CN109679964A - 一种表达人胰岛素基因的重组乳酸乳球菌 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种分泌表达人胰岛素和Exendin‑4的重组乳酸乳球菌MG1363。本发明构建了用于表达人胰岛素基因和Exendin‑4基因的专用重组乳酸乳球菌。培养和发酵该重组乳酸菌即可实现人胰岛素基因和Exendin‑4基因在乳酸菌表面展示表达。实验证明，本发明的重组乳酸菌能够正确的在其表面对人胰岛素基因和Exendin‑4基因进行展示表达，定位于重组乳酸菌表面的重组人胰岛素具有与天然胰岛素十分相似的空间结构，其可以与胰岛素多克隆抗体发生特异性结合，定位于重组乳酸菌表面的Exendin‑4和GLP‑1具有相同的生理功能，作用于相同的受体，还发现Exendin‑4比GLP‑1与受体的亲和性更高。

Description

一种表达人胰岛素基因的重组乳酸乳球菌
技术领域
本发明属于功能蛋白重组表达技术领域，具体涉及一种表达人胰岛素基因的重组乳酸乳球菌工程菌。
背景技术
糖尿病是由于机体内胰岛素分泌缺陷或/和胰岛素抵抗而引起的糖、脂、蛋白质代谢紊乱的一种慢性内分泌代谢疾病。糖尿病主要包括三种类型，I型糖尿病(Type Idiabetes mellitus,T1DM)、Ⅱ型糖尿病(Type II diabetes mellitus,T2DM)和妊娠糖尿病(Gestational Diabetes Mellitus,GDM)。I型糖尿病是一种自身免疫性疾病，是自身的T细胞过度反应从而选择性破坏胰腺中产胰岛素的P细胞，从而导致胰岛素的绝对缺乏。I型糖尿病多见于儿童和青少年，需要靠每天注射胰岛素来控制血糖，没有胰岛素，患者将无法生存，故该病也称为胰岛素依赖性糖尿病。Ⅱ型糖尿病又称为非胰岛素依赖型糖尿病，体内的胰岛细胞破坏并不严重，仍然能够产生一定量的胰岛素，但机体对胰岛素产生抵抗，从而导致胰岛素出现相对不足，主要发病糖尿病后期会导致严重的并发症。妊娠糖尿病是在妊娠期间被诊断的糖尿病，可能会对婴儿造成一定的影响。
针对I型糖尿病，有研究表明通过给T1DM的模型非肥胖糖尿病(Non-obesediabetic，NOD)小鼠口服胰岛素能够减轻或延缓其发病过程，其机制是抗原通过黏膜Peyer’s区吸收，从而激活免疫系统，之后与耐受性相关的效应T细胞被激活，引发口服耐受性，从而保护胰岛素不被损伤。但是如果直接口服抗原，因为抗原绝大多数都是蛋白质，蛋白质在口服过程中经过胃肠环境的影响，会发生明显的降解，因此严重影响抗原的有效作用效率。因此需要一种能够达到食品级要求的运输载体来降低或减轻抗原在经过肠胃环境时所受的损伤。
GLP-1是人体内分泌的一种胰高血糖素样肽，其可以促进胰岛素基因转录和胰岛素分泌，提高受体对胰岛素的敏感性，从而达到降低血糖水平的目的。GLP-1受体(GLP-1R)广泛分布于胰岛和其他组织如心脏、肾脏、肺、胃肠道和中枢神经系统的多个区域。GLP-1的功能由GLP-1R介导，GLP-1R可通过Gas、Gaq、Gai和Ga0介导细胞内多条信号通路发挥生理功能，GLP-1可促进胰岛素的生物合成(从根本上解决胰岛素缺乏问题)和分泌；可抑制胰岛P细胞凋亡和促进其增殖(有助于恢复胰岛细胞的功能)；可减缓胃排空和抑制食欲从而控制患者体重；增加外周组织对胰岛素的敏感性；还具有保护心血管功能(可缓解糖尿病并发症)，因此，GLP-1成为最理想的治疗Ⅱ型糖尿病的药物，正受到空前的关注。
尽管GLP-1抗糖尿病功能众多，但由于其体内半衰期很短(1－2min)，很快会被体内广泛存在的DPP-IV降解失去生物活性，因此天然形式的GLP-1不适合用来作为抗糖尿病的临床药物。
Exendin-4最初是从毒蜥蜴的唾液中分离出来的含有39个氨基酸的多肽，其氨基酸序列和GLP-1具有53％的同源性。研究发现Exendin-4和GLP-1具有相同的生理功能，作用于相同的受体，还发现Exendin-4比GLP-1与受体的亲和性更高。因此不仅可以激活GLP-1R，同时由于N端第二位氨基酸是Gly而不是Ala，能够抵抗DPP-IV的降解从而具有较长的生物半衰期(约2.4h)。但Exendin-4需要持续皮下注射进行给药，注射的方式给病人带来疼痛和不方便，尤其是对于像糖尿病这种慢性疾病需要长期持续注射，并且像多肽或蛋白质类药物，在口服过程中会被体内一系列的消化酶降解从而降低生物活性，同时其穿透肠上皮细胞吸收进入血液的能力很差，因此口服的方式一直以来被认为是最理想的最具吸引力的给药方式。
