CN104342445A - 一种高效分泌表达异源蛋白的载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域中表达载体，具体地说，涉及一种高效分泌表达异源蛋白的载体及其应用。高效分泌表达异源蛋白的编码信号肽为SEQID NO.1中碱基序列所示。高效分泌表达异源蛋白的载体，含有一条特定的核苷酸序列，该序列为启动子和编码信号肽的核苷酸序列；结构图示为：启动子序列、编码信号肽的核苷酸序列、6×His标签序列和PmaCI酶切位点；所述启动子为T7启动子，编码信号肽为微杆菌（Microbacterium sp.OU01）的壳聚糖酶信号肽。本发明载体在高效分泌表达外源基因的同时有效地提高表达产物的水溶性，利用亲和层析一步纯化即可以得到具有生物活性的重组蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域中表达载体，具体地说，涉及一种高效分泌表达异源蛋白的载体及其应用。
背景技术
随着分子生物学技术的发展和大规模测序技术的进步，大量具有重要应用前景的功能基因被挖掘出来。利用基因工程对功能基因进行重组表达，可以获得具有生物学活性的功能蛋白。蛋白的体外重组表达系统包括原核表达系统和真核表达系统，以大肠杆菌为代表的原核表达系统具有操作简单、表达迅速、高效等优点，成为最受关注的表达系统。
在大肠杆菌体外重组表达系统中，包涵体的形成、重组蛋白分离纯化过程中的蛋白变性和复性等问题严重制约了功能基因产品的规模化制备。分泌表达作为一种重要的表达方式被广泛采用。分泌表达指重组异源蛋白通过一定的方式（运输或者分泌）定位于细胞周质，甚至穿过细胞外膜进入培养基中。重组蛋白的分泌表达一般通过将一段信号肽序列嵌合到目的基因上游，在基因翻译过程中将表达产物整合到新生肽链的N端序列上，进而与细菌细胞膜的特异性受体识别并结合，引导生成的目的多肽分泌到细胞外周质空间或发酵培养基中；在穿膜过程中，信号肽被宿主编码的信号肽酶切除，从而更有利于形成目的蛋白的天然N-末端。此外，大肠杆菌细胞周质是一个氧化还原的环境，存在一系列的酶，有利于重组蛋白内二硫键的形成以及增强含有巯基蛋白的正确折叠，并减少重组蛋白对宿主菌的毒性，增加宿主菌的适应性。此外，细胞周质空间和胞外培养基中的宿主蛋白含量很低，也有利于目的蛋白的分离纯化。目前，制约重组蛋白分泌表达一个重要因素是高效分泌表达信号肽的欠缺，在前期研究中，人们也陆续发现了包括大肠杆菌外膜蛋白信号肽ompA在内的许多可以实现异源蛋白分泌表达的信号肽，但是在实际应用中，其分泌表达效率较低，导致规模化制备分泌表达蛋白的得率低，目的蛋白的生产成本高。因此，寻找更为高效的信号肽对于分泌表达蛋白的规模化制备具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有分泌表达载体所用的信号肽分泌效率低的不足，提供一种高效分泌表达异源蛋白的信号肽，以及含有该信号肽的重组表达载体及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种高效分泌表达异源蛋白的编码信号肽，高效分泌表达异源蛋白的编码信号肽为SEQ ID NO.1中碱基序列所示。
高效分泌表达异源蛋白的载体，含有一条特定的核苷酸序列，该序列为启动子和编码信号肽的核苷酸序列；结构图示为：启动子序列、编码信号肽的核苷酸序列、6×His标签序列和PmaCI酶切位点；所述启动子为T7启动子，编码信号肽为微杆菌（Microbacterium sp.OU01）的壳聚糖酶信号肽。所述载体带有PmaCI的单酶切位点，所述复制起点为pUC。所述载体的受体菌的复制原点及高拷贝复制原点为f1origin和pUC origin。
高效分泌表达异源蛋白载体的构建方法，
1）以CHISP-F/CHISP-R为引物对，Microbacterium sp.OU01的基因组DNA为模板，扩增所得产物如SEQ ID NO.1中碱基序列所示，PCR产物再经限制性内切酶Nde I和EcoR I进行双酶切，回收含有双酶切位点的片段；
其中，CHISP-F：5-TAAAGATTCAACGACTTGTTG-3；CHISP-R：TCACGTGGTGATGGTGATGGTGGGCGGAGGCAGCGCACCCG；
2）以MIH/pCR T7/NT TOPO T质粒为基础质粒，利用限制性内切酶NdeI和EcoR I进行双酶切，回收大片段；将回收的片段与步骤1）回收的含有双酶切位点的片段利用T4DNA连接酶连接后进行转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选得到阳性克隆含有的高效分泌表达异源蛋白重组载体，即为pCT7-CHISP6H。
高效分泌表达异源蛋白载体的应用，所述载体在微杆菌（Microbacterium sp.OU01）与芽孢杆菌（Bacillus sp.S-1）的壳聚糖酶成熟肽分泌表达中的应用。
