CN112831516A - 一种表达glp-1样因子的重组菌及应用 - Google Patents
一种表达glp-1样因子的重组菌及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112831516A CN112831516A CN202110180373.1A CN202110180373A CN112831516A CN 112831516 A CN112831516 A CN 112831516A CN 202110180373 A CN202110180373 A CN 202110180373A CN 112831516 A CN112831516 A CN 112831516A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glp
- recombinant
- factor
- expressing
- recombinant bacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 26
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 claims description 12
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 claims description 12
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108010053775 Nisin Proteins 0.000 claims description 11
- NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N Nisin Chemical compound N1C(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@@H]([C@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H](N)[C@H](C)CC)CSC[C@@H]1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(NCC(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CS[C@@H]2C)C(=O)N[C@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C)C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@@H](C(N[C@H](CC=4NC=NC=4)C(=O)N[C@H](CS[C@@H]3C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H]([C@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=3NC=NC=3)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(O)=O)=O)CS[C@@H]2C)=O)=O)CS[C@@H]1C NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N 0.000 claims description 11
- 239000004309 nisin Substances 0.000 claims description 11
- 235000010297 nisin Nutrition 0.000 claims description 11
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 7
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 claims description 7
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 claims 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 28
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 abstract description 14
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 abstract description 14
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 abstract description 14
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 abstract description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 8
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 abstract description 8
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 101100337060 Caenorhabditis elegans glp-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 3
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 3
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 2
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- XJRPTMORGOIMMI-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-amino-4-(trifluoromethyl)-1,3-thiazole-5-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C=1SC(N)=NC=1C(F)(F)F XJRPTMORGOIMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102100023374 Forkhead box protein M1 Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000907578 Homo sapiens Forkhead box protein M1 Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000030136 gastric emptying Effects 0.000 description 1