发明内容
本发明提供一种分泌表达人胰岛素和Exendin-4的重组乳酸乳球菌MG1363，从而弥补现有技术的不足。
本发明提供一种编码人胰岛素的基因，所述基因的核苷酸序列为SCI ID NO:1：
tttgttaaccaacatttatgtggttcacatttagttgaagctttgtatttagtttgtggtgaacgtggttttttctatacaccaaagacagcatcaagaggtttaccatttgcaggtattgttgaacaatgttgtacatcaatttgttcattatatcaacttgagaactactgtaac。
本发明还提供一种优化后的Exendin-4基因序列，所述基因的核苷酸序列为rExd4ID NO:2：
Cacggtgaaggtactttcacttcagatctttcaaaacaaatggaagaagaagctgttcgtcttttcatcgaatggcttaaaaacggtggtccatcatcaggtgctccaccaccatcataa。
本发明再一个方面提供一种不含抗性基因筛选标记的诱导性重组表达载体，所述的重组表达载体为分别插入有上述的编码人胰岛素的基因片段和编码Exendin-4基因的核苷酸片段的表达载体；
所述的表达载体，为pNZ8048表达载体。
本发明还提供一种重组乳酸乳球菌，是将上述的重组质粒载体转化导入到乳酸菌中得到的重组菌。
所述乳酸菌为乳酸乳球菌MG1363。
本发明还提供一种重组人胰岛素基因和Exendin-4基因的表达方法，是发酵上述的重组菌得到展示于乳酸菌表面的重组人胰岛素和Exendin-4。
本发明还提供上述的重组菌在制备预防或治疗I型和Ⅱ糖尿病口服疫苗中的应用。
本发明构建了用于表达人胰岛素基因和Exendin-4基因的专用重组乳酸乳球菌。培养和发酵该重组乳酸菌即可实现人胰岛素基因和Exendin-4基因在乳酸菌表面展示表达。实验证明，本发明的重组乳酸菌能够正确的在其表面对人胰岛素基因和Exendin-4基因进行展示表达，定位于重组乳酸菌表面的重组人胰岛素具有与天然胰岛素十分相似的空间结构，其可以与胰岛素多克隆抗体发生特异性结合，定位于重组乳酸菌表面的Exendin-4和GLP-1具有相同的生理功能，作用于相同的受体，还发现Exendin-4比GLP-1与受体的亲和性更高。
附图说明
图1：重组菌株MG1363/pNZ8048-SCI-59-rExd4促进INS-1胰岛细胞分泌胰岛素图，其中*P＜0.05表示与空白组相比有显著性差异；
图2：图2重组菌株MG1363/pNZ8048-SCI-59-rExd4促进INS-1胰岛细胞增殖图，其中**P＜0.01，***P＜0.001表示与空白组或空质粒组相比有显著性差异。
具体实施方式
本发明采用食品级的重组乳酸乳球菌MG1363作为黏膜投递载体表达并分泌人胰岛素类似物和Exendin-4，为了完全符合真正意义上的食品级乳酸菌，除了宿主菌是食品级之外，其所用到的载体也要相应达到食品级要求，即不能够具有绝大部分表达载体所使用的筛选标记—抗性基因，因为由于抗性基因的存在，有可能对动物或人体肠道的正常菌群产生不利影响，打乱其正常的肠道微生态系统的平衡。因此有必要利用不含抗性基因的表达载体和乳酸菌来构建重组菌，从而符合完全食品级要求，达到能够口服利用的要求。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：构建含有重组人胰岛素编码序列的pNZ8048载体
为了确保最终编码序列的准确性以及后续实验的顺利开展，根据人胰岛素原序列(GenBank号：NM-000207)，得到人膜岛素中的B链、A链的氨基酸序列，同时利用预先设计好的含有8个氨基酸残基的连接肽(Linker peptide)代替膜岛素原中的C链，进而把B链与A链相连并保持B链与A链氨基酸残基序列不变，最终设计形成单链胰岛素类似物SCI-59，其核苷酸序列为SCI ID NO:1。随后将合成片段插入乳酸乳球菌的nisin诱导表达载体pNZ8048中，得到质粒pNZ8048-SCI-59。
具体过程包括以下步骤：
根据重组人胰岛素编码序列设计扩增引物，并在上下游引物分别引入XbaI和KpnI酶切位点，引物序列如下：
上游引物
P1：5’-GCGGTACCTTTGTTAACCAACATTTATGTGG-3’
下游引物；
