CN103525773B - 一种提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法及其应用，属于动物疫病预防控制领域。通过构建能够表达猪蓝耳病病毒受体硫酸乙酰肝素、唾液酸粘附素、波形蛋白、CD163、CD151和非肌肉肌球蛋白重链ⅡA受体中的单个或多个的Marc145细胞或MA-104细胞，再利用该细胞接种猪蓝耳病病毒，收集病毒液，猪蓝耳病病毒感染滴度得到大幅提高；收集的病毒液可进一步用于蓝耳病疫苗生产。本发明利用能表达猪蓝耳病病毒受体细胞接种病毒，可连续收获病毒且收获病毒滴度提高2～5倍，而所制备疫苗的效力并没有降低，在不增加额外生产成本的基础上，使单位时间产能提高2～5倍。

Description

一种提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法及其应用

技术领域

本发明涉及动物疫病预防控制领域，尤其涉及一种提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法及其在疫苗生产中的应用。

背景技术

猪蓝耳病，也叫猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起的以母猪流产和仔猪呼吸障碍为主要特征的病毒性传染病，并引起严重的免疫抑制。该病毒自1987年在美国出现以来，已在全球猪群中广泛传播，给世界养猪业造成了巨大的经济损失，成为全球规模化猪场的主要疫病之一，也是全球猪病控制上的一大难题。

病毒受体是决定病毒宿主范围和组织嗜性的重要因素。关于病毒受体特异性和病毒起源宿主类型之间关系的研究是目前病毒学研究的热点和难点之一。猪蓝耳病病毒侵染靶细胞的先决条件是实现与宿主细胞的吸附，而宿主细胞表面的受体是完成这种吸附过程必不可少的。研究表明，猪蓝耳病病毒与细胞上的受体结合是实现其侵染猪肺泡巨噬细胞的先决条件。目前已经确定的猪蓝耳病病毒的细胞受体有六种，分别是硫酸乙酰肝素（HeparinSulphate，HS）、唾液酸粘附素（Sialoadhesin，Sn）、波形蛋白（Vimentin）、CD163（ClusterofDifferentiation163）分子、CD151（ClusterofDifferentiation151）分子和NMMHCIIA（非肌肉肌球蛋白重链ⅡA）分子。

随着蛋白质组学技术的发展，蛋白质组学技术将在抗病毒新药开发中起着越来越重要的作用。通过病毒感染亚细胞蛋白质组研究，可以筛选病毒作用于细胞的靶标蛋白。发现病毒的作用靶标对抗病毒新型药物的开发具有重要意义，可以根据靶标的结构有的放矢地设计多肽类等抗病毒分子药物，阻断病毒对靶标的作用等。可以将编码靶标蛋白的基因通过基因工程修饰的手段转移到相应细胞基因组中，增强细胞感染病毒的强度和持续时间，生产更高效价的疫苗，为病毒性疾病的预防和治疗带来前所未有的发展空间。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法。

本发明的另一目的在于提供上述方法在猪蓝耳病疫苗生产中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法，包括如下步骤：用细胞生长液培养可表达猪蓝耳病病毒受体的细胞；待细胞覆盖率达到80%以上时，移除细胞生长液，接种猪蓝耳病病毒，加入细胞维持液继续培养；待病毒引起的细胞病变达到80%以上时收获病毒液，随后补入不含病毒的细胞维持液，12h后再收毒，如此反复收毒3～5次。

所述的可表达猪蓝耳病病毒受体的细胞优选为能表达硫酸乙酰肝素(HeparinSulphate,HS)、唾液酸粘附素(Sialoadhesin,Sn)、波形蛋白(Vimentin)、CD163（ClusterofDifferentiation163）、CD151（ClusterofDifferentiation151）和NMMHCIIA（非肌肉肌球蛋白重链ⅡA）等受体中的单个或多个的Marc145细胞或MA-104细胞。