本发明通过信号肽将新合成的多肽引导并最终分泌到细胞外发酵液中，在转运完成以后，信号肽被切除，从而直接获得了所需要的外源蛋白表达产物。
所述的信号肽序列来源于微杆菌（Microbacterium sp.OU01）壳聚糖酶基因。微杆菌是一种革兰氏阴性细菌，可以分泌表达一种壳聚糖酶，该壳聚糖酶基因编码266个氨基酸，其中N端25个氨基酸组成信号肽序列[Sun,Y.Y.，et al.2006.Purification and characterization of two typesof chitosanase from a Microbacterium sp.Biotechnology Letters28:1393-1399;Zhang,J.Q.,and Sun,Y.Y.2007.Molecular cloning,expression and characterization of a chitosanase from Microbacteriumsp.Biotechnology Letters29:1221-1225.]。
本发明有如下优点：
1.本发明构建了一种大肠杆菌高效分泌表达异源蛋白的表达载体pCT7-CHISP6H，该载体含有T7启动子序列、信号肽序列、6×His标签序列以及PmaCI限制性内切酶的单克隆位点等特征。
2.本发明构建的载体pCT7-CHISP6H能有效地进行微杆菌Microbacterium sp.OU01和芽孢杆菌Bacillus sp.S-1的壳聚糖酶成熟肽基因的分泌表达，对开展其他蛋白在大肠杆菌中的分泌表达提供了一个基础质粒。
3.本发明在载体pCT7-CHISP6H上设计了PmaC I单酶切位点，利用限制性内切酶PmaC I对载体进行线性化酶切。利用 HD Clontechkit技术将线性化载体和目的基因的PCR产物直接进行连接反应，转化大肠杆菌DH5α，较传统的载体双酶切、连接转化构建工程菌株可以节省时间、提高载体构建的效率。
4.利用本发明所得质粒成功实现了微杆菌Microbacterium sp.OU01和芽孢杆菌Bacillus sp.S-1的壳聚糖酶成熟肽的分泌表达。同时，该质粒的成功构建对于其他具有目的基因重组表达的研究提供了新的思路。
5.本发明载体在高效分泌表达外源基因的同时有效地提高表达产物的水溶性，利用亲和层析一步纯化即可以得到具有生物活性的重组蛋白。
附图说明
图1为本发明实施例提供的分泌表达载体pCT7-CHISP6H的质粒图谱。
图2为本发明实施例提供的诱导表达的重组表达蛋白chi tosanase的酶解圈实验结果，其中A，B，C，D，E分别代表IPTG诱导0h，2h，3h，4h和5h后发酵液在4℃，10000×g离心10min后，取100μl上清液进行酶解圈分析的结果（37℃下放置1h）。
图3为本发明实施例提供的重组表达chitosanase分离纯化样品的SDS-PAGE分析结果图，其中，M为蛋白标准分子量；1为结合缓冲液收集样品；2为250mM咪唑洗脱样品。
具体实施方式
将微杆菌（Microbacterium sp.OU01）和芽孢杆菌（Bacillus sp.S-1）壳聚糖酶成熟肽编码基因分别插入到本发明载体质粒pCT7-CHISP6H的PmaCI酶切位点中，转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达，便可以实现这两个蛋白的高效分泌表达。
Microbacterium sp.OU01是一株从自然界中分离的、可以分泌表达壳聚糖酶的野生菌株[孙玉英等.壳聚糖酶高产菌株的筛选和发酵条件的研究,中国海洋大学学报(自然科学版),2007,(2):266-272]。该壳聚糖酶基因序列（注册号：EF159153）的获得及分析结果显示其编码氨基酸序列中含有一段信号肽，该信号肽的存在可能促使该壳聚糖酶高效的分泌表达。该信号肽序列在大肠杆菌分泌表达系统上的应用，大大提高了大肠杆菌体外分泌表达壳聚糖酶的效率。
通过对革兰氏阳性菌—芽孢杆菌壳聚糖酶在该系统中的表达分析，也提示该信号肽可以有效地实现芽孢杆菌壳聚糖酶成熟肽在大肠杆菌中的分泌表达。
实施例1
大肠杆菌高效分泌表达异源蛋白的载体pCT7-CHISP6H的构建。
（1）微杆菌Microbacterium sp.OU01壳聚糖酶基因信号肽序列的扩增
以Microbacterium sp.OU01的基因组DNA为模板，CHISP-F/CHISP-R为引物对，进行PCR扩增；
引物为：
CHISP-F：GCCATATGAAGATTCAACGACTTG（下划线部分为Nde I酶切位点）
CHISP-R：GCGAATTCGTGCACCATCACCATCACCATGGAGGCAGCGCACCCG CT（下划线部分为EcoR I酶切位点；双下划线为PmaC I酶切位点；加粗部分为6×His标签序列）
PCR反应体系为20ul，如下：
PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
所述扩增产物如SEQ ID NO.1中碱基序列所示的信号肽，其切割位点附近氨基酸序列为AAS-AE。
