CN105254763A

CN105254763A - 一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN105254763A
Application number: CN201510374340.5A
Authority: CN
Inventors: 张仁怀; 孙朝国; 潘仲; 李鹏飞
Original assignee: Chengdu Jinxinheng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chengdu Jinxinheng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2015-06-30
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2035-06-30
Also published as: CN105254763B

Abstract

本发明涉及一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其多肽区包括人血清蛋白和促胰岛素分泌素，所述促胰岛素分泌素以单体或者多个单体的形式通过连接肽与人血清白蛋白串联在一起，所述促胰岛素分泌素的氨基端和/或羧基端通过连接肽与人血清白蛋白羧基端和/或氨基端相连，所述编码连接肽的氨基酸序列的数目与编码促胰岛素分泌素的氨基酸序列的数目相等。本发明所述的重组促胰岛素分泌素融合蛋白具有药效好、半衰期长、简便、高效、安全，具有很好的应用前景等优点。

Description

一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种重组融合蛋白的制备工艺，尤其涉及一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白、制备方法及其应用，该重组促胰岛素分泌素融合蛋白为促胰岛素分泌素与人血清白蛋白的融合蛋白，该重组促胰岛素分泌素融合蛋白作为糖尿病和肥胖症的长效药物。

背景技术

促胰岛素分泌素(英文名称为Exendin-4)是从南美大毒蜥Gilamonster(Helodermasuspectum)口腔分泌物中分离出的一种含有39个氨基酸的多肽(Eng，J.等，J.Biol.Chem.，265：20259-62，1990；Eng，J.等，J.Biol.Chem.，267：7402-05，1992)。其氨基酸序列与类胰高血糖素(glucagon-likepeptide，GLP-1)有53％的同源性(Coke等，J.Biol.Chem.，268：19650-55，1993)。Chen和Drucker克隆了该基因，并得出它是不同于胰高血糖素基因(GLP-1是由胰高血糖素原加工而成)的另外一个基因的表达产物(J.Biol.Chem.，272：4108-15，1997)。

GLP作为胰高血糖素基因的产物，表达于胰岛α细胞和肠道粘膜L细胞。翻译产物胰高血糖素原通过翻译后蛋白加工形成多个活性肽，N端为胰高血糖素，从C端分切成GLP-1和GLP-2，二者与胰高血糖素序列50％同源(DruckerD.J.，Diabetes，1998，47：159)。GLP-1含有30个氨基酸，葡萄糖和脂肪可刺激其释放。GLP-1具有促胰岛素分泌作用，刺激胰腺β细胞分泌胰岛素。GLP-1抑制胰腺α细胞分泌胰高血糖素。GLP-1还可以抑制胃排空(Wettergren等，Dig.Dis.Sci.，1993，38(4)：655-73)，抑制胰高血糖素分泌(Creutzfeldt等，DiabetesCare，1996，19(6)：580-6)，GLP-1有食欲控制作用(Turton等，Nature，1996，379(6560)：69-72)，还有报道GLP-1可恢复老年大鼠胰岛细胞对葡萄糖的敏感性，使其葡萄糖的耐受性恢复到年轻大鼠的水平(Egan等，Diabetologia，1997，40(增刊1)：A130)。

GLP-1的半衰期仅数分钟，可被二肽基肽酶IV(dipeptidylpeptidaseIV，DPP-IV)快速降解，去除N端二肽，从而失去促胰岛素分泌的活性，DPP-IV分布广泛，在调控GLP-1活性中发挥重要作用(Kieffer等，Endocrinology，1995，136：3585)。GLP-1的体内生物作用时间短是其特征之一，这妨碍它开发为治疗药物。

Exendin-4的羧基端(即C端)含有GLP-1所没有的9个氨基酸，不容易被肽链内切酶降解；与GLP-1的氨基端(即N端)序列(His-Ala-Glu)不同，Exendin-4的N端倒数第2个氨基酸是甘氨酸(His-Gly-Glu)，不被二肽基肽酶IV分解，对DPP-IV的清除有抵抗作用，故血浆半衰期更长，具有良好的临床应用前景，是一种更有效而作用时间更长的GLP-1受体激动剂。

药理学研究证实了Exendin-4和GLP-1之间的相似与不同。据报道Exendin-4作用于分泌胰岛素的β-TC1细胞上的GLP-1受体，豚鼠胰腺分散的腺泡细胞和胃壁细胞。还报道所述肽刺激促生长素抑制素的释放和抑制立体胃中的胃泌素释放(Goke等，J.Biol.Chem.，1993，268：19650-55；Schepp等，Eur.J.Pharmacol.，1994，69：183-91；Eissele等，LifeSci.，1994，55：629-34)。报道发现Exendin-3和Exendin-4刺激胰腺腺泡细胞产生cAMP和释放淀粉酶(Malhotra，R.等，RegulatoryPeptides，41：149-56，1992；Raufman等，J.Biol.Chem.267：21432-37，1992；Sing等，Regul.Pept.53：47-59，1994)。Exendin-4的作用时间较GLP-1明显延长。例如在一个实验中，据报道Exendin-4降低糖尿病小鼠葡萄糖的作用持续数小时，而且根据计量最长长达24小时(Eng.J.，Diabetes，1996，45(增刊2)：152A)。根据Exendin-3和Exendin-4的促胰岛素活性，提出将其用于治疗糖尿病以及防止高血糖(Eng，美国专利号5,424,286)，该专利公开了Exendin-4与GLP-1促胰岛素分泌的对比实验，与GLP-1相比，产生促胰岛素分泌作用所需的Exendin-4浓度更低，而且Exendin-4在人体内的半衰期更长。大量动物模型实验显示，Exendin-4表现出了与GLP-1类似的抗糖尿病药的作用。

Exendin-4作为GLP-1类似物，能够模拟人体内天然的胃肠激素促进胰岛素分泌及调控血糖等，在多种动物模型中表现出了与GLP-1类似的抗糖尿病药的作用。其作用主要包括：(1)显著增加葡萄糖依赖性促胰岛素分泌，Exendin-4在血糖水平正常或低血糖时并不刺激胰岛素的分泌，仅在血糖水平较高时刺激胰岛素分泌；(2)抑制2型糖尿病患者胰高血糖素的分泌，在高血糖时降低血清中胰高血糖素浓度，但不减弱正常胰高血糖素对低血糖的反应；(3)刺激胰岛β细胞增生或胚胎胰岛素分泌细胞分化成熟，抑制胰岛β细胞凋亡从而增加胰岛β细胞的数量；(4)抑制餐后胃肠动力及分泌功能，延迟胃排空从而有利于餐后血糖的控制；(5)降低食欲，减少食物的摄入。与同类药物相比，它除了疗效确切、副作用更低外，还有目前市场上其它糖尿病治疗药物所不具备的两大优势：不产生低血糖和有减肥效果。