P2：5’-TGTCTAGAGTTACAGTAGTTCTCAAGTTG-3’；
以含有SEQ ID NO:1的重组人胰岛素编码序列的质粒pMD18T为模板，在引物P1P2存在下进行PCR扩增得到基因SCI-59，PCR扩增条件为：94℃5min→(94℃30s→55℃30s→74℃8s)×30个循环→74℃10min。
反应结束对PCR产物纯化并利用限制性内切酶XbaI和KpnI对其双酶切，再次纯化酶切产物。同时利用此相同的两种酶对载体pNZ8048进行双酶切并纯化其酶切产物，接下来将得到的两者利用t4DNA连接酶(Takara)在16℃条件下进行连接过夜。连接产物纯化后测序，结果表明重组人胰岛素序列已插入pNZ8048载体中，且序列信息正确，将此含有重组人胰岛素编码片段的重组载体命名为pNZ8048-SCI-59。
实施例2：构建含有Exendin-4基因的pNZ8048载体
Exendin-4基因的cDNA序列从GenBank(accession number DI206426.1)中査到，然后用JCAT软件对其按照乳球菌进行密码子优化，优化后的核苷酸序列为rExd4 ID NO:2，同时左端加入Usp45的信号肽和LEISSTCDA前导肽的碱基序列，两端带上NcoI和Hin dIII酶切位点。然后把准备好的碱基序列送至上海生工生物公司进行序列合成，随后将合成片段插入到pNZ8048-SCI-59中，得到质粒pNZ8048-SCI-59-rExd4。
实施例3：乳酸乳球菌感受态细胞的制备
将贮存乳酸乳球菌MG1363(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)接种于10mL GM17培养基，30℃过夜静置培养。将1mL过夜培养物接种于50mL含2.5％甘氨酸的SGM17培养基中，30℃静置培养至OD600值为0.5左右，冰浴，用OSPS缓冲液(0.5M蔗糖、10％甘油)洗涤菌体，再用OSPS缓冲液重悬细胞，-70℃保存或直接使用。
实施例4：乳酸乳球菌的电转化
将质粒pNZ8048-SCI-59-rExd4和空质粒pNZ8048分别和乳酸乳球菌感受态细胞在电转化杯中混合，使用2500V(电容25μ，电阻200Ω)脉冲输出，电转化乳酸乳球菌。将转化后的菌体，加入预冷的SMG17MC(GM17+20mM CaCl2+2mM MgCl2)，30℃静置孵育2h。洗涤细胞，涂布含氯霉素(7.5mg/mL)的GM17琼脂糖固体培养基。
转化后涂布的平板上出现抗氯霉素的阳性克隆。将重组单菌落接种于含有氯霉素(终浓度7.5μg/mL)的液体GM17培养基中，30℃恒温静置培养过夜，再按1％的接种量转接到5mL新鲜的含氯霉素(终浓度7.5μg/mL)的液体GM17培养基中，Nisin(购自Sigma)诱导检测人胰岛素样生长因子的表达情况。最终获得表达重组人胰岛素基因和Exendin-4基因的重组菌株MG1363/pNZ8048-SCI-59-rExd4和对照菌株MG1363/pNZ8048。
实施例5：人胰岛素基因和Exendin-4在重组乳酸菌中的表达和含量测定
将构建好的重组菌株MG1363/pNZ8048-SCI-59-rExd4以1:100的接种量过夜培养，第二天取培养液按3:100接种，4h后加入50ng/mL的Nisin进行诱导表达，诱导5h后，将菌液于4℃4000rgm离心5min，用预冷的PBS缓冲液洗菌体3次；收集后的菌体置于冰上搅动20min。用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。
重组乳酸菌表达的人胰岛素和Exendin-4的含量用ELISA试剂盒(胰岛素ELISA试剂盒和Exendin-4ELISA试剂盒均购自美国Millipore公司)测定。测定方法按照试剂盒提供的标准步骤操作。通过检测，测得Nisin诱导表达组每克湿菌体表达IGF为2.6ug，未加入Nisin诱导的对照组没有表达。在Nisin诱导2.5h时，Exendin-4的分泌量达到最大，为256nmol/L，此时菌体的浓度约为6×108CFU，在Nisin诱导3-6h，Exendin-4的分泌量基本保持稳定，然后开始下降，而未加入Nisin诱导的对照组没有表达。
实施例6：同时表达人胰岛素基因和Exendin-4基因的重组菌株MG1363/pNZ8048-SCI-59-rExd4作为口服疫苗进行动物实验
