CN106754981A

CN106754981A - 一种利用大肠杆菌系统制备小鹅瘟病毒样颗粒的方法

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Publication number: CN106754981A
Application number: CN201710049003.8A
Authority: CN
Inventors: 曲光刚; 沈志强; 金婷婷; 李书光; 武曰星; 王长江
Original assignee: Binzhou Shandong Province Animal And Veterinary Research Institute
Current assignee: Binzhou Shandong Province Animal And Veterinary Research Institute
Priority date: 2017-01-23
Filing date: 2017-01-23
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2037-01-23
Also published as: CN106754981B

Abstract

本发明涉及一种利用大肠杆菌系统可溶性表达小鹅瘟VP2蛋白制备小鹅瘟病毒样颗粒方法，一种可溶性表达小鹅瘟病毒VP2蛋白的方法，对鹅细小病毒VP2基因进行密码子优化，定点突变包括将密码子AGA突变为CGC和GGA突变为GGT,并克隆到pET‑Sumo载体上，构建重组表达载体pET‑Sumo‑VP2，并将pET‑Sumo‑VP2转化至原核表达菌，通过IPTG在37℃下诱导，获得可溶性重组VP2重组蛋白；将重组蛋白用ULP酶酶切后通过Ni柱纯化得到纯化的VP2蛋白。电镜结果显示酶切后的VP2蛋白可形成小鹅瘟病毒样颗粒，并且纯化后的VP2蛋白具有良好的反应原性，可用于小鹅瘟病毒基因工程亚单位疫苗的制备。

Description

一种利用大肠杆菌系统制备小鹅瘟病毒样颗粒的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种利用大肠杆菌系统可溶性表达小鹅瘟VP2蛋白制备小鹅瘟病毒样颗粒方法。

背景技术

鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）感染起初不同国家的学者将其称为鹅流感，又称鹅瘟或小鹅瘟、鹅肠炎、鹅肝炎、鹅传染性心肌炎等。本病名称的多样性反映了其病理学特征的多样性和对易感动物危害的严重性。不同日龄的雏鹅感染病毒后会出现不同的临床症状，分别表现为慢性型、亚急性型和急性型，其中急性型病程经过可以导致被感染鹅100%死亡。

小鹅瘟病毒（Gosling plague virus，GPV）属细小病毒科，病毒粒子无囊膜，核酸为单股DNA，GPV基因组两个主要的开放阅读框中的3-ORF编码3种结构蛋白VP1、VP2、和VP3，其中VP2是病毒的主要衣壳蛋白，具有高度的保守性，能诱导机体产生中和抗体，是GPV主要的免疫保护性抗原。针对小鹅瘟传统诊断和治疗措施中存在的诸如使用的高免血清产量低、成本高、易发生排异；卵黄抗体存在污染外源病毒的风险：弱毒疫苗则存在毒力返强的的风险等的诸多问题，而基因工程疫苗能够克服上述方法的缺点，具有替代传统疫苗的潜在优势。与真核表达系统不同，大肠杆菌表达系统操作方便，易于规模化生产，最重要的是表达外源蛋白成本低，尤其适用廉价的禽类疫苗的研发。目前，虽有部分重组VP2蛋白大肠杆菌表达的报道，但其表达的蛋白多以包涵体的形式存在，影响小鹅瘟VP2蛋白形成病毒样颗粒，限制了大肠杆菌表达的小鹅瘟VP2蛋白在疫苗研发中的应用。所以本试验利用部分密码子序列优化的小鹅瘟VP2基因来构建小鹅瘟主要保护性抗原VP2蛋白的原核表达载体，并在原核表达系统中对VP2蛋白进行可溶性表达，并利用可溶性的VP2蛋白制备小鹅瘟病毒样颗粒，为研制小鹅瘟基因工程疫苗奠定基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是大肠杆菌系统表达的小鹅瘟病毒VP2蛋白多以不溶的包涵体形式存在而无法获得小鹅瘟病毒样颗粒，影响了大肠杆菌表达的VP2蛋白在疫苗研发中应用的技术缺陷，提供一种利用大肠杆菌可溶性表达小鹅瘟病毒VP2蛋白，并利用该方法获得的可溶性VP2蛋白制备出小鹅瘟病毒样颗粒的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

利用一种可溶性表达的小鹅瘟病毒VP2蛋白制备小鹅瘟病毒样颗粒的方法，首先对鹅细小病毒VP2蛋白基因经过定点突变密码子进行优化，定点突变包括将密码子AGA突变为CGC和GGA突变为GGT。进一步地，定点突变的部位包括位于鹅细小病毒VP2如下氨基酸残基位点:第39位、第40位、第57位、第58位、第157位、第257位、第403位、第483位和第487位。根据本发明的再一个方面，提供编码上述可溶性融合蛋白的DNA序列。然后设计引物，扩增VP2基因，并克隆pET-Sumo载体上，构建表达载体pET-Sumo-VP2，将pET-Sumo-VP2转化至原核表达菌，通过 IPTG 在37℃下诱导获得可溶性VP2-Sumo蛋白，再经ULP蛋白酶酶切，将酶切产物过Ni柱纯化，得到纯化的VP2蛋白，将纯化好的VP2蛋白透析到PBS中，通过电镜观察，从而成功制备了小鹅瘟病毒样颗粒。

