CN106755036A - 一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，该技术方案依托于一种特异性识别TEM1蛋白的单链抗体，结合减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的肿瘤内特异性聚集及胞内侵袭的特性，携带细胞凋亡诱导因子Aif达到特异性杀伤肿瘤的效果。具体来看，本发明首先构建了Abvec‑Igk‑Aif、Abvec‑Igk‑T18‑Aif重组质粒，经扩增后通过电击转化的方式导入鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株，利用减毒鼠伤寒沙门氏菌胞内侵袭的特性，以HEK293‑T细胞为宿主实现蛋白的表达，最后利用含青霉素、链霉素的血清培养基杀死细胞内外的减毒鼠伤寒沙门氏菌，使重组质粒释放至真核细胞中，经细胞破碎后即得到含有目的蛋白的上清液，该上清液即属于本发明所述药物的一种存在形式。

Description

一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，进一涉及基因重组与转染方法的研究，同时涉及目的蛋白的表达及其功能验证，具体涉及一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法。
背景技术
细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)，是一类存在于线粒体内外膜之间的保守的黄素蛋白，可诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。人的AIF基因位于Xq25-26，其转录产生的mRNA的长度为2.4kb，编码产生的蛋白质有三个不同长度的可变剪接体，它们的氨基酸数分别为613、609和326。除可诱导细胞凋亡外，AIF兼具氧化还原酶的活性。
当细胞受到特定的凋亡诱导信号的刺激后，线粒体膜上的通透性孔道(mitochondrial permeability transition pores，MPTP)打开，允许AIF从线粒体释放到胞浆，并进入细胞核中，和另一个线粒体蛋白endonuclease G(Endo G)一起，引起核内DNA凝集并断裂成50kb大小的片段
在介导细胞凋亡过程时，AIF有两个方面的作用：一是可以作为细胞凋亡的起始因子，二是可以作为细胞凋亡的直接效应因子。在正常的情况下，AIF存在于线粒体中，可以清除细胞内的自由基从而阻止细胞凋亡；当细胞受到凋亡刺激后。AIF首先从线粒体出来，然后转移至细胞质中，最后转移到细胞核中发挥促进细胞凋亡的作用。
内皮唾液酸蛋白(TEM1/CD248)是Ⅰ型跨膜蛋白，由一个被糖基化修饰的80.9KDa的蛋白核心区组成，修饰后成熟的糖蛋白大约在175KDa。TEM1是近期发现的人类肿瘤标记物之一，其对肿瘤的细胞生长血管生成浸润及转移有重要作用。
TEM1外部分由五个球状结构域(N端的C型凝集素结构域，寿司样结构域，和三个表皮生长因子(EGF)样重复)和一个粘蛋白样区组成，其中核心蛋白大量唾液酸化与血栓调节蛋白相似。对于成体组织，TEM1的表达分布是这样的：子宫>肾小球>输卵管血管>心和肺>其他组织；另外，在内皮祖细胞中TEM1表达量相对很少。然而，在以下肿瘤中TEM1都有高表达，如肉瘤，脑肿瘤，乳腺癌，皮肤癌、结肠癌，且实验表明在卵巢癌中，TEM1表达与肿瘤的浸润、预后密切相关。因此，TEM1在正常组织不表达或者低表达，而在肿瘤血管组织高表达的特点，预示了TEM1作为肿瘤诊断和治疗的靶标分子的潜力。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，以解决现有技术中天然结构的细胞凋亡诱导因子AIF对肿瘤细胞的攻击缺乏靶向作用。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中缺乏一种AIF与抗体偶联的靶向抗肿瘤药物。
本发明要解决的再一技术问题是在获得了整合有AIF-单链抗体复合物的表达基因的重组质粒的情况下，现有技术中对此类质粒的表达方法操作繁琐、蛋白表达水平较低。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，包括以下步骤：
1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18-AIF表达基因、序列如SEQ ID No.2所示的AIF表达基因，分别通过酶切方式与Abvec-Igk质粒连接，分别得到重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；
2)分别取步骤1)所得重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主细胞E.coli Top10中进行质粒扩增；
3)分别收集步骤2)扩增后的重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分别通过电转法导入处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株中，即分别得到载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述电转法的操作条件是：电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms；
4)取HEK293-T细胞与载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的细胞量为1:80～1:120的比例在细胞培养板中混合，或者取HEK293-T细胞与载体菌株Abvec-Igk-Aif-VNP20009以二者的细胞量为1:80～1:120的比例在细胞培养板中混合；混合后培养4～16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40～56h，而后破碎细胞收集上清。
作为优选，所述T18-AIF表达基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif为模板，以序列如SEQID No.4、SEQ ID No.5所示的DNA片段为引物，经PCR扩增得到的。
作为优选，所述AIF表达基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif为模板，以序列如SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6所示的DNA片段为引物，经PCR扩增得到的。
作为优选，步骤1)所述酶切方式是经Age I和Bsiw I双酶切，对酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Abvec-Igk质粒中。
作为优选，步骤3)所述处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株，是通过以下方法制备的：
A)取冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株划线接种于LB固体培养基培养至形成单菌落；
B)挑取单菌落接种于3～7ml LB液体培养基中，35～39℃振荡培养10～14h；
C)取步骤B)培养所得的菌液，按1:80～1:120的体积比接种于LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD值不小于0.4；
D)冰浴15～25min后，离心取沉淀用1/8～1/12体积预冷的无菌去离子水洗涤，而后离心取沉淀用1/80～1/120体积预冷的、8～12％(mL/mL)浓度的甘油洗涤菌体，再离心沉淀重悬于1/80～1/120体积预冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。
作为优选，HEK293-T细胞的加入量为8000～12000个/孔；HEK293-T细胞与载体菌株在细胞培养板中混合后每孔中液体总体积为380～420μL。
作为优选，所述针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素是青霉素和链霉素。
在以上技术方案中，所述Abvec-Igk质粒明确限定为：NCBI GenBank中编号为FJ475056的质粒，该质粒的基因序列如SEQ ID No.3所示。因此本发明中所述Abvec-Igk质粒不具有其他指向作用或概况作用。