1、重组乳酸乳球菌的培养与收集
将重组菌接种于5mlGM17培养基中，30℃静置培养过夜，次日将培养物按1:50的比例接种于新鲜配制的GM17中，30℃静置培养至OD600约为0.3，然后向培养物中加入终浓度约为30ng/ml的乳酸链球菌素(Nisin)进行诱导，在30℃条件下，继续静置培养10小时。5000rpm，4℃离心10min，收集菌体，并用无菌PBS(pH7.4)洗涤3次，最后溶于无菌PBS(pH7.4)。同时以相同方法收集未诱导的重组菌活细胞作为对照组。
2、重组乳酸乳球菌对非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的口服效果实验
取4周龄NOD小鼠(购自上海史莱克公司)24只，将其随机分为PBS组、对照组和实验组，每组8只。PBS组用0.5ml无菌PBS灌胃，对照组用步骤1中收集的未诱导的工程菌活细胞按1011个细胞/只小鼠的量(悬浮于0.5ml无菌PBS中)灌胃，实验组用步骤1中收集的经过诱导的工程菌活细胞按1011个细胞/只小鼠的量(悬浮于0.5ml无菌PBS中)灌胃，第一周每天灌胃一次，此后每周一次。
(1)NOD小鼠血清中重组人胰岛素特异性抗体的分析：
将步骤1中收集的经过诱导的工程菌提取蛋白并经过SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜上。
对12周龄的PBS组、对照组和实验组的小鼠各取3只小鼠的血清，并利用封闭液(含有5％脱脂奶粉的TBS溶液)按照1:20的比例稀释作为一抗，二抗为1:500稀释的抗小鼠IgG(购自武汉三鹰生物技术有限公司)，经过western blot检测。
结果发现只有实验组小鼠体内产生了人胰岛素特异性抗体，而PBS组和对照组均未检测到特异性抗体的存在。表明只有经过诱导的重组乳酸菌可成功刺激NOD小鼠免疫系统产生特异性抗体。
(2)NOD小鼠血清中IL-4水平分析
喂养至12周龄的PBS组、对照组和实验组，每组取4只，每只取血500ul，制备血清，利用小鼠IL-4ELISA检测试剂盒检测各组小鼠血清中IL-4的含量。通过SPSS软件进行均数t检验统计结果如下：PBS组血清中IL-4水平为29.029±0.927pg/ml，对照组血清中IL-4水平为30.846±1.039pg/ml，实验组血清中IL-4水平为39.648±1.746pg/ml。分析可得实验组较PBS组、对照组中IL-4水平含量明显升高(P<0.05)。因此从作为免疫耐受相关的典型细胞因子IL-4水平的升高，表明诱导后的重组乳酸菌可以促进NOD小鼠免疫耐受的形成。
实施例7：重组菌株MG1363/pNZ8048-SCI-59-rExd4分泌Exendin-4作用的测定
1、大鼠胰岛细胞系INS-1的培养
大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1(20-30代)，培养在含有10％胎牛血清、10mM HEPES，50mMβ－巯基乙醇、1mM丙酮酸钠和1％双抗的RPMI 1640培养基中，于含有5％CO2浓度的培养箱中37℃培养，并隔天换液。
2、促胰岛素分泌实验
INS-1细胞按105/孔的细胞数接种在24孔板中，并培养至细胞长到100％融合。用1mL含有3mM葡萄糖的HBSS缓冲液润洗一次细胞，再加入1mL同样的缓冲液预培养2h，弃掉细胞培养基。制备含有Exendin-4的细胞培养基，并用含有5.6mM葡萄糖的RPMI 1640培养基稀释1倍，每孔加入600uL，与细胞一起孵育2h，标准品GLP-1(100nmol/L)和Exendin-4(100nmol/L)作为阳性对照。孵育后，小心吸取上清培养液，4000g，4℃离心10min，吸取上清用胰岛素ELISA试剂盒测定胰岛素的含量。
测定结果如图1所示，空白对照组分泌的胰岛素浓度为63.6ng/mL，阳性对照组Exendin-4(67.12ng/mL)和GLP-1(71.24ng/mL)均显著促进了胰岛素的分泌，胰岛素浓度分别提高了6％和12％。rExd4处理组胰岛素浓度为69.96ng/mL，比空白对照组显著增加了10％，与阳性对照促胰岛素分泌能力相当；含空载体PNZ8048的组胰岛素浓度与空白对照相比并没有显著差异。这些数据表明重组菌株MG1363/pNZ8048-SCI-59-rExd4分泌的Exendin-4具有生物活性，能够发挥促胰岛素分泌的作用。
3、促胰岛细胞增殖实验