更优选的，所述的可表达猪蓝耳病病毒受体的细胞为能表达CD151分子、CD163分子或共同表达CD151和CD163分子的Marc145细胞。

所述的表达猪蓝耳病病毒受体的细胞优选通过包含如下步骤的方法制备得到：将编码所述受体的基因片段连接到真核表达载体上，再转染到Marc145细胞或MA-104细胞中，通过G418和单细胞克隆培养法筛选获得表达猪蓝耳病病毒受体的细胞；所述的真核表达载体优选为pIRES2-EGFP。

所述的细胞生长液优选为含体积浓度为8%小牛血清的DMEM；所述的细胞维持液优选为含体积浓度为2%小牛血清的DMEM。

所述的猪蓝耳病病毒接种的剂量优选为0.0005～0.002MOI，更优选的，猪蓝耳病病毒接种的剂量为0.001MOI。

上述提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法在猪蓝耳病疫苗生产中的应用。

一种生产猪蓝耳病疫苗的方法包括如下步骤：按照上述方法收集病毒液后，将病毒液与冻干保护剂混合，制成冻干活疫苗；或将病毒液用100KD截留分子量的超滤膜包浓缩10倍以上，将灭活剂与浓缩的病毒液混合进行灭活后，再用凝胶层析柱柱层析得到纯化抗原，按抗原和油佐剂混合，乳化配制成灭活疫苗。

所述的冻干保护剂优选为质量浓度为5%的蔗糖脱脂乳；所述的灭火剂优选为质量浓度为37%的甲醛溶液；所述的油佐剂优选为用94%白油、6%Span-80和2%硬脂酸铝配制。

所述的病毒液与冻干保护剂的体积比优选为1:0.5～2，更优选为1:1；所述的灭活剂与浓缩的病毒液的体积比优选为1:1500～2500，更优选为1:2000；所述的抗原和油佐剂的体积比优选为1:0.5～2，更优选为1:1。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

本发明采用基因克隆方法从猪肺泡巨噬细胞克隆猪蓝耳病病毒受体蛋白基因编码片段，插入到真核表达载体，通过脂质体介导方式稳定转染到PRRSV敏感细胞，并采用极限稀释法，从单个阳性细胞克隆逐步扩繁，建立单个PRRSV受体或多个PRRSV受体遗传修饰的细胞系（株），利用该细胞接种猪蓝耳病病毒后，可以大幅提高病毒感染滴度，可以多次收毒,并最终确保所生产PRRSV疫苗效力的稳定性。例如，在本发明所列举实施方式中，利用猪蓝耳病病毒JXA1-R（JXA1）株感染稳定转染CD151分子、CD163分子和共同表达CD151和CD163分子，可连续收获病毒且收获病毒滴度提高2～5倍，而所制备疫苗的效力并没有降低。总体评价，采用本发明的技术，可以在不增加额外生产成本的基础上，使单位时间产能提高2～5倍。

附图说明

图1是PCR扩增的目的基因CD151和CD163片段电泳结果图；其中，A：CD151；B：CD163。

图2是重组质粒pIRES2-EGFP-CD151和pIRES2-EGFP-CD163分别用SalI和KpnI双酶切的电泳结果图；其中，A：pIRES2-EGFP-CD151；B：pIRES2-EGFP-CD163。

图3是稳定转染PRRSV受体蛋白基因CD151、CD163和CD151/CD163共转染的Marc145细胞在荧光倒置显微镜下的结果图；其中，A：转染CD151的Marc145细胞；B：转染CD163的Marc145细胞；C：CD151/CD163共转染的Marc145细胞；A、B、C各图中左图为明视野，右图为荧光显微镜观察结果。

图4是PRRSV受体在未转染Marc145细胞和转染的Marc145细胞中的表达情况结果图；其中，A1和A2分别是未转染的和转染CD151的Marc145细胞；B1和B2分别是未转染的和转染CD163的Marc145细胞；C1和C2分别是未转染的和CD151/CD163共转染的Marc145细胞；各图中左图蓝色指示细胞核，右图红色指示目标受体蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1猪蓝耳病病毒受体蛋白编码基因真核表达载体的构建及质粒提取

（1）目的基因编码区（CDS）引物设计

根据美国国家生物技术信息中心（NCBI，NationalCenterforBiotechnologyInformational；网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GenBank里已报道的猪CD151（NM_001243865.1）和CD163（NM_213976.1）基因序列，以此段序列为模板，利用primerpremier6及Oligo6软件进行引物设计。所设计的引物序列见表1，引物由上海生物工程公司合成。