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 1
- MGXWVYUBJRZYPE-YUGYIWNOSA-N incretin Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 MGXWVYUBJRZYPE-YUGYIWNOSA-N 0.000 description 1
- 239000000859 incretin Substances 0.000 description 1
- 206010022498 insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 208000021255 pancreatic insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007425 progressive decline Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/26—Glucagons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
- A23V2400/157—Lactis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Public Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Mycology (AREA)
Abstract
本发明公开了一种表达GLP‑1样因子的重组菌及应用，属于新型生物药物工程技术领域。本发明是通过构建含有GLP‑1样因子基因的重组表达载体并转化到食品级乳酸菌中，获得可发酵产生GLP‑1样因子的重组乳酸菌。该重组乳酸菌促进β细胞增殖，恢复并促进胰岛素的生物合成与分泌，提高外周组织、受体等对胰岛素的敏感性，降低血糖水平。
Description
技术领域
本发明属于新型生物药物工程技术领域，具体涉及一种表达GLP-1样因子的重组菌及应用。
背景技术
Ⅱ型糖尿病又称为非胰岛素依赖型糖尿病，体内的胰岛细胞破坏并不严重，仍然能够产生一定量的胰岛素，但机体对胰岛素产生抵抗，从而导致胰岛素出现相对不足。传统的理论认为Ⅱ型糖尿病发病和进展的一个重要原因是胰岛功能的进行性衰退，包括β细胞胰岛素分泌缺陷和α细胞胰升糖素不适当的分泌增加造成的胰岛素与胰升糖素比例失调，造成血糖控制的不断恶化，并发症的发生。临床主要通过作用于血糖代谢的部分环节来降低血糖，并未针对β细胞功能减退进行治疗。因此，研究新的治疗方法从根本上长期控制血糖稳定十分迫切。
GLP-1是一种在食物营养物质刺激下由肠道细胞合成分泌的肠促胰素，以葡萄糖浓度依赖方式作用于胰腺的β细胞促进胰岛素释放及α细胞抑制不适当的胰升糖素分泌，控制血糖水平。同时GLP-1可抑制胰岛β细胞凋亡和促进其增殖，有助于恢复胰岛细胞的功能，可减缓胃排空和抑制食欲从而控制患者体重，增加外周组织对胰岛素的敏感性等，使其成为最理想的治疗II型糖尿病的药物。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够表达GLP-1样因子的重组菌，通过口服途径促进β细胞增殖，恢复并促进胰岛素的生物合成与分泌，提高外周组织、受体等对胰岛素的敏感性，从根本上解决胰岛素缺乏从而达到降低血糖水平目的。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种表达GLP-1样因子的重组表达载体，所述重组表达载体是在表达载体中插入有编码GLP-1样因子的核苷酸序列；
所述编码GLP-1样因子的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
SEQ ID No:1：
在上述方案的基础上，所述表达载体为pNZ8149。
一种表达GLP-1样因子的重组菌，所述重组菌是由上述的重组表达载体转化导入到乳酸菌中所得。
在上述方案的基础上，所述乳酸菌为乳酸乳球菌NZ3900。
在上述方案的基础上，所述重组菌为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)HL19003，保藏编号为CCTCC NO：M 2020968。
上述表达GLP-1样因子的重组菌在制备预防和治疗Ⅱ型糖尿病药物或食品中的应用。
上述表达GLP-1样因子的重组菌在制备具有促进胰岛素分泌和胰岛细胞增殖功效的药物或食品中的应用。
使用上述重组菌表达GLP-1样因子的方法，步骤为：
(1)将保藏编号为CCTCC NO：M 2020968的重组菌株接种到M17培养基，30℃静置培养20h；
(2)取步骤(1)培养后的培养液按3％接种到GM17培养基，30℃恒温静置培养，待OD600nm至0.4，加入Nisin进行诱导表达。
在上述方案的基础上，所述Nisin加入终浓度为30ng/mL；诱导表达2-6h。
一种具有促进胰岛素分泌和胰岛细胞增殖功效的生物制剂，其特征在于，是由上述方法诱导后的菌液，经离心去除菌体后的上清液。
本发明采用的表达载体pNZ8149是由Nisin诱导的食品级的表达载体，并携带乳糖分解基因；NZ3900菌株是一类乳糖缺陷型菌株，当pNZ8149正确转入NZ3900菌株后，使菌株代谢乳糖产生乳酸，pH值的下降使得溴甲酚紫培养基由紫色变为黄色。
本发明有益效果在于，成功构建了用于表达GLP-1样因子基因的重组乳酸乳球菌。实验证明，本发明的重组乳酸菌能够分泌表达GLP-1样因子，促进胰岛素分泌和细胞增殖，可控制血糖水平。
附图说明
图1为重组表达载体pNZ8149-glp-1的构建流程。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
构建含有GLP-1样因子基因的pNZ8149载体
GLP-1样因子基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，两端带上NcoI和SphI酶切位点，同时引入Usp45的信号肽碱基序列，把设计好的碱基序列(SEQ ID No:2)送至上海生工生物公司进行序列合成，随后将合成片段插入到pNZ8149中，得到质粒pNZ8149-glp-1，其构建过程如图1所示。
