CN105925598A - 分泌表达glp-1的减毒鼠伤寒沙门氏菌的制备方法及应用 - Google Patents

分泌表达glp-1的减毒鼠伤寒沙门氏菌的制备方法及应用 Download PDF

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CN105925598A CN201610318452.3A CN201610318452A CN105925598A CN 105925598 A CN105925598 A CN 105925598A CN 201610318452 A CN201610318452 A CN 201610318452A CN 105925598 A CN105925598 A CN 105925598A
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辛洪波
陈廷涛
王鑫
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Abstract

一种分泌表达GLP‑1的减毒鼠伤寒沙门氏菌的制备方法及应用，是通过化学合成人源胰高血糖素样肽I基因，简称GLP‑1，即1‑37个氨基酸的有效功能区域，并加入真核细胞特有的分泌表达穿膜肽基因,构建pLive‑GLP‑1重组质粒，电转进入减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，实现GLP‑1的分泌表达，并通过口服或静脉注射进入人体血液循环后可以实现GLP‑1的持续表达，实现对II型糖尿病病症的缓解和治疗作用。

Description

分泌表达GLP-1的减毒鼠伤寒沙门氏菌的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种分泌表达胰高血糖素样肽I的减毒鼠伤寒沙门氏菌在治疗II型糖尿病中的应用，通过构建pLive-GLP-1表达载体，在添加真核细胞穿膜肽后，采用电转的方法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，利用减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009穿梭细胞的特性，实现GLP-1在细胞中的分泌表达，并通过静脉注射等方式实现人体内表达，达到缓解和治疗II型糖尿病的作用
背景技术
胰高血糖素样肽I，简称GLP-1，由胰高血糖素原基因表达，肠粘膜L细胞、胰岛α细胞、及神经元均有该基因存在，其中肠道细胞和神经元中胰高血糖素原基因的表达产物是GLP-1。GLP-1有两种生物活性形式，分别为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺，GLP-1约80％的循环活性来自GLP-1(7-36)酰胺。
GLP-1作为一种肠促胰素，由肠道L细胞分泌，具有葡萄糖依赖的胰岛素促泌作用、抑制胰高血糖素分泌、刺激β细胞增殖分化和抑制β细胞凋亡、抑制食欲及摄食、延缓胃排空，能恢复II型糖尿病患者受损的“肠促胰素效应”，是一类新型的糖尿病治疗药物。但是，GLP-1在人体血液中极易被二肽氨肽酶Ⅳ降解，简称DPP IV，仅在血液中存在2分钟左右，所以在医学上多采用GLP-1类似物或者DPP IV抑制剂来延长GLP-1的生理作用时间。
与此同时，减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009属于敲除其毒理基因的改造菌株，由于该改造菌株毒性小，且均有良好的穿梭细胞的特性，现今已有多种利用减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009表达的药物进入1期、2期、3期临床实验，安全性可靠。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分泌表达胰高血糖素样肽I的减毒鼠伤寒沙门氏菌的制备方法及其在治疗II型糖尿病中的应用，建立了一种GLP-1减速鼠伤寒沙门氏菌VMNP20009表达系统，通过该菌穿梭细胞的特性实现细胞内GLP-1的表达，发挥GLP-1间接降血糖的功能，从而实现对II型糖尿病的缓解和治疗作用；
本发明所述制备方法包括下列步骤：
一、pLive-GLP-1重组质粒构建
1、通过生物信息学分析，选择GLP-1氨基酸序列1-37，同时设计在GLP-1前面加一穿膜肽，序列N端和C端加NheI和BamHI两个酶切位点。之后将设计好的序列交测序公司合成，得到pUC57-GLP-1重组质粒；
2、构建pLive-GLP-1重组质粒
A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pLive，pUC57-GLP-1质粒；
B酶切
pLive，pUC57-GLP-1酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；
C配制2％琼脂糖凝胶电泳；110V电压下电泳45min，在片段168bp和载体3400bp切胶回收；
D酶连
体系如下，总体系10μL，Fragment：Vector＝5：1和10：1，10℃过夜；
E转化
a从-80℃冰箱中取200μL Top 10感受态细胞悬液，冰上解冻；
b加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；
c42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min；
d向管中加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态。离心4000rpm，1min。弃上清800μL，留200μL菌液，混匀；
e将上述菌液摇匀后取200μL涂布于含50ng/μL Kan的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h，挑取单克隆；
F送公司测序；
G测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒pLive-GLP-1，保存备用，步骤同步骤一；
二、pLive-GLP-1电转减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009
A减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009感受态制备
a取-80℃冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009接种于5mL LB液体培养基中，37℃过夜培养；
