CN102260346A - 一种Exendin-4类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程制备活性肽领域,公开一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽及其制备方法和应用。采用本实验室的融合表达制备技术平台,构建在大肠杆菌细胞内高效融合表达Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽的工程菌,融合蛋白表达量占细菌总蛋白的40%以上。酸切割融合蛋白可获得目的肽Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp,通过QAE-Sephadex A-50柱层析分离获得的目的肽用电喷雾质谱法测得其相对分子质量为4116.4Da,对正常雄性ICR小鼠口服葡萄糖负荷后具有显著的降血糖作用而不引起低血糖,显著促进胰岛细胞分泌胰岛素,对于二型糖尿病具有很好的临床应用前景。该制备方法具有目的肽表达量高,制备方法简便,获取目的肽过程不需使用较为昂贵的水解酶适用于工业生产等优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程制备活性肽领域,公开一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽及肽的融合表达工程菌的构建、融合蛋白酸水解制备Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽的方法及体外动物实验检测其降血糖及促进胰岛素分泌的活性。
技术背景
Exendin-4是美国FDA首个批准上市的肠促胰岛素类似物,最初发现于美国西南部希拉毒蜥(Heloderma suspectum)的唾液中,是一种含有39个氨基酸的多肽,与胰高血糖素样肽-1(GLP-1)有53%的序列同源性,是GLP-1受体的长效激动剂,Exendin-4可以促进葡萄糖浓度依赖性的胰岛素分泌,只有在高血糖条件下,才刺激胰岛素的分泌,在低血糖情况下,无此作用,这点与传统的磺酰脲类降糖药不同,因此其在临床上发生低血糖副作用的风险会降低;能够抑制餐后胰高血糖素的产生,延迟胃排空;通过诱导胰岛β细胞新生、促进胰岛β细胞增殖和抑制胰岛β细胞凋亡来实现改善胰岛β细胞功能和增强胰岛β细胞质量,并且其半衰期远远长于GLP-1。Exendin-4的这些生理功能使其在二型糖尿病的治疗中显示了广阔的前景。
Exendin-4作为天然物质的含量非常低,单靠提取不可能实现其临床价值。目前获取该物质的方法主要有化学合成法和基因工程法。化学合成的Exendin-4已于2005在美国上市,对于治疗二型糖尿病的疗效较为显著,但由于化学合成法成本较高,价格昂贵,步骤多,收率低,过程涉及有害化学物质等缺点,考虑到小分子多肽在大肠杆菌表达系统中表达量低及容易降解的特点我们尝试以基因 工程的方法来制备Exendin-4类似物,以提高产量,降低成本。本课题旨在构建Exendin-4的高效表达载体,并分离纯化Exendin-4多肽衍生物,为Exendin-4的基因工程生产提供依据。
由于全长的Exendin-4C端36-39位氨基酸存在Pro-Pro-Pro-Ser的刚性结构,在大肠杆菌中常出现不表达或表达量较低的情况,表达量一般都在15%-20%左右,如专利CN 101993851A,CN 101586104A,CN 1455001A等。Steffen Runge等人的研究同时也表明,色氨酸笼子(Exendin-4C端的31-39位氨基酸)在与受体的结合方面作用很小,截去了PPPS对活性影响不大,所以本专利优选了截短型的Exendin-4,即Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp。由于Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp分子量较小,在基因工程方法合成过程中常常容易被细菌胞内的酶所降解,基因工程中通常都将这种小肽与分子量稍大的融合伙伴连接实现共表达,表达后用凝血酶或肠激酶将融合伙伴与目的肽分离,但这种切割酶价格较为昂贵,不适合进行大规模的生产制备。本专利在融合伙伴与目的肽之间添加酸水解位点Asp-Pro-Pro,只需在50mmol/L盐酸中48℃水解48h就可以将两者水解开,大大降低了生产成本,适用于工业生产。Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp进入体内后Pro-Pro-即可被二肽基肽酶IV及PPCE酶水解释放为Exendin-4(1-35)-Asp发挥降糖作用。
发明内容
本发明的目的是公开一种融合表达且可酸水解释放Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽及其制备方法。
本发明的另一个目的是提供相应的编码序列,载体和宿主菌。
本发明的另一个目的是Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽具有显著的葡萄糖浓度依赖性降糖活性,不致于引起低血糖。
在本发明的另一方面,提供了一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽,它是在天然Exendin-4(1-39)N端添加了二肽基肽酶(DPP IV)切割位点及PPCE酶切位点,同时截去C端的36-39位氨基酸PPPS并接加1个Asp。
在本发明的第二方面,提供了一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽的制备方法,其特征在于,该方法包含步骤:
(a)在适合表达的条件下,培养权利要求4,5所述的质粒载体及其工程菌。
(b)从培养物中分离出SEQ NO:1所示氨基酸序列的Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽。
