CN102776216B

CN102776216B - 一种纤维素酶在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白的应用

Info

Publication number: CN102776216B
Application number: CN 201210264387
Authority: CN
Inventors: 祁庆生; 王圣钧; 高冬芳
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2032-07-27
Also published as: CN102776216A

Abstract

本发明公开了一种纤维素酶蛋白在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白的应用，其中所述蛋白序列是SEQ ID NO：1～7所示的氨基酸序列，或是与SEQ ID NO：1～7所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列，所述重组蛋白是抗菌肽或酶类。本发明为利用大肠杆菌制备蛋白质/多肽类药物、各种酶类、诊断抗原、抗体以及疫苗等提供了基础。在蛋白表达研究、酶制剂和蛋白药物生产等方面具有重要的理论意义和应用价值。

Description

一种纤维素酶在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白的应用

技术领域

本发明涉及一种纤维素酶蛋白的应用，尤其涉及一种纤维素酶蛋白在大肠杆菌中可溶性表达并分泌表达重组蛋白的应用。

背景技术

机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。因此，蛋白类分子是现代生物技术和生物制药产业发展的基石。蛋白质一直是生物研究的一个重要方面，获得大量纯化的蛋白质样品是蛋白质理化性质与功能研究、生物制药和酶制剂产业发展的基础。

为了获得大量的重组蛋白，人们发展了多种的蛋白表达系统，而其中大肠杆菌表达系统因其操作简单、遗传背景清楚、技术成熟、能够高效的表达各种异源蛋白等特点被广泛应用于研究和生产当中。但是，首先大肠杆菌表达的蛋白大都存在于细胞内，蛋白纯化困难；同时，大肠杆菌缺少蛋白的翻译后修饰系统，常常不能将翻译出的多肽链正确折叠修饰形成天然构象的蛋白质，而是形成不可溶的无功能的包涵体。包涵体中的多肽链折叠错误，必须通过复杂的变性复性过程才能获得有功能的蛋白，而复杂蛋白的复性过程的成功率非常低，导致蛋白的回收率非常低。以上这些方面都严重影响了大肠杆菌在重组蛋白生产方面的应用。

为了克服大肠杆菌在蛋白表达方面的瓶颈，人们开发了多种促使外源蛋白在大肠杆菌中高效、可溶性及分泌表达的方法。其中，形成融合蛋白的方法在可溶性表达和分泌表达方面被广泛的利用，并具有良好的效果。现在普遍使用的融合伴侣蛋白如葡萄球菌A蛋白（SPA）、硫氧还原蛋白、谷胱甘肽转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）或是周质蛋白TloAIII等在融合后可提高蛋白的溶解性；OmpA、OmpF、OsmY或是YebF等蛋白融合后促进蛋白的分泌。但是这些融合伴侣蛋白的使用不具有普遍性、同时受到稳定性较差和效率不能达到生产的要求等因素的困扰。实验证实，选择一种合适的融合蛋白对于提高蛋白的溶解性和分泌性是至关重要，且融合伴侣蛋白在蛋白表达研究、酶制剂和蛋白药物生产等方面具有重要的理论意义和应用价值，因此寻找更为高效的、具有广泛适用性的融合伴侣蛋白成为目前研究的热点。

本发明所述的纤维素酶蛋白为一种芽孢杆菌（Bacillus sp.Z-16）来源的纤维素酶（Cellulase），其具有较高的水解纤维素的活性，目前主要应用于洗涤、纺织、造纸和环保等方面。我们发现这种蛋白可以在大肠杆菌中高效可溶、分泌表达。检索表明：其在大肠杆菌中可溶及分泌表达的性质，以及其作为融和蛋白在大肠杆菌中进行重组蛋白的可溶及分泌表达的应用在国内外还未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纤维素酶的蛋白序列，利用此蛋白序列作为融合蛋白，在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白过程中的应用。其中所述纤维素酶蛋白在大肠杆菌中能高效表达重组纤维素酶蛋白，并能以融合蛋白形式促进其它蛋白的分泌。

本发明所述纤维素酶的蛋白序列在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白过程中的应用，其中：所述蛋白序列是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或是与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。

进一步的，上述蛋白序列是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或是与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。

优选的，上述蛋白序列是SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，或是与SEQ ID NO：3所示氨基酸序列具有70%及以上同源性的多肽序列。

最优选的，上述蛋白序列是SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，或是与所述氨基酸序列之一所示的氨基酸序列具有至少70%同源性的多肽序列。