与现有的降糖药相比，促胰岛素分泌素最大的优势在于其独特的作用机制，它可以在高血糖时刺激胰岛素的分泌，而低血糖时不刺激胰岛素的分泌，这样就有效防止了低血糖的发生，大大提高了用药的安全性，减少了胰岛素的用量，有效改善了患者的生活质量及用药危险性。

多肽类药物由于受体内蛋白酶降解和肾脏快速清除作用，体内半衰期较短，用药周期短。虽然Exendin-4相比于GLP-1在体内具有更长的半衰期，但临床上仍需要每天注射两针，给病患带来极大的不便和痛苦。因此，开发长效的Exendin-4制剂，就具有十分重要的意义。

白蛋白(又称清蛋白，albumin，Alb)系由肝实质细胞合成，在血浆中的半衰期约为15-19天，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40％-60％。它的主要作用是扩充血容量和维持血浆的渗透压。人血清白蛋白(简称HSA)是一种含有585个氨基酸的单链无糖基化的蛋白质，分子量Mr为66000～69000道尔顿，等电点pI4.7～4.9。HSA本身就是许多内源因子和外源药物的载体，药物和血清白蛋白结合后，可以减少其生物利用度同时增加在体内的半衰期(Lucas等JAmChemSoc，2004，126(43)：14258-14266.)。大多数治疗用的蛋白和多肽半衰期一般较短，而HSA有将近长达19天(PetesTP.AllAboutAlbumin.SanDiego：AcademicPress，1996.)的血清半衰期，并且HSA的基因在毕赤酵母中可以高效分泌表达(ChuangVT等，PharmRes，2002，19(5)：569-577)，上清液杂质含量较少，纯化方便，因此将蛋白质药物基因与HSA基因融合，在毕赤酵母或酿酒酵母中表达，获得HSA的融合蛋白，延长蛋白质药物的半衰期。

美国马里兰州人类基因组科学(HGS)公司已经进行一系列与HSA融合延长蛋白质药物半衰期的研究，其蛋白质药物HSA/IFN-α融合蛋白(Albuferon-α)研究结果表明，Albuferon-α平均半衰期148小时，比PEG化干扰素Pegasys平均半衰期80小时(50-140小时)和PEGIntron平均半衰期40小时(22-60小时)更长。它有很好的抗病毒活性，安全性和耐受性。病人用药后产生对HSA抗体为1.7％，但未用药者存在HSA抗体达3.4％，并且在抗体产生副反应，抗病毒反应和药代动力学之间没有明显的相关性(OsbornBL等，JPharmacolExpTher，2002，303(2)：540-548；HumanGenomeSciencesReportsPositiveResultsofPhase1/2ClinicalTrialofAlbuferoninChronicHepatitisC.HGSIPress，2004，Nov.2；HumanGenomeSciencesReportsPositiveResultsofPhase2ClinicalTrialofAlbuferoninTreatmentNaivePatientswithChronicHepatitisC.HGSIPress，2005，Apr.14)。

天然肠激酶(英文名称为Enterokinase)由一条结构亚基(重链)和一条催化弧基(轻链)构成，肠激酶在体内激活胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶。由于肠激酶的轻链结构在人、牛和猪中保守，其识别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎动物中也有很强的保守性，且几乎所有被定序的胰蛋白酶原都具有4个天冬酰胺相连的特征，此序列在其他的天然蛋白质上又非常罕见，而肠激酶的活性中心有一个特殊的阳离子位点，使得有强大负电的Asp-sp-Asp-Asp-Lys可以与此阳离子位点结合。因此，牛肠激酶的底物酶切位点序列具有高度的特异性。这种特点使得天然肠激酶成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中一个极其有用的工具而被广泛应用。

公开号为CN101240033A的发明专利(发明名称为一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法，申请号为200810018639.7)公开了一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白，该融合蛋白由两个串联的促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的N端或C端直接相连而成，不加任何连接肽。该融合蛋白中，由于没有连接肽，促胰岛素分泌肽之间，以及促胰岛素分泌肽与白蛋白之间可能会产生位阻效应，从而一方面影响促胰岛素分泌肽的空间结构，进而影响其功能，另一方面，连接区域可能形成新的抗原决定簇，增加融合蛋白的免疫原性。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，在该融合蛋白中，两个促胰岛素分泌素(Exendin-4)分别位于人血清白蛋白(HSA)的两端，便于各自发挥对受体的结合作用；同时，在促胰岛素分泌素(Exendin-4)与人血清白蛋白(HSA)之间引入连接肽，增加促胰岛素分泌素的空间绕性，既避免了空间位阻效应，又有效防止了免疫原性的产生。同时，通过将Exendin-4多肽与HSA形成融合蛋白来延长其体内半衰期，从而大大减少每个治疗周期的药物注射次数。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其多肽区包括促胰岛素分泌素和人血清白蛋白，所述促胰岛素分泌素以单体或者多个单体的形式通过连接肽与人血清白蛋白串联在一起，所述促胰岛素分泌素序列的氨基端和/或羧基端通过连接肽与人血清白蛋白羧基端和/或氨基端相连，所述编码连接肽的氨基酸序列的数目与编码促胰岛素分泌素的氨基酸序列的数目相等。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种用于治疗糖尿病的重组促胰岛素分泌素融合蛋白，将促胰岛素分泌素(Exendin-4)与人血清白蛋白(简称HSA)由一段连接肽相连，促胰岛素分泌素可位于人血清白蛋白的氨基端或羧基端，所述促胰岛素分泌素也可同时位于人血清白蛋白的氨基端和羧基端，促胰岛素分泌素可以以单体或者多个(至两个以上包括两个)单体串联形式存在于融合蛋白中，连接肽由免疫学上是惰性的氨基酸组成，且可增加相连的两个肽链的绕性。本发明所述的重组促胰岛素分泌素融合蛋白具有药效好、半衰期长、简便、高效、安全，具有很好的应用前景等优点。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述促胰岛素分泌素包含SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。