(c)纯化出Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽。
(d)进入体内后Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽被二肽基肽酶(DPP IV)及PPCE酶酶切,形成Exendin-4(1-35)-Asp肽。
在一优选例中,本发明的方法中,所述的步骤(b)包括:
通过溶菌,洗涤,乙醇沉淀等方法分离出Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽与融合伙伴C末端组成的融合蛋白;酸水解的方法从所述融合蛋白中切下融合伙伴,得到Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽。
在另一优选例中,所述的步骤(c)包括通过QAE-Sephadex A-50阴离子交换柱分离出Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽,透析除盐并冻干。
在本发明的第二方面,对正常ICR小鼠(6-8周龄)皮下注射Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽后,一次性灌胃给予高浓度葡萄糖,测定在不同时间点的血糖变化及20-30分钟时血浆中胰岛素分泌水平。
附图说明
图1 重组质粒构建原理示意图。DPP为酸水解位点,D代表Asp,P代表Pro 。
图2 PCR获得Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp基因的凝胶电泳检测结果。Lane1:Marker,Lane2:Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的基因。
图3 Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的基因测序结果。
图4 15%SDS-PAGE电泳检测重组菌经乳糖诱导表达融合蛋白结果。M:Marker Lan1:重组菌乳糖诱导前Lan2:重组菌乳糖诱导后。
图5 小肽电泳检测融合蛋白酸水解情况。Lan1:胰岛素对照,Lan2:融合蛋白酸水解0h,Lan3:融合蛋白水解12h,Lan4:融合蛋白水解36h,Lan4:融合蛋白水解。
图6 小肽电泳检测Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp纯化结果。Lan1:胰岛素对照Lan2:Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp。
图7 Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的电喷雾质谱图。
图8 Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp单次皮下注射对健康小鼠糖负荷后血糖的影响。
图9 Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp单次皮下注射对健康小鼠糖负荷后血清胰岛素水平的影响
具体实施方式
以下通过附图及实施例对本发明作进一步说明。
本说明书中所提到的材料中:
(1)宿主菌和质粒
宿主菌Escherichia coli BL21是基因工程常用工程菌种,基因工程研究相关的实验室一般都有保存。pED载体,5#载体为本实验室构建并保存。
(2)酶和试剂
分子克隆工具酶为Fermentas公司;质粒抽提试剂盒为南京天为生物科有限公司;PCR胶回收试剂盒为Takara公司的产品。
(3)培养基
LB培养基,配方见参考文献Sambrook J,FristshE F,Maniatis T.Molecular Cloning;A Laboratory Manual 2nd ed.NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。
玉米浆培养基配方:玉米浆25g/L,牛肉浸膏15g/L,谷氨酸钠10g/L。
QAE Sephadex A-50阴离子交换柱为美国GE公司产品。
本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转化大肠杆菌,这些都是基因工程研究领域的常规操作方法,具体参见Sambrook J,FristshE F,Maniatis T.Molecular Cloning;A Laboratory Manual2nd ed.NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,pp.16-340。
实施例1 Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp基因的克隆
以pED载体中的Pro-Pro-Exendin-4(1-39)-Asp基因为模板,M1和M2分别为上下游引物进行PCR,同时,设计上游引物M3,用于筛选阳性克隆。合成三条引物序列如下:
M1:5’-AAAGGATCCG CCG CAT GGC GAA GGC-3’含保护碱基及BamH I酶切位点
M2:5’-AAAAAGCTTAATCTGCACCAGAAGACGGACCAC-3’含保护碱基及HindIII酶切位点
M3:5’-ACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3’
引物由GeneScript Corporation公司合成。PCR反应在eppendorf PCR扩增仪上进行。其中M1、M2按1∶1浓度比例混合,于94℃,30s;57℃,30s;72℃,1min;共30个循环。1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(参见图2),条带位置与预期的131bp一致。