INS-1细胞按2×104/孔的细胞数接种在96孔培养板中培养36h，然后弃掉细胞培养基。制备含有Exendin-4的细胞培养基并用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基稀释1倍，并每孔加入100uL，与细胞一起孵育24h，标准品GLP-1(100nmol/L)和Exendin-4(100nmol/L)作为阳性对照，只加入RPMI 1640细胞培养基的孔作为空白对照。孵育完成后，用CCK-8试剂盒检测活细胞数。
结果如图2所示，将空白对照组的活细胞数看作100％，阳性对照Exendin-4和GLP-1均显著促进胰岛细胞的増殖(P＜0.001)，增殖率分别为108.9和108.1％。与空白对照组相比，重组菌株MG1363/pNZ8048-SCI-59-rExd4制备的细胞培养基也能够显著促进胰岛细胞增殖，增值率为104.1％(P＜0.01)；MG1363/pNZ8048组活细胞数与空白组无显著性差异。由此得出，rExd4显著促进了胰岛细胞增殖。
4、抑制胰岛细胞调亡实验
INS-1细胞按105/孔的细胞数接种在24孔培养板中，当细胞长到90％融合时，弃掉细胞培养基。制备含有Exendin-4的细胞培养基，并用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基稀释1倍，并每孔加入100ul，标准品GLP-1(100nmol/L)和Exendin-4(100nmol/L)
作为阳性对照，与细胞一起鮮育24h。每孔加入250nmol/L的星孢菌素与细胞孵育lh，然后用Annexin V-PI细胞凋亡试剂盒，流式细胞仪进行检测。
结果：用星孢菌素处理胰岛细胞1h，将空白组的早期凋亡数看作100％，药物组的早期凋亡细胞数比空白组显著增加(P＜0.05)，为116.4％，说明星孢菌素起到了促进胰岛细胞凋亡的作用。提前用MG1363/pNZ8048-SCI-59-rExd4制备的细胞培养基处理细胞24h，细胞凋亡率只有96.4％，相比药物组降低了约20％(P＜0.05)，与空白组的凋亡数无显著性差异；而用MG1363/pNZ8048制备的细胞培养基预处理细胞并没有显著降低凋亡细胞数(P＞0.05)。用标准品Exendin-4或GLP-1预处理细胞24h细胞凋亡数目与药物组相比显著降低(P＜0.05)，分别为108.9和108.1％，与正常组无显著性差异。以上结果表明，重组菌株MG1363/pNZ8048-SCI-59-rExd4合成与分泌的Exendin-4能够抑制星胞菌素对细胞的促凋亡作用，对胰岛细胞起到了很好的保护作用。
序列表
<110> 山东信得科技股份有限公司 青岛华义宏博生物科技有限公司
<120> 一种表达人胰岛素基因的重组乳酸乳球菌
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttgttaacc aacatttatg tggttcacat ttagttgaag ctttgtattt agtttgtggt 60
gaacgtggtt ttttctatac accaaagaca gcatcaagag gtttaccatt tgcaggtatt 120
gttgaacaat gttgtacatc aatttgttca ttatatcaac ttgagaacta ctgtaac 177
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacggtgaag gtactttcac ttcagatctt tcaaaacaaa tggaagaaga agctgttcgt 60
cttttcatcg aatggcttaa aaacggtggt ccatcatcag gtgctccacc accatcataa 120

Claims (8)

1.一种编码人胰岛素的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SCI ID NO:1。
2.一种Exendin-4基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为rExd4 ID NO:2。