本发明所述纤维素酶的蛋白序列在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白的方法为：将编码所述纤维素酶蛋白的核苷酸序列与编码所需表达蛋白的核苷酸序列连接组成融和基因后克隆入大肠杆菌表达载体，而后将该载体转化到大肠杆菌表达宿主菌中进行表达。

上述方法中，可以在本发明所述伴侣蛋白的末端添加纯化标签，以方便可溶性表达的融合蛋白的纯化。

上述方法中，可以在本发明所述伴侣蛋白与所需表达蛋白之间添加水解酶位点。水解酶优选肠激酶、内含肽、凝血酶、各种蛋白酶等，以方便表达蛋白的纯化。

上述方法中，融合蛋白可以使用层析柱进行分离纯化，在洗脱前使用相应的水解酶进行处理，以分离纯化目的蛋白。

上述方法中，所述重组蛋白主要是蛋白酶类，特别是麦芽糖结合蛋白（MBP）、胰高血糖素样肽（GLP-1）或酵母糖酰胺酶（Png1p）。

本发明提供的纤维素酶蛋白或多肽序列可以在大肠杆菌中进行可溶性及分泌表达融合蛋白，同时本发明还提供了优选的蛋白分离纯化方法，为利用大肠杆菌制备蛋白质/多肽类药物、各种酶类、诊断抗原、抗体以及疫苗等提供了基础。在蛋白表达研究、酶制剂和蛋白药物生产等方面具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1.纤维素酶（Cel）大肠杆菌高效表达载体的构建图。

图2.为Cel在大肠杆菌中高效表达的SDS-PAGE检测结果。

图中：M：低分子量蛋白标准

0：携带空质粒载体的对照菌体

其他条带为不同诱导时间的工程菌菌体。

图3.为Cel在大肠杆菌中分泌表达的SDS-PAGE检测结果。

图中：M：低分子量蛋白标准

0：携带空质粒载体菌株发酵上清液

其他条带为不同诱导时间的工程菌发酵液。

图4.Cel-CD与Png1p融和蛋白在大肠杆菌中高效可溶表达的SDS-PAGE检测结果。

图中：M：低分子量蛋白标准

1和2：均为菌体破碎液中的可溶性Cel-CD-Png1p样品。

图5.融和蛋白中纯化的Png1p的脱糖基化性质测定。

图中：底物为变性的RNase B

1：对照

2：Cel-CD-Png1p融和蛋白

3：纯化自融和蛋白的Png1p蛋白

4：纯化包涵体的的Png1p融合蛋白。

图6.Cel-CD与MBP融和蛋白在大肠杆菌中分泌表达的SDS-PAGE检测结果。

图中：M：低分子量蛋白标准

1：携带空质粒载体的对照菌体

2，3：均为Cel-CD-MBP融和蛋白诱导表达的菌体

4：携带空质粒载体的对照菌体发酵液

5，6：均为Cel-CD-MBP融和蛋白诱导表达的发酵液上清。

图7.Cel-CD与GLP-1融和蛋白在大肠杆菌中分泌表达的SDS-PAGE检测结果。

图中：M：低分子量蛋白标准

1：携带空质粒载体的对照菌体发酵液

2：均为Cel-CD-GLP-1融和蛋白诱导表达的发酵液上清。

图8.含有所述引导肽序列的表达载体的构建图。

图9.CBD在大肠杆菌中分泌表达的SDS-PAGE检测结果。

图中：M：核酸分子标准

1：引导肽1与CBD融合蛋白发酵结果

2：引导肽2与CBD融合蛋白发酵结果

3：引导肽3与CBD融合蛋白发酵结果

4：引导肽4与CBD融合蛋白发酵结果。

图10.PhoA在大肠杆菌中分泌表达的SDS-PAGE检测结果。

图中：M：核酸分子标准

1：引导肽1与PhoA融合蛋白发酵结果

2：引导肽2与PhoA融合蛋白发酵结果

3：引导肽3与PhoA融合蛋白发酵结果

4：引导肽4与PhoA融合蛋白发酵结果。

具体实施方式

下面结合附图，以较佳实施方式对本发明详细描述，但本所述内容不限制本发明。下列实施例中未标明具体条件的试验方法，基本上都按照分子克隆：实验室手册（New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press）中所述的条件，或是按照相关试剂或是试剂盒制造商所建议的条件。