SEQ ID No:1：
SEQ ID No:2：
实施例2
乳酸乳球菌感受态细胞的制备
挑取NZ3900单菌落接种于5mLGM17培养基(M17培养基、5g/L葡萄糖)中，30℃厌氧培育12h，进行活化；待12h后，在10mLSGM17培养基(M17培养基、0.5mol/L蔗糖、25g/L甘氨酸、5g/L葡萄糖)中转接入500μL已活化12h的菌液，30℃培养12h。将10mL培养液整体加至100mL SGM17培养液中，30℃培育4h后冰浴20min，5000r/min离心10min后弃上清液。用灭菌预冷的40mLOSPS缓冲液(0.5M蔗糖+10％甘油)重悬菌体，冰上静置20min离心弃上清液，25mL预冷溶液II(0.5mol/L蔗糖+100mL/L甘油+0.05mol/L EDTA)重悬菌体冰上静置20min后离心取菌体。再用15mL OSPS缓冲液重悬菌体，冰上静置20min后离心弃上清液。最后加入1mLOSPS缓冲液重悬菌体，80μL分装，置于-80℃保存或直接使用。
实施例3
乳酸乳球菌的电转化
将质粒pNZ8149-glp-1和实施例2制备的NZ3900感受态细胞在电转化杯中混合，在电阻200Ω、电容25μF、电场强度10kV/cm条件下进行电转化。将转化后的菌体，加入预冷的GM17MC恢复培养基(M17培养基、5g/L葡萄糖、20mmol/L MgCl2、2mmol/L CaCl2)，30℃静置孵育2h。洗涤细胞，涂布于筛选培养基(M17培养基、0.04g/L溴甲酚紫、琼脂)上，静置培养24h。进一步挑取平板上黄色生长的菌株活化并进行菌落PCR和双酶切验证，并进行测序分析。
测序分析为pNZ8149-glp-1乳酸乳球菌的阳性转化子即为表达GLP-1样因子的重组菌株NZ3900/pNZ8149-glp-1。
对NZ3900/pNZ8149-glp-1重组乳酸乳球菌进行生物保藏，保藏信息如下：
保藏时间：2020年12月24日
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心
保藏编号：CCTCC NO：M 2020968
保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心
分类命名：乳酸乳球菌HL19003 Lactococcus lactis HL19003
实施例4
glp-1样因子基因在重组乳酸菌中的表达和含量测定
将构建好的重组菌株NZ3900/pNZ8149-glp-1以1％的接种量接种于M17培养基，30℃静置培养20h，第二天取培养液按3％接种量再次接种于新鲜的GM17培养基中，30℃恒温静置培养约4h，待OD 600nm至0.4左右，加入Nisin至终浓度30ng/mL进行诱导表达，以不添加Nisin的重组菌株NZ3900/pNZ8149-glp-1培养液作为对照；取不同诱导时间的菌液于4℃、4000rpm离心5min，取上清进行glp-1含量的检测。
通过检测，在Nisin诱导2.5h时，glp-1的分泌量达到最大，为256nmol/L，此时菌体的浓度约为6×108CFU/mL，在Nisin诱导3-6h，glp-1的分泌量基本保持稳定，而未加入Nisin诱导的对照组没有表达。
实施例5
重组乳酸菌NZ3900/pNZ8149-glp-1对控糖作用的研究
重组乳酸菌NZ3900/pNZ8149-glp-1按3％接种量接种于新鲜的GM17培养基中，30℃恒温静置培养约4h，无菌加入终浓度为30ng/mL的Nisin诱导2.5h后，4000rpm无菌离心10min，取上清并与RPMI 1640培养基等比例混合备用。同时，将大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1细胞按1×105/孔的细胞数接种在96孔培养板中培养36h，弃上清，试验组加入重组乳酸菌培养上清与RPMI 1640培养基的等比混合液，对照组只加入RPMI 1640培养基，加样量均为100uL/孔，继续孵育12h后测定胰岛素含量和活细胞数。
结果表明，空白对照组胰岛素浓度为58ng/mL，其活细胞数计为100％，试验组胰岛素浓度为72.2ng/mL，其活细胞数为108.9％。由此可见，重组乳酸菌NZ3900/pNZ8149-glp-1可显著促进胰岛素的分泌和胰岛细胞增殖，可控血糖。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 青岛海华莱康生物医药技术有限公司
青岛海华生物医药技术有限公司
<120> 一种表达GLP-1样因子的重组菌及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 93
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
cataaggaag ggacctttac cagtgatgta agttcttatt tggaaggcca agctgccaag 60
gaattcattg cttggctggt gaaaggccga gga 93
<210> 2
<211> 1560
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccatggattc aaccgaactt aatgggagga aaaattaaaa aagaacagtt atgaaaaaaa 60
agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc ccgttgtcag 120
gtgtttacgc tgacacaaac tcagatattg ctaaacaaga tgcgacaatt tcaagcgcgc 180
aatctgctaa agcacaagca caagcacaag ttgatagctt gcaatcaaaa gttgacagct 240
tacaacaaaa gcaaacaagt actaaagcac aaatcgctaa aatcgaaagc gaactgaaag 300
cacttaatgc tcaaattgct actttgaacg aaagtatcaa agaacgtaca aagacattgg 360
aagctcaagc acgtagtgct caagttaaca gctcagcaac aaattatatg gatgctgttg 420
ttaattcaaa atctttgaca gatgttattc aaaaagtaac agctattgct actgtttcta 480