在以上技术方案中，所述T18是一种特异性识别TEM1的单链抗体，该抗体的名称(即T18)属于自创词汇。所述T18-Aif表达基因是指整合有Aif表达基因的重组单链抗体T18的表达基因。作为一种自创词汇，T18-Aif表达基因的技术特征是由序列如SEQ ID No.1所示的DNA表征的；在知晓该具体序列的情况下，T18-Aif表达基因可以通过本领域中常规的DNA合成方法获得，当然也可以利用以上优选技术方案中所披露的PCR方法获得。
本发明提供了一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，该技术方案依托于一种特异性识别TEM1蛋白的单链抗体，结合减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的肿瘤内特异性聚集及胞内侵袭的特性，携带细胞凋亡诱导因子Aif达到特异性杀伤肿瘤的效果。具体来看，本发明首先构建了Abvec-Igk-Aif、Abvec-Igk-T18-Aif重组质粒，经扩增后通过电击转化的方式导入鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株，利用减毒鼠伤寒沙门氏菌胞内侵袭的特性，以HEK293-T细胞为宿主实现蛋白的表达，最后利用含青霉素、链霉素的血清培养基杀死细胞内外的减毒鼠伤寒沙门氏菌，使重组质粒释放至真核细胞中，经细胞破碎后即得到含有目的蛋白的上清液，该上清液即属于本发明所述药物的一种存在形式，当然也可以通过常规的分离方式加以纯化后，进行其他剂型的制备。
本发明中，结合实验室前期筛选的单链抗体T18作为生物导航，可结合人类TEM1抗原，亲和力强，特异性高。通过T18与人源化毒素Aif的融合表达，实现肿瘤细胞凋亡的最终目的。
同时，本发明以减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009作为治疗载体，综合应用了减毒鼠伤寒沙门氏菌胞内侵袭的特性和特异性聚集在实体瘤中的性质，进一步扩大了本发明中肿瘤杀伤的特异性。
此外，本发明的技术优势还体现在以下方面：
1、与当下流行的ADC药物相比，本研究所用的Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009除了具备抗体本身的靶向作用，其宿主菌VNP20009可特异性定植于肿瘤，因此Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009具有两个靶向肿瘤的弹头，其特异性靶向肿瘤的作用较当下流行的ADC更为准确；
2、Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009属于活菌，只需按照常规细菌培养方法即可获得大量的菌体用于肿瘤治疗；而当下流行的ADC药物需要昂贵的细胞培养系统、繁琐的抗体表达和纯化步骤、需要洁净度极高的GMP车间以及后期难度高的毒素偶联技术。因此，本发明使用的Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009除具有比ADC药物更高的疗效外，起生产成本可能仅为ADC药物的千分之一甚至万分之一。
3、Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009携带的抗体为全人源化抗体，毒素也为全人源化毒素，因此Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009表达的毒蛋白为全人源化蛋白，与人体无任何排斥性，安全性高且半衰期长。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中T18-Aif、Aif对肿瘤细胞杀伤效果评价图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
根据人源化毒素Aif合成基因片段，通过PCR方法将实验室可特异识别肿瘤标志物TEM1的单链抗体片段T18扩增。之后将Aif和T18一同或者单独构建入Abvec-Igk载体，获得重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif和Abvec-Igk-Aif。
将-80℃保存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落于5ml LB中，37℃振荡培养12h；按1：100比例接种于100ml LB中振荡培养至细菌OD＝0.4左右；冰浴20min后，4℃3000rpm离心10min；菌体沉淀用1/10体积预冷的无菌去离子水洗涤两次，4℃3000rpm离心10min；菌体沉淀再次用1/100体积预冷的10％甘油洗涤菌体，4℃3000rpm离心10min；将菌体沉淀重悬于1/100体积预冷的10％甘油中，制成VNP20009感受态分装后-80℃留存备用。
将已获得的重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif电转进入减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，采用0.1cm电转杯，条件设置为：1.8kv 200Ω25uF，电转4.7ms；通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，获得重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，命名为Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009、Abvec-Igk-Aif-VNP20009。
将HEK293T细胞与Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009、Abvec-Igk-Aif-VNP20009按1:50～200比例混合培养后，待细胞破碎后获取细胞混合液上清，即含有T18-Aif、Aif蛋白的上清。
将TEM1阴性细胞和阳性细胞按照10000/孔，接种于24孔板(采用不含青霉素和链霉素的培养基)，将T18-Aif、Aif蛋白的上清与原培养液上清按1:1与分别加入24孔板中，总体积400μL，培养1-4天，观察T18-Aif、Aif对TEM1对阴阳性细胞的杀伤效果。如图1所示，T18-Aif对TEM1阳性细胞杀伤明显，对TEM1阴性细胞无杀伤效果；Aif蛋白对TEM1阴阳性细胞均无杀伤效果。
实施例2
一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，包括以下步骤：
1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18-AIF表达基因、序列如SEQ ID No.2所示的AIF表达基因，分别通过酶切方式与Abvec-Igk质粒连接，分别得到重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；
2)分别取步骤1)所得重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主细胞E.coli Top10中进行质粒扩增；
3)分别收集步骤2)扩增后的重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分别通过电转法导入处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株中，即分别得到载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述电转法的操作条件是：电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms；
4)取HEK293-T细胞与载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的细胞量为1:80的比例在细胞培养板中混合；混合后培养4h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40h，而后破碎细胞收集上清。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
所述T18-AIF表达基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif为模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的DNA片段为引物，经PCR扩增得到的。
所述AIF表达基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif为模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6所示的DNA片段为引物，经PCR扩增得到的。