实施例1：纤维素酶在大肠杆菌中高效表达载体的构建

1．菌株和质粒

大肠杆菌DH5α（E.coli DH5αLacZΔM15 hsdR recA）

大肠杆菌BL21（DE3）（E.coli BL21（DE3））

大肠杆菌BL21（DE3）/pLysS（E.coli BL21（DE3）/pLys）

质粒pET28a

以上菌株和质粒均购自Novagen公司。

2．分子克隆用酶和试剂

限制性内切酶NcoI、BamHI；Pfu DNA聚合酶；T4连接酶；蛋白分子量标准均购自MBI-Fermentas。

Agarose Gel DNA Purification Kit，DNA Fragment Purification Kit购自OMEGA Ltd.。

TIANprep Mini Plasmid Kit购自TIANGEN。

核酸分子量标准1Kb Marker购自BioLab。

3.方法

以Bacillus sp.Z-16基因组DNA为模板，利用引物Cel-F/Cel-R扩增编码Cellulase（缩写为Cel）的基因序列，Cel基因的理论长度为2475bp。在Cel-F1/Cel-R1的两端分别带有NcoI/XhoI酶切位点，引物由北京华大基因公司合成：

Cel-F1：5’-TTTTCCATGGAAGGAAACACTCGTGAAGAC-3’（酶切位点NcoI）

Cel-R1：5’-TTTTCTCGAGTTTTTTCTTAGCCTCATTTTTG-3’（酶切位点XhoI）

以Cel-F1和Cel-R1为引物，利用PCR(聚合酶链式反应)体外扩增Cel核苷酸序列。DNA聚合酶为TransEco FastPfu DNA Polymerase。Bacillus sp.Z-16纤维素酶Cel基因的PCR扩增体系及条件见表1.1

表1.1纤维素酶基因的PCR扩增体系及条件

琼脂糖凝胶（0.8%）电泳检测片段的大小，并利用Agarose Gel DNA Purification Kit回收目的条带，纯化回收并溶于ddH₂O中，用于酶切反应。

pET28a质粒热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有25-50μg/mL卡那霉素（Kan）的LB琼脂平板上挑取含有质粒的单菌落，接种于5mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡过夜。收集菌体利用TIANprep Mini Plasmid Kit提取扩增后质粒并溶于ddH₂O中，用于酶切反应。

其中所述的大肠杆菌DH5α感受态细胞通过以下方式制备获得：从新活化的无抗性LB固体培养基平板上挑取DH5α单菌落接种于50mL LB液体培养基中，37℃、250rmp振荡培养至OD600=0.4，将菌体转移至预冷且无菌的100mL离心管中，冰上放置冷却30min，4000rpm4℃离心10min。小心倒去上清，加入预冷的0.1mol/L CaCl₂（含20%甘油）溶液悬浮菌体；冰浴15min，4000rpm4℃离心10min。重复上述操作两次后，加入1mL CaCl₂重悬菌体。100μL/Ep管分装后直接用于转化或-70℃保存。

所述的热激转化法是：取大肠杆菌DH5α感受态细胞置于冰上融化，加入待转入质粒，混匀后冰浴30min；42℃热激90sec；热激后迅速置于冰上冷却2min；加入1mL无抗性LB液体培养基，37℃恢复培养1h；4000rpm3min离心获取菌体，100μL LB液体培养基重悬后涂布在50μg/mL卡那霉素抗性固体培养基上，37℃培养过夜。

将PCR回收片断及提取的pET28a质粒利用NcoI、XhoI核酸内切酶进行双酶切，酶切体系及反应条件见表1.2。

表1.2双酶切反应体系及条件

酶切后片段利用琼脂糖凝胶（0.8%）电泳回收并溶于ddH₂O中，用于连接反应。连接体系及反应条件见表1.3。

表1.3连接反应体系及条件

构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素抗性的LB琼脂平板上挑取含有质粒的单菌落，接种于5mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡过夜，收集菌体，TIANprep Mini Plasmid Kit提取重组质粒并溶于ddH₂O。利用NcoI/XhoI核酸内切酶双酶切分析，筛选阳性转化子。阳性转化子通过序列测定来进行验证，测序由北京华大基因公司完成。

