CN103146631B - 一种表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
一种表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明的表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌是同时携带重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ和质粒pTf16-ParaB-tig的大肠杆菌BL21(DE3)。其中，所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ中的PoIFN-γ基因序列是SEQ ID NO.4；所述质粒pTf16-ParaB-tig可表达分子伴侣tig。本发明方法提高了猪γ-干扰素的可溶性及产量，工艺简单且成本低，具有良好的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
猪γ-干扰素(porcine interferon gamma，PoIFN-γ)也称猪II型干扰素，是一类由活化的T淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞等分泌的细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤、激活淋巴细胞和免疫调节等功能。实际应用中，将猪干扰素作为疫苗佐剂，与治疗不同疾病的疫苗联合使用，研制出免疫效果更好的新型疫苗，对猪病防治具有积极的影响。
目前猪干扰素的批量生产主要有细胞诱导培养法和以毕赤酵母、大肠杆菌为表达系统的基因重组法。前一种方法以动物细胞为原料，生产工艺复杂，成本高，且产品有携带外源病毒和其他病原微生物的危险。以毕赤酵母为表达系统的基因重组法虽较前一种先进，生产成本大大降低，但其工艺还是相对较复杂且表达量有限。而以大肠杆菌为表达系统的基因重组法，虽能提高其表达量，但产物为无活性的包涵体，需经繁琐低效、代价昂贵的复性过程才能获得生物学功能。因此，如何获得高表达量的活性猪γ-干扰素成为近年来学者们广为研究的热点。
本发明克服了上述现有技术制备猪γ-干扰素表达量低、产物为无活性包涵体、制备工艺复杂繁琐等缺陷，提出了一种表达可溶性猪γ-干扰素的基因工程菌及其构建方法，以及利用该基因工程菌进行猪γ-干扰素的高效制备方法；通过采用自诱导培养基发酵表达猪γ-干扰素，省去了监测菌体密度和添加IPTG诱导剂等步骤，使操作简洁易行，同时避免了IPTG对菌体的毒害作用。利用本发明方法制备猪γ-干扰素，成本低、易操作、产量高且活性好。
发明内容
本发明提出一种表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌，所述基因工程菌是同时携带重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ和质粒pTf16-ParaB-tig的大肠杆菌BL21(DE3)。其中，所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ中的PoIFN-γ基因序列是SEQ ID NO.4；所述质粒pTf16-ParaB-tig可表达分子伴侣tig。
其中，所述PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)的5′端为SEQ ID NO.2(含肠激酶和KpnI酶切位点)，3′端为SEQ ID NO.3(含终止密码子和BamHI酶切位点)，中间为经优化的猪 γ-干扰素成熟肽基因(SEQ ID NO.1)。
本发明还提出了所述基因工程菌的构建方法，其步骤为：将所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ和质粒pTf16-ParaB-tig分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述基因工程菌。
其中，所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ的构建方法为：首先人工合成所述PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)，用KpnI/BamHI对所述PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)和质粒pET-32a(+)进行双酶切，连接、转化大肠杆菌DH5α，再挑取重组子并提取得到所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ。所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ经测序鉴定，证实其含有所述PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)。
本发明还提供一种应用所述基因工程菌制备可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的方法，其步骤为：将所述表达可溶性猪γ-干扰素的基因工程菌于LB液体培养基中进行培养后，转接入自诱导培养基继续培养，然后离心收集菌体；重悬所述菌体，搅拌过夜后，将其超声破碎并离心收集上清，经镍离子亲和层析并脱盐、浓缩得到纯化的猪γ-干扰素融合蛋白，将其酶解后再次经镍离子亲和层析并脱盐、浓缩，得到所述猪γ-干扰素。