表1猪CD151和CD163基因cDNA扩增的引物序列

(+)和(-)分别表示扩增片段的上游和下游引物；斜体为保护性碱基；粗体为限制性酶切位点。

（2）目的基因的PCR扩增

以提取的猪肺泡巨噬细胞（PAM细胞）总RNA反转录得到的cDNA为模板，用表1中的引物进行PCR扩增。采用KODDNA聚合酶，PCR反应体系为50μL体系，其中包括ddH₂O10μL，dNTPs8μL（浓度为10mM），2×Buffer25μL，cDNA模板4μL，上下游引物分别添加1μL，KODDNA聚合酶1μL。PCR反应程序：94℃预变性2min；98℃变性10s，退火30s，68℃延伸1kb/30s，35个循环。

（3）目的基因片段的检测

PCR反应结束后，取10μLPCR扩增产物，加0.5μL上样缓冲液（10×LoadingBuffer），混匀后小心点样于0.7%的琼脂糖凝胶胶孔中，同时点5μLDL1kMarker作为参照，在150V电压条件下，电泳40min。电泳结束后，在加有EB的缓冲液中染色15min，取出用干净的水洗去表面的EB，然后利用G-BOX凝胶成像系统观察电泳结果，结果如图1所示，CD151和CD163片段与预期大小相符。

（4）目的片段的回收、酶切和纯化

DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后，在长波长紫外灯下（时间尽可能短）确保目的片段与其它DNA分开，精确切取含有目的片段的琼脂糖凝胶，放入一无菌的1.5mL的Eppendorf（EP）管中，利用DNA胶回收试剂盒（Axygen，USA）回收目的DNA。步骤：加入400μL溶胶液，于60℃水浴5min，其间轻弹EP管，使凝胶完全溶化。将溶化的胶溶液转移到套有2mL收集管的回收柱，室温静置2min，8000r/min，离心1min，倒掉收集管中的废液，加入500μL的洗涤液洗两次，最后12000r/min离心1min，将回收柱转至一干净的1.5mLEP管中，加10μLddH₂O洗脱，于室温放置5min，12000r/min离心1min，收集管中即为回收的DNA片段，用于下一步酶切反应。

利用SalI和KpnI内切酶对回收得到的CD151（762bp）和CD163（3333bp）DNA片段进行双酶切，20μL体系：1.5×T3μL，BSA2μL，DNA14μL，SalI0.5μL，KpnI0.5μL。

在37℃恒温箱中酶切5h之后，在通过DNA回收试剂盒进行纯化（步骤同DNA胶回收）最后纯化得到的产物可用于下一步的连接。

（5）载体酶切、回收和连接

20μL酶切体系：ddH₂O10μL，1.5×T3μL，BSA2μL，pIRES2-EGFP载体4μL（2μg），SalI0.5μL，KpnI0.5μL。

酶切之后，将全部样品加到0.7%的琼脂糖凝胶点样孔中电泳。然后利用胶回收试剂盒对目的片段进行回收（方法同上）。最后将得到的线性载体与目的基因DNA分别进行连接，20μL连接体系：ddH₂O9μL，buffer2μL，DNA6μL（0.3pmol），载体2μL（0.03pmol），T4DNAligase1μL，在4℃连接反应过夜。

（6）连接产物转化DH5α

无菌条件下，在100μL的DH5α感受态细胞中加入10μL连接产物，混匀后冰浴30min，然后42℃水浴热击90s，迅速冰浴1～2min。每管加400μLLB培养基，37℃复苏60min；5000rpm离心6min，弃上清400μL，剩余的涂布至含100μg/mLAmp的LB琼脂平板上，37℃培养12～16h至单菌落出现。

（7）PCR检测阳性菌

挑取平板上的单菌落于3mL（含100μg/mL的Amp）LB培养基中，37℃300rmp振摇培养过夜。取1μL菌液做模板进行PCR检测。检测阳性后送武汉擎科测序公司进行测序。测序结果与GenBank序列一致的菌液可以直接扩大培养，提取去内毒素质粒。