重组质粒构建见图1。

实施例2：纤维素酶Cel在大肠杆菌中高效表达与分泌

1、SDS-PAGE试剂

聚丙烯酰胺凝胶的配制：

A液：丙烯酰胺储存液（30%w/v丙烯酰胺，0.8%w/v双丙烯酰胺），取29.2g丙烯酰胺，0.8g

双丙烯酰胺，ddH₂O至100mL，4℃保存。

B液：分离胶缓冲液，1.5MTris-HCl（PH8.8）0.4%SDS。4℃保存。

C液：浓缩胶缓冲液，1MTris-HCl（PH6.8）0.4%SDS。4℃保存。

10%过硫酸铵：取0.1g过硫酸铵加1mL ddH₂O，4℃。

TEMED:购自Sigma，T8133

将上述各溶液按表2.1混合，配制12%的分离胶及5%的浓缩胶，灌注制胶板，聚合后可用于电泳。

表2.1聚丙烯酰胺凝胶配方

电泳缓冲液：

10×Tris-甘氨酸缓冲液：144g甘氨酸，30gTris，10%SDS。使用时用ddH₂O稀.释至1×。

染色液：

考马斯亮蓝G-250染色液：100mg考马斯亮蓝G-250，溶于100mL无水乙醇，加50mL70%磷酸，ddH₂O稀释至1L，充分搅拌混匀，过滤。

脱色液：

100mL乙酸，100mL无水乙醇，ddH₂O稀释至1L。

2、缓冲液：

PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：0.27g磷酸二氢钾，1.42g磷酸氢二钠，8g氯化钠，0.2g氯化钾，ddH₂O定容至1L，浓盐酸调pH至7.4。

3、方法

将实施例1中所述重组质粒热激法转化入E.coli BL21(DE3)表达菌株中。挑取在含有25-50μg/mL卡那霉素的LB平板中筛选的阳性克隆,在无菌条件下用接种环接1～2环于5mL并加有终浓度为25-50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃条件下，250rpm摇床振荡培养8h，制得种子液；以1%～5%的接种量转接入装有50mL培养基的三角瓶中。37℃剧烈振荡培养3h，使细菌处于对数生长中期，OD₆₀₀值约为0.8。从50mL对数生长期菌液中取1mL做对照，向其余菌液中加入0.5mol/L IPTG溶液，使其最终浓度为0.8mmol/L。加入IPTG后菌液继续培养6-18h后，12000rpm离心10min，取上清与沉淀分别保存待用，检测目的蛋白的表达及分泌情况。

目的蛋白检测：

上清中加50μL2×SDS上样缓冲液，煮沸5-10min备用；沉淀用PBS缓冲液清洗一次，加50μL ddH₂O和50μL2×SDS上样缓冲液，重悬沉淀，煮沸5-10min破碎细胞，10000rpm离心10min，取上清备用。

在浓缩胶进行8V/cm稳压电泳，当溴酚兰指示剂进入分离胶后改为15V/cm稳压电泳至溴酚兰带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶使用考马斯亮兰染色液染色1h以上，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。

SDS-PAGE结果见图2和图3，Cel的表达量占菌体总蛋白的25%以上，在发酵12小时，有大量的Cel蛋白分泌到细胞外的发酵液中，分泌量可以达到800mg/L。

实施例3：利用本发明所述蛋白使酵母糖酰胺酶（Png1p）在大肠杆菌中高效可溶表达

优选纤维素酶的催化结构域部分氨基酸序列为融和蛋白，以酵母糖酰胺酶（Png1p）蛋白为例来验证本发明所述系统的可行性。

Cellulase的N-端催化结构域部分（缩写为Cel-CD），为Cellulase N-端序列，如SEQ IDNO：2所示，由374个氨基酸组成，基因的理论长度为1125bp。酵母糖酰胺酶（Png1p）是一个有363个氨基酸，没有信号肽，分子量为42.5kDa的蛋白，编码Png1p的基因在酵母XVI染色体的左臂上，由1092个核苷酸序列组成。Png1p可以在大肠杆菌中高效表达，但是都是以包涵体的形式存在。

1、试剂：

缓冲液A：50mmol/L磷酸钠，pH8.0；0.3mol/L氯化钠；10mmol/L咪唑。

缓冲液B：50mmol/L磷酸钠，pH8.0；20mmol/L咪唑；0.5mol/L氯化钠。

缓冲液C：50mmol/L磷酸钠，pH8.0；0.3mol/L氯化钠。

缓冲液D：50mmol/L磷酸钠，pH8.0；250mmol/L咪唑；0.3mol/L氯化钠。

2、方法：

2.1表达载体的构建

首先构建Cel-CD-Png1p的融合基因。

根据已知的酿酒酵母糖酰胺酶的基因序列（Genebank[gi:50593503]）和Cel-CD的基因序列，设计引物Cel-CD-F2/Cel-CD-R2和Cel-CD-Png1-F/Cel-CD-Png1-R：