其中，所述自诱导培养基的配方为：甘油0.1-2％v/v、胰蛋白胨0.1-2％w/v，酵母提取物0.1-2％w/v，乳糖0.1-2％w/v，葡萄糖0.01-0.2％w/v，NaCl0.1-2％w/v，Na2HPO45-100mM，KH2PO45-100mM，(NH4)2SO45-100mM，MgSO41-20mM。
其中，所述菌体的重悬使用破菌缓冲液，其配方为：Tris10-100mM、溶菌酶0.01-0.2％w/v、TritonX-1000.1-1％v/v。
本发明还提供了一种用于治疗猪病毒性疾病的组合物，其含有有效量的可溶性猪γ-干扰素，以及药学可接受成分。
本发明的目的在于构建一种表达可溶性猪γ-干扰素的基因工程菌，用于生产可溶性且成本低的猪γ-干扰素。
本发明要解决的一个技术问题是构建一种可溶性表达猪γ-干扰素的基因工程菌。其特征在于，该基因工程菌是同时携带重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ和质粒pTf16-ParaB-tig的大肠杆菌BL21(DE3)。
所述的基因工程菌的进一步特征在于，所述的重组质粒是pET-32a(+)-PoIFN-γ，能够高效表达猪γ-干扰素，其中，PoIFN-γ基因具有如下本发明设计的SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列：
GGGGTACCGACGACGACGACAAGCAGGCGCCGTTTTTTAAAGAAATTACCATTCTGAAAGATTATTTTAATGCGAGCACCAGCGATGTGCCGAATGGCGGCCCGCTGTTTCTGGAAA TTCTGAAAAATTGGAAAGAAGAAAGCGATAAAAAAATTATTCAGAGCCAGATTGTGAGCTTTTATTTTAAATTTTTTGAAATTTTTAAAGATAATCAGGCGATTCAGCGCAGCATGGATGTGATTAAACAGGATATGTTTCAGCGCTTTCTGAATGGCAGCAGCGGCAAACTGAATGATTTTGAAAAACTGATTAAAATTCCGGTGGATAATCTGCAGATTCAGCGCAAAGCGATTAGCGAACTGATTAAAGTGATGAATGATCTGAGCCCGCGCAGCAATCTGCGCAAACGCAAACGCAGCCAGACCATGTTTCAGGGCCAGCGCGCGAGCAAATAATAAGGATCCG
该基因工程菌的另一特征在于，所述的质粒pTf16-ParaB-tig能够表达分子伴侣tig，其中，ParaB是质粒pTf16的启动子。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种表达可溶性猪γ-干扰素的基因工程菌的构建方法。本发明通过采用以下技术方案解决以上技术问题：首先对天然猪γ-干扰素核苷酸序列进行优化，得到既不改变天然猪γ-干扰素的氨基酸序列，又能在大肠杆菌BL21(DE3)中高效率表达的基因，人工合成后插入到质粒pET-32a(+)中，构建成重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ，再将质粒pTf16-ParaB-tig和重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，即获得表达可溶性PoIFN-γ的基因工程菌。具体操作步骤如下：
第一步：PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)的合成
参照大肠杆菌BL21(DE3)对氨基酸密码子的偏爱性、碱基GC含量、mRNA二级结构等综合因素对天然猪γ-干扰素基因序列进行优化，得到既不改变天然猪γ-干扰素的氨基酸序列，又能在大肠杆菌BL21(DE3)中高效率表达的猪γ-干扰素成熟肽基因(SEQ ID NO.1)，其序列如下：
CAGGCGCCGTTTTTTAAAGAAATTACCATTCTGAAAGATTATTTTAATGCGAGCACCAGCGATGTGCCGAATGGCGGCCCGCTGTTTCTGGAAATTCTGAAAAATTGGAAAGAAGAAAGCGATAAAAAAATTATTCAGAGCCAGATTGTGAGCTTTTATTTTAAATTTTTTGAAATTTTTAAAGATAATCAGGCGATTCAGCGCAGCATGGATGTGATTAAACAGGATATGTTTCAGCGCTTTCTGAATGGCAGCAGCGGCAAACTGAATGATTTTGAAAAACTGATTAAAATTCCGGTGGATAATCTGCAGATTCAGCGCAAAGCGATTAGCGAACTGATTAAAGTGATGAATGATCTGAGCCCGCGCAGCAATCTGCGCAAACGCAAACGCAGCCAGACCATGTTTCAGGGCCAGCGCGCGAGCAAA。
为方便克隆和表达，在SEQ ID NO.1的5′端添加GGGGTACCGACGACGACGACAAG(其中GG为保护碱基，GGTACC为KpnI酶切位点，GACGACGACGACAAG编码肠激酶酶切位点)，在SEQ ID NO.1的3′端添加TAATAAGGATCCCG(其中TAA编码终止密码 子，GGATCC为BamHI酶切位点，CG为保护碱基)，得到PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)，优化后委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。