PCR产物经凝胶回收获得的目的基因片段和5#载体质粒分别经BamH I和HindIII双酶切,琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段与载体基因片段后用T4DNA连接酶16℃连接,转化至E.coli BL21感受态细胞后涂布到含50mg/ml卡那霉素的LB固体培养基上,37℃培养过夜,挑取单菌落,PCR方法初筛阳性克隆,将阳性克隆送至上海金斯瑞生物技术有限公司进行测序,测序结果经软件比对 后完全正确(参见附图3)。
实施例2 Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp多肽基因在大肠杆菌中的表达及发酵罐培养
重组表达菌以1%接种量在液体LB培养基中37℃振荡过夜,5%的接种量转接于6.5L玉米浆发酵液中,添加1%色拉油作消泡剂,搅拌转数为560r/min,上罐发酵3.5h后OD600达到1.4,此时加入终浓度为5mmol/L乳糖诱导表达,8h后收集菌体,留样进行SDS-PAGE分析(参见附图4)。在分子量约22.11KDa处出现明显的蛋白条带。融合蛋白在诱导后8h达到稳定的最大表达量,BandScan软件分析显示融合蛋白占细菌总蛋白的40%以上,并在胞内形成了包涵体。
实施例3 融合蛋白的分离纯化
诱导表达后的工程菌经离心回收菌体,将菌体用50mmol/LpH7.4的Tris·HCl缓冲液洗涤两次,向收集的菌体中加入配制好的菌体裂解液(4ml/g菌体),于37℃摇床恒温剧烈振荡过夜,以充分裂解菌体,裂解至溶液不粘滞时,离心收集沉淀。每克裂解后的菌体沉淀加入10ml包涵体洗涤液1(0.2% Triton X-100,50mmol/L Tris·HCl),将包涵体悬浮于洗涤液中剧烈振荡2小时后,离心收集沉淀。将沉淀加入适量蒸馏水中重悬洗涤,洗涤后离心收集沉淀。再用包涵体洗涤液2(2mol/L Urea,10% Triton X-100)洗涤沉淀2次,收集洗涤后的包涵体。每克包涵体加入8ml包涵体溶解液(8mol/L Urea,50mmol/L Tris·HCl),混匀,室温下连续振荡至包涵体溶解,12000r/min离心20分钟,收集上清液。向包涵体溶解液上清中加入0.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇,边加边轻轻搅拌以沉淀杂蛋白,-20℃放置20分钟,离心,收集上清,在离心后上清中加入1倍体积的预冷的无水乙醇沉淀融合蛋白,-20℃放置20分钟,离心,收集上清。向离心后上清中加入3倍体积的预冷的无水乙醇沉淀融合蛋白,-20℃放置2小时,离心,收集沉淀,称重,得 到融合蛋白。
实施例4 融合蛋白的酸水解
将3倍乙醇沉淀获得的融合蛋白加入50mmol/L盐酸溶液(融合蛋白终浓度为5%)置于48℃水浴锅中进行酸水解,水解48h(参见附图5)。将酸水解后的溶液pH分别调至4.5、7.6、9.3进行等电点沉淀,4℃冰箱中分别放置2h,离心去除沉淀的杂蛋白,留Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp目的多肽含量丰富的上清。
实施例5 Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp多肽的分离纯化
将实施例4得到的含Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的上清于pH5.5的乙酸铵溶液中透析48h。上样于用0.02mol/L乙酸铵平衡好的QAE Sephadex A-50离子交换柱(1.6cm×20cm)。分别用0.05mol/L、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L NaCl溶液进行阶段洗脱,收集样品,冻干,进行小肽电泳检测,结果见附图6。
实施例6 Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp多肽的质谱分析
由中国药科大学完成。
方法为:电喷雾质谱。
给出的一组峰分子量都相差22,是加了不同个数的Na离子峰。如:m/z 4139是[M+Na]+,m/z 4161是[M+2Na-H]+,m/z 4183是[M+3Na-2H]+,等等。据此可以推算出Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽的分子量为4116.4Da,与理论推算值4115.95Da基本一致(附图7)。
实施例7 Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp多肽的小鼠口服葡萄糖耐量实验
ICR小鼠,雄性,6-8周,体重22~28g,按体重随机分4组,分别为空白对照组,Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp多肽低、中、高剂量三个给药组,每组7只,实验前适应实验室环境1-2周,实验前1晚禁食,仅给予饮水。
冻干的样品以pH7.0灭菌的磷酸盐缓冲溶液稀释至所需浓度;血糖仪与血糖 试纸购自北京怡成生物电子技术有限公司,小鼠胰岛素检测试剂盒购自瑞典Mercodia公司。
Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp多肽给药组皮下注射分别给予20μg/kg、80μg/kg、140μg/kg样品;空白对照组小鼠皮下给予等量磷酸盐缓冲液;各组小鼠分别于给药后灌胃2.0g/kg葡萄糖,并于葡萄糖负荷后0min、10min、20min、40min、60min、80min、100min、120min对小鼠进行尾静脉取血,血糖仪测定血糖浓度。Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp低、中、高剂量三个给药组降糖测定结果如图8所示,说明Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp降糖作用呈现剂量依赖性,两者与空白组相比具有显著的降血糖作用并不会引起低血糖。