进一步，所述人血清白蛋白包含SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。

进一步，所述连接肽包含SEQIDNO：3所示的氨基酸序列。

进一步，所述促胰岛素分泌素以单体的形式通过连接肽与人血清白蛋白串联在一起，所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白的通式为H-L-E，其中，H代表编码人血清白蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列，L代表编码连接肽的核苷酸序列或氨基酸序列序列，E代表编码促胰岛素分泌素的核苷酸序列或氨基酸序列，所述通式代表的氨基酸序列包含SEQIDNO：5所示的氨基酸序列、衍生序列、同源序列或近似序列。

该重组促胰岛素分泌素融合蛋白包含SEQIDNO：5所示氨基酸序列的多肽，或其片段、同源物、类似物或衍生物。在优选的实施方案中，重组促胰岛素分泌素融合蛋白由SEQIDNO：5所示氨基酸序列构成。

进一步，所述通式H-L-E代表的核苷酸序列包含SEQIDNO：6所示的核苷酸序列、衍生序列、同源序列或近似序列。

本发明还提供了一种编码重组促胰岛素分泌素融合蛋白的多核苷酸分子，其特征在于它是编码与SEQIDNO：5相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。

优选地，本发明的多核苷酸分子包含SEQIDNO：6所示的核苷酸序列、衍生序列、同源序列或近似序列；更优选地，本发明所述的多核苷酸分子是SEQIDNO：6所示的核苷酸序列。

进一步，所述编码促胰岛素分泌素的核苷酸序列或氨基酸序列、所述编码连接肽的核苷酸序列或氨基酸序列的数目均为两个，所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白的通式为E-L-H-L-E，其中，H代表编码人血清白蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列，L代表编码连接肽的核苷酸序列或氨基酸序列，E代表编码促胰岛素分泌素的核苷酸序列或氨基酸序列，所述通式代表的氨基酸序列包含SEQIDNO：9所示的氨基酸序列、衍生序列、同源序列或近似序列。

该重组促胰岛素分泌素融合蛋白是包含SEQIDNO：9所示氨基酸序列的多肽，或其片段、同源物、类似物或衍生物。在优选的实施方案中，重组促胰岛素分泌素融合蛋白由SEQIDNO：9所示氨基酸序列构成。

进一步，所述通式E-L-H-L-E代表的核苷酸序列包含SEQIDNO：10所示的核苷酸序列、衍生序列、同源序列或近似序列。

本发明提供了一种编码重组促胰岛素分泌素融合蛋白的多核苷酸分子，其特征在于它是编码与SEQIDNO：9相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。

优选地，本发明的多核苷酸分子包含SEQIDNO：10所示的核苷酸序列、衍生序列、同源序列或近似序列；更优选地，本发明的多核苷酸分子是SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。

进一步，所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列还包括标签序列和酶切位点序列连接而成的核苷酸序列或氨基酸序列。

进一步，所述标签序列和酶切位点序列连接而成的核苷酸序列或氨基酸序列的通式为Histag-EK，其中，Histag代表Histag标签序列，EK代表被天然肠激酶识别的序列，所述通式Histag-EK代表的氨基酸序列包含SEQIDNO：4所示的序列。

采取上述进一步方案的有益效果是：在构建设计时，发明人意外的发现在重组促胰岛素分泌素融合蛋白的序列之前加上亲和纯化标签His-tag以及除掉His-tag的天然肠激酶的切割位点，采用亲和层析技术，可以简化纯化工艺，提高收率，降低杂质含量，提高最终产品品质。而现有的关于Exendin-4融合蛋白文献中未见采用这种方式的报道。发明人又更一步的通过设计天然肠激酶的切割位点序列来达到最佳的酶切效果。

进一步，所述编码促胰岛素分泌素的核苷酸序列或氨基酸序列、所述编码连接肽的核苷酸序列或氨基酸序列的数目均为一个，所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白的通式为Histag-EK-H-L-E，其中，H代表编码人血清白蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列，L代表编码连接肽的核苷酸序列或氨基酸序列，E代表编码促胰岛素分泌素的核苷酸序列或氨基酸序列，所述通式代表的氨基酸序列包含SEQIDNO：7所示的序列。

进一步，所述通式Histag-EK-H-L-E代表的核苷酸序列包含SEQIDNO：8所示的核苷酸序列。

进一步，所述编码促胰岛素分泌素的核苷酸序列或氨基酸序列、所述编码连接肽的核苷酸序列或氨基酸序列的数目均为两个，所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白的通式为Histag-EK-E-L-H-L-E，其中，H代表编码人血清白蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列，L代表编码连接肽的核苷酸序列或氨基酸序列，E代表编码促胰岛素分泌素核苷酸序列或氨基酸序列，所述通式代表的氨基酸序列包含SEQIDNO：11所示的序列。

进一步，所述通式Histag-EK-E-L-H-L-E代表的核苷酸序列包含SEQIDNO：12所示的核苷酸序列。

本发明中提到的重组促胰岛素分泌素融合蛋白的“同源性”蛋白是指，蛋白本来具有重组促胰岛素分泌素融合蛋白的氨基酸序列，但其中一个或多个氨基酸残基已被不同的氨基酸残基保守地取代，并且所得到的蛋白可用于实施本发明。保守氨基酸取代是本领域已知的。造成这样的取代的规则包含由Dayhof，M.D.(1978，国家生物医学研究基金，Washington，D.C.，第5卷，增刊3)等所述的取代规则。更具体地说，保守氨基酸取代发生在与其酸性、极性或侧链大小相关联的氨基酸家族内。一般可将遗传编码的氨基酸分为四组：(1)酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电的极性氨基酸：甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同分类为芳香氨基酸。任何特定组内的一个或多个取代，例如用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、或用谷氨酸取代天冬氨酸、或用丝氨酸取代苏氨酸，或任何其他氨基酸残基结构上相关的氨基酸残基，例如有相似酸性、极性、侧链大小的，或在其某些组合方面有相似性的氨基酸残基取代，一般对蛋白的功能或免疫原性不会有太大影响。