信号肽序列如SEQ ID NO.1中下划线部分所示：
ATGAAGATTCAACGACTTGTTGCCCTCGCGGCTGCGGTGTCACTGAGCATCGGGTTGAGC GGGTGCGCTGCCTCCGCCGAAACGGCCGGGACCGTCGACTTGGACGCGCCCGTCCAGAAGGACACCGCAATGTCGCTCGTGTCCAGCTTCGAGAACTCATCGACGGACTGGCAGGCGCAGTACGGCTACCTTGAGGACATCGCAGACGGCCGAGGGTACACCGGGGGACTCATCGGATTCACCTCGGGCACAGGAGACATGCTCGAGCTCGTCCGCGCATATTCCGCGTCTTCGCCGGGAAACCCGCTCGAGCAGTACATCCCGGCGTTGGAAGTAGTGAACGGCACCGACTCGCACGCTGGTCTCGGTCAAGGCTTCGAACAGGCGTGGGCCGATGCGGCTGAGACGTCGGAGTTCAGGGCTGCGCAGGATGCAGAACGGGATCGCGTGTACTTCGACCCGGCCGTGGCGCAGGGCAAGGCTGACGGGCTGAGCGCCCTGGGGCAGTTCGCCTACTACGACACCCTCGTCGTCCACGGACCCGGGTCGCAGCGAGACGCATTCGGTGGCATCCGGGCGGAGGCACTCTCCGCAGCGCTACCGCCTTCGCAGGGTGGCGACGAGACCGAATACCTCGAGGCGTTCTTCGACGCCCGGAACGTCATCATGCGAGAAGAGCCGGCCCACGCAGACACCTCCCGTATCGATACCGCGCAGCGCGTATTCCTGCAGAACGGGAACTTCGATCTCGAGCGCCCCCTCACCTGGTCTGTCTACGGAGACCAGTTCTCCCTGAACTAG
（a）序列特征：
●长度：801bp，有效长度1-75bp
●类型：碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：双链DNA
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：微杆菌Microbacterium sp.OU01
（f）特异性名称：gene
（2）重组载体pCT7-CHISP6H的构建
以MIH/pCR T7/NT TOPO T质粒[张继泉等，中国明对虾蜕皮抑制激素在大肠杆菌中的表达与分离纯化,高技术通讯，2006，16（3）：301-306]为基础质粒，利用限制性内切酶Nde I和EcoR I进行双酶切，回收大片段，记作pCT7；同时将步骤（1）中获得的PCR产物同样利用限制性内切酶NdeI和EcoR I进行双酶切，回收双酶切PCR产物的片段，记作CHISP。将回收片段pCT7和CHISP利用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，以T7-F/T7-ter为引物对，利用PCR方法对LB平板上的单克隆进行检测，将PCR检测阳性克隆摇菌后进行DNA测序，由此筛选到构建的重组载体，命名为pCT7-CHISP6H（质粒结构见附图1）。
本发明通过PmaC I酶切位点的引入,采取 HD Clontech kit方法进行载体构建,可以有效的避免了在载体构建过程中因为双酶切引入其他多余的核苷酸序列，从而造成表达出的异源蛋白有多余的氨基酸。
上述核苷酸序列的信息如下：
GATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGATTCAACGACTTGTTGCCCTCGCGGCTGCGGTGTCACTGAGCATCGGGTTGAGCGGGTGCGCTGCCTCCGCCCACCATCACCATCACCACGTGAATTCGAAGCTTGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATC
其中下划线、双下划线、黑体部分和方框分别表示T7启动子、PmaC I酶切位点、编码6×His标签的序列和T7转录终止序列。
实施例2
微杆菌Microbacterium sp.OU01壳聚糖酶成熟肽重组表达载体pCT7-CHISP6H-mschito的构建及诱导表达、分离纯化和活性分析。
（1）Microbacterium sp.OU01壳聚糖酶成熟肽序列扩增与片段回收
根据Microbacterium sp.OU01壳聚糖酶成熟肽序列信息结合HD Clontech kit使用说明，设计引物扩增其成熟肽序列，引物序列如下：
pCT7-CHISP6H-mschitoF:CATCACCATCACCACTCCGCCGAAACGGCCGGGA（下划线部分序列为与线性化载体pCT7-CHISP6H匹配的15bp序列）