步骤1)所述酶切方式是经Age I和Bsiw I双酶切，对酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Abvec-Igk质粒中。
步骤3)所述处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株，是通过以下方法制备的：
A)取冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株划线接种于LB固体培养基培养至形成单菌落；
B)挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，35℃振荡培养10h；
C)取步骤B)培养所得的菌液，按1:80的体积比接种于LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD值为0.4；
D)冰浴15min后，离心取沉淀用1/8体积预冷的无菌去离子水洗涤，而后离心取沉淀用1/80体积预冷的、8％(mL/mL)浓度的甘油洗涤菌体，再离心沉淀重悬于1/80体积预冷的、8％(mL/mL)的甘油中。
HEK293-T细胞的加入量为8000个/孔；HEK293-T细胞与载体菌株在细胞培养板中混合后每孔中液体总体积为380μL。
所述针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素是青霉素和链霉素。
实施例3
一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，包括以下步骤：
1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18-AIF表达基因、序列如SEQ ID No.2所示的AIF表达基因，分别通过酶切方式与Abvec-Igk质粒连接，分别得到重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；
2)分别取步骤1)所得重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主细胞E.coli Top10中进行质粒扩增；
3)分别收集步骤2)扩增后的重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分别通过电转法导入处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株中，即分别得到载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述电转法的操作条件是：电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms；
4)取HEK293-T细胞与载体菌株Abvec-Igk-Aif-VNP20009以二者的细胞量为1:120的比例在细胞培养板中混合；混合后培养16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养56h，而后破碎细胞收集上清。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
所述AIF表达基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif为模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6所示的DNA片段为引物，经PCR扩增得到的。
步骤3)所述处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株，是通过以下方法制备的：
A)取冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株划线接种于LB固体培养基培养至形成单菌落；
B)挑取单菌落接种于7ml LB液体培养基中，39℃振荡培养14h；
C)取步骤B)培养所得的菌液，按1:120的体积比接种于LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD值为0.7；
D)冰浴25min后，离心取沉淀用1/12体积预冷的无菌去离子水洗涤，而后离心取沉淀用1/120体积预冷的、12％(mL/mL)浓度的甘油洗涤菌体，再离心沉淀重悬于1/120体积预冷的、12％(mL/mL)的甘油中。
HEK293-T细胞的加入量为12000个/孔；HEK293-T细胞与载体菌株在细胞培养板中混合后每孔中液体总体积为420μL。
实施例4
一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，包括以下步骤：
1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18-AIF表达基因、序列如SEQ ID No.2所示的AIF表达基因，分别通过酶切方式与Abvec-Igk质粒连接，分别得到重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；
2)分别取步骤1)所得重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主细胞E.coli Top10中进行质粒扩增；
3)分别收集步骤2)扩增后的重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分别通过电转法导入处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株中，即分别得到载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述电转法的操作条件是：电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms；
4)取HEK293-T细胞与载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的细胞量为1:120的比例在细胞培养板中混合；混合后培养10h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养48h，而后破碎细胞收集上清。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南昌大学
<120> 一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2376
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttagggctga caccagaaca gaaacagaaa aaggccgcgt tatctgcttc agaaggagag 60
gaagttcctc aagacaaggc gccaagtcat gttcctttcc tgctaattgg tggaggcaca 120
gctgcttttg ctgcagccag atccatccgg gctcgggatc ctggggccag ggtactgatt 180
gtatctgaag atcctgagct gccgtacatg cgacctcctc tttcaaaaga actgtggttt 240
tcagatgacc caaatgtcac aaagacactg cgattcaaac agtggaatgg aaaagagaga 300
agcatatatt tccagccacc ttctttctat gtctctgctc aggacctgcc tcatattgag 360
aatggtggtg tggctgtcct cactgggaag aaggtagtac agctggatgt gagagacaac 420
atggtgaaac ttaatgatgg ctctcaaata acctatgaaa agtgcttgat tgcaacagga 480
ggtactccaa gaagtctgtc tgccattgat agggctggag cagaggtgaa gagtagaaca 540
acgcttttca gaaagattgg agactttaga agcttggaga agatttcacg ggaagtcaaa 600
tcaattacga ttatcggtgg gggcttcctt ggtagcgaac tggcctgtgc tcttggcaga 660
aaggctcgag ccttgggcac agaagtgatt caactcttcc ccgagaaagg aaatatggga 720
aagatcctcc ccgaatacct cagcaactgg accatggaaa aagtcagacg agagggggtt 780
aaggtgatgc ccaatgctat tgtgcaatcc gttggagtca gcagtggcaa gttacttatc 840
aagctgaaag acggcaggaa ggtagaaact gaccacatag tggcagctgt gggcctggag 900
cccaatgttg agttggccaa gactggtggc ctggaaatag actcagattt tggtggcttc 960
cgggtaaatg cagagctaca agcacgctct aacatctggg tggcaggaga tgctgcatgc 1020
ttctacgata taaagttggg aaggaggcgg gtagagcacc atgatcacgc tgttgtgagt 1080
ggaagattgg ctggagaaaa tatgactgga gctgctaagc cgtactggca tcagtcaatg 1140
ttctggagtg atttgggccc cgatgttggc tatgaagcta ttggtcttgt ggacagtagt 1200
ttgcccacag ttggtgtttt tgcaaaagca actgcacaag acaaccccaa atctgccaca 1260
gagcagtcag gaactggtat ccgatcagag agtgagacag agtccgaggc ctcagaaatt 1320
actattcctc ccagcacccc ggcagttcca caggctcccg tccaggggga ggactacggc 1380
aaaggtgtca tcttctacct cagggacaaa gtggtcgtgg ggattgtgct atggaacatc 1440
tttaaccgaa tgccaatagc aaggaagatc attaaggacg gtgagcagca tgaagatctc 1500
aatgaagtag ccaaactatt caacattcat gaagacgaat tcgcgggtaa tcgtgtgcgt 1560
cgctctgttg gtcttaaggg tggtggaggt ggttctggtg gtggaggttc tggtggtggt 1620
ggatctggcc agcttgtgct gactcagcca ccttccctct ctgcatctcc tggagcatca 1680
gccagtctca cctgcacctt acgcagtgac atcaatgttg gttcctacag gatatcctgg 1740
taccagcaga agccagggag tcctccccag tatctcctga gctacaaatc agactcagat 1800
aagcagaagg gctctggagt ccccagccgc ttctctggat ccaaagatgc ttcggccaat 1860
gcagggattt tactcatctc tgggctccag tctgaggatg aggctgacta ttattgtatg 1920
atttggcaca acagcgctgg ggtgttcggc gggggcacca agctgaccgt cctaggcggt 1980
ggttcctcta gatcttcctc ctctggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gcaggtgcag 2040
ctgcaggagt cgggaggaac cttggtacag cctggggggt ccctgagact ctcttgtgaa 2100
gcctctggat tcacctttag caactatgcc atgggctggg tccgccagac tccaggaaag 2160
gggctggagt ggctgtcggc tattcgtaaa agtggcacta ccacatacta cgcggactcc 2220
gtgaagggcc ggttcatcat ctccagagac aattccaaga acaccctgta tctgcaaatg 2280
aataggctga gagtcggcga cacggccact tattactgtg cgactcaccc catcgcgggc 2340
tactggggcc agggaagcct ggtcactgtc tcctcc 2376
<210> 2
<211> 1536
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttagggctga caccagaaca gaaacagaaa aaggccgcgt tatctgcttc agaaggagag 60
gaagttcctc aagacaaggc gccaagtcat gttcctttcc tgctaattgg tggaggcaca 120
gctgcttttg ctgcagccag atccatccgg gctcgggatc ctggggccag ggtactgatt 180
gtatctgaag atcctgagct gccgtacatg cgacctcctc tttcaaaaga actgtggttt 240
tcagatgacc caaatgtcac aaagacactg cgattcaaac agtggaatgg aaaagagaga 300
agcatatatt tccagccacc ttctttctat gtctctgctc aggacctgcc tcatattgag 360
aatggtggtg tggctgtcct cactgggaag aaggtagtac agctggatgt gagagacaac 420
atggtgaaac ttaatgatgg ctctcaaata acctatgaaa agtgcttgat tgcaacagga 480
ggtactccaa gaagtctgtc tgccattgat agggctggag cagaggtgaa gagtagaaca 540
acgcttttca gaaagattgg agactttaga agcttggaga agatttcacg ggaagtcaaa 600
tcaattacga ttatcggtgg gggcttcctt ggtagcgaac tggcctgtgc tcttggcaga 660
aaggctcgag ccttgggcac agaagtgatt caactcttcc ccgagaaagg aaatatggga 720
aagatcctcc ccgaatacct cagcaactgg accatggaaa aagtcagacg agagggggtt 780
aaggtgatgc ccaatgctat tgtgcaatcc gttggagtca gcagtggcaa gttacttatc 840
aagctgaaag acggcaggaa ggtagaaact gaccacatag tggcagctgt gggcctggag 900
cccaatgttg agttggccaa gactggtggc ctggaaatag actcagattt tggtggcttc 960
cgggtaaatg cagagctaca agcacgctct aacatctggg tggcaggaga tgctgcatgc 1020
ttctacgata taaagttggg aaggaggcgg gtagagcacc atgatcacgc tgttgtgagt 1080
ggaagattgg ctggagaaaa tatgactgga gctgctaagc cgtactggca tcagtcaatg 1140
ttctggagtg atttgggccc cgatgttggc tatgaagcta ttggtcttgt ggacagtagt 1200
ttgcccacag ttggtgtttt tgcaaaagca actgcacaag acaaccccaa atctgccaca 1260
gagcagtcag gaactggtat ccgatcagag agtgagacag agtccgaggc ctcagaaatt 1320
actattcctc ccagcacccc ggcagttcca caggctcccg tccaggggga ggactacggc 1380
aaaggtgtca tcttctacct cagggacaaa gtggtcgtgg ggattgtgct atggaacatc 1440
tttaaccgaa tgccaatagc aaggaagatc attaaggacg gtgagcagca tgaagatctc 1500
aatgaagtag ccaaactatt caacattcat gaagac 1536
<210> 3
<211> 4756
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcgagctcg cccgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 60
ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 120
ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 180
acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 240
ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 300
aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 360
tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat 420
gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 480
gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc 540
ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt 600
ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga 660
caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt 720
gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga gtctataggc ccaccccctt ggcttcgtta 780
gaacgcggct acaattaata cataacctta tgtatcatac acatacgatt taggtgacac 840
tatagaataa catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gtccaactgc 900
acctcggttc tatcgattga attccaccat gggatggtca tgtatcatcc tttttctagt 960
agcaactgca accggtgtac actcgagcgt acgaagcttg gccgccatgg cccaacttgt 1020
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 1080
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 1140
tctggatcga tcgggaatta attcggcgca gcaccatggc ctgaaataac ctctgaaaga 1200
ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc tgtggaatgt gtgtcagtta 1260
gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 1320
tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc 1380
atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta 1440
actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca 1500
gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga 1560
ggcctaggct tttgcaaaaa gctgttaaca gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 1620
gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccccttcg 1680
ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgtagcc 1740
tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 1800
accgcatacg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 1860
tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 1920
cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 1980
ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 2040
tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 2100
gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 2160
tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 2220
aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat 2280
tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc aactccgcta 2340
tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 2400
tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc 2460
tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagta ttcttgaaga 2520
cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 2580
tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 2640
taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 2700
tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 2760
gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 2820
gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 2880
cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 2940
tgtggcgcgg tattatcccg tgatgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 3000
tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 3060
atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 3120
ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 3180
gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 3240
gagcgtgaca ccacgatgcc agcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 3300
gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 3360
gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 3420
gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 3480
cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 3540
atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 3600
tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 3660
ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 3720
gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 3780
tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 3840
ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt 3900
ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 3960
gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 4020
ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 4080
tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 4140
cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 4200
agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 4260
agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 4320
gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 4380
tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt 4440
accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca 4500
gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg 4560
attcattaat ccagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 4620
gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 4680
gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 4740
catgattacg aattaa 4756
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgtcgagtc gaaccggttg ggaagcggca ctgg 34
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtcgtgctca ccgtacgtta ggaggagacg gtgaccag 38
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtcgtgctca ccgtacgtta gtcttcatga atgttgaata g 41

Claims (7)

1.一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18-AIF表达基因、序列如SEQ ID No.2所示的AIF表达基因，分别通过酶切方式与Abvec-Igk质粒连接，分别得到重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；
2)分别取步骤1)所得重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主细胞E.coli Top10中进行质粒扩增；
3)分别收集步骤2)扩增后的重组质粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分别通过电转法导入处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株中，即分别得到载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述电转法的操作条件是：电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms；
4)取HEK293-T细胞与载体菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的细胞量为1:80～1:120的比例在细胞培养板中混合，或者取HEK293-T细胞与载体菌株Abvec-Igk-Aif-VNP20009以二者的细胞量为1:80～1:120的比例在细胞培养板中混合；混合后培养4～16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40～56h，而后破碎细胞收集上清。
2.根据权利要求1所述的一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于所述T18-AIF表达基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif为模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的DNA片段为引物，经PCR扩增得到的。
3.根据权利要求1所述的一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于所述AIF表达基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif为模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6所示的DNA片段为引物，经PCR扩增得到的。
4.根据权利要求1所述的一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于步骤1)所述酶切方式是经Age I和Bsiw I双酶切，对酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Abvec-Igk质粒中。
5.根据权利要求1所述的一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于步骤3)所述处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株，是通过以下方法制备的：
A)取冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株划线接种于LB固体培养基培养至形成单菌落；
B)挑取单菌落接种于3～7ml LB液体培养基中，35～39℃振荡培养10～14h；
C)取步骤B)培养所得的菌液，按1:80～1:120的体积比接种于LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD值不小于0.4；
D)冰浴15～25min后，离心取沉淀用1/8～1/12体积预冷的无菌去离子水洗涤，而后离心取沉淀用1/80～1/120体积预冷的、8～12％(mL/mL)浓度的甘油洗涤菌体，再离心沉淀重悬于1/80～1/120体积预冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。
6.根据权利要求1所述的一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于HEK293-T细胞的加入量为8000～12000个/孔；HEK293-T细胞与载体菌株在细胞培养板中混合后每孔中液体总体积为380～420μL。
7.根据权利要求1所述的一种细菌和抗体结合双靶向抑杀实体瘤药物的制备方法，其特征在于所述针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素是青霉素和链霉素。
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