在本发明中，“SEQIDNO：5所示氨基酸序列的类似物”、“SEQIDNO：9所示氨基酸序列的类似物”被定义为，与SEQIDNO：5或SEQIDNO：9相比较，具有一个或几个氨基酸取代、删除、转换或增加的分子。“SEQIDNO：5所示氨基酸序列的衍生物”、“SEQIDNO：9所示氨基酸序列的衍生物”被定义为如下一种分子，它具有SEQIDNO：5或SEQIDNO：9类似物氨基酸序列，但是另外还具有化学修饰的一个或几个氨基酸侧链基团，α-碳原子，末端氨基，或者末端羧酸基。化学修饰包括增加部分化学结构，生成新键，和除去部分化学结构。对氨基酸侧链基团的修饰包括赖氨酸ε-氨基的酰基化，精氨酸，组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化，以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰氨基。末端氨基的修饰包括脱氨基，N-低级烷基修饰，N-二低级烷基修饰和N-酰基修饰。对末端羧基的修饰包括酰胺修饰，低级烷基酰胺修饰，二烷基酰胺修饰和低级烷基酯修饰。低级烷基是C₁-C₄烷基。并且，还可以用蛋白质化学的普通技术人员熟知的保护基，保护一个或几个侧链基团或末端基团。还可以使氨基酸的α-碳原子单甲基化或二甲基化。

本发明所用的术语“多核苷酸分子”是指单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。

生产和操作本文公开的多核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的重组技术完成(参见Maniatis等，1989，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，分子生物学当前技术，GreenePublishingAssociates&WileyInterscience，NY)。

本发明提供了包含编码重组促胰岛素分泌素融合蛋白的一种多核苷酸分子，在进一步的优选实施方案中，本发明的编码重组促胰岛素分泌素融合蛋白的多核苷酸分子包含选自下列成员的核苷酸序列：(1)包含SEQIDNO：6和10的核苷酸序列；(2)与SEQIDNO：6和SEQIDNO：10所示核苷酸序列至少70％相同、优选至少80％相同、更优选至少90％相同、最优选至少95％相同的核苷酸序列；(3)在中等严谨杂交条件下、优选高度严谨杂交条件下与具有SEQIDNO：6和SEQIDNO：10或其互补序列的多核苷酸分子能杂交的核苷酸序列(参见Ausubel等(编)，1989，分子生物学当前技术，第1卷，GreenPublishingAssocintes，Inc.，andJohnWiley&Sons，Inc.，NY，P.2.10.3)；或者(4)与SEQIDNO：5和SEQIDNO：9编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列。

进一步，上述核苷酸序列插入在表达载体和/或细胞宿主系统。

本发明提供含有编码本发明多核苷酸的重组表达载体、由该重组表达载体转化的宿主细胞，以及由该宿主细胞所衍生的新的株系或细胞系。在一优选实施方案中，本发明提供一种包含本发明多核苷酸分子的重组真核表达载体pHE，以及含有该重组表达载体的遗传工程宿主细胞PP-HE；在另一优选实施方案中，本发明提供一种包含本发明多核苷酸分子的重组真核表达载体pEHE，以及含有该重组表达载体的遗传工程宿主细胞PP-EHE。

可用于表达本发明的重组促胰岛素分泌素融合蛋白的各种表达载体是本领域已知的，其中包括含有特定编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA和粘粒DNA表达载体。可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型原核表达载体质粒包括pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(BioradLaboratories，Richmond，CA)、pPL和pKK223(Pharmacia，Piscataway，NJ)、pQE50(Qiagen，Chatsworth，CA)和pGEM-TEASY(Promega，Madison，WI)等。可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型真核表达载体包括蜕皮激素诱导型哺乳动物表达系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)、基于巨细胞病毒启动子-增强子的系统(Promega，Madison，WI；Stratagene，LaJolla，CA；Invitrogen)，和基于杆状病毒的表达系统(Promega)等。

可用于实施本发明的宿主细胞可以是真核或原核细胞。这样的宿主细胞包括但不只限于微生物，例如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA载体转化的细菌，或者用重组载体转化的酵母，或者是动物细胞，如用重组病毒载体如杆状病毒感染的昆虫细胞，或用重组病毒载体如腺病毒或痘苗病毒感染的哺乳动物细胞等。例如，可使用大肠杆菌菌株，如DH5α菌株。真核宿主细胞包括酵母细胞，但也可有效地利用小鼠、仓鼠、牛、猴或人细胞系等哺乳动物细胞。可用于表达本发明的重组蛋白质的真核宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NIH/3T3等。

在本发明的一个优选的实施例中，重组促胰岛素分泌素融合蛋白表达基因克隆到酵母表达载体pPICZαA中，转化巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)X33细胞，进行融合蛋白的高效表达。

本发明还提供了一种上述重组促胰岛素分泌素融合蛋白制备方法，包括所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白工程菌构建、发酵、所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白分离纯化、鉴定。

本发明进一步提供制备重组促胰岛素分泌素融合蛋白的方法，其包括在适于该融合蛋白的条件下培养用重组表达载体转化的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收和纯化该重组融合蛋白的步骤。在一个优选的实施方案中，宿主细胞经细胞培养、离心后，上清液分别经亲和层析、肠激酶酶切、亲和层析和离子交换层析纯化，其中优选的亲和层析为镍离子螯合亲和层析(ImmobilizedMetal-chelatingAffinityChromatography，IMAC)，优选的离子交换为CM-SepharoseFF。

进一步，在基因构建设计时，在促胰岛素分泌素融合蛋白前加入亲和纯化标签His-tag，可以通过Ni²⁺鳌和亲和层析快速、简便、高效地纯化融合蛋白，大大提高了回收率。重组促胰岛素分泌素融合蛋白中的His-tag，又可以通过肠激酶切割来去除。采用本发明方案和工艺制备促胰岛素分泌素融合蛋白，具有快速、简便、高效的特点，产品回收率大于70％，同时杂质含量低，从而提高了产品品质。

本发明所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白在治疗糖尿病和肥胖症领域中具有广泛的应用。

本发明进一步提供含有本发明重组促胰岛素分泌素融合蛋白作为活性成分和药学上可接受载体的药物组合物，以及该药物组合物在制备治疗糖尿病的药物中的用途，所述的糖尿病包括一型和二型糖尿病。

含有本发明重组促胰岛素分泌素融合蛋白的药物组合物可用于多种治疗目的，本发明的药物组合物不仅用于治疗一型和二型糖尿病，还可以用于治疗肥胖症。

本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、静脉内给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的含有重组促胰岛素分泌素融合蛋白的药物组合物制成各种合适的剂型，其中包含至少一种有效剂量的本发明的重组促胰岛素分泌素融合蛋白和至少一种药学上可接受的药用载体。

适当剂型的实例为片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液和糖浆，用于皮肤表面的油膏和药贴、气雾胶、鼻喷剂以及可用于注射的无菌溶液等。

含有本发明所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白的药物组合物可以制成溶液(水剂)或者冻干粉末(粉剂)以用于胃肠外给药。冻干粉末在使用前可加入适当溶剂或其它可药用的载体将粉末重新配制。液体配方一般是缓冲液、等渗溶液和水溶液。