（8）超纯质粒提取

采用Omega公司Endo-freePlasmidMiniKitII试剂盒提取供转染使用的超纯质粒。挑取平板上的单菌落，接种至3mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养过夜，按1:100的比例扩大培养；接种目的菌于10～15mLLB中37℃培养过夜。用10mL离心管5000g2min集菌，留1mL菌液重悬菌体。将重悬液转移到2mL的离心管中。集菌完成后要弃净培养液，加入500μL的SolutionI，充分重悬菌体，用枪头反复吹打（混匀，不能出现细菌团）；加入500μL的SolutionII，缓慢上下颠倒7～10次，使菌体充分裂解，室温放置2min至裂解液变澄清（注意不要超过5min），SolutionII不能长时间暴露在空气中，用完后，立即盖上盖子；加入250μL预冷的BufferN3，缓慢上下颠倒数次，直到生成白色沉淀，以最大的离心速度（一般为12000r/min）4℃离心10min；小心移取上清液到干净的1.5mL离心管中加0.1×体积的ETR，颠倒数次混匀，冰上孵育10min（加入ETR后，裂解液变浑浊，在冰上孵育之后会变澄清，不要使用2mL的离心管）。42℃，5min，裂解液再次浑浊，12000g3min，ETR将会在管底形成一层蓝色的沉淀；转移上层水相到1个新的2mL离心管中，加入0.5×体积的无水乙醇，缓慢混合6～7次，室温孵育1～2min；转移700μL混合液到HiBindTMDNAMiniColumnII和2mL离心管中，室温下10000g1min离心，弃出废液，重复这一步骤；加500μLHB清洗柱子，室温下10000g1min离心，弃出流液（去除残留蛋白污染）；加700μLDNAWashingBuffer，室温下10000g1min离心，弃出流液，重复操作一次；最高速度离心3min，干燥柱子中的膜，将柱子放入一个新的1.5mL的离心管中，加80～100μLEndotoxin-FreeElutionBuffer，最高转速离心5min，得到可以表达CD151和CD163分子的真核表达载体pIRES2-EGFP-CD151和pIRES2-EGFP-CD163。

最后将pIRES2-EGFP-CD151和pIRES2-EGFP-CD163分别用SalI和KpnI进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳对酶切片段进行验证，结果如图2所示，表明重组质粒构建成功。提取的质粒用核酸蛋白分析仪测定其浓度。

实施例2细胞转染

待Marc145细胞或MA-104细胞融合达到85%以上时，将其接种于新的培养皿，于37℃、5%CO₂培养箱中培养培养24小时，待细胞融合至70～80%时，按照Lipofectamine2000转染试剂盒操作说明书进行CD151（所用质粒为pIRES2-EGFP-CD151）、CD163（所用质粒为pIRES2-EGFP-CD163=1:1）、CD151和CD163（所用质粒为pIRES2-EGFP-CD151:pIRES2-EGFP-CD163=1:1）转染操作，6h后更换有血清、无双抗的DMEM培养基（DMEM+10%胎牛血清（Gibco公司））。转染48h后，开始用G418培养基（DMEM+10%胎牛血清+G418（Gibco公司））筛选。过程为：第1～3天300μg/mL，接着用600μg/mL的浓度继续筛选，直至绝大部分细胞死亡，将G418浓度改为800μg/mL维持筛选6周。将获得细胞采用极限稀释法传至96孔细胞培养板，每孔约1个细胞，交替使用常规细胞生长培养基（DMEM+10%胎牛血清（Gibco公司）+100IU青霉素/链霉素）和G418（600μg/mL）培养基培养单个细胞，至其长出单个克隆。在荧光显微镜下挑选出最优的细胞克隆继续培养，并不断扩繁至建立稳定转染CD151、CD163和CD151/CD163共转染的细胞系（株），转染CD151、CD163和CD151/CD163共转染的Marc145细胞在荧光倒置显微镜下的图片如图3所示，转染后的细胞均表达强烈的绿色荧光，表明细胞能够稳定表达目的蛋白。