第二步：构建含PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)的重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ
将人工合成的PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)用KpnI/BamHI双酶切，回收大片段并与用同样的酶双酶切的克隆载体pET-32a(+)连接，构建重组表达载体pET-32a(+)-PoIFN-γ。将重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ转化大肠杆菌DH5a。筛选重组质粒的转化子并提取重组质粒。酶切鉴定后，阳性克隆送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序分析，证实该重组表达载体含有正确的PoIFN-γ基因序列。
第三步：构建表达可溶性猪γ-干扰素的基因工程菌
将上一步制得的重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ转入大肠杆菌BL21(DE3)中，再将含有分子伴侣tig基因的质粒pTf16-ParaB-tig转入含pET-32a(+)-PoIFN-γ的大肠杆菌BL21(DE3)中，即得表达可溶性猪γ-干扰素的分子伴侣共表达基因工程菌。
本发明再一目的在于提供一种利用上述基因工程菌制备可溶性猪γ-干扰素的方法，具体操作步骤如下：
第一步：菌体收集
将上述构建好的表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌在LB液体培养基中37℃，210rpm培养12小时，并按1％(v/v)的比例转接入自诱导培养基中27℃，210rpm培养18小时。最后离心收集菌体。
其中，自诱导培养基配方如下：
甘油0.1-2％(v/v)、胰蛋白胨0.1-2％(w/v)，酵母提取物0.1-2％(w/v)，乳糖0.1-2％(w/v)，葡萄糖0.01-0.2％(w/v)，NaCl0.1-2％(w/v)，Na2HPO45-100mM，KH2PO45-100mM，(NH4)2SO45-100mM，MgSO41-20mM。
第二步：制备猪γ-干扰素融合蛋白
将第一步收集的菌体用破菌缓冲液重悬，4℃搅拌过夜。次日超声破碎后，离心收集上清，进行镍离子亲和层析，收集猪γ-干扰素融合蛋白组分，用截留分子量为30KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管将蛋白脱盐和浓缩，得到纯化的猪γ-干扰素PoIFN-γ融合蛋白。
其中，破菌缓冲液配方如下：
Tris10-100mM、溶菌酶0.01-0.2％(w/v)、TritonX-1000.1-1％(v/v)。
第三步：制备猪γ-干扰素
用肠激酶酶解上述纯化的猪γ-干扰素融合蛋白，30℃酶解10-16小时后再次进行镍离子 亲和层析，收集穿透峰，用截留分子量为10KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白脱盐和浓缩，得到纯化的猪γ-干扰素。
本发明提供了一种猪γ-干扰素的基因序列及高效表达、纯化可溶性猪γ-干扰素的新技术方法，克服了现有技术的不足。其优点在于：对天然猪γ-干扰素核苷酸序列进行全面优化，大大提高了表达量；利用分子伴侣共表达系统发酵表达猪γ-干扰素，可有效提高其可溶性、活性及产量。采用自诱导培养基发酵表达目的蛋白，省去了监测菌体密度和添加IPTG诱导剂等步骤，使实验操作变得更加简洁易行；其次，避免了IPTG对细菌的毒害作用。自诱导方法得到的菌体的生物量高，猪γ-干扰素融合蛋白产量也高。进行两次亲和层析，便可从发酵液中获得较纯的猪γ-干扰素，纯化步骤简便，比传统技术的多次层析更易于操作。因此应用分子伴侣共表达系统和自诱导途径有利于猪γ-干扰素的大规模工业化生产。
本发明对天然猪γ-干扰素核苷酸序列进行全面优化，设计序列SEQ ID NO.4，大大提高了猪γ-干扰素的表达量；通过自诱导培养基和分子伴侣共表达系统发酵基因工程菌，大大提高了菌体的生物量和蛋白产量，且共表达分子伴侣可促进猪γ-干扰素融合蛋白的正确折叠，提高其可溶性，通过这种方法可获得高表达量的可溶性猪γ-干扰素融合蛋白。融合蛋白经两次镍离子亲和层析即可得到较纯的猪γ-干扰素，本发明纯化工艺简单，易于操作，生产成本低且表达量高，为工业化生产猪γ-干扰素提供了新的参考。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。说明书及实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件进行。
实施例1构建表达可溶性猪γ-干扰素的基因工程菌
第一步：PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)的人工合成
参照大肠杆菌BL21(DE3)对氨基酸密码子的偏爱性、碱基GC含量、mRNA二级结构等综合因素对天然猪γ-干扰素核苷酸序列进行优化，本发明设计得到既不改变天然猪γ-干扰素的氨基酸序列，又能在大肠杆菌BL21(DE3)中高效率表达的猪γ-干扰素成熟肽基因，其序列(SEQ ID NO.1)如下：