剂型中还可含有其它常规组分，如防腐剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲液、调节渗透压的盐、乳化剂、增甜剂、着色剂、调味剂等等。本发明药物组合物中使用的稳定剂优选柠檬酸钠、甘氨酸、甘露醇、神经节糖苷等。含有本发明药物组合物的注射水针或冻干粉针更优选的配方包括，重组促胰岛素分泌素融合蛋白5.0mg，NaCl4-6mg，磷酸盐3.02mg，甘氨酸5.0-20mg或甘露醇10-30mg，注射用水1.0mL。

若有特殊治疗要求，本发明的药物组合物还可包含其他活性药理成分，这种相伴使用有利于治疗。

本发明药物组合物中重组促胰岛素分泌素融合蛋白的用量可以在一个较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些已知的因素，诸如根据疾病的种类、病情严重程度、病人体重、剂型、给药途径等因素很容易的加以确定。

本发明中，对于名称“HE”和“EHE”指一般的描述，重组与否不用特别突出明示，就在名称前没有加“r”；当要着重强调重组时或描述的就是重组蛋白时，就加r，即名称分别为“rHE”、“rEHE”。

附图说明

图1为PP-EHE表达上清SDS-PAGE电泳图。

图2为SDS-PAGE检测融合蛋白rEHE表达和纯化结果。泳道1，发酵上清液；泳道2，第一次镍离子螯合亲和层析样品；泳道3，第二次镍离子螯合亲和层析样品；泳道4，阴离子交换柱层析样品。

图3为rEHE免疫印迹结果。

图4为rHE及rEHE的药效学试验结果。

图5为rHE及rEHE的药代动力学试验结果。

具体实施方式

以下将以巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)作为宿主的例子，通过具体实施例的方式，对本发明进行举例说明，但应当理解这些实施例不以任何形式限制本发明范围。

实施例1、表达重组促胰岛素分泌素融合蛋白的工程菌株PP-HE的构建

1、序列的来源及设计

将促胰岛素分泌素通过连接肽与人血清白蛋白C端相连，其融合蛋白的结构式如下：人血清白蛋白-连接肽-促胰岛素分泌素(简写为H-L-E，其中，H代表编码人血清白蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列，L代表编码连接肽的核苷酸序列或氨基酸序列，E代表编码促胰岛素分泌素的核苷酸序列或氨基酸序列)，将重组促胰岛素分泌素融合蛋白称为人血清白蛋白-促胰岛素分泌素融合蛋白(简称HSA-Ex4，或HE)，通过DNA重组技术产生的该融合蛋白称为重组人血清白蛋白-促胰岛素分泌素融合蛋白(简称rHSA-Ex4，或rHE)，其氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。

为了便于纯化，在目的蛋白HE前加上His-tag标签和肠激酶酶切位点，得到的表达蛋白的结构为为：Histag-EK-HSA-L-E，其氨基酸序列如SEQIDNO：7所示。其中，E所代表的序列为促胰岛素分泌素氨基酸序列，与文献(Eng，J.等，J.Biol.Chem.，267：7402-05，1992)一致，如SEQIDNO：1所示；HAS代表的序列为人血清白蛋白序列，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，其序列与NCBI序列(AY728024，Homosapiensserumalbuminprecursor，mRNA，completecds)完全一致；L代表的序列为连接肽的序列，由甘氨酸、丝氨酸组成，含16个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；Histag代表His-tag标签序列，EK代表被天然肠激酶识别的酶切位点，Histag-EK所代表的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。该融合蛋白在酵母细胞中表达后，借助酵母菌α因子信号肽分泌到胞外，再通过亲和层析，经天然肠激酶酶切，得到重组促胰岛素分泌素融合蛋白rHE，其氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。

2、DNA合成

根据酵母菌密码子的偏爱性，设计编码Histag-EK-HSA-L-E的DNA序列，如SEQIDNO：8所示。全人工合成表达序列SEQIDNO：8，委托上海生工生物工程公司合成，为了便于克隆操作，序列合成时，在上游引入EcoRI酶切位点，下游引物中引入KpnI酶切位点。

合成序列克隆到载体pUC57中，命名为pUC57-HE，测序结果与设计序列完全一致。

3、重组质粒pHE的构建

本发明中分子克隆的方法除有特别说明外，均参见文献(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002)。DNA操作中所使用的质粒DNA提取试剂盒、高纯度质粒小提中量试剂盒、感受态细胞E.coliDH5α、TOP10均购自天根生化科技(北京)有限公司；PCR纯化试剂盒(QIAquickPCRPurificationKit)、DNA连接试剂盒(DNALigationKit)、DNA片段凝胶回收试剂盒(QIAquickGelExtractionKit)均购自QIAGEN公司，限制性内切酶均购自NEBBioLabs公司，表达载体pPICXαA购自Invitrogen公司。试剂盒的使用方法及限制性内切酶的酶切条件等参考相应的产品说明书。全基因合成委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行，测序委托宝生物工程(大连)有限公司进行。

用EcoRI/KpnI对pUC57-HE进行酶切，回收1.9kb大小的目的片段，与经过EcoRI/KpnI酶切后回收的pPICZαA质粒连接。连接产物转化E.coliTOP10感受态细胞，用添加zeocin抗生素的低盐LB(1％Tryptone，0.5％YeastExtract，0.5％NaCl，pH7.5)平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆提取质粒后进行PCR鉴定，并送宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。鉴定正确后将序列正确的重组子命名为pHE。

4、毕赤酵母的转化及工程菌的筛选

本发明中关于毕赤酵母的培养、转化、筛选、诱导表达等方法，以及所用培养基配方除有特别说明外，均参见毕赤酵母表达试剂盒说明书(InvitrogenLifeTechnologies，EasySelectTMPichiaExpressionKit，AManualofMethodsforExpressionofRecombinantProteinsUsingpPICZandpPICZαinPichiapastoris，VersionG)。

将测序正确的重组子菌株进行培养，用高纯度质粒提取试剂盒提取质粒pHE，用SacI酶切pHE，使其线性化。用线性化pHE转化巴斯德毕赤酵母X-33。从平板上挑取10个转化子进行诱导表达实验，通过电泳结果，选取表达最高的株菌，并用PCR方法对其进行鉴定，保存鉴定合格的工程菌株。pHE转化巴斯德毕赤酵母X-33得到的工程菌命名为PP-HE。