pCT7-CHISP6H-mschitoR:AAGCTTCGAATTCACCTAGTTCAGGGAGAACTGG（下划线部分序列为与线性化载体pCT7-CHISP6H匹配的15bp序列）
以pCT7-CHISP6H-mschitoF/pCT7-CHISP6H-mschitoR为引物对，Microbacterium sp.OU01的基因组DNA为模板(100ng/μl)，进行PCR扩增，具体PCR反应体系和扩增程序如下：
PCR反应体系为50μl，包括：
PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物电泳后进行产物回收。
利用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行电泳分析，切胶回收与预测大小一致的片段，片段大小为720bp左右，并利用NanoDrop测定回收片段的浓度（31.5ng/μl）。
（2）pCT7-CHISP6H质粒的线性化酶切
利用PmaC I对质粒pCT7-CHISP6H进行酶切，利用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物，回收2.5kb左右的酶切片段，并利用NanoDrop测定回收片段浓度（35ng/μl）。
（3）pCT7-CHISP6H-mschito载体的构建
根据 HD Clontech kit使用说明，将回收的PCR产物和PmaCI酶切的pCT7-CHISP6H线性化质粒进行反应，具体反应体系与反应条件为：回收的PCR产物1μl，回收的单酶切载体2μl，5×HD2μl，无菌水5μl，混匀后，在50℃反应15min后立即置于冰上，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，以T7-F/T7-ter为引物对，利用PCR方法对LB平板上的单克隆进行检测，将PCR检测阳性克隆摇菌后进行DNA测序，由此筛选到构建的重组载体，命名为pCT7-CHISP6H-mschito。
（4）重组mschito的诱导表达和分离纯化
抽提pCT7-CHISP6H-mschito质粒，转化BL21(DE3)中，37℃条件下，在含有100μg/mL氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中摇菌，待菌体浓度达到OD600为0.6左右，添加终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达6h。4℃，10000g离心10min后，取上清液利用酶解圈法（固体平板中含有终浓度为1%的壳聚糖）检测重组壳聚糖酶的活性。酶解圈实验分析结果见图2，结果显示利用该方法获得的重组壳聚糖酶可以有效的降解胶体壳聚糖。
重组工程菌经活性检测具有壳聚糖酶活性后，进行放大实验，放大至500mL体积。发酵液离心后，上清液直接利用His标签蛋白纯化预装柱HisTrapFF Crude（5mL）进行亲和层析法纯化。具体步骤如下：
HisTrapFF Crude（5mL）柱经10倍柱体积的超纯水冲洗后，用5倍柱体积的结合缓冲液（10mM咪唑，500mM NaCl，50mM pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液）平衡；发酵液中分别添加1/7发酵体积的5M咪唑母液、5M NaCl母液以及0.5M pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，混匀，4℃，10000g离心10min，取上清液上HisTrapFF Crude柱，流速控制在5mL/min；上样结束后，利用结合缓冲液冲洗10倍柱体积；利用洗脱液（250mM咪唑，500mM NaCl，50mM pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液）洗脱。洗脱后的样品利用分子截留量为10K的超滤离心管去除咪唑和NaCl，以20mM pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液作为交换液，经多次超滤离心，最后制备成浓缩样品溶于20mM pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中。对分离纯化的样品进行SDS-PAGE分析，结果显示通过一步亲和层析分离可以得到纯度为电泳纯的重组壳聚糖酶，其分子量大小与预测值一致（见附图3）。
实施例3
利用表达载体pCT7-CHISP6H对Bacillus sp.S-1壳聚糖酶进行表达载体构建、重组表达和活性分析
为了检验该信号肽的普适性，利用革兰氏阳性菌Bacillus sp.S-1的壳聚糖酶（注册号：EU924147）在该表达系统中进行测试，重组表达载体pCT7-CHISP6H-Bschito的构建方法同实施例2，具体操作如下：
设计用于扩增Bacillus sp.S-1壳聚糖酶成熟肽的引物序列如下：