实施例3病毒受体在Marc145细胞中的表达

（1）细胞培养：按常规细胞培养方法分别培养转染CD151、CD163、CD151/CD163和未转染的Marc145细胞。于超净工作台内，打开六孔板，放置灭菌盖玻片；将细胞悬液滴加至盖玻片上，置于CO₂浓度为5%的培养箱中于37℃培养至细胞贴壁（约2h）；加入2mL细胞培养基（DMEM+10%胎牛血清（Gibco公司）+100IU青霉素/链霉素）继续培养约6h；倒去培养基，用PBS（pH7.4）洗3次，每次5min。

（2）细胞固定：4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3次，每次5min。

（3）细胞破膜：爬片稍甩干后用组化笔在盖玻片中间细胞分布均匀的位置画圈（防止抗体流走），加50～100μL破膜工作液（BD公司），室温孵育10min，PBS（pH7.4）洗3次，每次5min。

（4）加一抗：去除PBS，分别用PBS按一定比例稀释好的一抗（均购自Abcam公司）（兔抗CD163，1:50；兔抗CD151，1:50；兔抗CD69，1:50；兔抗CD34，1:100；小鼠抗CD44，1:100；小鼠抗CD90，1:100；兔抗vimentin，1:100）覆盖组织；爬片平放于冰箱内4℃孵育过夜。

（5）加二抗：爬片用PBS（pH7.4）洗涤3次，每次5min；去除PBS后在圈内滴加与一抗相应种属的荧光二抗（均购自Abcam公司）（cy3标记山羊抗兔1:100；cy3标记山羊抗小鼠1:100）覆盖组织，避光室温孵育50min。

（6）DAPI复染细胞核：爬片用PBS（pH7.4）洗涤3次，每次5min；去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

（7）封片：爬片用PBS（pH7.4）洗涤3次，每次5min；爬片稍甩干后将有细胞的一面朝下用抗荧光淬灭封片剂将玻片封固在载玻片上封片。

（8）镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像，如图4所示，表明转染后的细胞能够超量表达相应受体蛋白。

实施例4超表达猪蓝耳病病毒受体的细胞在提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度和猪蓝耳病疫苗生产中的应用

（1）细胞：超表达猪蓝耳病病毒受体CD151、CD163和CD151/CD163共表达的Marc145细胞或MA-104细胞。

（2）猪蓝耳病病毒：JXA1-R（JXA1）株。

（3）细胞生长液：含体积浓度为8%小牛血清的DMEM（北京清大天一生物技术有限公司）。

（4）细胞维持液：含体积浓度为2%小牛血清的DMEM（北京清大天一生物技术有限公司）。

（5）细胞培养：按照常规细胞培养方法用细胞生长液进行细胞扩繁培养（参考薛庆善主编《体外培养的原理和技术》（科学出版社2001年出版））；将扩大培养的细胞接种到转瓶中培养，控制转速10转/小时。

（6）病毒繁殖：取所需数量的、细胞覆盖率达到80%以上的细胞转瓶，移除细胞生长液，按照0.001MOI剂量接种猪蓝耳病病毒，加入细胞维持液，在37℃下继续培养。

（7）收毒：在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变，直至其达到80%以上时收获病毒液，随后补入不含病毒的细胞维持液，12h后再收毒，反复收毒5次；按Reed-Muench法计算TCID50值（表2）。将收获的病毒液置于2～8℃中，保存在-20℃。

（8）制备疫苗：①活疫苗（JXA1-R株）：将上述收获的病毒液按病毒液与冻干保护剂的体积比为1:1加入质量浓度为5%的蔗糖脱脂乳冻干保护剂，制成冻干活疫苗。②灭活苗（JXA1株）：将上述收获的病毒液用100KD截留分子量的超滤膜包浓缩10倍，灭活剂与病毒液的体积比按1:2000加入质量浓度为37%的甲醛溶液进行灭活后，再经凝胶层析柱Sepharose4FF柱层析得到纯化抗原，按抗原和油佐剂体积比1:1的比例加入油佐剂，乳化配制成灭活疫苗（油佐剂的配制为94%（V/V）白油、6%（V/V）的Span-80、2%（g/V）硬脂酸铝）。