实施例2表达重组促胰岛素分泌素融合蛋白的工程菌株PP-PP-EHE的构建

促胰岛素分泌素-人血清白蛋白-促胰岛素分泌素融合蛋白(EHE)是在HSA的N端和C端通过连接肽各接一个Exendin-4，其氨基酸序列如SEQIDNO：9所示，其DNA序列如SEQIDNO：10所示。

如上所述，为了便于纯化，在目的蛋白EHE前加上His-tag标签和天然肠激酶酶切位点，得到的表达蛋白结构为：Histag-EK-E-L-HSA-L-E，如SEQIDNO：11所示。根据酵母菌密码子的偏爱性，设计编码Histag-EK-E-L-HSA-L-E的DNA序列，如SEQIDNO：12所示。

采用实施例1所述方法，构建得到EHE表达菌株PP-EHE。

实施例3、工程菌的发酵

本实施例以表达菌株PP-EHE为例进行具体说明。

一级种子培养：将菌株PP-EHE接种于50mLYPD培养基(中文名称为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)中，250rpm，30℃培养20小时左右。

二级种子培养：按体积分数1％的接种量将一级种子菌培养液接种于200mLBMGY培养基(为本领域常用的培养基，按照常规方法配制)中，250rpm，30℃培养20小时左右。

发酵培养：于5L发酵罐中加入3.5LFM22培养基(含有42.9g/LKH₂PO₄，5g/L(NH₄)₂SO₄，1.0g/LCaSO₄·2H₂O，14.3g/LK₂SO₄，11.7g/LMgSO₄·7H₂O，40g/L甘油，培养基的pH为5.3)，高压灭菌后加入200mL二级种子菌和3.5mL名称为PMT4溶液的微量元素溶液(含有2.0g/LCuSO₄·5H₂O，0.08g/LNaI，3.0g/LMnSO₄·H₂O，0.2g/LNa₂MoO₄·2H₂O，0.02g/LH₃BO₃，0.5g/LCaSO₄·2H₂O，0.5g/LCoCl₂，7g/LZnCl₂，22g/LFeSO₄·7H₂O，2g/L生物素Biotin，1mL/L浓H₂SO₄)。发酵条件采用自动控制，其参数为：pH为5.3，培养温度为30℃，溶氧控制在20％。当培养至大约20小时后，培养系统的甘油消耗殆尽，溶氧与pH均迅速上升，此时开始补料(每1000mL补料中含有质量分数为50％的甘油和6mLPMT4溶液)，至菌体浓度达到OD₆₀₀＝150左右。将终浓度为1％(体积分数)的甲醇，每隔12小时补加一次，共诱导96小时，诱导结束时OD₆₀₀为430。补料方式采用反馈补料法，根据溶氧、pH值的变化补加适量营养。

发酵结束，取发酵上清进行电泳检测，电泳结果表明，重组促胰岛素分泌素融合蛋白占所有分泌蛋白的65％(质量百分数)(见图1标注的“表达产物”)。蛋白含量测定结果表明，目标蛋白即重组促胰岛素分泌素融合蛋白(即重组的Histag-EK-E-L-HSA-L-E)表达量约1000mg/L发酵液。

菌株PP-EHE和菌株PP-HE的发酵方法相同。

实施例4融合蛋白的纯化

本实施例以菌株PP-EHE表达的rEHE为例进行详细说明。

将发酵液在4℃条件下，以5000rpm离心10分钟，取上清液，用于层析。

1.第一次镍离子螯合亲和层析

将发酵上清液上于用缓冲液A(含有20mMTris-HCl和500mMNaCl，pH为8.0)平衡的镍离子螯合亲和层析(ChelatingSepharoseFastFlow，GEHealthcare)柱，缓冲液A充分洗涤后，用缓冲液B(含有20mMTris和200mM咪唑，pH为8.0)洗脱，收集洗脱峰，得到融合蛋白样品。

2.重组促胰岛素分泌素融合蛋白的酶切

用天然肠激酶酶切割，除去表达的重组促胰岛素分泌素融合蛋白的His-tag标签。配制酶切反应液，其组成如下：1mg/mL重组促胰岛素分泌素融合蛋白，50mMTris-HCl(pH为8.0)，1mMCaCl₂，天然肠激酶(按1U天然肠激酶酶切割5mg重组促胰岛素分泌素融合蛋白的比例加入天然肠激酶)。25℃酶切20小时。

3.第二次镍离子螯合亲和层析

将步骤2酶切后蛋白溶液上样于用缓冲液C(含有20mMTris-HCl，pH为8.0)平衡的镍离子螯合亲和层析柱。用缓冲液C洗涤，收集穿透液，得到rEHE蛋白样品。

4.阴离子交换柱层析

将上述rEHE蛋白样品上于经缓冲液C平衡的QSepharoseFastFlow(GEHealthcare)层析柱，缓冲液C充分洗涤后，用体积分数100％C到100％D(缓冲液D含有20mMTris-HCl和1MNaCl，pH为8.0)梯度洗脱，得到纯度大于99％的rEHE蛋白。

各层析步骤得到的样品，用质量体积比10％SDS-PAGE电泳检测，结果见图2，说明已获得了纯化后的rEHE。

菌株PP-EHE表达的rHE的纯化过程与菌株PP-EHE表达的rEHE的纯化过程一致。

实施例5rHE及rEHE融合蛋白的检定

1、SDS-PAGE纯度及分子量分析

纯化得到的rHE及rEHE融合蛋白纯品采用胶浓度为10％的SDS-PAGE进行电泳(郭尧君，蛋白质电泳实验技术，科学出版社，1999)，用Bio-RadGelDoc2000凝胶成像系统扫描测定，融合蛋白纯度大于98％，符合《中国药典》的要求。

2、N末端和C末端氨基酸序列分析

采用Edman降解法测定，rHE的N末端的15个氨基酸序列为：DAHKSEVAHRFKDLG，rEHE的N末端15个氨基酸序列为：HGEGTFTSDLSKQME。N-末端氨基酸序列分析结果与理论序列完全相同，说明已经制备的rHE及rEHE一级结构是正确的。

3、免疫印迹分析

对照品Exendin-4购自Bachem公司，兔抗重组促胰岛素分泌素多克隆抗体(简称兔抗Exendin-4多克隆抗体，购自艾博抗(上海)贸易有限公司)，AP-羊抗兔IgG(中文名称为碱性磷酸酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G)、NBT/BCIP(为NBT和BCIP预混溶液，其中NBT的中文名称为氯化硝基四氮唑兰，BCIP的中文名称为5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐)等购自Sigma公司。rEHE样品经胶浓度为10％的SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜(中文名称为聚偏氟乙烯膜)上，室温下5％(质量/体积比)脱脂奶粉封闭2小时，与兔抗Exendin-4多克隆抗体与按体积比1∶500加样，温育1.5小时，再与AP-羊抗兔IgG(按体积比1∶1000加样)，温育1小时，NBT/BCIP显色。rEHE免疫印迹结果阳性(见图3中的条带1处的目的蛋白)。