b将获得菌液按照1％接种于LB液体培养基中，37℃静置培养至菌体OD600值为0.3-0.4，收集备用；
c将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4℃离心5000rpm/min，5min；收集菌体；
d沉淀用冰冷的10％甘油溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000rpm/min，5min，收集沉淀。
e最后沉淀重悬于1/100体积10％甘油溶液中，冰浴10min后即可使用。
B减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009电转化
a取2μL重组质粒，浓度不低于150ng/μL，与上述方法制备的50μL冰冷的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1cm电击杯中，置于冰上静置5min，设置条件为1800V，200Ω，25μF；
b电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离心管中，同时计入800μL的LB液体培养基中，37℃培养1.5h，取100μL转化后产物涂布在含有50ng/μL Kan抗性的LB平板上，37℃静置培养12h，筛选阳性克隆子；
三、减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009与人源胚胎肾细胞293-T细胞共培养
A将293-T细胞按照50000个/孔接种到24孔板中,第二天备用；
B将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009复苏，过夜培养；
C当VNP2009长至108CFU/mL，采用等体积不含双抗的含有10％胎牛血清的DMEM培养基洗涤细菌3次，按照细菌：细胞200：1接种24孔板，处理6-8h；更换含双抗的含有10％胎牛血清的DMEM培养基，处理36h；
D收集细胞培养的上清和沉淀进行蛋白检测；
四、Western检测pLive-GLP-1在293-T细胞中的分泌表达
A电泳
a配制12％SDS-PAGE凝胶
b样品处理
将上述收集的蛋白样品中加入浓度4×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，终浓度为1×，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
c上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内；电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液；100V电泳90～120min；
B Western检测
a采用硝酸纤维素膜转膜，即NC膜；条件为80V 45min；
b转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；
c加入Western封闭液，即5％脱脂牛奶，在摇床上缓慢摇动，室温封闭90分钟；
d兔源GLP-1多克隆抗体按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含一抗的5％脱脂牛奶中4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜，TBST洗涤三次，每次10min；
e辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含二抗的5％脱脂牛奶中，在侧摆摇床上缓慢摇动孵育60min，TBST洗涤三次，每次10min；
f显色液A液和B液各250μL 1:1避光混合，现配现用，曝光。
本发明所述分泌表达胰高血糖素样肽I的减毒鼠伤寒沙门氏菌的应用为：
一、链脲佐菌素诱导二型糖尿病小鼠模型的建立
SPF级小鼠随机分为正常对照组10只和模型组10只。正常对照组小鼠饲喂普通饲料4周后，小鼠腹腔注射STZ溶剂(柠檬酸缓冲液，即0.1M柠檬酸钠：0.1M柠檬酸为1：1.32，pH＝4.5)，饲喂普通饲料3周；模型组小鼠饲喂高脂高糖饲料4周后，腹腔一次性注射100mg/kg的STZ，继续饲喂高脂高糖饲料3周。小鼠II型糖尿病成模标准:空腹血糖≥11.1mmol/L，且有多饮、多尿、多食、体重增加不明显，即为造模成功。
二、减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009灌胃
将造模成功后的小鼠，灌胃重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，菌液经生理盐水洗涤2次后，隔天灌胃一次，标准为5×106CFU/kg，共进行5次；正常组饲喂普通饲料，造模组饲喂高脂高糖饲料；
三、组织样品收集
正常对照组和造模组分别在尾静脉注射后第七天，取小鼠血液、肠组织和肝组织，组织破碎后检测是否表达GLP-1；并检测小鼠血糖含量和胰岛素含量是否与正常组一致。
本发明的有益效果：本发明通过构建pLive-GLP-1表达载体，在添加真核细胞穿膜肽后，采用电转的方法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，利用减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009穿梭细胞的特性，实现GLP-1在细胞中的分泌表达，并通过静脉注射等方式实现人体内表达，达到缓解和治疗II型糖尿病的作用。
具体实施方式
本发明所述制备方法包括下列步骤：
一、pLive-GLP-1重组质粒构建
1、通过生物信息学分析，选择GLP-1氨基酸序列1-37，同时设计在GLP-1前面加一穿膜肽，序列N端和C端加NheI和BamHI两个酶切位点。之后将设计好的序列交测序公司合成，得到pUC57-GLP-1重组质粒；
2、构建pLive-GLP-1重组质粒
A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pLive，pUC57-GLP-1质粒；
B酶切
pLive，pUC57-GLP-1酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；
C配制2％琼脂糖凝胶电泳；110V电压下电泳45min，在片段168bp和载体3400bp切胶回收；
D酶连
体系如下，总体系10μL，Fragment：Vector＝5：1和10：1，10℃过夜；
E转化
a从-80℃冰箱中取200μL Top 10感受态细胞悬液，冰上解冻；
b加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；
c42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min；
d向管中加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态。离心4000rpm，1min。弃上清800μL，留200μL菌液，混匀；
e将上述菌液摇匀后取200μL涂布于含50ng/μL Kan的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h，挑取单克隆；
F送公司测序；
G测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒pLive-GLP-1，保存备用，步骤同步骤一；
二、pLive-GLP-1电转减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009
A减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009感受态制备
a取-80℃冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009接种于5mL LB液体培养基中，37℃过夜培养；
b将获得菌液按照1％接种于LB液体培养基中，37℃静置培养至菌体OD600值为0.3-0.4，收集备用；
c将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4℃离心5000rpm/min，5min；收集菌体；
d沉淀用冰冷的10％甘油溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000rpm/min，5min，收集沉淀。
e最后沉淀重悬于1/100体积10％甘油溶液中，冰浴10min后即可使用。
B减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009电转化
a取2μL重组质粒，浓度不低于150ng/μL，与上述方法制备的50μL冰冷的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1cm电击杯中，置于冰上静置5min，设置条件为1800V，200Ω，25μF；
b电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离心管中，同时计入800μL的LB液体培养基中，37℃培养1.5h，取100μL转化后产物涂布在含有50ng/μL Kan抗性的LB平板上，37℃静置培养12h，筛选阳性克隆子；
三、减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009与人源胚胎肾细胞293-T细胞共培养
A将293-T细胞按照50000个/孔接种到24孔板中,第二天备用；
B将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009复苏，过夜培养；
C当VNP2009长至108CFU/mL，采用等体积不含双抗的含有10％胎牛血清的DMEM培养基洗涤细菌3次，按照细菌：细胞200：1接种24孔板，处理6-8h；更换含双抗的含有10％胎牛血清的DMEM培养基，处理36h；
D收集细胞培养的上清和沉淀进行蛋白检测；
四、Western检测pLive-GLP-1在293-T细胞中的分泌表达
A电泳
a配制12％SDS-PAGE凝胶
b样品处理
将上述收集的蛋白样品中加入浓度4×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，终浓度为1×，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
c上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内；电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液；100V电泳90～120min；
B Western检测
a采用硝酸纤维素膜转膜，即NC膜；条件为80V 45min；
b转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；
c加入Western封闭液，即5％脱脂牛奶，在摇床上缓慢摇动，室温封闭90分钟；
d兔源GLP-1多克隆抗体按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含一抗的5％脱脂牛奶中4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜，TBST洗涤三次，每次10min；
e辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含二抗的5％脱脂牛奶中，在侧摆摇床上缓慢摇动孵育60min，TBST洗涤三次，每次10min；
f显色液A液和B液各250μL 1:1避光混合，现配现用，曝光。
本发明所述分泌表达胰高血糖素样肽I的减毒鼠伤寒沙门氏菌的应用为：
一、链脲佐菌素诱导二型糖尿病小鼠模型的建立
SPF级小鼠随机分为正常对照组10只和模型组10只。正常对照组小鼠饲喂普通饲料4周后，小鼠腹腔注射STZ溶剂(柠檬酸缓冲液，即0.1M柠檬酸钠：0.1M柠檬酸为1：1.32，pH＝4.5)，饲喂普通饲料3周；模型组小鼠饲喂高脂高糖饲料4周后，腹腔一次性注射100mg/kg的STZ，继续饲喂高脂高糖饲料3周。小鼠II型糖尿病成模标准:空腹血糖≥11.1mmol/L，且有多饮、多尿、多食、体重增加不明显，即为造模成功。
二、减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009灌胃
将造模成功后的小鼠，灌胃重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，菌液经生理盐水洗涤2次后，隔天灌胃一次，标准为5×106CFU/kg，共进行5次；正常组饲喂普通饲料，造模组饲喂高脂高糖饲料；
三、组织样品收集
正常对照组和造模组分别在尾静脉注射后第七天，取小鼠血液、肠组织和肝组织，组织破碎后检测是否表达GLP-1；并检测小鼠血糖含量和胰岛素含量是否与正常组一致。