3.一种不含抗性基因筛选标记的诱导性重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体为分别插入有权利要求1所述的编码人胰岛素的基因片段或权利要求2所述的编码Exendin-4基因的核苷酸片段的表达载体。
4.如权利要求3所述的诱导性重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pNZ8048表达载体。
5.一种重组乳酸乳球菌，其特征在于，所述的重组乳酸乳球菌是将权利要求3所述的诱导性重组表达载体导入到乳酸菌中得到的重组菌。
6.如权利要求5所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于，所述的乳酸菌为乳酸乳球菌MG1363。
7.一种重组人胰岛素基因和Exendin-4基因的表达方法，其特征在于，所述的方法是发酵利要求5所述的重组乳酸乳球菌得到展示于乳酸菌表面的重组人胰岛素和Exendin-4。
8.权利要求5所述的重组乳酸乳球菌在制备预防或治疗I型和Ⅱ糖尿病口服疫苗中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112831516A (zh) * 2021-02-08 2021-05-25 青岛海华莱康生物医药技术有限公司 一种表达glp-1样因子的重组菌及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000009666A2 (en) * 1998-08-10 2000-02-24 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Differentiation of non-insulin producing cells into insulin producing cells by glp-1 or exendin-4 and uses thereof
CN104805091A (zh) * 2015-05-13 2015-07-29 武汉真福医药股份有限公司 重组人胰岛素的表达方法及专用表达载体、工程菌和应用
CN105254763A (zh) * 2015-06-30 2016-01-20 成都谨信恒生物技术有限公司 一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白、制备方法及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000009666A2 (en) * 1998-08-10 2000-02-24 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Differentiation of non-insulin producing cells into insulin producing cells by glp-1 or exendin-4 and uses thereof
CN104805091A (zh) * 2015-05-13 2015-07-29 武汉真福医药股份有限公司 重组人胰岛素的表达方法及专用表达载体、工程菌和应用
CN105254763A (zh) * 2015-06-30 2016-01-20 成都谨信恒生物技术有限公司 一种重组促胰岛素分泌素融合蛋白、制备方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHU ZENG等: "Recombinant Lactococcus lactis expressing bioactive exendin-4 to promote insulin secretion and beta-cell proliferation in vitro", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
曾珠: "重组表达Exendin-4功能肽乳酸菌工程菌的构建及口服投递活性研究", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112831516A (zh) * 2021-02-08 2021-05-25 青岛海华莱康生物医药技术有限公司 一种表达glp-1样因子的重组菌及应用

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