小鹅瘟病毒VP2蛋白是其主要的结构蛋白之一，目前通过原核表达系统实现其可溶性表达未有报道。一般表达的小鹅瘟病毒VP2蛋白多以包涵体的形式存在，无法形成病毒样颗粒，限制了不溶性VP2的实际应用。申请人通过大量探索发现：将VP2基因与pET-Sumo载体相连，并配合 25℃的诱导温度可以表达出大量可溶性表达的VP2蛋白，并且该可溶性VP2蛋白可以形成小鹅瘟病毒样颗粒。

本发明使用pET-Sumo表达载体，该载体可以促进重组表达蛋白的可溶性表达。实验研究表明，包涵体形式表达重组蛋白影响其氨基酸折叠形成正常的蛋白质三级、四级拓扑结构，进而影响重组表达蛋白的抗原性和生物活性。本发明克服了表达的蛋白不可溶的缺点。在蛋白纯化方面，使用pET-Sumo载体虽然实现了目的蛋白的可溶性表达，但重组VP2蛋白上带有Sumo标签，用Ni柱纯化时蛋白过大不易纯化，且所带的Sumo标签会影响VP2蛋白本身形成病毒样颗粒（VLP），所以本发明使用了ULP蛋白酶特异性的将Sumo标签与VP2蛋白切开。

ULP蛋白酶可以特异性的将重组蛋白上的Sumo标签切下，使之与VP2蛋白分离，酶切后的混合蛋白溶液经Ni柱纯化，即得到VP2蛋白。

优选地，本发明所述原核表达菌在培养至 OD600值为 0.5 ～ 0.7 后，加入 IPTG进行诱导；更优选地，原核表达菌在培养至OD600值为0.6 后，加入IPTG 进行诱导

优选的，本发明所述IPTG 诱导的浓度为0.25～1 mM，诱导时间为8 ～20 h。

更优选地，申请人发现所述原核表达菌在37℃培养下，IPTG 诱导浓度为1 mM，且

诱导时间为6 h 时，VP2蛋白的表达量最高，且多为可溶性表达。

具体地，上述方法包括以下步骤：

S1. 重组质粒pET-Sumo-VP2的构建：设计SEQ ID NO ：1 所述引物扩增优化后的VP2基因，将优化后的VP2基因与pET-Sumo载体相连构建质粒pET-Sumo-VP2；最后将pET-Sumo和测序正确的pMD18-T-VP2进行双酶切后构建表达载pET-Sumo-VP2；

S2. 将pET-Sumo-VP2转化入BL21（DE3）plyss中，测序鉴定为阳性之后，将菌液接种于培养基中，培养至OD600值为0.5 ～ 0.7，加入IPTG 诱导后，离心重悬菌体，破碎菌体，收集上清，获得可溶性VP2-Sumo蛋白。通过重复性试验发现，pET-Sumo-VP2该质粒在BL21（DE3）plyss菌中表达的稳定性更高，所以后续表达均使用BL21（DE3）plyss表达菌株。

S3. 将得到的VP2- Sumo蛋白用ULP酶酶切，按0.5%的酶量加入，将酶切产物通过固定化金属配体亲和层析方法进行纯化，最终获得纯度很高的VP2蛋白。

S4. 将纯化后的VP2蛋白透析到PBS中，换液三次，每次间隔6小时，透析结束后，取样品进行电镜观察，结果证明最终利用可溶性的VP2蛋白成功制备了小鹅瘟病毒样颗粒。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种利用大肠杆菌表达的可溶性小鹅瘟病毒VP2蛋白制备小鹅瘟病毒样颗粒的方法，首先对鹅细小病毒VP2基因进行密码子优化，再将改造好的VP2基因克隆到pET-Sumo载体上，构建表达载体pET-Sumo-VP2，并将pET-Sumo-VP2 转化至原核表达菌，通过IPTG 在37℃下诱导获得；以上述方法获得的Sumo-VP2重组蛋白几乎全部以可溶表达的形式存在，再将重组蛋白VP2-Sumo进行ULP酶切，使VP2蛋白与Sumo标签蛋白分开，再经Ni柱纯化，纯化后，该重组蛋白可形成病毒样颗粒（VLP），具有良好的反应原性，为研究小鹅瘟基因工程亚单位疫苗打下基础。

附图说明

图1 为VP2基因的PCR 扩增图；其中，M ：2000bp 的DNA 分子量标准；1 ：VP2；2 ：ddH2O对照。

图2 为重组克隆质粒VP2-pET-Sumo的酶切鉴定；其中，M ：12000bp 的DNA 分子量标准；1 ：VP2-pET-Sumo重组质粒的Bam HⅠ和HindⅢ双酶切产物。

图3 为密码子优化后的VP2测序结果；

图4 为VP2基因密码子优化前、后的重组蛋白诱导表达量比较；其中，M ：蛋白分子量标准；1：VP2基因密码子优化前的重组蛋白表达量；2：VP2基因密码子优化后的重组蛋白表达量；3：阴性对照。

图5为不同诱导温度对蛋白表达量的影响；其中，M ：蛋白分子量标准； 1-5：分别在10℃、15℃、20℃、28℃和37℃温度下诱导的蛋白表达;；6：IPTG 诱导前的蛋白表达。

图6为不同IPTG 诱导时间对蛋白表达量的影响；其中，M ：蛋白分子量标准；1-8分

别为IPTG 诱导0、2、4、6、8、12、16和20小时的蛋白表达。

图7为不同IPTG 浓度对诱导蛋白表达量的影响；其中，M ：蛋白分子量标准； 1-6：

IPTG 浓度分别为：0、0.1、0.25、0.5、1.0 和1.2 mM。

图8为37℃下0.25mM IPTG 诱导6 h 后表达的蛋白；其中，M ：蛋白分子量标准；1：诱导后BL21 细菌的蛋白表达；2 ：转化空载体pET-Sumo的BL21（DE3）plyss诱导后蛋白表达；3：转化重组质粒 VP2-pET-Sumo的BL21（DE3）plyss诱导前蛋白表达；4 ：转化重组质粒VP2-pET-Sumo的BL21（DE3）plyss诱导后蛋白表达，超声后上清；5 ：转化重组质粒VP2-pET-Sumo的BL21（DE3）plyss诱导后蛋白表达，超声后沉淀；6 ：转化重组质粒 VP2-pET-Sumo的BL21（DE3）plyss诱导后的上清蛋白，经ULP酶酶切后蛋白；7 ：酶切后经亲和层析纯化后的VP2蛋白。

图9为切除标签后VP2蛋白的电镜照片。

图10为纯化后VP2蛋白的Western-blot分析结果；其中，1 ：阴性对照；2：纯化的VP2蛋白；M ：蛋白分子量标准。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本

发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1原核表达重组质粒pET-Sumo-VP2的构建与鉴定

1、鹅细小病毒VP2蛋白基因密码子的优化

定点突变包括将密码子AGA突变为CGC和GGA突变为GGT。进一步地，定点突变的部位包括位于鹅细小病毒VP2如下氨基酸残基位点:第39位、第40位、第57位、第58位、第157位、第257位、第403位、第483位和第487位。

2、引物设计：根据NCBI 基因库中小鹅瘟病毒结构蛋白VP2基因序列（AY506547）以及pET-Sumo载体酶切位点，运用OLigo6.0 软件，设计一对带酶切位点的引物（由上海捷瑞生物技术有限公司合成），引物序列如下：

VP2-F：5' CG GGATCC ACGGCACCCGTCAA 3'（下划线为BamH I酶切位点）

VP2-R：5'CCCAAGCTTTCATTACAGATTTTGAGTTAGATATCTG 3'

（下划线为Hind III酶切位点，TCA为附加的终止密码子。）

4、VP2优化后基因的PCR扩增与克隆

4.1 参照PrimeSTAR Max DNA Polymerase说明书分别扩增VP2序列，反应体系如表1。

表1 VP2 30μlPCR反应体系

试剂	体积
		PrimeSTAR Max Premix(2×)	15μl
VP2-F(10 μmol)	1μl
		VP2-R(10 μmol)	1μl
GPV VP2-pMD18-T(1 ng/μl)	1μl
		ddH₂O	12 μl

反应程序：：98℃变性10 s； 55℃退火15 s ；72℃延伸10s共运行30 个循环，72℃终延伸10 min，最后-20℃保存，结果如图1。

参照OMEGA普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（Gel Extraction kit）的使用说明书进行PCR 产物的回收、纯化，具体步骤如下：

(1)在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。

(2)将切下含有DNA条带的凝胶放入1.5mL离心管，称重。

(3)加一到两倍体积溶胶/结合液DB。（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100 μL，则加入100 μL～200 μL溶胶液；如果凝胶浓度大于2%，应加入2～4倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400mg。）

(4)56℃水浴放置3～5分钟（或直至胶完全溶解）。每1～2分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解。

(5)将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm离心30～60秒，倒掉收集管中的废液。（如果总体积超过750μL，可分两次将溶液加入同一吸附柱AC中）

(6)加入700 μL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇！），12000 rpm离心1分钟，弃掉废液。

(7)将吸附柱AC放回空收集管中，12000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

(8)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50 μL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12000 rpm离心1分钟。如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入离心柱中，离心1分钟。

(9)NANO DROP 2000测定PCR产物回收浓度，为后续PCR产物的连接作参考。

4.2 VP2-pET-Sumo的构建及鉴定

将新构建载体VP2-pET-Sumo与已回收的VP2 PCR产物分别用限制性内切酶BamH I、Hind III进行双酶切处理，酶切体系如表2。

表2pET-Sumo50 μl酶切反应体系

试剂	体积
		10×Q.Cut buffer	5μl
pET-Sumo（500 ng/μl）	2μl
		Q．cutBamH I	1μl
Q．cutHind III	1 μl
		ddH₂O	41μl

反应条件：先30℃酶切反应30 min，再37℃酶切反应30 min。

pET-Sumo经BamH I、Hind III双酶切后回收得到产物40 ng/μl

回收的VP2 PCR产物分别用限制性内切酶BamH I、Hind III进行双酶切处理，酶切体系如表3。

表3VP2 PCR产物30 μl酶切反应体系

试剂	体积
		10×Q.Cut buffer	3 μl
VP2 PCR回收产物（150 ng/μl）	1.5 μl
		Q．cutBamH I	1 μl
Q．cutHind III	1 μl
		ddH₂O	23.5 μl

反应条件：先30℃酶切反应30 min，再37℃酶切反应30 min。

VP2 经BamH I、Hind III双酶切后回收得到产物9.6 ng/μl

4.3 将pET-Sumo（BamH I、Hind III双酶切后）与VP2（（BamH I、Hind III双酶切后））回收产物进行连接，连接体系如表4。

表4 10 μl酶切反应体系

试剂	体积
		10× T4 ligase buffer	1 μl
VP2（9.6 ng/μl）	7.5μl
		pET-Sumo（40 ng/μl）	1μl
T4 ligase	0.5 μl

反应条件：16℃连接反应 1 h。

5、连接产物转化DH5α 感受态细胞：本研究采用热休克法将4.3获得的连接产物转入大肠杆菌细胞中，具体步骤如下：

（1）从-80℃冰箱取一小份感受态细胞悬液，立即放于冰上解冻。

（2）加入适量目的质粒或连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min。

（3）42℃水浴热击60 s，迅速置于冰上冷却3 ～ 5 min。

（4）加入1mL LB 液体培养基，混匀后37℃振荡培养60min ；

（5）10000rpm 瞬离30 s后，去掉上清液至只剩余100μl后，重悬菌体，将其涂布于含相

应抗生素的筛选平板上，正面向上放置于37℃恒温培养箱中待菌液完全被培养基吸收后倒

置平板，培养12～16h。

用灭菌的10μl枪头挑取可疑菌落于含氨苄青霉素的LB 液体培养基中，于37℃震

荡培养12～16h，取适量菌液作PCR 鉴定，PCR 扩增体系如表5。

表5 25μl PCR反应体系

试剂	体积
		10×PCR buffer	2.5 μl
dNTPs(2.5mM)	2 μl
		VP2-F（10 μM）	1 μl
VP2-R（10 μM）	1 μl
		菌液	1 μl
rTaq	0.5 μl
		ddH₂O	17 μl

PCR 反应程序：95℃预变性5min ；（95℃变性40 s；55℃退火40 s；72℃延伸1min50 s）共运行34个循环，72℃终延伸10min，最后-20℃保存。

6、阳性菌液保存和质粒的提取

对PCR鉴定为阳性克隆的菌液加15%甘油，冻存于-80℃备用。

对阳性克隆菌液进行质粒提取，参照Plasmid Mini Protocol I 说明书操作，具体操作步骤如下：

(1)取37℃摇瓶培养过夜16～18 h的菌液1.5～5.0 mL，加入1.5 mL离心管中，10000×g，离心1分钟，倒掉上清并用吸水纸尽量吸干残液。（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）

(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μL Solution I/RNaseA溶液(4℃放置)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。（注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。）

(3)向离心管中加入250 μL Solution Ⅱ溶液，温和地上下翻转6－8次使菌体充分裂解。（注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。）

(4)向离心管中加入350 μL Solution Ⅲ溶液，立即温和地上下翻转10次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000 rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。（注意：Solution Ⅲ加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。）

(5)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），（注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。）

(6)向吸附柱中加入500 μL Buffer HB洗涤，12,000 rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(7)加入700 μL的DNA Wash Buffer(加有乙醇的)，12,000 rpm离心60秒。

(8)重复步骤（7）一次。

(9)弃掉收集管中液体后，12,000 rpm空离心2分钟。

(10) 弃掉收集管，换为新的1.5 mL离心管，加入30～50 μL Elution Buffer，滴入吸附柱中间位置，静置2分钟，12,000 rpm离心60秒。（注意：如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。）

(11) NANO DROP2000测定所提质粒浓度，-20°C保存备用。

7、序列测定

将PCR 鉴定为阳性的菌液所提质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定，测序结果如图3。使用lasergene MegAlign 软件，对测序结果与NCBI上VP2基因序列（AY506547）进行比对。将比对正确的质粒命名为VP2-pET-Sumo。

8、将测序正确的VP2-pET-Sumo质粒转入表达菌株BL21（DE3）plyss感受态细胞

取1ng/μl VP2-pET-Sumo质粒1 μl转入BL21（DE3）plyss感受态细胞中，具体转化方法参照步骤5。

37℃摇完菌后直接取100μl涂布于含相应抗生素的筛选平板上，正面向上放置于37℃恒温培养箱中待菌液完全被培养基吸收后倒置平板，培养12～16h。

9、双酶切验证

用灭菌的10μl枪头挑取转化后所涂平板上的菌落于含氨苄青霉素的LB 液体培养基中，于37℃震荡培养12～16h，提取质粒，对所提质粒做双酶切，验证是否为重组阳性质粒，具体体系如表6：

表6 VP2-pET-Sumo 50 μl酶切反应体系

试剂	体积
		10×Q.Cut buffer	5 μl
VP2-pET-Sumo（500 ng/μl）	2 μl
		Q．cutBamH I	1 μl
Q．cutHind III	1 μl
		ddH₂O	41 μl

酶切完成后，核酸电泳检测结果（如图2）表明，所提质粒为VP2-pET-Sumo重组阳性质粒。

10、VP2优化前基因的克隆与重组质粒的构建过程同上述VP2优化后基因的克隆与重组质粒的构建，步骤略。

实施例2：可溶性VP2-pET-Sumo重组蛋白的表达及最佳诱导条件的确定

首先，将两种重组质粒（VP2基因优化前、优化后）分别转化至表达菌株感受态BL21（DE3）plyss中，划板后挑取阳性菌落，按1 ：50 比例接种于（含氨苄青霉素100μg/ml）LB 液体培养基中，分别于37℃摇床中200r/min 振荡培养，至菌液OD600值为0.6 左右时，加入IPTG至终浓度1mM，进行30℃初步诱导表达5 h后，收样，样本于4000r/min 离心15 min，并将菌体沉淀用原体积1/20 的PBS（pH 7.4）重悬，超声破碎仪超声后，4℃，12000r/min 离心10 min，吸取各个样品超声破碎后上清，按常规方法进行SDS-PAGE，比较VP2基因优化前与优化后的重组蛋白表达量。结果（如图4）表明，VP2基因经点突变优化后的重组蛋白表达量较优化前有明显提高，则后续蛋白各诱导条件摸索均使用点突变优化后的VP2基因与pET-Sumo所构建的重组质粒，按下列方法进行VP2-Sumo重组蛋白的优化表达。

1. 诱导表达温度的确定

加入浓度为1mM 的IPTG，并分别于10℃、15℃、20℃、28℃和37℃的条件下震荡培养至恰当的诱导时间取样。样本于4000r/min 离心15 min，并将菌体沉淀用原体积1/20 的PBS（pH 7.4）重悬，超声破碎仪超声后，4℃，12000r/min 离心10 min，吸取各个样品超声破碎后上清，按常规方法进行SDS-PAGE，检测各样品上清中融合蛋白的表达。用BandScan（5.0版）软件分析泳道内蛋白含量，以确定最佳诱导表达温度。结果表明（如图5），37℃诱导比其他温度诱导的目的蛋白的表达量都高，确定最佳诱导表达温度为37℃。

2. IPTG 诱导时间的确定

重复诱导实验，当转化菌液OD600值达0.6 左右时，加入浓度为1mM 的IPTG，37℃诱导表达，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h和20 h后取样。样本经4000r/min 离心10min，弃上清，并将菌体沉淀用原体积1/20 的PBS重悬，超声破碎仪超声后，4℃，12000 r/min 离心10min，吸取各个样品超声破碎后上清，进行 SDS-PAGE 检测，并经BandScan 分析，确定IPTG最佳诱导时间。结果（如图6）显示，诱导6h后收样，目的蛋白表达量即达到最高，随诱导时间的延长VP2表达量不再增加，所以最终确定IPTG 的最佳诱导时间是6 h。

3. IPTG 诱导浓度的确定

按上述最佳诱导方法，当转化菌液OD600值达0.6 左右时，分别用终浓度为0.1mM、0.25mM、0.5mM、0.7mM、1mM和1.2mM的IPTG 于37℃诱导表达6 h 后取样。样品以4000r/min离心10min，弃上清，收集菌体沉淀用原体积1/20 的PBS重悬，超声破碎仪超声后，4℃，12000 r/min 离心10 min，吸取各个样品超声破碎后上清，进行 SDS-PAGE检测并经BandScan 分析，确定IPTG 最佳诱导浓度。结果（如图7）显示IPTG 诱导浓度从0.25-1.2mM，VP2蛋白表达量相近，所以确定最佳的IPTG诱导浓度为0.25 mM。

4. 可溶性Sumo-VP2蛋白ULP酶切反应

将含有阳性质粒（VP2-pET-Sumo）的BL21（DE3）plyss菌液按1 ：100 的比例接种于200ml LB 液体培养基（含氨苄青霉素100μg/ml）中，于37℃振荡培养至OD600大约0.6 左右时，加入浓度为0.25mM 的IPTG，37℃诱导6 h，收样，菌体用ULP buffer重悬、超声，离心得上清，将上清中加入ULP酶，使目的蛋白与ULP酶的质量比为200:1，30℃酶切2 h，酶切后4℃，12000 r/min 离心10 min，可见极少量沉淀，将上清样品放于4℃，待后续纯化。蛋白的可溶性表达与酶切结果见图8。

5. 酶切后的蛋白样品的电镜观察

利用透射电镜观察，结果（见图9）显示，酶切后的VP2蛋白能够自我组装成直径20~22nm大小的VLPs，形态结构类似于小鹅瘟病毒粒子。

6. 可溶性VP2蛋白非变性纯化

6.1可溶性Sumo-VP2蛋白的纯化

可溶性Sumo-VP2蛋白，使用GE公司His Trap FF（1ml）产品对表达蛋白进行纯化。参照说明书进行，具体操作如下：

（1）蛋白准备

将诱导蛋白表达后菌液，4000g 离心10min，收集菌体。用结合缓冲液20mL 重悬（酶切缓冲液用量为原菌液体积的1/20），超声破碎仪超声后，4℃，12000 r/min 离心10 min，弃掉少量沉淀，取上清待过亲和层析柱纯化。

（2）亲和层析

a. 柱子的准备

用 3-5 个柱床体积的蒸馏水洗去柱内的乙醇。用10个柱床体积的结合缓冲液平衡柱。流速控制在1 ml/min。

b.上柱：将步骤（1）准备好的蛋白溶液经0.22μm的滤膜过滤后，用蠕动泵泵入已经平衡好的预装柱，流速控制在≤1 ml/min。同时接流穿液，即纯化后的蛋白液，—80℃保存。纯化效果见图7。

c.洗脱：直接用带250 mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱柱子，以每组分0.5mL 收集6个组分，

使用微量分光光度计NANO DROP 2000测量每组分目的蛋白的量，1-6 号收集液分别为：1.0、5.2、3.99、1.2、0.6和0.1mg/ml，然后继续用该洗脱缓冲液洗脱10 min。

纯化后蛋白液用SDS-PAGE 检测，使用Bandscan 软件对SDS-PAGE 图片进行分析重

组VP2蛋白的纯度，为90%。

6.2 纯化的Sumo-VP2蛋白ULP酶切

将纯化后的可溶性Sumo-VP2蛋白用ULP酶切除SUMO标签，具体操作如下：

a.蛋白透析

取10 ml上述亲和层析纯化的Sumo-VP2蛋白置于50mM Tris-HCl（pH 8.0）中4℃透析过夜，使用BCA试剂盒检测透析后Sumo-VP2蛋白浓度为2 mg/ml；

b.蛋白酶切

将上述透析好的Sumo-VP2蛋白中加入ULP酶，使重组蛋白与ULP酶的质量比为200:1，30℃酶切2 h，酶切后4℃，12000 r/min 离心10 min，可见极少量沉淀，将上清样品放于4℃，待后续纯化。蛋白的酶切结果见图8；

c.蛋白过柱纯化

将ULP酶切后的蛋白溶液二次过层析柱，以去除Sumo标签，纯化具体操作同6.1步骤中蛋白亲和层析纯化操作。

7. 纯化的VP2蛋白的抗原性分析

用Western blot 对纯化的VP2蛋白的抗原性进行检测，具体步骤如下：

（1）将VP2蛋白的SDS-PAGE 置于转印平皿中，剪一张与SDS-PAGE 凝胶一样大小的

PVDF膜1 张，转膜前先用甲醇激活30 s，然后浸泡于转移缓冲液中大约15min 左右，以驱除留于滤膜上的气泡。PAGE 凝胶和转膜所用滤纸也均浸泡于转膜缓冲液中约15 min左右。

（2）阳极朝上，阴极在底部，按由下到上分别是滤纸、PVDF膜、PAGE 凝胶和滤纸的顺序平铺，每一层保证无气泡。

（3）安装电转移，按5.5 mA/cm²计算出所用的恒定电流，转移30min。

（4）加10ml 封闭液（含3% 脱脂奶粉的PBST），4℃封闭过夜。

（5）然后弃掉封闭液，不用洗涤，直接加入1 ：100稀释的抗小鹅瘟病毒的鸡血清（实验室制备）作为一抗，37℃作用1 h。

（6）弃反应液体，用PBST 洗涤5次，每次5min。

（7）最后再用酶标二抗HRP-兔抗鸡IgG（Solarbio公司）37℃条件下作用1h，同样洗5次，每次5min。

（8）用DAB显色5-10 min，最后拍照保存。Western-blot 检测结果（如图10）显示，纯化后的VP2蛋白（65 kDa）可被抗小鹅瘟病毒的鸡血清特异性识别，表明，该蛋白具有良好的反应原性。

首先，本发明对鹅细小病毒VP2基因进行密码子优化，采用原核表达系统实现了小鹅瘟VP2蛋白的可溶性表达；其次，针对表达的可溶性重组蛋白所带的大分子标签，本发明采用ULP酶酶切的方式将VP2蛋白与Sumo标签分开，再通过亲和层析纯化方法将Sumo标签去除，去掉大分子标签的VP2蛋白经电镜观察结果显示其更易形成接近于小鹅瘟病毒的自然结构形态，并且经Western Blot验证了去掉标签的VP2蛋白具有较好的免疫原性。本发明过程简单、易操作，更适用于小鹅瘟基因工程亚单位疫苗的商业化大批量生产。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院

<120> 一种利用大肠杆菌系统制备小鹅瘟病毒样颗粒的方法

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1767

<212> DNA

<213> goose parvovirus

<400> 1

acggcacccg tcaaaaaaaa tacagggaaa cttactgacc attacccggt agttaagaag 60

cctaaactta ccgaggaagt cagtgcggga ggtggtagta gtgccgtaca agacggtggt 120

gccaccgcgg agggcaccga acctgtggca gcatctgaaa tggcagaggg tggtggcgga 180

gctttgggcg acgcttcagg gggtgccgat ggagtgggta atgcctcggg aaattggcat 240

tgcgattccc aatggatggg aaacacagtc atcacaaaga ccaccagaac ctgggtcctg 300

cccagctaca acaaccacat ctacaaagcg attaccagtg gaacctctca agatgcaaat 360

gtccagtatg caggatacag taccccctgg gggtactttg atttcaaccg cttccactgc 420

cacttctccc ctagagactg gcagagactt atcaacaacc attggggaat ccgccccaag 480

tctcttaaat tcaagatctt caatgtccaa gtcaaagaag tcacaacgca ggatcagacg 540

aagaccattg caaacaatct cacgtcaaca attcaagtct ttacggatga cgagcatcaa 600

ctcccgtatg tcctgggctc ggctacggaa ggcaccatgc cgccgttccc gtcggatgtc 660

tatgccctgc cgcagtacgg gtattgcaca atgcacacca accggaacgg tgcacgattc 720

aatgaccgga gtgcattcta ctgcttagaa tacttcccca gtcagatgct acgcacaggc 780

aacaactttg agttcacgtt tgactttgaa gaagttcctt tccacagcat gttcgctcat 840

tcacaggact tagacaggct gattaacccc ttagtggatc aatacctctg gaatttcaat 900

gaggtagaca gcagcagaaa tgctcaattt aaaaaggctg tgaaaggcgc ttatggcacc 960

atgggccgca attggctgcc aggacctaaa ttcctggacc agagagttag ggcctatcca 1020

ggcggaacag ataattatgc aaactggaac atctggagta atggaaacaa ggttaatttg 1080

aaggacaggc agtacctcct gcaacccgga cctgtatcag ctactcacac agaagcagag 1140

gcttccagca tcccagccca aaatatttta ggtttagcta aagatccata cagatctggc 1200

agcgctacag caggtataag tgatattatg gtcacggacg agcaggaagt agcacctaca 1260

aacggcgtag ggtggaaacc atatggcaag actgtaacga atgaacaaaa cactactaca 1320

gctcctacaa gttcagatct ggatgttctt ggagctttac caggaatggt ttggcagaac 1380

agggatatat atctgcaggg acctatttgg gcaaaaatac cgaagactga tggtaaattc 1440

catccttctc cgaatctcgg tggttttggt ctgcacaatc caccgccgca ggtgttcatc 1500

aagaatacac cagtgcctgc agaccctcca gtagaatacg tgcaccagaa gtggaattcc 1560

tacataaccc agtactctac gggccagtgt acagtagaga tggtgtggga gctgagaaaa 1620

gaaaattcaa agaggtggaa cccagaaatc cagttcacca gtaatttcag tgacagaaca 1680

agcataatgt ttgcacctaa tgaaactggt ggatatgtag aagatagatt aattggaacc 1740

agatatctaa ctcaaaatct gtaatga 1767

<210> 2

<211> 587

<212> PRT

<213> goose parvovirus

<400> 2

Thr Ala Pro Val Lys Lys Asn Thr Gly Lys Leu Thr Asp His Tyr Pro

1 5 10 15

Val Val Lys Lys Pro Lys Leu Thr Glu Glu Val Ser Ala Gly Gly Gly

20 25 30

Ser Ser Ala Val Gln Asp Gly Gly Ala Thr Ala Glu Gly Thr Glu Pro

35 40 45

Val Ala Ala Ser Glu Met Ala Glu Gly Gly Gly Gly Ala Leu Gly Asp

50 55 60

Ala Ser Gly Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asn Trp His

65 70 75 80

Cys Asp Ser Gln Trp Met Gly Asn Thr Val Ile Thr Lys Thr Thr Arg

85 90 95

Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Ile Tyr Lys Ala Ile Thr

100 105 110

Ser Gly Thr Ser Gln Asp Ala Asn Val Gln Tyr Ala Gly Tyr Ser Thr

115 120 125

Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro

130 135 140

Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn His Trp Gly Ile Arg Pro Lys

145 150 155 160

Ser Leu Lys Phe Lys Ile Phe Asn Val Gln Val Lys Glu Val Thr Thr

165 170 175

Gln Asp Gln Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln

180 185 190

Val Phe Thr Asp Asp Glu His Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala

195 200 205

Thr Glu Gly Thr Met Pro Pro Phe Pro Ser Asp Val Tyr Ala Leu Pro

210 215 220

Gln Tyr Gly Tyr Cys Thr Met His Thr Asn Arg Asn Gly Ala Arg Phe

225 230 235 240

Asn Asp Arg Ser Ala Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met

245 250 255

Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Thr Phe Asp Phe Glu Glu Val

260 265 270

Pro Phe His Ser Met Phe Ala His Ser Gln Asp Leu Asp Arg Leu Ile

275 280 285

Asn Pro Leu Val Asp Gln Tyr Leu Trp Asn Phe Asn Glu Val Asp Ser

290 295 300

Ser Arg Asn Ala Gln Phe Lys Lys Ala Val Lys Gly Ala Tyr Gly Thr

305 310 315 320

Met Gly Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro Lys Phe Leu Asp Gln Arg Val