Cel-CD-F2：5-TTTTCATATGGAAGGAAACACTCGTGAAGAC-3（酶切位点NdeI）

Cel-CD-R2：5-TTTTGGATCC AAGTACTTTCGTGTATTTTGTA-3（酶切位点BamHI，柔性肽序列）

Cel-CD-Png1F：5-TTTTGGATCC

AAAATGGGAGAGGTATACGAAA

A-3（酶切位点BamHI，肠激酶识别位点编码序列）

Cel-CD-Png1R：5-TTTTCTCGAGCTATTTACCATCCTCCCCAC-3（酶切位点XhoI）

PCR获得Cel-CD和Png1p的核苷酸序列并利用基因重组的方式构建Cel-CD-Png1p的融合基因，在融合基因的两端分别添有NdeI/XhoI的酶切位点，在两个蛋白之间添有肠激酶的水解识别位点和序列为GGGGSGGGGS的柔性肽序列。

将融合基因序列利用NdeI和XhoI核酸内切酶进行双酶切消化后，克隆到pET28a质粒的相应酶切位点之间。构建的重组质粒分别进行PCR验证、NdeI和XhoI核酸内切酶双酶切分析，筛选阳性转化子。阳性转化子通过序列测定来进行验证。具体步骤参见实施例1。

构建的转化子命名为pET28a/Cel-CD-Png1。

2.2Png1p的诱导表达、纯化与性质鉴定

1）.Png1p融合蛋白的表达

将重组质粒pET28a/Cel-CD-Png1转化入大肠杆菌BL21(DE3)。挑取LB固体培养基平板筛选后的阳性克隆,在无菌条件下用接种环接1～2环于5mL并加有终浓度为25-50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃条件下，150～300rpm摇床振荡培养8～16h，制得种子液；以1%～5%的接种量转接入装有50mL培养基的300mL三角瓶中。37℃剧烈振荡培养3h，使细菌处于对数生长中期，OD₆₀₀值约为0.8。从50mL对数生长期菌液中取1mL做对照，向其余菌液中加入0.5mol/L IPTG溶液，使其最终浓度为0.8mmol/L。加入IPTG后菌液继续培养6h，12000rpm离心10min，弃上清收集菌体。

目的蛋白检测：

将沉淀用PBS洗一次，加20mL PBS重悬菌体，超声（200W）破碎菌体，后12000rpm离心10min，上清及沉淀分别进行检测。上清中加50μL2×SDS加样缓冲液，煮沸5-10min备用；沉淀用PBS缓冲液洗一次，加50μL灭菌双蒸水和50μL2×SDS加样缓冲液，重悬沉淀，煮沸5-10min，12000rpm离心10min，取上清备用。

在浓缩胶进行8V/cm稳压电泳，当溴酚兰指示剂进入分离胶后改为15V/cm稳压电泳至溴酚兰带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色1h以上，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。具体步骤参见实施例2。

SDS-PAGE结果见图4，重组融合蛋白可以在大肠杆菌中高效表达，且破碎后的菌体上清中有大量的可溶性蛋白，经检测，可溶性蛋白表达量，Cel-Png1p达到510mg/L。

2）重组蛋白的纯化与活性测定。

（1）扩大培养及菌体收集

将含有重组表达质粒的大肠杆菌单菌落接种到50mL含相应卡那霉素抗生素的LB液体培养基中,37℃培养过夜。取2.5mL菌液接入250mL含有相应抗生素的LB液体培养基中,37℃培养过夜。待OD₆₀₀值达0.8时，加入IPTG（终浓度为0.8mmol/L），诱导培养6h后，12000rpm10min离心收集菌体。

（2）菌体超声破碎

收集菌体后，用缓冲液A溶解。冰浴、超声(200W)破碎细胞，每破碎10s，间隔10s，反复破碎6次后结束，在显微镜下观察破碎结果，之后12000rpm离心20min分离上清液和沉淀。

（3）亲和层析纯化Png1p蛋白

a）装柱：将10mLNi-NTA倒入2.5×10cm柱中，用3个柱床体积的缓冲液A在4℃进行柱平衡。

b）上样：将工程菌菌体破碎后分离得到的上清上样，用6个柱床体积的缓冲液B清洗。

c）酶切：用含有肠激酶的6个柱床体积的缓冲液C（50mmol/L磷酸钠，pH8.0；0.3mol/L氯化钠）对柱子进行清洗，收集清洗液。收集液进行SDS-PAGE分析。

d）洗脱：用6个柱床体积的缓冲液D（50mmol/L磷酸钠，pH8.0；250mmol/L咪唑；0.3mol/L氯化钠）洗脱目的蛋白，再生层析柱。

（4）活性的测定。

以核糖核酸酶B（RNase B）作为模式底物。反应体系及条件如表3.1所示：

表3.1核糖核酸酶B（RNase B）作为模式底物的反应体系及条件

其中RNase B可为天然的或是经过热变性的。热变性条件为RNase B在100°C水浴处理10min，然后迅速冷却。

反应完成后，样品使用15%的SDS-PAGE进行电泳分析，考马斯亮蓝染色后使用ImageJ program软件进行初步定量分析。

将等量Cel-Png1p，酶切纯化后的Png1p与其野生型酶Png1p在相同的条件下进行活性比较。反应1h后，三者的脱糖基化效率基本相同。可见，融合表达和经过酶切纯化的Png1p并不影响其活性。

分析结果见图5。

实施例4：利用本发明所述蛋白序列使麦芽糖结合蛋白（MBP）和胰高血糖素样肽（GLP-1）在大肠杆菌中分泌表达

优选纤维素酶的催化结构域部分氨基酸序列为融和蛋白，以麦芽糖结合蛋白（MBP）和胰高血糖素样肽（GLP-1）为例来验证本发明所述系统的可行性，但本所述内容不限制本发明。

Cellulase的N-端催化结构域部分（缩写为Cel-CD），为Cellulase N-端序列，如SEQ IDNO：2所示，由374个氨基酸组成，基因的理论长度为1125bp。MBP是一种定位于周质空间，由396个氨基酸组成的蛋白质分子，其N-末端的27个氨基酸为穿过内膜的信号肽序列，由MalE基因编码。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)，是由31个氨基酸组成的多肽类药物。

1）融合表达载体的构建

首先构建Cel-CD-MBP及Cel-CD-GLP-1的融合基因。

根据已知的麦芽糖结合蛋白的基因序列MalE（Genebank[gi:12934071]）及GLP-1的基因序列，设计引物Cel-CD-MBP-F/Cel-CD-MBP-R，Cel-CD-GLP-1-F/Cel-CD-GLP-1-R：

CEL-CD-MBP-F:5-TTTTGGATCCATCGAAGAAGGTAAACTGGT-3（酶切位点BamHI）

CEL-CD-MBP-R:5-TTTTCTCGAGTTACTTGGTGATACGAGTCT（酶切位点XhoI）

CEL-CD-GLP-1-F：5-TTTTGGATCCGATGACGATGACAAACATGC-3（酶切位点BamHI）

CEL-CD-GLP-1-R：5-TTTTCTCGAGTTAACCACGGCCCTTAACCAGCC-3（酶切位点XhoI）

使用引物Cel-CD-MBP-F/Cel-CD-MBP-R，Cel-CD-GLP-1-F/Cel-CD-GLP-1-R及Cel-CD引物Cel-F/Cel-CD-R2,PCR获得Cel-CD，MBP和GLP-1的核苷酸序列并利用基因重组的方式构建Cel-CD-MBP和Cel-CD-GLP-1融合基因，在融合基因的两端分别添加NcoI/XhoI的酶切位点，在两个蛋白之间添加肠激酶的水解识别位点和序列为GGGGSGGGGS的柔性肽序列。

将融合基因序列利用NcoI和XhoI核酸内切酶进行双酶切消化后，克隆到pET28a质粒的相应酶切位点之间。构建的重组质粒分别进行PCR验证、NcoI和XhoI核酸内切酶双酶切分析，筛选阳性转化子。阳性转化子通过序列测定来进行验证。具体步骤参见实施例1。

构建的转化子命名为pET28a/Cel-CD-MalE和pET28a/Cel-CD-GLP-1。

2）Cel-CD-MBP融合蛋白的细胞外分泌表达

将重组表达质粒pET28a/Cel-CD-MalE及pET28a/Cel-CD-GLP-1转化入大肠杆菌BL21(DE3)。挑取LB平板中筛选后的阳性克隆,在无菌条件下用接种环接1～2环于5mL并加有终浓度为25～50μg/mL的卡那霉素的发酵培养基中，37℃条件下，150～300rpm摇床振荡培养8～16h，制得种子液；以1%～5%的接种量转接入装有50mL培养基的300mL三角瓶中。37℃剧烈振荡培养3h，使细菌处于对数生长中期，OD₆₀₀值约为0.8。从50mL对数生长期菌液中取1mL做对照，向其余菌液中加入0.5mol/L IPTG溶液，使其最终浓度为0.8mmol/L。加入IPTG后菌液继续培养6-18h，12000rpm离心10min，取上清与沉淀分别保存待用，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达及分泌情况。具体步骤参见实施例2。目的蛋白检测：

取1.5mL诱导的培养物，12000rpm离心30s，分离上清沉淀；上清中加50μL2×SDS加样缓冲液，煮沸5-10min备用；沉淀用PBS缓冲液洗一次，加50μL灭菌双蒸水和50μL2×SDS加样缓冲液，重悬沉淀，煮沸5-10min，10000rpm离心10min，取上清备用。

SDS-PAGE结果见图6和图7，工程菌株发酵12h以后，有大量的Cel-MBP和Cel-GLP-1融合蛋白分泌到细胞外的发酵液中。

实施例5：优选Cellulase的N-末端序列作为引导肽在大肠杆菌中分泌表达重组蛋白。

优选纤维素酶的N-末端序列作为引导肽，以环糊精糖基转移酶淀粉结合区（CBD）和大肠杆菌碱性磷酸酶（PhoA）为例来验证本发明所述系统的可行性。环糊精糖基转移酶淀粉结合区（CBD）由103个氨基酸组成的蛋白序列，大肠杆菌碱性磷酸酶（PhoA）成熟蛋白是449个氨基酸组成的蛋白序列。

1）引导肽的合成。

此引导肽来源为芽孢杆菌的纤维素酶Cellulase的N-末端序列，如SEQ ID NO：4-7所示，分别由20-40个氨基酸序列组成。因为引导肽较短，可以使用PCR或是全基因化学合成的方法。

使用PCR的方法合成引导肽，根据已知的引导肽氨基酸序列及编码核苷酸序列设计引物，在5’端添加NcoI酶切位点，在3’端添加BamHI酶切位点。

引导肽F：5-TTTTCCATGGAAGGAAACACTCGTGAAGAC-3（酶切位点NcoI）

引导肽-1R：5-TTTTGGATCCATCTACTAATGTCATTTGTC-3（酶切位点BamHI）

引导肽-2R：5-TTTTGGATCCTTGTAATTGTAATGCGCCAG-3（酶切位点BamHI）

引导肽-3R：5-TTTTGGATCCGCCAGCCTCAGAAGGGCGTT-3（酶切位点BamHI）

引导肽-4R：5-TTTTGGATCCGCGTTTAACATTGTCATTAC-3（酶切位点BamHI）

以引导肽-F为前引物，分别以引导肽-1R，引导肽-2R，引导肽-3R，引导肽-4R为后引物，以芽孢杆菌的纤维素酶Cel为模板，利用PCR体外扩增编码引导肽信号肽的核苷酸序列。电泳检测片段的大小，试剂盒回收目的片段。具体步骤参见实施例1。

2）构建大肠杆菌分泌表达载体系统。

将得到的编码信号肽的核苷酸片断和pET28a质粒利用NcoI、BamHI核酸内切酶进行双酶切消化。然后试剂盒回收纯化酶切的片段。

将回收的质粒和基因片段利用T4连接酶连接，得到的重组分泌表达质粒分别命名为pEL1，pEL2，pEL3和pEL4。

将含有重组质粒的连接液转化DH5α感受态细胞，并将转化液涂布于终浓度为25～50μg/mL的卡那霉素的固体LB培养基平板上，37℃条件下，静置培养16h，挑取单菌落筛选转化子。

将单菌落挑取转入含有25～50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，225rpm下培养过夜。试剂盒提取重组质粒，验证质粒的大小。并用NcoI、BamHI核酸内切酶双酶切分析，筛选含有编码信号肽的核苷酸序列的重组质粒转化子。阳性转化子进行测序鉴定。以上具体步骤参见实施例1。

重组质粒构建见图8。

3）环糊精糖基转移酶淀粉结合区（CBD）和大肠杆菌碱性磷酸酶（PhoA）的融合表达载体的构建。

使用环糊精糖基转移酶淀粉结合区（CBD）（GenBank:X78145.1）及碱性磷酸酶（PhoA）（NC000913.2）为模式蛋白对构建的重组分泌表达质粒进行验证。