gtgccaacaa acaaatcttg gaacaacaag aaaaagagca aaaagagctt agccaaaagt 540
cagaaactgt taaaaagaac tacaaccagt tcgtttctct ttcacaaagt ttggattctc 600
aagctcaaga attgacttca caacaagctg aactcaaagt tgcgactttg aactatcaag 660
caacaattgc aactgcgcaa gataaaaaac aagctttatt agatgaaaaa gcagctgcag 720
aaaaagcagc tcaagaagca gctaaaaaac aagcggctta tgaagctcaa caaaaagaag 780
cagcacaagc acaagcagct tcaacagcag caactgctaa agctgtagaa gcagcaactt 840
catcagcttc tgcttcatct agtcaagctc cacaagtaag tacaagcact gataatacaa 900
catcaaatgc tagtgcctca aacagttcta atagttcatc aaactcaagt tcaagttcta 960
gcagttcatc aagctcaagc tcaagctcaa gtaattctaa tgctggtggg aatacaaatt 1020
caggcactag tactggaaat actggaggaa caactactgg tggtagcggt ataaatagtt 1080
caccaattgg aaatccttat gctggtggtg gatgtactga ctatgtatgg caatactttg 1140
ctgcacaagg aatttatatc agaaatatca tgcctggtaa tggtggacaa tgggcttcta 1200
atggacctgc ccaaggcgtg ctccatgttg taggagctgc tcctggtgtt atcgcatcaa 1260
gcttctcagc tgattttgtt ggatatgcaa actcacctta cggtcacgta gctattgtaa 1320
aatcagttaa ttcagatggt acaattacta tcaaagaagg cggatatggt acaacttggt 1380
ggggacatga acgtactgta agtgcgtctg gtgttacttt cttgatgcca aactagaaaa 1440
aagtcttaat aaataaaaaa tagcataagg aagggacctt taccagtgat gtaagttctt 1500
atttggaagg ccaagctgcc aaggaattca ttgcttggct ggtgaaaggc cgaggagcat 1560
Claims (10)
1.一种表达GLP-1样因子的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是在表达载体中插入有编码GLP-1样因子的核苷酸序列；
所述编码GLP-1样因子的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.根据权利要求1所述的表达GLP-1样因子的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pNZ8149。
3.一种表达GLP-1样因子的重组菌，其特征在于，所述重组菌是由权利要求1或2所述的重组表达载体转化导入到乳酸菌中所得。
4.根据权利要求3所述表达GLP-1样因子的重组菌，其特征在于，所述乳酸菌为乳酸乳球菌NZ3900。
5.根据权利要求3或4所述表达GLP-1样因子的重组菌，其特征在于，所述重组菌为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)HL19003，保藏编号为CCTCC NO：M 2020968。
6.权利要求5所述表达GLP-1样因子的重组菌在制备预防和治疗Ⅱ型糖尿病药物或食品中的应用。
7.权利要求5所述表达GLP-1样因子的重组菌在制备具有促进胰岛素分泌和胰岛细胞增殖功效的药物或食品中的应用。
8.使用权利要求5所述重组菌表达GLP-1样因子的方法，其特征在于，步骤为：
(1)将保藏编号为CCTCC NO：M 2020968的重组菌株接种到M17培养基，30℃静置培养20h；
(2)取步骤(1)培养后的培养液按3％接种到GM17培养基，30℃恒温静置培养，待OD600nm至0.4，加入Nisin进行诱导表达。
9.根据权利要求8所述重组菌表达GLP-1样因子的方法，其特征在于，所述Nisin加入终浓度为30ng/mL；诱导表达2-6h。
10.一种具有促进胰岛素分泌和胰岛细胞增殖功效的生物制剂，其特征在于，是由权利要求9所述方法诱导后的菌液，经离心去除菌体后的上清液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110180373.1A CN112831516A (zh) | 2021-02-08 | 2021-02-08 | 一种表达glp-1样因子的重组菌及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110180373.1A CN112831516A (zh) | 2021-02-08 | 2021-02-08 | 一种表达glp-1样因子的重组菌及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112831516A true CN112831516A (zh) | 2021-05-25 |
Family
ID=75933225
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110180373.1A Withdrawn CN112831516A (zh) | 2021-02-08 | 2021-02-08 | 一种表达glp-1样因子的重组菌及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112831516A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116103212A (zh) * | 2022-10-25 | 2023-05-12 | 海南华宋医药科技有限公司 | 共表达glp-1和oxm的重组细菌 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102796755A (zh) * | 2012-06-28 | 2012-11-28 | 郑州大学 | 一种乳酸乳球菌表达载体及其制备方法与应用 |
