞、CD4+T细胞和CD4+CD8α+T细胞流式圈门策略如图4所示。CD8α+T细胞比例变化如图5所示，7DPI时攻毒组CD8α+T细胞比例增高(P<0.05)，14DPI和21DPI时可检测到攻毒组CD8α+T细胞比例显著增高(P<0.001)，表明病毒的感染可能引起鸡体内的CD8α+T细胞免疫应答。CD4+T细胞比例和CD4+CD8α+T细胞比例如图6、图7所示，在整个检测过程中，攻毒组的CD4+T细胞比例和CD4+CD8α+T细胞比例与对照组相比均没有统计学差异(注：运用unpaired t-test进行统计学分析)。

3.3感染后B21单倍型SPF鸡PBMC的细胞免疫相关基因表达变化

为进一步验证细胞免疫应答在ALV-J感染B21单倍型SPF鸡过程中发挥的作用，荧光定量PCR检测体内感染14、21天后PBMC中重要免疫基因mRNA表达量的变化，其中检测主要包括四部分：CTLs基因、Th2基因、天然免疫相关基因和炎症相关基因。

天然免疫相关基因部分(图8)，与对照组相比，抗病毒基因ISG12-2(Interferon-stimulated gene 12-2)在14DPI和21DPI表达量显著上调(P<0.05或P<0.01)；IFIT5(Interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5)在14DPI表达量显著上调(P<0.05)；MX1(Myxovirus resistance 1)在21DPI表达量显著上调(P<0.05)。CTLs基因部分(图9)，NK-lysin、HMG-2(high mobility group box 2)和PARP(Poly(ADP-ribose)polymerase)在14DPI表达量显著上调(P<0.05)；Granzyme A在14DPI和21DPI表达量均显著上调(P<0.01)；Granzyme K和MHC-I在21DPI表达量极显著上调(P<0.01)。检测的Th2基因(图10)中，MHC-II在14DPI和21DPI表达量显著上调(P<0.05或P<0.01)；IL-13在21DPI表达量显著上调(P<0.05)。趋化因子和炎性细胞因子部分(图11)，与对照组相比，各个基因表达量无明显差异。结合图5中CD8α+T细胞比例增加，进一步说明ALV-J感染成功激活了B21单倍型SPF鸡的T细胞免疫应答。综合上述结果，ALV-J SCAU-HN06株感染B21单倍型SPF鸡并且能有效引起细胞免疫应答的感染模型建立成功(注：运用unpaired t-test进行统计学分析)。

3.4ELISpot试验检测候选多肽免疫原性

用合成的多肽分别刺激感染ALV-J 28天后的B21单倍型SPF鸡脾脏淋巴细胞，如图12、图13、图14所示，在阳性对照组成立的前提下，统计学分析发现与阴性对照组相比，以ALV-J-M70作为刺激物的试验组能显著产生更多斑点(P<0.05)，说明这条多肽能刺激细胞分泌IFN-γ(图15)，是具有免疫原性的T细胞表位，为ALV-J表位疫苗的研发提供物质和理论基础。图12、图13、图14中M76和L53为展示的另外两条代表性的试验组肽。

M70具体的表位信息见表5。

表5一条针对B21单倍型鸡的ALV-J T细胞表位信息

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种ALV-J MHC-B21限制性表位肽，其特征在于，所述表位肽的氨基酸序列为PRLMGPFYEQL。

2.编码权利要求1所述的ALV-J MHC-B21限制性表位肽的基因。

3.如权利要求1所述的ALV-J MHC-B21限制性表位肽或权利要求2所述的基因在制备抗J亚型禽白血病病毒表位疫苗中的应用。

4.如权利要求1所述的ALV-J MHC-B21限制性表位肽权利要求2所述的基因在制备抗J亚型禽白血病病毒药物中的应用。

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