将环糊精糖基转移酶淀粉结合区（CBD）及碱性磷酸酶（PhoA）克隆到以上步骤2所构建的重组质粒中构建重组表达载体，步骤如下：

首先根据已知的环糊精糖基转移酶淀粉结合区（CBD）及碱性磷酸酶（PhoA）的核苷酸序列设计引物，并在基因片段5’端添加BamHI酶切位点，在3’端添加XhoI酶切位点。

CBD-F：5-TTTTGGATCCGACCAGGTCAGCGTCCGCTT-3（酶切位点BamHI）

CBD-R：5-TTTTCTCGAGTTATGGCTGCCAATTCACGT-3（酶切位点XhoI）

PhoA-F：5-TTTTGGATCCACACCAGAAATGCCTGTTCT-3（酶切位点BamHI）

PhoA-R：5-TTTTCTCGAGTTATTTCAGCCCCAGAGCGGCTT-3（酶切位点XhoI）

PCR获得CBD及PhoA的基因片段后，分别BamHI/XhoI进行双酶切消化后克隆到BamHI/XhoI双酶切消化后的重组载体中。所得到的重组表达载体分别命名为pEL1-CBD，pEL2-CBD，pEL3-CBD和pEL4-CBD及pEL1-PhoA，pEL2-PhoA，pEL3-PhoA和pEL4-PhoA。利用质粒试剂盒提取重组表达质粒，验证质粒的大小。使用PCR和酶切的方法验证重组质粒，并将阳性转化子进行测序鉴定。具体步骤参见实施例1。

4）CBD融合蛋白及PhoA融合蛋白的细胞外分泌表达。

将构建并验证的重组分泌表达质粒pEL1-CBD，pEL2-CBD，pEL3-CBD和pEL4-CBD及pEL1-PhoA，pEL2-PhoA，pEL3-PhoA和pEL4-PhoA转化入E.coli BL21(DE3)。挑取LB平板中筛选后的阳性克隆,在无菌条件下用接种环接1～2环于5mL并加有终浓度为25～50μg/mL的卡那霉素的发酵培养基中，30～40℃条件下，150～300rpm摇床振荡培养8～16h，制得种子液；以1%～5%的接种量转接入装有50mL培养基的300mL三角瓶中。37℃剧烈振荡培养3h，使细菌处于对数生长中期，OD₆₀₀值约为0.8。从50mL对数生长期菌液中取1mL做对照，向其余菌液中加入1mol/L IPTG溶液，使其最终浓度为0.8mmol/L。加入IPTG后菌液继续培养6-18h，12000rpm离心10min，取上清与沉淀分别保存待用，最后离心收获细菌，检测目的蛋白的表达及分泌情况。

目的蛋白检测：

取1.5mL诱导的培养物，12000rpm离心30sec，分离上清沉淀；上清中加50μL2×SDS加样缓冲液，煮沸5-10min备用；沉淀用PBS洗一次，加50μL灭菌双蒸水和50μL2×SDS加样缓冲液，重悬沉淀，煮沸5-10min，10000rpm离心10min，取上清备用。

SDS-PAGE结果见图9和图10，各工程菌株在发酵12h后，有大量的添加引导肽的蛋白分泌到细胞外的发酵液中。

Claims

1.一种纤维素酶的蛋白序列在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白过程中的应用，其特征在于：所述蛋白序列是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.一种纤维素酶的蛋白序列在大肠杆菌中可溶及分泌表达重组蛋白过程中的应用，其特征在于：所述蛋白序列是SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述纤维素酶的蛋白序列在大肠杆菌可溶及分泌表达重组蛋白的方法为：将编码所述纤维素酶蛋白的核苷酸序列与编码所需表达蛋白的核苷酸序列连接组成融合基因后克隆入大肠杆菌表达载体，而后将该载体转化到大肠杆菌表达宿主菌中进行表达，所述所需表达蛋白是麦芽糖结合蛋白（MBP）、胰高血糖素样肽（GLP-1）或酵母糖酰胺酶（Png1p)。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述纤维素酶的蛋白序列在大肠杆菌可溶及分泌表达重组蛋白的方法为：将编码所述纤维素酶蛋白的核苷酸序列与编码所需表达蛋白的核苷酸序列连接组成融合基因后克隆入大肠杆菌表达载体，而后将该载体转化到大肠杆菌表达宿主菌中进行表达，所述所需表达蛋白是环糊精糖基转移酶淀粉结合区（CBD）和大肠杆菌碱性磷酸酶（PhoA）。