实施例8 Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp多肽的促胰岛素分泌作用
ICR小鼠,雄性,6-8周,体重22~28g,实验前1晚禁食,仅给予饮水。Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp多肽给药组皮下注射分别给予20μg/kg、80μg/kg、140μg/kg样品;空白对照组小鼠皮下给予等量磷酸盐缓冲液;各组小鼠分别于皮下给药后灌胃2.0g/kg葡萄糖,20min后小鼠尾静脉取血100μl,快速吹入离心管中(预加20μl 0.1M EDTA),4℃ 4000r/min离心3min,取上清,保存于-20℃,小鼠胰岛素检测试剂盒测定胰岛素浓度。
空白对照组、Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp低、中、高剂量三个给药组促进胰岛素分泌的结果如图9所示,低、中、高剂量三个给药组与空白组相比,促进胰岛素分泌作用具有极显著差异(P<0.001),说明Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp具有较好的促胰岛素分泌作用。
除上述事实外,本发明还可以有其他实施方式,凡采用等同替换或等效变换性的技术方案,均落于本发明要求的保护范围。
Claims (9)
1.一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp,其中Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的氨基酸序列为:
Pro-Pro-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Asp(SEQ ID NO:1)。
2.根据权利要求1所述的Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp,其特征在于,它包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp,其特征在于:该类似物分子量为4116.4Da,Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp N端添加的2个脯氨酸(Pro)可以与融合伙伴的C端天冬氨酸(Asp)形成酸水解位点,在盐酸作用下可以断开;Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的C端截掉Exendin-436-39位氨基酸的Pro-Pro-Pro-Ser刚性结构,并添加一个Asp,形成的Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp类似物表达量较高且依然能保持显著的生物活性,能够有效降低血糖而不引起低血糖,并且具有促进胰岛β细胞分泌胰岛素的能力。
4.一种载体,其特征在于:它含权利要求2所述的核苷酸序列及权利要求3所述的重组方法:将Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp基因与本实验室构建的5#载体上的融合伙伴的DNA片段连接,构成新的融合蛋白基因。该融合蛋白基因位于5#载体T7启动子的下游。这个重组的融合表达质粒称5#-Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp。
5.一种基因工程菌,其特征在于:含有权利要求4所述的载体。
6.包括权利要求4所述的该类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的重组方法,其特征在于:该融合伙伴与活性多肽之间以Asp-Pro-Pro-连接,这种连接对酸敏感。
7.一种Exendin-4(1-35肽)类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的制备方法,其特征在于,该方法包含步骤:
(I)在适合的表达条件下,权利要求5所述的宿主菌。
(II)通过溶菌,洗涤,乙醇沉淀等方法,分离出Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp与融合伙伴C末端组成的融合蛋白;用酸水解方法切割融合蛋白,形成权利要求1所示的Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的氨基酸序列。
(III)通过QAE-Sehadex A-50分离出Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于:所述的步骤(III)中的Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽进入体内后,被体内丰富的二肽基肽酶IV及PPCE酶迅速切掉Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp N端的Pro-Pro-,形成Exendin-4(1-35)-Asp,这对于研制抗二肽基肽酶IV降解的长效激素是有益的。
9.根据权利要求1所述的Exendin-4类似物的活性,其特征在于:所述的Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp依然具有以葡萄糖浓度依赖方式降低血糖而不引起低血糖,促进胰腺胰岛β细胞分泌胰岛素作用,且作用效果显著,有望用于治疗二型糖尿病。
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