| CN103627711A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-03-12 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 胰岛素样生长因子重组乳酸菌及其应用 |
| CN106011165A (zh) * | 2016-05-06 | 2016-10-12 | 南昌大学 | 分泌表达glp-1的乳酸乳球菌的制备方法及其应用 |
| CN108060195A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-05-22 | 广东唯泰生物科技有限公司 | 一种发酵生产重组胰高血糖素样肽-1蛋白的方法 |
| CN109679964A (zh) * | 2019-01-12 | 2019-04-26 | 青岛华义宏博生物科技有限公司 | 一种表达人胰岛素基因的重组乳酸乳球菌 |
-
2021
- 2021-02-08 CN CN202110180373.1A patent/CN112831516A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102796755A (zh) * | 2012-06-28 | 2012-11-28 | 郑州大学 | 一种乳酸乳球菌表达载体及其制备方法与应用 |
| CN103627711A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-03-12 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 胰岛素样生长因子重组乳酸菌及其应用 |
| CN106011165A (zh) * | 2016-05-06 | 2016-10-12 | 南昌大学 | 分泌表达glp-1的乳酸乳球菌的制备方法及其应用 |
| CN108060195A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-05-22 | 广东唯泰生物科技有限公司 | 一种发酵生产重组胰高血糖素样肽-1蛋白的方法 |
| CN109679964A (zh) * | 2019-01-12 | 2019-04-26 | 青岛华义宏博生物科技有限公司 | 一种表达人胰岛素基因的重组乳酸乳球菌 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116103212A (zh) * | 2022-10-25 | 2023-05-12 | 海南华宋医药科技有限公司 | 共表达glp-1和oxm的重组细菌 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108728382B (zh) | 一株具降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生能力的植物乳杆菌及其应用 | |
| CN110747157B (zh) | 一种能在肠道中降解尿酸的工程益生菌及其制备方法与应用 | |
| CN114181864B (zh) | 一种鼠李糖乳杆菌hf01及其应用 | |
| CN113846035B (zh) | 一株缓解肠炎、脑膜炎和促进肠道发育的唾液乳杆菌及其应用 | |
| AU2021388477A9 (en) | Use of Lactobacillus paracasei ET-22 for enhancing resistance of intestinal tract to bacterial infection and improving intestinal immunity | |
| CN111733111B (zh) | 一株植物乳杆菌nx-1及其在制备降血糖药物中的应用 | |
| CN111471660B (zh) | 一种乙醛脱氢酶重组基因及其乳酸菌载体和应用 | |
| US8741622B2 (en) | Stress tolerant Bifidobacteria | |
| CN107903310A (zh) | 一种重组膜蛋白、微生物、含有其的组合物及应用 | |
| CN107236694A (zh) | 一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法 | |
| CN114540231A (zh) | 一种在发酵食品中促进风味物质产生的乳酸片球菌及其应用 | |
| CN114231473A (zh) | 一株益生植物乳杆菌及其在低盐发酵肉食品制备中的应用 | |
| CN116445356B (zh) | 一种调节肠道菌群及增强免疫力的动物双歧杆菌乳亚种ba67及其应用 | |
| CN114085792A (zh) | 一种用于防治结肠癌的副干酪乳杆菌及其应用 | |
| CN112831516A (zh) | 一种表达glp-1样因子的重组菌及应用 | |
| CN106811436A (zh) | 一株植物乳杆菌及其在制备矫正社交行为制剂中的应用 | |
| CN112080449B (zh) | 一种屎肠球菌r40及其在降胆固醇、产胞外多糖和抗氧化中的应用 | |
| CN112143667B (zh) | 一种高表达乙醛脱氢酶的耐酸植物乳杆菌及其应用 | |
| CN117946953A (zh) | 重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及应用 | |
| CN115820512A (zh) | 一株嗜热链球菌菌株EuAS-D-S6及其应用 | |
| CN111004735A (zh) | 一株发酵乳杆菌及其在改善肠道健康方面的应用 | |
| CN102382779B (zh) | 一种凝固型无添加酸乳的制造方法及其所应用的干酪乳杆菌 | |
| CN109628366B (zh) | 一种提高乳酸菌抗酸胁迫能力的方法 | |
| CN103060219A (zh) | 一种发酵乳饮料制造方法及其所应用的干酪乳杆菌 | |
| CN110692719A (zh) | 一种凝结芽孢杆菌jy69及其制备活菌型混合莓果浆的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20210525 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |