CN106011165A - 分泌表达glp-1的乳酸乳球菌的制备方法及其应用 - Google Patents

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CN106011165A CN201610298373.0A CN201610298373A CN106011165A CN 106011165 A CN106011165 A CN 106011165A CN 201610298373 A CN201610298373 A CN 201610298373A CN 106011165 A CN106011165 A CN 106011165A
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辛洪波
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Abstract

一种分泌表达GLP‑1的乳酸乳球菌的制备方法及其应用，是通过化学合成人源胰高血糖素样肽 I，简称GLP‑1，即1‑37个氨基酸的有效功能区域，并加入乳酸乳球菌特有的分泌表达穿膜肽SPusp45,构建pMG36e‑GLP‑1重组质粒，电转进入乳酸乳球菌，实现GLP‑1的分泌表达，并通过饮食进入人体肠道后可以实现GLP‑1的持续表达，实现对II 型糖尿病病症的缓解和治疗作用。

Description

分泌表达GLP-1的乳酸乳球菌的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种分泌表达胰高血糖素样肽I的乳酸乳球菌MG1363的制备方法及其在治疗II型糖尿病中的应用，通过构建pMG36e-GLP-1组成型表达载体，在添加乳酸乳球菌穿膜肽SPusp45后，采用电转的方法将重组质粒转入乳酸乳球菌MG1363实现GLP-1的分泌表达。同时，乳酸乳球菌优良的耐酸、耐胆盐和其益生特性，为其在肠道中的定植和持续不断的表达提供理论基础，最终实现在II型糖尿病中的治疗作用。
背景技术
胰高血糖素样肽I，简称GLP-1，由胰高血糖素原基因表达，肠粘膜L细胞、胰岛α细胞、及神经元均有该基因存在，其中肠道细胞和神经元中胰高血糖素原基因的表达产物是GLP-1。GLP-1有两种生物活性形式，分别为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺，GLP-1约80％的循环活性来自GLP-1(7-36)酰胺。
GLP-1作为一种肠促胰素，由肠道L细胞分泌，具有葡萄糖依赖的胰岛素促泌作用、抑制胰高血糖素分泌、刺激β细胞增殖分化和抑制β细胞凋亡、抑制食欲及摄食、延缓胃排空，能恢复II型糖尿病患者受损的“肠促胰素效应”，是一类新型的糖尿病治疗药物。但是，GLP-1在人体血液中极易被二肽氨肽酶Ⅳ降解，简称DPP IV，仅在血液中存在2分钟左右，所以在医学上多采用GLP-1类似物或者DPP IV抑制剂来延长GLP-1的生理作用时间。
本发明构建了pMG36e-GLP-1重组表达载体，采用乳酸乳球菌M1363作为表达菌株。乳酸乳球菌属于公认的益生菌，对人体有良好的益生作用，同时乳酸菌良好的耐酸、耐胆盐的特性，为重组菌株在肠道中发挥作用提供了基本条件，并且乳酸乳球菌在人体肠道中可以实现GLP-1持续不断地表达，避免GLP-1在血液中被DPP IV降解，从而无法发挥功能，从达到缓解和治疗II型糖尿病的功效。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种分泌表达胰高血糖素样肽I的乳酸乳球菌MG1363的制备方法及其在治疗II型糖尿病中的应用，建立了一种GLP-1乳酸乳球菌表达系统，通过乳酸乳球菌的肠道定植和GLP-1的持续表达，发挥GLP-1间接降血糖的功能，从而实现对II型糖尿病的缓解和治疗作用；
本发明所述制备方法包括下列步骤：
一、pMG36e-GLP-1重组质粒构建
1、PstI-SPusp45-GLP-1-HindIII全序列化学合成
获得pUC57-GLP-1重组质粒；
2、构建pMG36e-GLP-1重组质粒
A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pMG36e，pUC57-GLP-1质粒；
B酶切
pMG36e，pUC57-GLP-1酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；
C配制2％琼脂糖凝胶电泳，110V电压下电泳45min；在276bp和3600bp切胶回收；
D酶连
酶连体系如下，总体系10μL，Fragment：Vector＝5：1和10：1，10℃过夜；
E转化
a从-80℃冰箱中取200μL MC1061感受态细胞悬液，冰上解冻；
b加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；
c 42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min；
d向管中加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态。离心4000rpm，1min。弃上清800μL，留200μL菌液，混匀；
e将上述菌液摇匀后取200μL涂布于含300ng/μL红霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h，挑取单克隆；
F送公司测序；
G测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒pMG36e-GLP-1，保存备用，步骤同步骤一；
二、pMG36e-GLP-1电转乳酸乳球菌MG1363
A乳酸菌感受态制备
a取-80℃冻存的乳酸乳球菌MG1363接种于5mL含有5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃过夜培养；
b将获得菌液按照1％接种于含有2.5％Gly和5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃静置培养至菌体OD600值为0.3-0.4，收集备用；
c将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4℃离心5000rpm/min，5min；收集菌体；
d沉淀用冰冷的10％蔗糖和10％甘油混合溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000rpm/min，5min，收集沉淀。
e最后沉淀重悬于1/100体积10％蔗糖和10％甘油混合溶液中，冰浴10min后即可使用。
B乳酸乳球菌MG1363电转化
a取2μL重组质粒，浓度不低于150ng/μL，与上述方法制备的50μL冰冷的乳酸菌感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1cm电击杯中，置于冰上静置5min，设置条件为1800V，200Ω，25μF；
b电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离心管中，同时计入800μL的含5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃培养2h，取100μL转化后产物涂布在含有红霉素抗性的含5％葡萄糖的M17平板上，30℃静置培养24-72h，筛选阳性克隆子；
三、Western检测pMG36e-GLP-1在乳酸乳球菌中的分泌表达
A电泳
a配制12％SDS-PAGE凝胶
b样品处理
将含有pMG36e-GLP-1的乳酸乳球菌MG1363培养36h-48h，收集上清和沉淀；将上述收集的蛋白样品中加入浓度4×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
c上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内；电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液；100V电泳90～120min；
B Western检测
a采用硝酸纤维素膜转膜，即NC膜；条件为80V 45min；
b转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；
c加入Western封闭液，即5％脱脂牛奶，在摇床上缓慢摇动，室温封闭90分钟；
d兔源GLP-1多克隆抗体按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含一抗的5％脱脂牛奶中4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜，TBST洗涤三次，每次10min；
e辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含二抗的5％脱脂牛奶中，在侧摆摇床上缓慢摇动孵育60min，TBST洗涤三次，每次10min；
f显色液A液和B液各250μL 1:1避光混合，现配现用，曝光。
本发明所述制备分泌表达胰高血糖素样肽I的乳酸乳球菌MG1363的应用为：
一、链脲佐菌素诱导二型糖尿病小鼠模型的建立
SPF级小鼠随机分为正常对照组10只和模型组10只。正常对照组小鼠饲喂普通饲料4周后，小鼠腹腔注射STZ溶剂(柠檬酸缓冲液，即0.1M柠檬酸钠︰0.1M柠檬酸为1︰1.32，pH＝4.5)，饲喂普通饲料3周；模型组小鼠饲喂高脂高糖饲料4周后，腹腔一次性注射100mg/kg的STZ，继续饲喂高脂高糖饲料3周。小鼠II型糖尿病成模标准:空腹血糖≥11.1mmol/L，且有多饮、多尿、多食、体重增加不明显，即为造模成功。二、重组菌pMG36e-GLP-1乳酸乳球菌MG1363灌胃
将造模成功后的小鼠，灌胃重组MG1363，菌液经生理盐水洗涤2次后，隔天灌胃一次，标准为5×106CFU/kg，共进行5次；正常组饲喂普通饲料，造模组饲喂高脂高糖饲料；
三、组织样品收集
正常对照组和造模组分别在最后一次灌胃结束、结束后第七天、结束后第14天取小鼠血液、肠组织和肝组织，组织破碎后检测是否表达GLP-1；并检测小鼠血糖含量和胰岛素含量与正常组是否一致。
本发明的有益效果：本发明通过构建pMG36e-GLP-1组成型表达载体，在添加乳酸乳球菌穿膜肽SPusp45后，采用电转的方法将重组质粒转入乳酸乳球菌MG1363实现GLP-1的分泌表达。同时，乳酸乳球菌优良的耐酸、耐胆盐和其益生特性，为其在肠道中的定植和持续不断的表达提供理论基础，最终实现在II型糖尿病中的治疗作用。
具体实施方式
本发明所述制备方法包括下列步骤：
一、pMG36e-GLP-1重组质粒构建
1、PstI-SPusp45-GLP-1-HindIII全序列化学合成
获得pUC57-GLP-1重组质粒；
2、构建pMG36e-GLP-1重组质粒
A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pMG36e，pUC57-GLP-1质粒；
B酶切
pMG36e，pUC57-GLP-1酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；
C配制2％琼脂糖凝胶电泳，110V电压下电泳45min；在276bp和3600bp切胶回收；
D酶连
酶连体系如下，总体系10μL，Fragment：Vector＝5：1和10：1，10℃过夜；
E转化
a从-80℃冰箱中取200μL MC1061感受态细胞悬液，冰上解冻；
b加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；
c 42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min；
d向管中加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态。离心4000rpm，1min。弃上清800μL，留200μL菌液，混匀；
e将上述菌液摇匀后取200μL涂布于含300ng/μL红霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h，挑取单克隆；
F送公司测序；
G测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒pMG36e-GLP-1，保存备用，步骤同步骤一；
二、pMG36e-GLP-1电转乳酸乳球菌MG1363
A乳酸菌感受态制备
a取-80℃冻存的乳酸乳球菌MG1363接种于5mL含有5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃过夜培养；
b将获得菌液按照1％接种于含有2.5％Gly和5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃静置培养至菌体OD600值为0.3-0.4，收集备用；
c将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4℃离心5000rpm/min，5min；收集菌体；
d沉淀用冰冷的10％蔗糖和10％甘油混合溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000rpm/min，5min，收集沉淀。
e最后沉淀重悬于1/100体积10％蔗糖和10％甘油混合溶液中，冰浴10min后即可使用。
B乳酸乳球菌MG1363电转化
a取2μL重组质粒，浓度不低于150ng/μL，与上述方法制备的50μL冰冷的乳酸菌感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1cm电击杯中，置于冰上静置5min，设置条件为1800V，200Ω，25μF；
b电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离心管中，同时计入800μL的含5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃培养2h，取100μL转化后产物涂布在含有红霉素抗性的含5％葡萄糖的M17平板上，30℃静置培养24-72h，筛选阳性克隆子；
三、Western检测pMG36e-GLP-1在乳酸乳球菌中的分泌表达
A电泳
a配制12％SDS-PAGE凝胶
b样品处理
将含有pMG36e-GLP-1的乳酸乳球菌MG1363培养36h-48h，收集上清和沉淀；将上述收集的蛋白样品中加入浓度4×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
c上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内；电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液；100V电泳90～120min；
B Western检测
a采用硝酸纤维素膜转膜，即NC膜；条件为80V 45min；
b转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；
c加入Western封闭液，即5％脱脂牛奶，在摇床上缓慢摇动，室温封闭90分钟；
d兔源GLP-1多克隆抗体按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含一抗的5％脱脂牛奶中4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜，TBST洗涤三次，每次10min；
e辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含二抗的5％脱脂牛奶中，在侧摆摇床上缓慢摇动孵育60min，TBST洗涤三次，每次10min；
f显色液A液和B液各250μL 1:1避光混合，现配现用，曝光。
本发明所述制备分泌表达胰高血糖素样肽I的乳酸乳球菌MG1363的应用为：
一、链脲佐菌素诱导二型糖尿病小鼠模型的建立
SPF级小鼠随机分为正常对照组10只和模型组10只。正常对照组小鼠饲喂普通饲料4周后，小鼠腹腔注射STZ溶剂(柠檬酸缓冲液，即0.1M柠檬酸钠︰0.1M柠檬酸为1︰1.32，pH＝4.5)，饲喂普通饲料3周；模型组小鼠饲喂高脂高糖饲料4周后，腹腔一次性注射100mg/kg的STZ，继续饲喂高脂高糖饲料3周。小鼠II型糖尿病成模标准:空腹血糖≥11.1mmol/L，且有多饮、多尿、多食、体重增加不明显，即为造模成功。
二、重组菌pMG36e-GLP-1乳酸乳球菌MG1363灌胃
将造模成功后的小鼠，灌胃重组MG1363，菌液经生理盐水洗涤2次后，隔天灌胃一次，标准为5×106CFU/kg，共进行5次；正常组饲喂普通饲料，造模组饲喂高脂高糖饲料；
三、组织样品收集
正常对照组和造模组分别在最后一次灌胃结束、结束后第七天、结束后第14天取小鼠血液、肠组织和肝组织，组织破碎后检测是否表达GLP-1；并检测小鼠血糖含量和胰岛素含量与正常组是否一致。

Claims (2)

1.一种分泌表达GLP-1的乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于：
一、pMG36e-GLP-1重组质粒构建
1、PstI-SPusp45-GLP-1-HindIII全序列化学合成
获得pUC57-GLP-1重组质粒；
2、构建pMG36e-GLP-1重组质粒
A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pMG36e，pUC57-GLP-1质粒；
B酶切
pMG36e，pUC57-GLP-1酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；
C配制2％琼脂糖凝胶电泳，110V电压下电泳45min；在276bp和3600bp切胶回收；
D酶连
酶连体系如下，总体系10μL，Fragment：Vector＝5：1和10：1，10℃过夜；
E转化
a从-80℃冰箱中取200μL MC1061感受态细胞悬液，冰上解冻；
b加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；
c 42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min；
d向管中加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，离心4000rpm，1min，弃上清800μL，留200μL菌液，混匀；
e将上述菌液摇匀后取200μL涂布于含300ng/μL红霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h，挑取单克隆；
F送公司测序；
G测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒pMG36e-GLP-1，保存备用，步骤同步骤一；
二、pMG36e-GLP-1电转乳酸乳球菌MG1363
A乳酸菌感受态制备
a取-80℃冻存的乳酸乳球菌MG1363接种于5mL含有5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃过夜培养；
b将获得菌液按照1％接种于含有2.5％Gly和5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃静置培养至菌体OD600值为0.3-0.4，收集备用；
c将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4℃离心5000rpm/min，5min；收集菌体；
d沉淀用冰冷的10％蔗糖和10％甘油混合溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000rpm/min，5min，收集沉淀；
e最后沉淀重悬于1/100体积10％蔗糖和10％甘油混合溶液中，冰浴10min后使用；
B乳酸乳球菌MG1363电转化
a取2μL重组质粒，浓度不低于150ng/μL，与上述方法制备的50μL冰冷的乳酸菌感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1cm电击杯中，置于冰上静置5min，设置条件为1800V，200Ω，25μF；
b电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离心管中，同时计入800μL的含5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃培养2h，取100μL转化后产物涂布在含有红霉素抗性的含5％葡萄糖的M17平板上，30℃静置培养24-72h，筛选阳性克隆子；
三、Western检测pMG36e-GLP-1在乳酸乳球菌中的分泌表达
A电泳
a配制12％SDS-PAGE凝胶
b样品处理
将含有pMG36e-GLP-1的乳酸乳球菌MG1363培养36h-48h，收集上清和沉淀；将上述收集的蛋白样品中加入浓度4×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白；
c上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内；电泳时电泳液使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液；100V电泳90～120min；
B Western检测
a采用硝酸纤维素膜转膜，即NC膜；条件为80V 45min；
b转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；
c加入Western封闭液，即5％脱脂牛奶，在摇床上缓慢摇动，室温封闭90分钟；
d兔源GLP-1多克隆抗体按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含一抗的5％脱脂牛奶中4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜，TBST洗涤三次，每次10min；
e辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含二抗的5％脱脂牛奶中，在侧摆摇床上缓慢摇动孵育60min，TBST洗涤三次，每次10min；
f显色液A液和B液各250μL 1:1避光混合，现配现用，曝光。
2.一种分泌表达GLP-1的乳酸乳球菌的应用，其特征在于：
一、链脲佐菌素诱导二型糖尿病小鼠模型的建立
SPF级小鼠随机分为正常对照组10只和模型组10只；正常对照组小鼠饲喂普通饲料4周后，小鼠腹腔注射STZ溶剂，所述溶剂为柠檬酸缓冲液，即0.1M柠檬酸钠︰0.1M柠檬酸为1︰1.32，pH＝4.5，饲喂普通饲料3周；模型组小鼠饲喂高脂高糖饲料4周后，腹腔一次性注射100mg/kg的STZ，继续饲喂高脂高糖饲料3周；小鼠II型糖尿病成模标准:空腹血糖≥11.1mmol/L，且有多饮、多尿、多食、体重增加不明显，即为造模成功；
二、重组菌pMG36e-GLP-1乳酸乳球菌MG1363灌胃
将造模成功后的小鼠，灌胃重组MG1363，菌液经生理盐水洗涤2次后，隔天灌胃一次，标准为5×106CFU/kg，共进行5次；正常组饲喂普通饲料，造模组饲喂高脂高糖饲料；
三、组织样品收集
正常对照组和造模组分别在最后一次灌胃结束、结束后第七天、结束后第14天取小鼠血液、肠组织和肝组织，组织破碎后检测是否表达GLP-1；并检测小鼠血糖含量和胰岛素含量与正常组是否一致。
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