CAGGCGCCGTTTTTTAAAGAAATTACCATTCTGAAAGATTATTTTAATGCGAGCACCAGCGATGTGCCGAATGGCGGCCCGCTGTTTCTGGAAATTCTGAAAAATTGGAAAGAAGAAAGCGATAAAAAAATTATTCAGAGCCAGATTGTGAGCTTTTATTTTAAATTTTTTGAAATT TTTAAAGATAATCAGGCGATTCAGCGCAGCATGGATGTGATTAAACAGGATATGTTTCAGCGCTTTCTGAATGGCAGCAGCGGCAAACTGAATGATTTTGAAAAACTGATTAAAATTCCGGTGGATAATCTGCAGATTCAGCGCAAAGCGATTAGCGAACTGATTAAAGTGATGAATGATCTGAGCCCGCGCAGCAATCTGCGCAAACGCAAACGCAGCCAGACCATGTTTCAGGGCCAGCGCGCGAGCAAA。
为方便克隆和表达，在SEQ ID NO.1的5′端添加GGGGTACCGACGACGACGACAAG(其中GGTACC为KpnI酶切位点，GG为其保护碱基，GACGACGACGACAAG编码肠激酶酶切位点)，在SEQ ID NO.1的3′端添加TAATAAGGATCCCG(其中TAA编码终止密码子，GGATCC为BamHI酶切位点，CG为其保护碱基)，得到PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)，优化后委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。
第二步：构建含PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)的重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ
将人工合成的PoIFN-γ基因(SEQ ID NO.4)用KpnI/BamHI双酶切，回收大片段并与用同样的酶双酶切的克隆载体pET-32a(+)连接，构建重组表达载体pET-32a(+)-PoIFN-γ。将重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ转化大肠杆菌DH5a，筛选重组质粒的转化子并提取重组质粒，酶切鉴定后，阳性克隆送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序分析，证实该重组表达载体含有正确的PoIFN-γ基因序列。
第三步：构建表达可溶性猪γ-干扰素的基因工程菌
将阳性重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到pET-32a(+)-PoIFN-γ/BL21(DE3)基因工程菌。取1ml该菌液接种于含氨苄青霉素的新鲜LB培养基中培养，并制成pET-32a(+)-PoIFN-γ/BL21(DE3)基因工程菌的感受态细胞。再将含有分子伴侣tig基因的质粒pTf16-ParaB-tig转入该感受态细胞中，即可得到表达可溶性猪γ-干扰素的pET-32a(+)-PoIFN-γ/pTf16-ParaB-tig/BL21(DE3)共表达基因工程菌。
实施例2制备猪γ-干扰素
本实施例中所用菌种为：pET-32a(+)-PoIFN-γ/pTf16-ParaB-tig/BL21(DE3)共表达基因工程菌。
本实施例中所用自诱导培养基的配方为：甘油0.5％(v/v)，胰蛋白胨1％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v)，乳糖0.2％(w/v)，葡萄糖0.05％(w/v)，NaCl0.5％(w/v)，Na2HPO450mM，KH2PO450mM，(NH4)2SO425mM，MgSO42mM。
培养发酵的具体过程是：先将保存菌株pET-32a(+)-PoIFN-γ/pTf16-ParaB-tig/BL21(DE3)画线接种于含氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37℃恒温过夜培养，再从平板上挑出单菌 落，接种于含氨苄青霉素和氯霉素的自诱导培养基中，27℃，210rpm培养18h，离心收集菌体。
制备猪γ-干扰素融合蛋白：将上一步收集的菌体用破菌缓冲液重悬，4℃搅拌过夜。次日超声破碎后，离心收集上清。取镍离子亲和层析柱，将破菌上清缓慢加入层析柱中，再分别用5倍体积的IDA-0，IDA-40，IDA-80，IDA-200，IDA-1000溶液洗脱，并收集各个组分的洗脱液，用SDS-PAGE分析蛋白质洗脱情况。SDS-PAGE分析后，将含有猪γ-干扰素融合蛋白的洗脱液用截留分子量为30KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白脱盐和浓缩，得到纯化的猪γ-干扰素融合蛋白。
其中，破菌缓冲液配方如下：
Tris50mM、溶菌酶0.01％(w/v)、TritonX-1000.4％(v/v)。
洗脱液配方如下：
IDA-0：Tris-HCl(pH7.4)20mM，0.5M NaCl。
IDA-40：Tris-HCl(pH7.4)20mM，0.5M NaCl，40mM咪唑。
IDA-80：Tris-HCl(pH7.4)20mM，0.5M NaCl，80mM咪唑。
IDA-200：Tris-HCl(pH7.4)20mM，0.5M NaCl，200mM咪唑。
IDA-1000：Tris-HCl(pH7.4)20mM，0.5M NaCl，1M咪唑。
制备猪γ-干扰素：用肠激酶酶解上述所得的猪γ-干扰素融合蛋白，30℃酶解10-16小时后再次进行镍离子亲和层析，收集穿透峰和IDA-0的洗脱液，合并两者，用截留分子量为10KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将猪γ-干扰素脱盐和浓缩，即得到所需要的纯化的猪γ-干扰素。
实施例3包含猪γ-干扰素的组合物的配制