pCT7-CHISP6H-bschitoF：
CATCACCATCACCACGCAAGTGTAACGGACAATTC（下划线部分序列为与线性化载体pCT7-CHISP6H匹配的15bp序列）
pCT7-CHISP6H-bschitoR：
AAGCTTCGAATTCACTTAATTATCGTATCCTTCATAAATCGC（下划线部分序列为与线性化载体pCT7-CHISP6H匹配的15bp序列）
以pCT7-CHISP6H-bschitoF/pCT7-CHISP6H-bschitoR为引物对，Bacillus sp.S-1的基因组DNA为模板(100ng/μl)，进行PCR扩增，具体PCR反应体系和扩展程序如下：
PCR反应体系为50μl，包括：
PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸10min。利用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行电泳分析，切胶回收与预测大小一致的片段，片段大小为1300bp左右，并利用NanoDrop测定回收片段的浓度（38.6ng/μl）。
（2）pCT7-CHISP6H-bschito载体的构建
根据 HD Clontech kit使用说明，将回收的PCR产物和PmaCI酶切的pCT7-CHISP6H线性化质粒进行反应，具体反应体系与反应条件为：回收的PCR产物1μl，回收的单酶切载体2μl，5×HD2μl，无菌水5μl，混匀后，在50℃反应15min后立即置于冰上，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，以T7-F/T7-ter为引物对，利用PCR方法对LB平板上的单克隆进行检测，将PCR检测阳性克隆摇菌后进行DNA测序，由此筛选到构建的重组载体，命名为pCT7-CHISP6H-bschito。
（3）重组bschito的诱导表达和分离纯化
抽提pCT7-CHISP6H-bschito质粒，转化BL21(DE3)中，37℃条件下，在含有100μg/mL氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中摇菌，待菌体浓度达到OD600为0.6左右，添加终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达6h。4℃，10000g离心10min后，取上清液利用酶解圈法（固体平板中含有终浓度为1%的壳聚糖）检测重组壳聚糖酶的活性。结果显示利用该载体获得的重组Bacillus sp.S-1的壳聚糖酶可以有效的分泌表达，表达产物具有很好的降解壳聚糖酶的活性。
Claims (6)
1.一种高效分泌表达异源蛋白的编码信号肽，其特征在于：高效分泌表达异源蛋白的编码信号肽为SEQ ID NO.1中碱基序列所示。
2.一种权利要求1所述的高效分泌表达异源蛋白的载体，其特征在于：含有一条特定的核苷酸序列，该序列为启动子和编码信号肽的核苷酸序列；结构图示为：启动子序列、编码信号肽的核苷酸序列、6×His标签序列和PmaCI酶切位点；所述启动子为T7启动子，编码信号肽为微杆菌（Microbacterium sp.OU01）的壳聚糖酶信号肽。
3.按权利要求2所述的高效分泌表达异源蛋白的载体，其特征在于：所述载体带有PmaCI的单酶切位点，所述复制起点为pUC。
4.按权利要求2所述的高效分泌表达异源蛋白的载体，其特征在于：所述载体的受体菌的复制原点及高拷贝复制原点为f1origin和pUCorigin。
5.一种权利要求2所述的高效分泌表达异源蛋白载体的构建方法，其特征在于：
1）以CHISP-F/CHISP-R为引物对，Microbacterium sp.OU01的基因组DNA为模板，扩增所得产物如SEQ ID NO.1中碱基序列所示，PCR产物再经限制性内切酶Nde I和EcoR I进行双酶切，回收含有双酶切位点的片段；
其中，CHISP-F：5-TAAAGATTCAACGACTTGTTG-3；CHISP-R：TCACGTGGTGATGGTGATGGTGGGCGGAGGCAGCGCACCCG；
2）以MIH/pCR T7/NT TOPO T质粒为基础质粒，利用限制性内切酶NdeI和EcoR I进行双酶切，回收大片段；将回收的片段与步骤1）回收的含有双酶切位点的片段利用T4DNA连接酶连接后进行转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选得到阳性克隆含有的高效分泌表达异源蛋白重组载体，即为pCT7-CHISP6H。
6.一种权利要求2所述的高效分泌表达异源蛋白载体的应用，其特征在于：所述载体在微杆菌（Microbacterium sp.OU01）与芽孢杆菌（Bacillussp.S-1）的壳聚糖酶成熟肽分泌表达中的应用。
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