Claims (2)

1.一种分泌表达GLP-1的减毒鼠伤寒沙门氏菌的制备方法，其特征在于：
一、pLive-GLP-1重组质粒构建
a)通过生物信息学分析，选择GLP-1氨基酸序列1-37，同时设计在GLP-1前面加一穿膜肽，序列N端和C端加NheI和BamHI两个酶切位点。之后将设计好的序列交测序公司合成，得到pUC57-GLP-1重组质粒；
b)构建pLive-GLP-1重组质粒
A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pLive，pUC57-GLP-1质粒；
B酶切
pLive，pUC57-GLP-1酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；
C配制2％琼脂糖凝胶电泳；110V电压下电泳45min，在片段168bp和载体3400bp切胶回收；
D酶连
体系如下，总体系10μL，Fragment：Vector＝5：1和10：1，10℃过夜；
E转化
a从-80℃冰箱中取200μL Top 10感受态细胞悬液，冰上解冻；
b加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；
c42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min；
d向管中加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态。离心4000rpm，1min；弃上清800μL，留200μL菌液，混匀；
e将上述菌液摇匀后取200μL涂布于含50ng/μL Kan的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h，挑取单克隆；
F送公司测序；
G测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒pLive-GLP-1，保存备用，步骤同步骤一；
二、pLive-GLP-1电转减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009
A减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009感受态制备
a取-80℃冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009接种于5mL LB液体培养基中，37℃过夜培养；
b将获得菌液按照1％接种于LB液体培养基中，37℃静置培养至菌体OD600值为0.3-0.4，收集备用；
c将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4℃离心5000rpm/min，5min；收集菌体；
d沉淀用冰冷的10％甘油溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000rpm/min，5min，收集沉淀；
e最后沉淀重悬于1/100体积10％甘油溶液中，冰浴10min后使用；
B减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009电转化
a取2μL重组质粒，浓度不低于150ng/μL，与上述方法制备的50μL冰冷的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1cm电击杯中，置于冰上静置5min，设置条件为1800V，200Ω，25μF；
b电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离心管中，同时计入800μL的LB液体培养基中，37℃培养1.5h，取100μL转化后产物涂布在含有50ng/μL Kan抗性的LB平板上，37℃静置培养12h，筛选阳性克隆子；
三、减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009与人源胚胎肾细胞293-T细胞共培养
A将293-T细胞按照50000个/孔接种到24孔板中,第二天备用；
B将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009复苏，过夜培养；
C当VNP2009长至108CFU/mL，采用等体积不含双抗的含有10％胎牛血清的DMEM培养基洗涤细菌3次，按照细菌：细胞200：1接种24孔板，处理6-8h；更换含双抗的含有10％胎牛血清的DMEM培养基，处理36h；
D收集细胞培养的上清和沉淀进行蛋白检测；
四、Western检测pLive-GLP-1在293-T细胞中的分泌表达
A电泳
a配制12％SDS-PAGE凝胶
b样品处理
将上述收集的蛋白样品中加入浓度4×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，终浓度为1×，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白；
c上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内；电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液；100V电泳90～120min；
B Western检测
a采用硝酸纤维素膜转膜，即NC膜；条件为80V 45min；
b转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；
c加入Western封闭液，即5％脱脂牛奶，在摇床上缓慢摇动，室温封闭90分钟；
d兔源GLP-1多克隆抗体按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含一抗的5％脱脂牛奶中4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜，TBST洗涤三次，每次10min；
e辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含二抗的5％脱脂牛奶中，在侧摆摇床上缓慢摇动孵育60min，TBST洗涤三次，每次10min；
f显色液A液和B液各250μL 1:1避光混合，现配现用，曝光。
2.一种分泌表达GLP-1的减毒鼠伤寒沙门氏菌的应用，其特征在于：
一、链脲佐菌素诱导二型糖尿病小鼠模型的建立
SPF级小鼠随机分为正常对照组10只和模型组10只，正常对照组小鼠饲喂普通饲料4周后，小鼠腹腔注射STZ溶剂，所述溶剂为柠檬酸缓冲液，即0.1M柠檬酸钠：0.1M柠檬酸为1：1.32，pH＝4.5，饲喂普通饲料3周；模型组小鼠饲喂高脂高糖饲料4周后，腹腔一次性注射100mg/kg的STZ，继续饲喂高脂高糖饲料3周，小鼠II型糖尿病成模标准:空腹血糖≥11.1mmol/L，且有多饮、多尿、多食、体重增加不明显，即为造模成功；
二、减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009灌胃
将造模成功后的小鼠，灌胃重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，菌液经生理盐水洗涤2次后，隔天灌胃一次，标准为5×106CFU/kg，共进行5次；正常组饲喂普通饲料，造模组饲喂高脂高糖饲料；
三、组织样品收集
正常对照组和造模组分别在尾静脉注射后第七天，取小鼠血液、肠组织和肝组织，组织破碎后检测是否表达GLP-1；并检测小鼠血糖含量和胰岛素含量是否与正常组一致。
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