4、活性测定

rHE及rEHE活性测定方法与Exendin-4相同。Exendin-4特异性的与肺膜及胰岛瘤细胞的GLP-1受体相互作用；与GLP-1一样，在分离的大鼠胰岛和小鼠胰岛瘤细胞β-TC-1中，在葡萄糖的刺激下，其呈剂量依赖的诱导胰岛素的分泌；同样，也刺激RIN-5F细胞胞内cAMP升高，用不同剂量的rHE及rEHE与IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)同时刺激RIN-5F细胞5min，胞内cAMP迅速升高，裂解的细胞上清中的cAMP含量呈剂量依赖性。IBMX是磷酸二酯酶抑制剂，阻止产生的cAMP的降解。根据rHE及rEHE刺激RIN-5F细胞胞内产生的cAMP呈剂量依赖，通过测定其产生的cAMP含量来确定产品的生物学活性。方法简要步骤如下：

1)取对数生长期的RIN-5F(购自ATCC，货号CRL-2058)细胞，PBS洗细胞一次，胰酶消化制成细胞悬液，血球记数板记数并调整细胞密度约为1×10⁵个/ml。接种细胞于96孔培养板，接种量200μl/孔。置培养板于37℃、CO₂培养箱(CO₂的浓度为5％)中，连续培养3天。

2)除去细胞培养上清，加入200μL无血清细胞培养基，CO₂培养箱孵育2小时。

3)用含1mmol/LIBMX(中文名称为3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)和0.1％(质量/体积比)BSA(中文名称为牛血清白蛋白)的无血清细胞培养液作为稀释液，将样本预稀释至200ng/L，然后作4倍稀释，每个样本8个稀释度，每个稀释梯度做双复孔。

4)除去无血清培养上清，将稀释好的各梯度样本180μl加入细胞培养板对应孔中，置37℃，CO₂培养箱CO₂培养箱(CO₂的浓度为5％)孵育5分钟。

5)除去刺激细胞的上清，加入200μL0.1mol/L的HCl37℃孵育30min，提取细胞中的cAMP，取上清用于检测。

6)取上清100μL，采用R&D公司的cAMP检测试剂盒(LowpH，ELISA法)，按说明书要求操作测定cAMP含量。

7)结果计算：

数据利用直线回归计算法进行处理，并按下式公式计算结果：

检测结果表明，rHE的比活性为4.61×10⁴AU/mg，rEHE的比活性为7.80×10⁴AU/mg。

5、内毒素及热原质试验

按照《中国药典》(第三部，2010年版)中“生物制品细菌内毒素试验规程”的规定，用鲎试剂法检测所制备的HSA-Ex4样品的内毒素含量不高于10EU/5mgrHE或rEHE。按照“生物制品热原质试验规程”的规定，采用家兔法测定其热原质为阴性。

上述检测结果表明，通过本发明的工艺制备的rHE及rEHE各项检测指标与预期一致。产品纯度、热原等指标符合《中国药典》(第三部，2010年版)的相关规定，其质量已符合人注射用生物制品的要求。

实施例6、含有融合蛋白rHE及rEHE的药物组合物

含有rHE及rEHE的药物组合物可以是冻干粉针和注射水针。冻干粉针的配方如下：5.0mg/mLrHE(或rEHE)，15mg/mL甘露醇，5.85mg/mLNaCl，1.73mg/mLNa2HPO4，0.94mg/mLNaH₂PO₄，pH为7.0。分装为1.0mL/西林瓶，rHE(或rEHE)含量为5.0mg/西林瓶，冷冻干燥后，按生物制品检定规程要求进行检定，各项指标均符合要求。

注射水针的配方如下：5.0mg/mLrHE(或rEHE)，0.37mg/mL醋酸，0.32mg/mL醋酸钠，15mg/mL甘露醇，2.5mg/mL间甲酚，pH4.5。分装为1.0mL/西林瓶，rHE(或rEHE)含量为5.0mg/西林瓶。按生物制品检定规程要求进行检定，各项指标均符合要求。

实施例7、rHE及rEHE的药效学试验

取糖尿病模型鼠BSK(品系名称为db/db，购自四川大学实验动物中心)，共24只，分为3个实验组和1个对照组，每组6只鼠，雌雄各半，实验组分别腹腔注射rHE(剂量为1.0mg/kg体重，即每千克的鼠注射1.0mgrHE)、rEHE(剂量为1.0mg/kg体重，即每千克的鼠注射1.0mgrEHE)及Exendin4(剂量为10μg/kg体重，即每千克的鼠注射10μgExendin4)，阴性对照组腹腔注射HSA(剂量为1.0mg/kg体重，即每千克的鼠注射1.0mgHSA)；分别于给药后0min、30min、60min、2h、24h、48h测定血糖值。与阴性对照HSA相比，rHE、rEHE具有降低糖尿病模型鼠血糖浓度的作用；与Exendin4相比，rHE、rEHE降糖作用具有长效特性，结果见图4。

实施例8、rHE及rEHE的药代动力学试验

选取大鼠(购自四川大学实验动物中心)16只，分2组，每组8只，雌雄各半。分别静脉注射¹²⁵I标记的rHE及rEHE，剂量为1.0mg/kg体重，即每千克鼠注射的量为1.0mg。分别于注射后0、0.133h、3h、6h、24h、48h、72h、96h、120h采取血样，同位素放射性分析血清中rHE及rEHE含量，具体检测步骤按照本领域常规标准检测方法进行。结果表明，rHE、rEHE终末血清清除半衰期T1/2分别为：85h、87h(见图5)。与Exendin4的半衰期2.4小时相比，rHE及rEHE的半衰期大大延长了。

实施例9重组促胰岛素分泌素融合蛋白的酶切对比实验

常规的肠激酶酶切割序列是DDDDK(其中D为天冬氨酸的简写，K为赖氨酸的简写)，但是现有的肠激酶酶切割序列的酶切效果不好，纯化的重组促胰岛素分泌素融合蛋白并不能满足使用的要求。