325 330 335

Arg Ala Tyr Pro Gly Gly Thr Asp Asn Tyr Ala Asn Trp Asn Ile Trp

340 345 350

Ser Asn Gly Asn Lys Val Asn Leu Lys Asp Arg Gln Tyr Leu Leu Gln

355 360 365

Pro Gly Pro Val Ser Ala Thr His Thr Glu Ala Glu Ala Ser Ser Ile

370 375 380

Pro Ala Gln Asn Ile Leu Gly Leu Ala Lys Asp Pro Tyr Arg Ser Gly

385 390 395 400

Ser Ala Thr Ala Gly Ile Ser Asp Ile Met Val Thr Asp Glu Gln Glu

405 410 415

Val Ala Pro Thr Asn Gly Val Gly Trp Lys Pro Tyr Gly Lys Thr Val

420 425 430

Thr Asn Glu Gln Asn Thr Thr Thr Ala Pro Thr Ser Ser Asp Leu Asp

435 440 445

Val Leu Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Ile Tyr

450 455 460

Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Lys Thr Asp Gly Lys Phe

465 470 475 480

His Pro Ser Pro Asn Leu Gly Gly Phe Gly Leu His Asn Pro Pro Pro

485 490 495

Gln Val Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Val Glu

500 505 510

Tyr Val His Gln Lys Trp Asn Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly

515 520 525

Gln Cys Thr Val Glu Met Val Trp Glu Leu Arg Lys Glu Asn Ser Lys

530 535 540

Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr Ser Asn Phe Ser Asp Arg Thr

545 550 555 560

Ser Ile Met Phe Ala Pro Asn Glu Thr Gly Gly Tyr Val Glu Asp Arg

565 570 575

Leu Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Gln Asn Leu

580 585

Claims

1.一种可溶性表达小鹅瘟病毒VP2蛋白的方法，其特征在于，对鹅细小病毒VP2基因进行密码子优化得到优化后的VP2基因序列，扩增所述的优化后的VP2基因序列，并克隆到pET-Sumo载体上，构建表达载体pET-Sumo-VP2，将pET-Sumo-VP2转化至原核表达菌，通过IPTG在37℃下诱导获得可溶性重组VP2蛋白，将重组VP2蛋白用ULP酶进行30℃酶切2 h,使VP2蛋白与Sumo标签分开，酶切后的蛋白用Ni柱纯化，可得到纯化的VP2蛋白，将纯化好的VP2蛋白透析到PBS中，通过电镜观察，该重组蛋白VP2可形成病毒样颗粒。

2.根据权利要求1所述的可溶性表达小鹅瘟病毒VP2蛋白的方法，其特征在于，所述密码子优化采用定点突变的手段，定点突变包括将密码子AGA突变为CGC和GGA突变为GGT，定点突变的部位包括位于鹅细小病毒VP2如下氨基酸残基位点:第39位、第40位、第57位、第58位、第157位、第257位、第403位、第483位和第487位，优化后的VP2基因为SEQ ID No：1。

3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，将原核表达菌在培养至OD₆₀₀值为0.5 ～0.7后，加入 IPTG 进行诱导。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，IPTG诱导的浓度为0.25mM，诱导时间为6 h。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.重组质粒pET-Sumo-VP2的构建：设计引物，扩增核苷酸序列为SEQ ID NO：1的VP2基因，将VP2基因与pMD18-T相连构建质粒pMD18-T-VP2；最后将pET-Sumo载体和测序正确的pMD18-T-VP2进行双酶切后构建表达载体pET-Sumo-VP2；

S2. 将pET-Sumo-VP2转化入BL21（DE3）plyss菌中，测序鉴定为阳性之后，将菌液接种于培养基中，培养至 OD₆₀₀值为 0.5 ～ 0.7 后，加入 IPTG 诱导后，离心重悬菌体，超声破碎菌体，收集上清，获得可溶性重组VP2蛋白。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，将重组VP2蛋白用ULP酶进行30℃酶切2 h，使VP2蛋白与Sumo标签分开，酶切后的蛋白用Ni柱纯化。

7.权利要求1至6任一项所述的方法制备得到的可溶性重组VP2蛋白，其特征在于，将纯化好的VP2蛋白透析到PBS中，通过电镜观察，该重组蛋白VP2可形成病毒样颗粒。

8.权利要求1至6任一项所述的方法制备得到的可溶性重组VP2蛋白在制备用于预防和治疗鹅细小病毒感染的药物中的应用。

9.一种免疫制剂，其特征在于，包含权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的可溶性重组VP2蛋白。

10.一种高免血清或卵黄抗体，其特征在于，其是以权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的可溶性重组VP2蛋白作为抗原制备而成。