配制0.9％(w/v)NaCl溶液，取1mg纯化的猪γ-干扰素PoIFN-γ溶于0.5ml NaCl溶液中；另取50mg甘露醇，溶解于0.5ml NaCl溶液中；将二者混匀即为猪γ-干扰素PoIFN-γ与甘露醇的组合物，其中含1mg/ml的PoIFN-γ及50mg/ml的甘露醇。
实施例4所得猪γ-干扰素的组合物的检测
以上方法制备的猪γ-干扰素组合物，经检测结果如下：
| 样品 | 纯度 | 蛋白浓度 | pH | 比活 | 无菌检 | 内毒素 |
| 猪γ-干扰素组合物 | 97.6％ | 972mg/L | 6.8 | 1.16×103 | 符合规定 | 符合规定 |
纯度：用HPLC检测按实施例2所制备的猪γ-干扰素的纯度，结果大于97％；
蛋白浓度：用BCA法测定猪γ-干扰素组合物中蛋白含量，结果大于970mg/L。
活性：用常规的细胞病变抑制法WISH/VSV检测该猪γ-干扰素组合物的活性，结果大于1.10×103IU/mg；
比活性：生物学活性与蛋白质含量之比。
Claims (5)
1.一种制备可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的方法，其特征在于，其步骤为：利用表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌于LB液体培养基中进行培养后，转接入自诱导培养基继续培养，然后离心收集菌体；重悬所述菌体，搅拌过夜后，将其超声破碎并离心收集上清，经镍离子亲和层析并脱盐、浓缩得到纯化的猪γ-干扰素融合蛋白，将其酶解后再次经镍离子亲和层析并脱盐、浓缩，得到所述猪γ-干扰素PoIFN-γ；
其中，所述表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌是同时携带重组质粒pET-32a（+）-PoIFN-γ和质粒pTf16-ParaB-tig的大肠杆菌BL21（DE3）；其中，所述重组质粒pET-32a（+）-PoIFN-γ中的PoIFN-γ基因序列是SEQ ID NO.4；所述质粒pTf16-ParaB-tig表达分子伴侣tig；所述PoIFN-γ基因SEQ ID NO.4的5＇端为SEQ ID NO.2，3＇端为SEQ ID NO.3，中间为猪γ-干扰素成熟肽基因SEQ ID NO.1；
所述自诱导培养基的配方为：甘油0.1-2%v/v、胰蛋白胨0.1-2%w/v，酵母提取物0.1-2%w/v，乳糖0.1-2%w/v，葡萄糖0.01-0.2%w/v，NaCl0.1-2%w/v，Na2HPO4 5-100mM，KH2PO4 5-100mM，(NH4)2SO4 5-100mM，MgSO4 1-20mM。
2.如权利要求1所述制备可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的方法，其特征在于，其步骤为：将所述重组质粒pET-32a（+）-PoIFN-γ和质粒pTf16-ParaB-tig分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中，得到所述基因工程菌。
3.如权利要求1所述制备可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的方法，其特征在于，所述重组质粒pET-32a（+）-PoIFN-γ的构建方法为：首先人工合成所述PoIFN-γ基因SEQ ID NO.4，用KpnI/BamHI对所述PoIFN-γ基因SEQ ID NO.4和质粒pET-32a（+）进行双酶切，连接、转化大肠杆菌DH5ɑ，再挑取重组子并提取所述重组质粒pET-32a（+）-PoIFN-γ。
4.如权利要求3所述制备可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的方法，其特征在于，所述重组质粒pET-32a（+）-PoIFN-γ经测序鉴定，证实其含有所述PoIFN-γ基因SEQ ID NO.4。
5.如权利要求1所述制备可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的方法，其特征在于，所述菌体的重悬使用破菌缓冲液，其配方为：Tris10-100mM、溶菌酶0.01-0.2%w/v、TritonX-100 0.1-1%v/v 。
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| Title |
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| Kazuyo Nishihara等.Overexpression of trigger factor prevents aggregation of recombinant proteins in Escherichia coli.《Appl. Environ. Microbiol.》.2000,第66卷(第3期),884–889. |
| Overexpression of trigger factor prevents aggregation of recombinant proteins in Escherichia coli;Kazuyo Nishihara等;《Appl. Environ. Microbiol.》;20000331;第66卷(第3期);884–889 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103146631A (zh) | 2013-06-12 |
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