为了提高酶切效率从而提高重组促胰岛素分泌素融合蛋白的品质，发明人采用了与常规序列完全不同的His-tag及肠激酶识别序列，选择增加酸性氨基酸D的数量的DDDDDDDDK序列作为肠激酶识别序列，具体结果见表1，而增加其他种类的氨基酸序列均得不到如此理想的酶切效果。

表1本发明采用肠激酶识别序列与现有肠激酶识别的酶切效果对比

融合蛋白	EK酶切割序列	酶切效果(％)
			Histag-EK-E-L-HSA-L-E	DDDDK	10
Histag-EK-E-L-HSA-L-E	DDDDDK	26
			Histag-EK-E-L-HSA-L-E	DDDDDDK	60
Histag-EK-E-L-HSA-L-E	DDDDDDDDK	85
			Histag-EK-E-L-HSA-L-E	DDDDDDDDDDK	86

实验结果表明，本发明采用的DDDDDDDDK作为酶切割序列为时，可大大提高了酶切效果。

同时，本发明采用自主研发的重组牛肠激酶进行酶切，该酶在构建时在其C端加入His-tag标签，(具体的重组牛肠激酶的构建方法参见：孙自勇、陈均勇，牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达纯化和活性鉴定，南京大学学报，2004，40(1)：41。)，从而在对酶切产物进行亲和层析时，可以高效除去未酶切的HE或者EHE融合蛋白、切割下来的His-tag标签以及酶切时添加的肠激酶。

实施例10His-tag标签后加上连接肽有利于与亲和柱的结合

为了避免His-tag在空间结构上受到其他部分的影响，从而影响表达蛋白与亲和层析柱的结合能力，在His-tag标签后加上增加了GGGSGGGS(其中，G为甘氨酸的简写，S为丝氨酸的简写)。

表2His-tag标签后加上连接肽后与亲和柱的结合效果对比

因此，本发明在构建重组促胰岛素分泌素融合蛋白时设计了最佳的序列，使得后期纯化工艺更简单，提高了收率，降低了杂质含量，提高了产品品质。

综上，本发明提供了一组药效好、半衰期长的新型GLP-1受体激动剂(rHE、rEHE)，与Exendin4相比，其半衰期大大延长，预计只需每周用药1-2次，增加了病人的依从性。同时本发明提供了一种采用重组DNA技术制备rHE、rEHE的方法，该方法简便、高效、安全，具有很好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，其多肽区促胰岛素分泌素和人血清白蛋白，所述促胰岛素分泌素以单体或者多个单体的形式通过连接肽与人血清白蛋白串联在一起，所述促胰岛素分泌素的氨基端和/或羧基端通过连接肽与人血清白蛋白羧基端和/或氨基端相连，所述编码连接肽的氨基酸序列的数目与编码促胰岛素分泌素的氨基酸序列的数目相等。

2.根据权利要求1所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述促胰岛素分泌素包含SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白包含SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述连接肽包含SEQIDNO：3所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述促胰岛素分泌素以单体的形式通过连接肽与人血清白蛋白串联在一起，所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白的通式为H-L-E，其中，H代表编码人血清白蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列，L代表编码连接肽的核苷酸序列或氨基酸序列序列，E代表编码促胰岛素分泌素的核苷酸序列或氨基酸序列，所述通式H-L-E代表的氨基酸序列包含SEQIDNO：5所示的氨基酸序列、衍生序列、同源序列或近似序列。

6.根据权利要求5所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述通式H-L-E代表的核苷酸序列包含SEQIDNO：6所示的核苷酸序列、衍生序列、同源序列或近似序列。

7.根据权利要求4所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述促胰岛素分泌素的氨基端和羧基端分别通过连接肽与人血清白蛋白羧基端和氨基端相连，所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白的通式为E-L-H-L-E，其中，H代表编码人血清白蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列，L代表编码连接肽的核苷酸序列或氨基酸序列，E代表编码促胰岛素分泌素的核苷酸序列或氨基酸序列，所述通式代表的氨基酸序列包含SEQIDNO：9所示的氨基酸序列、衍生序列、同源序列或近似序列。

8.根据权利要求7所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述通式E-L-H-L-E代表的核苷酸序列包含SEQIDNO：10所示的核苷酸序列、衍生序列、同源序列或近似序列。

9.根据权利要求4所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列还包括标签序列和酶切位点序列连接而成的核苷酸序列或氨基酸序列。

10.根据权利要求9所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述标签序列和酶切位点序列连接而成的核苷酸序列或氨基酸序列的通式为Histag-EK，其中，Histag代表Histag标签序列，EK代表被天然肠激酶识别的序列，所述通式代表的氨基酸序列包含SEQIDNO：4所示的序列。

11.根据权利要求10所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白的通式为Histag-EK-H-L-E，其中，H代表编码人血清白蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列，L代表编码连接肽的核苷酸序列或氨基酸序列，E代表编码促胰岛素分泌素的核苷酸序列或氨基酸序列，所述通式代表的氨基酸序列包含SEQIDNO：7所示的序列。

12.根据权利要求11所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述通式Histag-EK-H-L-E代表的核苷酸序列包含SEQIDNO：8所示的核苷酸序列。

13.根据权利要求10所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述促胰岛素分泌素的氨基端和羧基端分别通过连接肽与人血清白蛋白羧基端和氨基端相连，所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白的通式为Histag-EK-E-L-H-L-E，其中，H代表编码人血清白蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列，L代表编码连接肽的核苷酸序列或氨基酸序列，E代表编码促胰岛素分泌素核苷酸序列或氨基酸序列，所述通式代表的氨基酸序列包含SEQIDNO：11所示的序列。

14.根据权利要求13所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述通式Histag-EK-E-L-H-L-E代表的核苷酸序列包含SEQIDNO：12所示的序列。

15.根据权利要求12或14所述一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白，其特征在于，所述核苷酸序列插入在表达载体和/或细胞宿主系统。

16.一种权利要求1至15任一项所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白制备方法，其特征在于，包括所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白工程菌构建、发酵、所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白分离纯化、鉴定。

17.根据权利要求16所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白制备方法，其特征在于，重组促胰岛素分泌素融合蛋白纯化的过程中，利用肠激酶切割表达重组促胰岛素分泌素融合蛋白。

18.一种权利要求1至15任一项所述重组促胰岛素分泌素融合蛋白在治疗糖尿病和肥胖症领域中的应用。

19.一种利用权利要求1至15任一项所述的重组促胰岛素分泌素融合蛋白制备的药物组合物。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，所述药物组合物为粉剂或水剂。