（9）疫苗效力检验：①疫苗免疫接种：将疫苗分别按2mL/头的剂量接种4～6周龄仔猪10头，同时设非免疫对照组10头。②血清抗体检测：在免疫前和免疫后28天采集猪血清，检测对猪蓝耳病病毒中和抗体效价。③攻毒保护试验：免疫后28天，用猪蓝耳病病毒（含量为105.5TCID50/mL的病毒液）1:10稀释后给每头猪肌肉接种3mL，继续饲养观察21天，扑杀剖检。检测结果见表2。

表2病毒培养效价及疫苗效力检测结果

由表中结果中可以看出，本发明能表达猪蓝耳病病毒受体的细胞，与同类型普通细胞相比较，在所培养病毒的效价上，前者较后者高出2～5倍；在疫苗效力上，前者与后者相当。总体评价，前者的生产效率高于后者2～5倍。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCELISTING

<110>武汉市畜牧兽医科学研究所

<120>一种提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法及其应用

<130>1

<160>4

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>CD151-F

<400>1

cggtcgacatgggcgaattcggcgagaag29

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>CD151-R

<400>2

cggggtacctcagtagtgctccagcttcag30

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>CD163-F

<400>3

cggtcgacatggtgctacttgaagactctg30

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>CD163-R

<400>4

cggggtacctcattgtacttcagagtggtc30

Claims (6)

1.一种提高猪蓝耳病病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)靶细胞感染滴度的方法，其特征在于包括如下步骤：用细胞生长液培养经遗传修饰后可超表达猪蓝耳病病毒受体的细胞；待细胞覆盖率达到80％以上时，移除细胞生长液，接种猪蓝耳病病毒JXA1-R，加入细胞维持液继续培养；待病毒引起的细胞病变达到80％以上时收获病毒液，随后补入不含病毒的细胞维持液，12h后再收毒，如此反复收毒3～5次；

所述的经遗传修饰后可超表达猪蓝耳病病毒受体的细胞为能超表达CD151分子、CD163分子或共同表达CD151和CD163分子的Marc145或MA-104细胞，其通过包含如下步骤的方法制备得到：将编码CD151分子和/或CD163分子基因片段连接到真核表达载体pIRES2-EGFP上，再转染到Marc145细胞或MA-104细胞中，通过G418和单细胞克隆培养法筛选获得超表达猪蓝耳病病毒受体的细胞；其中，扩增CD151、CD163分子基因片段的引物为：

CD151-F：cgGTCGACATGGGCGAATTCGGCGAGAAG，

CD151-R：cggGGTACCTCAGTAGTGCTCCAGCTTCAG；

CD163-F：cgGTCGACATGGTGCTACTTGAAGACTCTG，

CD163-R：cggGGTACCTCATTGTACTTCAGAGTGGTC。

2.根据权利要求1所述的提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法，其特征在于：所述的猪蓝耳病病毒接种的剂量为0.0005～0.002MOI。

3.权利要求1或2所述的提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法在猪蓝耳病疫苗生产中的应用。

4.一种生产猪蓝耳病疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：按照权利要求1或2所述的提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法收集病毒液后，将病毒液与冻干保护剂混合，制成冻干活疫苗；或将病毒液用100KD截留分子量的超滤膜包浓缩10倍以上，将灭活剂与浓缩的病毒液混合进行灭活后，再用凝胶层析柱柱层析得到纯化抗原，按抗原和油佐剂混合，乳化配制成灭活疫苗。

5.根据权利要求4所述的生产猪蓝耳病疫苗的方法，其特征在于：所述的冻干保护剂为质量浓度为5％的蔗糖脱脂乳；所述的 灭活剂为质量浓度为37％的甲醛溶液；所述的油佐剂用94％白油、6％Span-80和2％硬脂酸铝配制。

6.根据权利要求4所述的生产猪蓝耳病疫苗的方法，其特征在于：所述的病毒液与冻干保护剂的体积比为1:0.5～2；所述的灭活剂与浓缩的病毒液的体积比为1:1500～2500；所述的抗原和油佐剂的体积比为1:0.5～2。